Manual de Laboratorio

Manual del Laboratorio de Bioqumica

Jaime Andrs Pereaez Jimnez Andrs Felipe Zapata Betancur

Francisco Pea Rivera Maritza Fernndez Culma Rafael Salamanca Flrez

Docentes Departamento de Farmacia

Universidad de Antioquia Facultad de Qumica Farmacutica

Departamento de Farmacia Primera edicin Medelln, 2012

CONTENIDO

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA

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Pg. INTRODUCCIN 4 OBSERVACIONES GENERALES 5 Normas de bioseguridad en el laboratorio 5 Reglamento interno del laboratorio 5 Normas para el trabajo en el laboratorio 5 Manejo y disposicin de los residuos 6 Equipo de proteccin personal (EPP) 7 Primeros auxilios 8 EQUIPOS DE LABORATORIO 10 PRCTICA # 1 Bases de datos y herramientas estadsticas 14 PRCTICA # 2 Espectrofotometra y curva de calibracin 17 PRCTICA # 3 Cuantificacin de protenas: mtodo de Bradford 21 PRCTICA # 4 Actividad enzimtica: Tirosinasa 23 PRCTICA # 5 Fosfatasa alcalina I 29 PRCTICA # 6 Fosfatasa alcalina II 32 PRCTICA # 7 Actividad enzimtica: Fosfolipasa A2 35 PRCTICA # 8 Fermentacin alcohlica: Gluclisis anaerobia 38 PRCTICA # 9 Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida 42

INTRODUCCIN




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La Bioqumica es el estudio de la estructura, composicin y las reacciones qumicas de las molculas en los organismos vivos. La Bioqumica emergi como una disciplina separada cuando cientficos combinaron la biologa con la qumica orgnica, inorgnica o la fisicoqumica, y comenzaron a estudiar como los organismos obtenan la energa a partir de los alimentos, las bases qumicas de la herencia y los cambios fundamentales que ocurren en la en los procesos de salud-enfermedad. Este manual pretende brindar un acercamiento a diferentes tcnicas usadas para el estudio de diversos procesos bioqumicos. En esta recopilacin, se hace especial nfasis en los fundamentos prcticos relacionados con la enzimologa: actividad enzimtica, influencia de diferentes factores fisicoqumicos sobre la misma, extraccin de enzimas y productos de reaccin, cintica enzimtica e inhibicin enzimtica. Lo anterior con el fin de brindar a los estudiantes de qumica farmacutica una visin global sobre una de las disciplinas de la bioqumica ms usada para el desarrollo de nuevos frmacos. Asimismo, en este manual se presentan conceptos terico-prcticos sobre la cuantificacin de protenas, metabolismo (gluclisis) y electroforesis como parte del conjunto de tcnicas usadas para visualizar y separar protenas desde muestras complejas.

OBSERVACIONES GENERALES




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Normas de bioseguridad en el laboratorio Las normas de seguridad en el laboratorio pretenden crear en los estudiantes una conciencia de autocuidado y de cumplimientos a las normas internacionales y nacionales frente al tema, velando por la integridad fsica de las personas en el laboratorio y el correcto desarrollo de las prcticas acadmicas obteniendo un resultado confiable y acorde a los procedimientos realizados. Reglamento interno del laboratorio El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo experimental, en l se aprende observando y ensayando, y por tanto, se requiere un comportamiento responsable y acorde a las normas para evitar perjuicios personales a s mismos, a los compaeros o a la Institucin, porque su omisin o incumplimiento, puede ocasionarlos. Normas para el trabajo en el laboratorio:

Los estudiantes deben ser puntuales y disponer adecuadamente de su tiempo, para no trastornar las prcticas de los grupos siguientes. Es indispensable leer, analizar y aclarar las dudas antes de comenzar su trabajo en el laboratorio.

Siempre deben usar bata blanca de manga larga con cierre y con bolsillos internos, las gafas de seguridad, el respirador, los guantes y gorro (estos tres ltimos para casos especficos y si se hace necesario). La bata debe permanecer cerrada durante toda la prctica.

Los celulares se deben apagar o poner en modo silencioso o vibracin, con el fin de no perturbar el desarrollo normal del laboratorio y las llamadas, si el profesor lo permite, se deben contestar afuera del laboratorio.

El uso de audfonos al interior del laboratorio no est permitido, ya que generan distraccin y pueden desencadenar accidentes.

Las gorras, cachuchas o vsceras se deben guardar en el morral o bolso.

El cabello, si es largo, se debe llevar recogido para evitar accidentes.

Se recomienda no portar reloj, anillos, cadenas, aretes o pulseras, los cuales

pueden generar accidentes o deteriorarse por accin de los reactivos o equipos

de trabajo.

Nunca colocar sobre las mesas de trabajo morrales, sacos y dems objetos personales. No utilizar las mesas de trabajo como asientos.

Revisar el material asignado antes de iniciar la prctica, verificar si est completo y en buen estado. Informar al tecnlogo o monitor cualquier anomala.

TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DEL MATERIAL DE USO GENERAL.

Identificar y hacer uso correcto, si es necesario, del extintor de incendios y el botiqun de primeros auxilios.

Se prohbe fumar e ingerir cualquier tipo de alimento dentro del laboratorio y durante la prctica.

El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden ocasionar graves accidentes. Se debe mantener el buen comportamiento y la disciplina, y se debe manejar un tono de voz adecuado.

Durante la prctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA en las mesas de trabajo, as como en el sitio asignado para materiales y reactivos de uso general.

Al iniciar y finalizar una prctica, se deben lavar las manos con agua y jabn.

Antes de usar un reactivo o solucin leer las etiquetas e interpretar los smbolos de seguridad. Evitar el contacto con los ojos, la piel y la ropa.

Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o esptulas asignadas para cada uno de los reactivos o soluciones preparadas para evitar contaminaciones y por ende la prdida total de los reactivos. LOS REACTIVOS Y/O SOLUCIONES NO SE DEBEN RETIRAR DE LOS SITIOS ASIGNADOS, taparlos despus de su uso.

Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las instrucciones dadas por el profesor, el tecnlogo o el monitor. No descuidar los equipos que se encuentren en funcionamiento.

Rotular adecuadamente con nombre, cdigo del curso y fecha, los ensayos realizados que requieren un seguimiento por varios das. Ubicarlos en el sitio asignado dentro del laboratorio.

El laboratorio es un espacio para el aprendizaje, por lo cual no se permiten visitas durante el tiempo de clase, los encuentros con los compaeros de estudio se deben realizar en sitios y horas diferentes a los del laboratorio.

Por seguridad y cuidado personal se debe evitar al mximo trabajar solo en el laboratorio, siempre se debe estar acompaado de otra persona.

Manejo y disposicin de los residuos No se deben arrojar residuos slidos, papeles, servilletas por las pocetas, al piso o a las mesas de trabajo, desecharlos en forma adecuada y en los recipientes asignados para tal fin:

Color Caneca Tipo de Residuo Clasificacin

Gris Papel, Cartn Reciclable

Blanca Vidrio limpio Reciclable

Roja Muestras y material

contaminado Riesgo Qumico y Biolgico

Verde Basura, servilletas, guantes

no contaminados No Reciclable

Al finalizar la prctica y despus de disponer correctamente de los residuos, lavar el material con precaucin, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas en el sitio correspondiente, informar a la persona encargada para recibir el visto bueno de entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRAR DEL LABORATORIO SIN HABER REALIZADO CORRECTAMENTE LA ENTREGA. En caso de prdida, ruptura de materiales o contaminacin de algn reactivo, los estudiantes debern reportarlo en el formato especificado y retornarlo al laboratorio en los 15 das siguientes. El material debe tener las mismas condiciones o especificaciones del perdido y debe presentarse la factura correspondiente. La no reposicin a tiempo de los elementos genera impedimentos para la prxima matricula. Equipo de proteccin personal (EPP)

Proteccin ocular Las gafas de seguridad deben ofrecer una buena proteccin frontal y lateral. Son de uso permanente durante toda la prctica.

Proteccin de las manos Para cada prctica se debe portar guantes protectores de laboratorio, los cuales se utilizaran cuando sea necesario, ya sean de latex o de nitrilo

Proteccin de los pies La proteccin de los pies est diseada para prevenir heridas producidas por sustancias corrosivas, objetos pesados, descargas elctricas, as como para evitar deslizamientos en suelos mojados, motivo por el cual debe ser un zapato que cubra todo el pie. No se permiten chanclas, sandalias, etc. Adems se debe utilizar ropa que cubra en su totalidad las piernas y que sea resistente, como lo son jeans o pantalones, no se permiten minifaldas, shorts, etc.

Proteccin pulmonar Las mascarillas individuales, deben contener el adsorbente adecuado al tipo de sustancia que se va a manipular y se deben portar cuando sea necesario.

Ropa de proteccin La bata de laboratorio est diseada para proteger la ropa y la piel de las sustancias qumicas que pueden derramarse o producir salpicaduras. Es de obligatorio uso.

Primeros auxilios

Quemaduras Para la atencin de pequeas quemaduras producidas por material caliente, como lo son los baos mara, las placas o mantas de calentamiento , etc. Se debe efectuar primero un lavado con abundante agua fra en la zona afectada durante 10-15 minutos. Luego del lavado se debe aplicar una crema o pomada indicada para estas lesiones, como lo es la Sulfadiazina de Plata (Sulfaplata ) la cual se encuentra en el botiqun de primeros auxilios del laboratorio. Las quemaduras ms graves y que comprometan mucho tejido epitelial se debe proceder con el lavado con agua fra sobre el tejido afectado y remitir inmediatamente al servicio medico para recibir atencin especializada.

Cortes Si durante el desarrollo de las practicas se presenta algn corte, este se debe lavar inmediatamente con agua y jabn desinfectante y se debe cubrir con un apsito indicado, si la hemorragia persiste se debe acudir inmediatamente al servicio medico.

Derrame de productos qumicos sobre la piel Los productos qumicos que se hallan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mnimo durante 15 minutos. Las duchas de seguridad son usadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado con un grifo. Se debe retirar toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible mientras est bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensin de la herida. No intentar neutralizar y proporcionar asistencia mdica a la persona afectada.

Salpicaduras en ojos En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave los ojos, menos grande ser el dao producido. Lava los ojos con agua corriente abundante durante 15 minutos como mnimo. Para esto se debe utilizar el lavaojos ubicado en la ducha de seguridad. Es necesario mantener los ojos bien abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los parpados y siempre se debe recibir asistencia mdica por pequea que sea la lesin.

Incendios Evacuar inmediatamente el laboratorio, por pequeo que sea el fuego, para esto utilizar la salida principal o por la salida de emergencia si la principal est bloqueada. Avisar a todos los compaeros de trabajo sin que se cree pnico y conservando siempre la calma.

o Fuego leve Si el fuego es pequeo y localizado, apagar utilizando extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con recipientes de tamao adecuado que lo ahogue. Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del fuego. No utilice nunca agua para extinguir fuego provocado por inflamacin con un disolvente.

o Fuegos alto Aislar el fuego. Utilizar los extintores adecuados: el de CO2 para incendios de gases (tipo A) y el de agua a presin con CO2 en solucin, para slidos y lquidos.

Fuego corporal Si se genera fuego sobre ti en tu ropa, pide ayuda inmediatamente, estrate sobre el suelo y comienza a rodar sobre ti mismo, si el fuego continua la persona que te este auxiliando te debe cubrir con una manta o cobija con el fin de ahogar el fuego o trasladarte a la ducha de seguridad para extinguirlo con agua y si se requiere se debe retirar su ropa, siempre y cuando no se encuentre adherida a su piel, si es as utilizar una tijera y cortar la no adherida. No se debe utilizar el extintor directamente sobre la persona y se debe acudir inmediatamente al servicio medico.

EQUIPOS DE LABORATORIO




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Bao Mara Equipo utilizado para hacer calentamientos indirectos de diferentes lquidos o solidos mediante la transferencia de calor a travs de la conveccin trmica del medio. El calentamiento se realiza de una forma lenta y constante. Para realizar el calentamiento en el bao mara el lquido o el solido se dispone en un recipiente resistente al calor y se ubica al interior del equipo, de esta forma el agua se calienta y poco a poco va transfiriendo el calor a la sustancia de inters. Antes de comenzar a usar se debe verificar el nivel del agua. Estufa de Secado Se utiliza para secar el material utilizado en el laboratorio ya sea de vidrio, plstico o acero inoxidable entre otros. Tambin se puede utilizar para la esterilizacin del vidrio o el metal de acuerdo con el tiempo y el calor programado. Existen diferentes tipos de estufas de secado (hornos de secado) de acuerdo con el tipo de conveccin del calor, ya sea natural o forzada. El calor utilizado por la estufa para realizar el secado y la esterilizacin se denomina calor seco.

Tabla de temperatura / tiempo de esterilizacin por calor seco

TEMPERATURA C TIEMPO (Minutos) TEMPERATURA C TIEMPO (Minutos)

180 30 140 150 170 60 150 180

160 120 121 360 http://www.medifesas.com/mdf/images/stories/documentos/metodos_de_esterilizar_el_instrumental.pdf

Espectrofotmetro Consiste en un instrumento que nos permite determinar la cantidad de radiacin absorbida o trasmitida por un compuesto. El espectrofotmetro nos permite realizar lecturas de la radiacin absorbida o transmitida en la regin visible del espectro, la cual se encuentra entre 400 y 750 nm de longitud de onda. Cada compuesto posee una longitud de onda de mxima de absorbancia en la cual se realiza la lectura para posterior determinacin de la concentracin. Balanza Analtica La balanza analtica es uno de los equipos ms utilizados e importantes al interior de un laboratorio tanto de anlisis como de investigacin. De esta depende la correcta medida de muchas de las sustancias a trabajar lo cual permite tener resultados ms exactos y confiables. Estas balanzas poseen caractersticas de precisin y exactitud, por lo cual su manipulacin requiere mucho cuidado y limpieza, garantizando as la conservacin de sus partes un buen estado y mejor funcionamiento. El correcto funcionamiento de las balanzas tambin depende de los factores ambientales y ubicacin al interior del laboratorio, motivo por el cual deben estar en un lugar exclusivo de pesado donde incidan en lo menos posibles factores como corrientes de aire, rayos del sol o dems perturbaciones. pH-Metro Equipo que permite realizar la determinacin del diferencial del potencial elctrico en una disolucin, el mtodo se basa en la corriente elctrica generada entre dos disoluciones con diferente potencial. Para realizar la lectura de este diferencial se utiliza un electrodo, el cual al ser sumergido en una disolucin establece un potencial elctrico a travs de la membrana de vidrio, el cual es comparado con el potencial invariable del electrodo de referencia y puede estar al interior del electrodo o estar ubicado externamente. El electrodo al ser un elemento de vidrio y tan delicado, requiere que sea manipulado con mucho cuidado y cada vez que se usa debe de ser enjuagado con

abundante agua destilada o desionizada, adems debe de conservarse de manera permanente y mientras no este en uso en una solucin de KCl. Plancha de agitacin con calentamiento Este equipo posee un imn central fijo el cual es el encargado de hacer girar un barra magntica que depositamos en las disoluciones, al producirse la repulsin de cargas el magneto gira brindando as una agitacin constante a la disolucin. Este equipo es de gran ayuda el momento de preparar disoluciones con sustancias poco solubles en el solvente utilizado y adems nos brinda la posibilidad de calentamiento con lo podemos acelerar el proceso de disolucin en muchos casos. Tambin se puede utilizar sin agitacin y solamente utilizando el calentamiento, pues posee controles independientes para estas funciones. Cabina de Extraccin de gases La cabina de extraccin de gases nos permite trabajar al interior del laboratorio de forma segura al momento de manipular sustancias toxicas voltiles, minimizando el contacto del personal del laboratorio con estos vapores y una menor contaminacin al medio. Adems de la proteccin contra los vapores y humo, la cabina tambin ofrece proteccin frente a derrames y posibles explosiones. El funcionamiento de esta se basa en la extraccin de los vapores generados en el rea de trabajo, los cuales van por conductos hacia el exterior luego de pasar por un filtro que minimiza la contaminacin del medio ambiente. Centrifuga La centrifuga es un equipo que nos permite separar lquidos o solidos de lquidos, mediante la diferencia de densidades. La mezcla es introducida a la centrifuga en tubos de ensayo y es sometido a una fuerza rotativa, la cual genera que el liquido de mayor densidad o el solido se precipite hacia el fondo del tubo de ensayo.

Agitador tipo vrtex

Se usa para agitar lquidos dispuestos en tubos de ensayo o frascos pequeos. Mediante un motor se genera un movimiento circular de una pieza de goma que posteriormente trasmite el movimiento al recipiente que contiene el lquido y finalmente se forma un vrtice. La mayora de agitadores tipo vrtex tienen la posibilidad de considerar diferentes configuraciones, entre ellas la de funcionar solo cuando una dbil presin se aplica sobre la pieza de goma.

PRCTICA # 1 BASES DE DATOS Y HERRAMIENTAS ESTADSTICAS




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El uso de las bases de datos en el mundo acadmico es ms comn da a da, sin embargo muchos estudiantes no tienen xito en sus bsquedas, ya sea por desconocimiento de los buscadores o por imprecisin en las palabras claves utilizadas. En esta prctica se darn conceptos bsicos sobre el uso de las bases datos a las que nuestra biblioteca tiene acceso.

Science Direct

Springer

Pubmed

EBSCO Y otras ms. Como ingresar a las bases de datos de la Universidad de Antioquia

Ingresar al sistema de bibliotecas y solicitar contrasea

Ingresar a las diferentes bases de datos

Seleccionar la base de datos requerida y realizar la bsqueda

La estadstica es una herramienta valiosa que debe ser aprovechada por personas que trabajan en diferentes areas. En ciencias biolgicas la estadstica nos ayuda a establecer diferencias entre tratamientos, concentraciones, tiempos, ensayos, estndar y muestras, entre otras. Adicionalmente sta ciencia es de gran apoyo al momento de discutir los resultados obtenidos experimentalmente, sin embargo muchas personas no conocen los anlisis que deben ser realizados a sus datos y mucho menos la interpretacin de los mismos. Por esta razn en esta prctica se darn nociones del uso de Excel en algunos anlisis estadsticos simples, asi como la interpretacin de los mismos.

PRCTICA # 2 ESPECTROFOTOMETRA Y CURVA DE CALIBRACIN




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Objetivos

Conocer los aspectos bsicos de la tcnica instrumental espectrofotometra.

Elaborar una curva de calibracin de un compuesto coloreado (Paranitrofenol (PNP) o Azul de metileno).

Determinar la concentracin de una muestra problema a partir de la curva de calibracin.

Aspectos Tericos La espectrofotometra es una tcnica til para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reaccin. El mtodo se basa en la medicin de la intensidad de la luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solucin coloreada, que puede ser de uno o varios compuestos. La absorcin mxima de energa ocurre a una

longitud de onda ( ) especfica para cada molcula. La intensidad de la energa absorbida (absorbancia) es directamente proporcional a la concentracin del compuesto en una solucin.

Radiacin electromagntica y absorbancia de la luz La radiacin electromagntica es una clase de energa que se transmite por el espacio a enormes velocidades. Adopta muchas formas, siendo la ms fcilmente reconocible la luz. Otras manifestaciones menos evidentes son la radiacin gamma, los rayos X, el ultravioleta (UV), el microondas y la radiofrecuencia. La radiacin

electromagntica viaja en forma de ondas, con una longitud de onda especfica ( ) (distancia entre puntos consecutivos de una onda). Otra propiedad importante de las

ondas es la frecuencia ( ), definida como nmero de oscilaciones por unidad de tiempo. La frecuencia tambin es importante para definir la energa de la onda, ya que

como se muestra en la ecuacin E= h , siendo h la constante de Plank (= 6.62 10 -34

Joule x segundo), la frecuencia es directamente proporcional a la energa de la onda. El espectro electromagntico entonces, est constituido por ondas electromagnticas de diferente frecuencia. Una regin del espectro electromagntico es la visible, entre ~400~800 nm. Cualquier energa producida en esta estrecha banda producir la sensacin de visin cuando estimula el ojo humano normal. As, radiaciones entre

~400~420 producirn color violeta y radiaciones entre ~570~585 producirn color amarillo.

Absorbancia y ley de Beer

Cuando una molcula absorbe radiacin visible, sus electrones se excitan y pasan a un nivel de energa mayor, sin embargo los electrones tambin pueden caer a niveles de menor energa y pueden emitir radiacin electromagntica. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido (ej. una solucin), una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. La absorbancia es la cantidad de luz absorbida, mientras que la transmitancia es la cantidad de luz que logra pasar el cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo. Por su parte, la ley de Beer, establece que la absorbancia est relacionada linealmente con la concentracin de la especie absorbente y con la longitud de la trayectoria de la radiacin en el medio absorbente. Adicionalmente, esta ley involucra la absortividad molar (), la cual es una constante para cada especie que absorba

energa en la regin visible. Finalmente la ecuacin de la ley de Beer es: A = bc, donde () es el coeficiente de extincin molar, b es la longitud de paso del haz de luz por la muestra y c es la concentracin. Se puede notar en la ecuacin que la absorbancia esta directamente relacionada con la concentracin de la especie problema.

Materiales:

Espectrofotmetro

Celdas para el Espectrofotmetro

Tubos de ensayo

Vaso de precipitados

Frasco lavador

Reactivos:

Solucin de Paranitrofenol (139.1088 g/mol) 1 x10-4 Molar o Azul de metileno 319.85 g/mol) 4.01 x 10-5 Molar

Solucin acuosa NaCl 0.9% (Si se trabaja con PNP)

Agua destilada o desionizada

Seccin Experimental

Manejo del Espectrofotmetro. Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las siguientes indicaciones o remitirse al manual del equipo:

o Seleccione la longitud de onda deseada (PNP 410 nm Azul de Metileno 665 nm)

o Introducir la celda que contiene la solucin blanco, la cual se prepara mezclando 3ml de solucin salina o agua.

o Calibrar el 0 de Absorbancia / 100% de transmitancia. o Retirar la celda que contiene la solucin blanco. o Realizar las lecturas correspondientes.

Curva de calibracin para soluciones coloreadas.

o Rotule 7 tubos de ensayo y prepare las soluciones indicadas en la siguiente tabla mediante diluciones dobles sucesivas.

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7

Dilucin 0 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

Solucin Patrn (ml)

0 4 0 0 0 0 0 0

Cantidad de solucin

anterior (ml) 0 0 2 2 2 2 2 2

Solucin salina (ml)

4 0 2 2 2 2 2 2

Concentracin (mol/l)

Absorbancia obtenida

o Grafique los resultados de absorbancia y concentracin tabulados y

obtenga la ecuacin de la lnea recta mediante el uso de los conceptos bsicos de estadstica que le fueron ensaados en la prctica anterior.

o Obtenga el valor de concentracin de su muestra problema, utilizando la ecuacin antes encontrada.

Residuos Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos NO clorados.

Preguntas

Qu es una curva de calibracin?

Qu caractersticas debe cumplir?

Se puede construir una curva de calibracin con sustancias no coloreadas?

Por qu razn se eligi una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva de absorcin?

Qu significado tiene la pendiente de la grfica?

Que son las desviaciones de la ley de Beer y cules son sus principales causas?

Bibliografa

Schmid, F.-X. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry. Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group. 2001.

PRCTICA # 3 CUANTIFICACIN DE PROTENAS: MTODO DE BRADFORD




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Objetivo

Determinar la concentracin de protenas de una muestra desconocida a partir de una curva de calibracin de albmina, usando el mtodo de Bradford.

Aspectos Tericos El mtodo de Bradford est basado en la unin del colorante Azul de Coomassie G250 a las protenas. Estudios han indicado que el colorante puede existir en cuatro formas inicas pKa 1.15, 1.82, y 12.4. La forma ms aninica es la azul, la cual se une a la protena y tiene un mximo de absorbancia a 590nm. Por lo tanto, la cantidad de protena puede ser estimada al determinar la cantidad de colorante en la forma azul. Esto usualmente se obtiene al medir la absorbancia de la solucin a 595 nm.

Materiales

Espectrofotmetro.

Celdas para espectrofotmetro.

Agitador.

Micropipeta 1001000 l.

Reactivos

Solucin acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.

Solucin de Albumina 1 mg/ml.

Suero Fetal Bovino 1/20.

Reactivo de Bradford. o Azul de Coomasie. o Etanol. o cido Ortofosfrico.

Seccin experimental

Realice la siguiente curva de calibracin mediante diluciones dobles sucesivas: Patrn: Albmina (BSA) 1mg/ml = 1g/1L. Diluyente: Solucin buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Dilucin (v/v) 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Concentracin (g/100L) 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56

Prepare una serie tubos en los cuales depositar 200 L de cada una de las diluciones preparadas, posteriormente adicione 3 ml del reactivo Azul de Coomasie, deje en reposo por 5 min en la oscuridad y lea Absorbancia a 595 nm contra un blanco correctamente preparado.

Utilizar anlisis de regresin lineal simple para el anlisis de los datos.

Para determinar la concentracin de una muestra problema, adicionar a 100 L de sta 3 ml de Azul de Coomasie, y proceda interpolando en la recta de calibracin y haciendo los ajustes a que hubiere lugar.

Preguntas

Cul es la base del mtodo?

Cules son las interferencias del mtodo?

Investigue otros mtodos de cuantificacin de protenas?

Bibliografa

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 1976; 72: 248-254.

Spector, T. Refinement of the Coomassie Blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for

PRCTICA # 4 ACTIVIDAD ENZIMTICA: TIROSINASA




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Objetivo

Determinar la actividad enzimtica de la tirosinasa y la influencia de diferentes factores fisicoqumicos sobre la misma.

Aspectos Tericos

Actividad enzimtica e influencia de factores fisicoqumicos sobre esta Las enzimas son los catalizadores de los sistemas biolgicos, son altamente especficas y se recuperan al final de cada ciclo de reaccin. En general son de carcter proteico pero tambin se conocen algunos RNAs con propiedades catalticas. Estos catalizadores tienen parmetros enzimticos como Km y Vmax, sin embargo estos varan de acuerdo al sustrato y la concentracin de enzima. La forma ms adecuada de cuantificar la actividad enzimtica es medir la cantidad de producto que se forma por unidad de tiempo. Sin embargo, tal actividad se ve influenciada por el pH y la temperatura del microambiente donde ocurre la reaccin, la concentracin de sustrato y coenzimas o cofactores, entre otras. Todas las enzimas tienen condiciones ptimas de catlisis, es decir un pH, temperatura y fuerza inica del medio a las cuales la enzima cataliza la reaccin de la forma ms eficiente posible. Sin embargo, los cambios de pH en el ambiente donde ocurre la reaccin pueden provocar que las cadenas laterales de los aminocidos del sitio activo se protonen o desprotonen lo que provocara una perdida en la capacidad de la enzima para llevar a cabo la reaccin. De igual forma cambios en la temperatura y la fuerza inica del medio, provocan cambios conformacionales en la enzima que finalmente conducen a disminucin en la eficiencia cataltica.

Tirosinasa y pardeamiento enzimtico El oscurecimiento de algunas frutas y verduras (banano, pera, manzana, papa), despus de que son expuestas al medio ambiente, se conoce como pardeamiento enzimtico. Este proceso es llevado a cabo por la Tirosinasa, (o-difenol O2 oxidorreductasa E.C. 1.14.18.1.). Esta metal-enzima es la que est en el interior de las

frutas antes mencionadas y como la reaccin requiere de oxgeno molecular, la pigmentacin, no ocurre si la parte interior de estas frutas no est expuesta al aire. La reaccin catalizada por la enzima se muestra en la figura 1, esta reaccin conduce a la formacin de un pigmento color caf, conocido como melanina, el cual se produce tras oxidacin de la tirosina y posterior polimerizacin de los productos de reaccin.

Figura 1. Reaccin catalizada por la Tirosinasa

En el desarrollo de esta prctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de la papa y hacerla reaccionar con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto L-metildopacromo, que es de color caf; la aparicin de este se puede seguir espectrofotomtricamente a una de 420nm, que es donde se presenta su mxima absorcin.

Reactivos y Equipos

Solucin buffer glicina 0.05 M pH 10.4.

Solucin buffer fosfato 0.1 M pH 7.2.

Solucin buffer fosfato 0.1 M pH 6.0.

Solucin buffer citrato pH 3.

Solucin DOPA 0.03 M (en buffer fosfato de pH 6.0).

Papas.

Arena de mar.

Lienzo o pauelo limpio.

Mortero.

Espectrofotmetro.

Hielo picado.

HO

COOH

NH2

HO

HO

COOH

NH2

O

O

NH2

COOH

NH

COOH

HO

HONH

COOHO

O

NH

HO

HO

O

ONH

N

N

O

O

O

O

Tirosina DOPA Dopa quinona

Dopa crome, 420 nm

Melanina

Enz Enz

O2 O2

CO2

Seccin Experimental Extraccin de la enzima.

Coloque 10 g de la papa en el mortero pre-enfriado y adicione 10 ml de buffer de fosfato 0.1M (pH=7.2).

Adicione unos pocos gramos de arena de mar a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta solida.

Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 10 minutos a 3500 RPM.

La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un bao de hielo.

Diluya la solucin sobrenadante 1/10 con buffer pH=7.2 hasta completar 20 ml.

Rotule esta solucin como extracto enzimtico. Medida de la actividad enzimtica.

Mezcle en un tubo de ensayo: o 1ml de extracto enzimtico. o 3 ml de buffer pH=7.2. o 1 ml de solucin de L-metildopa.

Prepare un blanco de reactivos.

Calibrar el espectrofotmetro a = 420 nm.

Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el espectrofotmetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotmetro cada 20 segundos durante 3 minutos.

Calcule la actividad enzimtica de la pendiente de la grfica Absorbancia vs tiempo.

Influencia de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica.

Mezcle en un tubo de ensayo: o 2 ml de extracto enzimtico (otros grupos pueden hacerlo con 1.5, 2.5

ml de extracto enzimtico). o 2 ml de buffer pH=7.2. o 1 ml de solucin de L-metildopa.

Prepare un blanco de reactivos de acuerdo a la cantidad de extracto enzimtico utilizado.

Calibrar el espectrofotmetro a =420 nm.


Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotmetro cada 20 segundos durante 3 minutos. (Tabla 1)


Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto anterior.

Tabla 1: Influencia de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica

Absorbancia Mililitros de extracto enzimtico

1.0 1.5 2.0 2.5 Tiempo (seg) tubo

0.0 20

40

60

80 100

120

150

180 Nota: Los datos de 1.0 ml debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad enzimtica.

Influencia del pH sobre la actividad enzimtica.

Mezcle en un tubo de ensayo}: o 1ml de extracto enzimtico. o 3 ml de buffer pH 3 (otros grupos lo pueden hacer con buffer pH 10) o 1 ml de solucin de L-metildopa.




Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotmetro cada 20 segundos durante 3 minutos (Tabla 2).


Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de Medida de la actividad enzimtica.

Tabla 2: Influencia del pH sobre la actividad enzimtica

Absorbancia pH

3.0 7.2 10.0 Tiempo(seg)tubo

0.0

20

40 60

80

100

120

150

180

Nota: Los datos de pH 7.2 debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad enzimtica.

Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

Mezcle en un tubo de ensayo: o 1ml de extracto enzimtico. o 3 ml de buffer pH= 7.2. o 1 ml de solucin de L-metildopa.

Introduzca el tubo en un bao mara a 37 0C durante 5 minutos. Otros grupos lo pueden hacer incubando a 2C en un bao de hielo.



Sin dejar enfriar el tubo de reaccin, agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el espectrofotmetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotmetro cada 20 segundos durante 3 minutos (Tabla 3).


Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de Medida de la actividad enzimtica.

Tabla 3: Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimtica

Absorbancia 2C 25C 37C

Tiempo(seg)tubo

0.0 20

40

60 80

100

120

150 180

Nota: Los datos de 25C debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad enzimtica.

Se recomienda a los docentes que todos los estudiantes realicen la extraccin de la enzima, pero que los ensayos de influencia de concentracin de enzima, pH y temperatura sean realizados por diferentes grupos. Al final de la prctica los datos deben ser compartidos.

Preguntas

La enzima acta mejor a pH cido, bsico o neutro?

Explique cmo afecta la concentracin de enzima la actividad enzimtica.

La enzima acta mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiolgicas?

Documntese sobre el mecanismo cataltico de la tirosinasa y responda lo siguiente: Como pueden los pH cidos y bsicos influenciar sobre la actividad enzimtica?

Bibliografa

Decker H, Dillinger R, Tuczek F. How Does Tyrosinase Work? Recent Insights from Model Chemistry and Structural Biology . Angew. Chem. Int. Ed. 2000; 39: 1591-1595.

PRCTICA # 5 FOSFATASA ALCALINA I




5-324

Objetivo

Comprender la reaccin bsica de las fosfatasas.

Construir una curva de calibracin con el producto de la reaccin, la cual ser usada para calcular la cantidad de producto liberado despus de la catlisis.

Aspectos Tericos

Generalidades y principio del mtodo La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfosteres, liberando el fosfato inorgnico.

RCOOP + H2O RCOO- + Pi Ejerce su accin a pH elevado, del orden de 10. La presencia de iones Zn2+ es necesaria para su actividad, mientras que el fosfato la inhibe. La especificidad de la enzima por R es dbil (estructuralmente es posible variar R conservando la actividad enzimtica) y R puede ser un radical alqulico o fenlico. R-OH puede ser un alcohol primario o secundario, un fenol o un alcohol cclico. El sustrato que usaremos en este ensayo ser el p-Nitrofenilfosfato. (PNPP).

PNPP PNP

Este sustrato es incoloro pero por hidrlisis se libera el p-Nitrofenol (PNP), que es

amarillo y absorbe a = 410 nm, lo cual posibilita seguirlo espectrofotometricamente. Este es el principio fundamental de esta prctica.

OPO3--

NO2

H2O

HPO3--

OH

NO2

Enz

En resumen: Si por accin de la enzima se produce el p-nitrofenol, precisamos de un mtodo que nos permita cuantificar sta sustancia, para as calcular la velocidad de la reaccin medida por la enzima. Para ello debemos hacer una curva de calibracin.

Reactivos

Buffer de glicina 0.05 M, pH 10.4.

Solucin fosfato disdico 0.5 M.

Solucin de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M. (Para esta solucin y las disoluciones sucesivas, utilice el buffer de Glicina como solvente).

Solucin acuosa de ZnCl2 6 10-4M.

Solucin enzimtica: Suero sanguneo diluido 1/2 con buffer de glicina.

Solucin acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 5 10-3M.

Solucin acuosa de Na2HPO4 5.0 10-3M.

Seccin experimental Construccin de la curva de calibracin con el producto de la reaccin.

Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNP.

Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina.

Luego de haber realizado las diluciones adicione 1 ml de la solucin de Fosfato

0.5 M y 0.5 ml de la solucin de ZnCl2 6 10-4 M a cada uno de los tubos.

Prepare un blanco para este experimento.

Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice las lecturas.

Registre las absorbancias obtenidas.

Tubo 1 2 3 4 5 Blanco

Dilucin PNP 10-4M Volumen final 2 ml

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 2 ml

Glicina

Fosfato de sodio 0.5M 1 1 1 1 1 1

Sln de ZnCl2 6 10-4M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Absorbancia

Concentracin PNP

Calcule la concentracin de PNP en cada una de las diluciones.

Realice el grfico de Absorbancia en funcin de la concentracin de PNP.

Exprese la concentracin en mol/l. Nota:

En todos los ensayos enzimticos, es fundamental que el material de vidrio este limpio.

Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.

Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.

Bibliografa

Bessey O, Lowry O, Brock MJ. A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum. J. Biol. Chem. 1946; 164: 321-329.

PRCTICA # 6 FOSFATASA ALCALINA II




5-324

Objetivo

Calcular los parmetros cinticos de la fosfatasa alcalina mediante el uso de un sustrato sinttico y el seguimiento espectrofotomtrico de la aparicin del producto de la reaccin.

Determinar el tipo de inhibicin del fosfato sobre la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina.

Seccin experimental Influencia de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica: Determinacin de parmetros cinticos Km y Vm.

Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNPP.

Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina.

Luego de haber realizado las diluciones adicione 0.5 ml de la solucin de ZnCl2

6 10-4 M a cada uno de los tubos.


PNPP Volumen final 2 ml

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 2 ml

Glicina Sln. ZnCl2 6 10

-4M (ml)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Absorbancia

Prepare un blanco para este experimento.

Deje en reposo durante 5 minutos.

Incubar los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal 1/2 tambin de de calentarse bajo las mismas condiciones.

Adicionar 0.5 mL de la solucin enzimtica (Suero Fetal Bovino) a cada tubo de ensayo.

Garantizar que cada tubo reaccione con la solucin enzimtica exactamente 15 minutos a 37 C.

Luego de los 15 minutos detener la reaccin con 1 mL Na2HPO4 0.5 M.

Registrar las absorbancias a 410 nm.

Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la curva de calibracin obtenida en la prctica anterior.

Construya y complete la siguiente tabla

[PNPP] Absorbancia [PNP] V0 = [PNP]/min 1/[PNPP] 1/V0

Grafique los inversos 1/[PNPP] y 1/V0 determine Km y Vm

Determinacin del tipo de inhibicin.

Preparar en 5 tubos numerados del 1 al 5 y un blanco, las siguientes mezclas:


PNPP Volumen final 2 ml

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 2 ml

glicina

Inhib.0.5 10-2M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Sln. ZnCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Dejar en reposo durante 15 minutos.

Incubar los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal tambin de de calentarse bajo las mismas condiciones.

Luego adicionar 0.5 ml de la solucin enzimtica.

Garantizar que cada tubo reaccione exactamente 15 minutos a 37 C.

Luego de los 15 minutos detener la reaccin adicionando 1 ml de a cada tubo Na2HPO4 0.5 M.

Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice las lecturas.

Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la curva de calibracin obtenida en la prctica anterior.

Construir la misma tabla que utiliz para determinar los parmetros enzimticos, Km y Vm, y ahora calclelos en presencia del inhibidor.

Determinar el tipo de inhibicin.

Preguntas

Cul es la importancia clnica de la fosfatasa alcalina?

En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto?

Sera posible revertir la inhibicin provocada por el fosfato aumentando la concentracin de PNPP?

Nota:

En todos los ensayos enzimticos, es fundamental que el material de vidrio este limpio.

Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.

Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.

Bibliografa

Trentham DR, Gutfreund H. The kinetics of the reaction of nitrophenyl phosphates with alkaline phosphatase from Escherichia coli. Biochem J. 1968; 106: 455-460.

PRCTICA # 7 ACTIVIDAD ENZIMTICA: FOSFOLIPASA A2




5-324

Objetivos Cuantificar la actividad de una enzima que actua en una interfase lpido:agua.

Utilizar la tcnica de extraccin lquido:lquido para separar uno de los productos de la reaccin.

Aspectos Tericos Las fosfolipasas A2 (Phospholipase A2, PLA2) forman una superfamilia que actualmente cuenta con 15 grupos a su vez divididos en numerosos subgrupos. Estas enzimas se caracterizan por su capacidad para hidrolizar el enlace ester de la posicin sn-2 de un glicerofosfolpido (Figura 1). Su clasificacin est basada en su secuencia, masa molecular, procedencia, posicin de sus puentes disulfuro, requerimiento de calcio, entre otras caractersticas. Los productos de la hidrlisis del enlace ester de la posicin sn-2 del fosfolpido son un cido graso y un lisofosfolpido. Ambos representan el primer paso en la formacin de segundos mensajeros que juegan papeles fisiolgicos de gran importancia. Cuando el cido araquidnico es liberado puede ser convertido en eicosanoides, por medio de la accin de diferentes enzimas. Estas molculas pueden ejercer una gran variedad de efectos fisiopatolgicos, principalmente los relacionados con la respuesta inflamatoria. Por su parte, los lisofosfolpidos pueden ser convertidos en cido lisofosfatdico o ser acetilado hacia el factor activador de plaquetas, productos que tambin exhiben una variedad de efectos fisiolgicos.

Figura 1. Reaccin catalizada por las PLA2. Liberacin de un cido graso desde la posicin sn-2 de un glicerofosfolpido.

Las PLA2s de venenos de serpiente pertenecen a los grupos IA, IIA y IIB. Estas protenas inducen diversos efectos, entre los cuales se incluyen neurotoxicidad pre y/o

posinptica, miotoxicidad local y/o sistmica, anticoagulacin, cardiotoxicidad, modulacin de la agregacin plaquetaria, actividades hemoltica, edematizante e hipotensora y dao directo en rganos como el rin, pulmn e hgado (2). Aunque es claro que no todas las PLA2s de venenos de serpiente tienen la capacidad de inducir todos los efectos mencionados. Estas enzimas tienen la particularidad de no actuar eficientemente sobre un sustrato en solucin, lo hacen mejor un sustrato agregado (fosfolpidos de membrana), por esta razn stas protenas se conocen como enzimas interfaciales (actan sobre su sustrato en la interfase lipido:agua que se encuentra sobre la membrana celular). Adicionalmente, estas enzimas son dependientes de Ca2+ para su actividad enzimtica. En esta prctica utilizaremos yema de huevo como fuente de fosfolpidos agregados y como fuente de enzima usaremos veneno de serpiente. Para cuantificar la actividad enzimtica se extraern los cidos grasos liberados despus de accin de la enzima y se titularn con NaOH usando azul de timol como indicador.

Materiales

Bao Mara.

Micropipetas (10-100, 100-1000) l.

Pipetas volumtricas 2 ml, 5 ml.

Plancha de agitacin y calentamiento.

Reactivos

Buffer (Tris-HCl 0.1M, CaCl2 0.01M pH 8.5).

Yema de huevo.

Mezcla de extraccin (Isopropanol:Heptano 8:2).

Hidrxido de sodio (0.01 N).

Mezcla de titulacin (Azul de Timol 0.1% en agua y posterior dilucin 1:10 en Etanol 96%).

Solucin acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.

Triton 100 X.

Seccin Experimental

En un tubo de ensayo adicionar 1 ml del sustrato de yema de huevo.

Luego agregar 0.1 ml de la solucin de muestra problema.

Llevar al bao mara e incubar a 37C por 15 min

Retirar del bao mara y agregar 5 ml de mezcla de extraccin y agitar fuertemente.

Agregar 2 ml de hexano a cada tubo.

Adicionar 3 ml de agua a cada tubo e invertir la mezcla unas 3 veces.

Tomar 2 ml de la fase superior y pasarlos a un tubo de ensayo limpio.

Agregar 1 ml de la mezcla de titulacin.

Titular con el NaOH 0.01 N adicionando con micropipeta de a 10 l, hasta viraje a un color amarillo verdoso.

Calcular los Eq-g de cidos grasos generados con base en los l de NaOH gastados, por unidad de tiempo y de masa de enzima. Expresar los resultados en actividad

enzimtica Eq/min/mg Enzima.

Resultados

NaOH x Normalidad de NaOH = Eq NaOH = Eq cidos grasos

Eq /15 min /Miligramos toxina

Preguntas

Adems de buscar inhibidores de PLA2 que se unan al sitio activo de la enzima (competitivos), podemos investigar inhibidores que bloqueen la enzima en otros aspectos, cuales?

Estas enzimas tienen en su superficie aminocidos bsicos, si usamos fosfatidilcolina (Zwiterion) o fosfatidilserina (anin) para cuantificar su actividad enzimtica, sobre cual sustrato obtendremos el resultado mayor?

Podemos medir la actividad enzimtica de la enzima sobre fosfolpidos no agregados?

Bibliografa

Dole VP. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. J. Clin. Invest 2000; 35, 150-154.

Kini RM. Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom phospholipase A2 enzymes. Toxicon. 2003.42: 827-840.

Schaloske RH, Dennis EA. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 2006; 1761: 1246-1259.

PRCTICA # 8 GLUCLISIS ANAEROBIA: FERMENTACIN ALCOHLICA




5-324

Objetivos Determinar las diferentes velocidades en la fermentacin de mono, di y

polisacridos.

Determinar el efecto de la concentracin del azucar en el proceso de fermentacin.

Comprobar la inhibicin de la ruta metablica ocasionada por el NaF.

Aspectos Tericos El metabolismo es el conjunto de reacciones y procesos fsicoqumicos que ocurren en una clula. Estos procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular, y permiten las diversas actividades de las clulas: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estmulos, entre otras. El metabolismo se divide en dos procesos acoplados: catabolismo y anabolismo. En el primero se llevan a cabo reacciones de degradacin de compuestos macromoleculares que conduce a la liberacin de energa. Mientras que las reacciones anablicas usan la energa liberada en el catabolismo para sintetizar nuevos compuestos qumicos que resultan ser vitales para la clula. Una de los procesos catablicos ms importantes es la glucolisis. Esta ruta metablica es una de las principales fuentes de energa en la gran mayora de organismos, ya que los carbohidratos son usados como un alimento fundamental. La glucolisis consta de 10 reacciones y esta dividida en dos fases, la primera se conoce como la fase de preparacin y la segunda como la fase de ganancia. La gluclisis conduce a piruvato, no obstante, el destino final de este varia dependiendo del organismo y la presencia y/o ausencia de oxigeno en el medio. En el ser humano, cuando se realiza gluclisis en condiciones anaerbicas (ausencia de O2), el piruvato es convertido a lactato (fermentacin lctica), sin embargo si la clula humana realiza este proceso en condiciones aerbicas (Presencia de O2), el piruvato es oxidado a acetil coenzima A, la cual posteriormente entra al ciclo de Krebs para producir equivalentes reductores que finalmente sern usados en la cadena transportadora de electrones para generar energa qumica en forma de ATP. Por otro lado, en algunas bacterias y levaduras, cuando la glucolisis es llevada a cabo en ausencia de oxigeno, el piruvato es oxidado a etanol, proceso que se conoce como fermentacin alcohlica (Figura 1).

El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas tales como vino, la cerveza, la sidra, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. En la prctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y polisacridos), midiendo la cantidad de CO2 que se va generando en el tiempo.

Materiales

Tubos de ensayos.

Beakers.

Bao Mara.

Manguera.

Agujas de jeringa.

Probeta 25ml.

Tapones para tubos de ensayo.

Soporte universal.

Reactivos Levadura fresca al 10%.

Glucosa al 10% y 30%.

Fructosa al 30%.

Sacarosa al 30%.

Almidn al 1%.

NaF 0.1M.

Agua destilada.

Glucosa

2Piruvato

2Lactato 2 Etanol

2Acetil CoA

2 CO2 2 CO2

Sin O2 Sin O2 O2

Seccin Experimental

1. Adicione a un tubo de ensayo 2ml de solucin de glucosa al 10% colquelo en un bao de agua a 35-37 C durante 2 minutos y luego aada 5ml de la suspensin de levadura.

2. Tape el tubo de ensayo con un tapn de caucho, agite y atraviese el tapn con la aguja de jeringa desechable.

3. Monte el sistema mostrado en la siguiente figura:

Nota: La probeta se llena con agua, se tapa con el dedo pulgar, se invierte y se sumerge en el beaker con agua. La probeta debe contener agua, hasta donde termine la marcacin.

4. Apenas comience a burbujear cronometre 15 minutos y lea en la probeta el volumen desplazado. Tenga en cuenta el volumen inicial y rsteselo al volumen final.

5. Repita los pasos anteriores con: glucosa, fructosa, sacarosa y almidn y en diferentes porcentajes P/V.

6. Adicione a un tubo de ensayo 5ml de suspensin de levadura, 2 ml de solucin

glucosa al 10% y 1ml de agua destilada y repita los pasos desde el segundo hasta el cuarto.

7. Por ultimo, coloque en un tubo de ensayo 5ml de suspensin de levadura, 2ml

de solucin de glucosa al 10% y 1ml de la solucin de NaF y repita los pasos desde el segundo hasta el cuarto.

8. Anote los datos en la siguiente tabla.

Carbohidrato Glucosa

1% Tubo 1

Glucosa 10%

Tubo 2

Fructosa 10%

Tubo 3

Sacarosa 10%

Tubo 4

Almidn 1%

Tubo 5

Glucosa 10% con

agua Tubo 6

Glucosa 10%con

NaF Tubo 7

Volumen

Residuos Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos, dispngalos por el desage. Resultados

Compare los volmenes obtenidos en los tubos 1 y 2 A que se debe el resultado?

Escriba la reaccin neta balanceada de la fermentacin de cada uno de los carbohidratos.

Segn las ecuaciones del numeral anterior, Dnde ocurrir la mayor produccin de CO2? Esta ello de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente? Explique (Compare los volmenes de los tubos 2, 3, 4 y 5) y ordene los carbohidratos segn la rapidez en la fermentacin.

Cmo interpretara el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentacin? (compare los tubos 6 y 7).

Preguntas

En que consiste la fermentacin lctica y glicrica? En que diferencian de la fermentacin etanlica?

El arsenato (AsO4-3) es qumicamente similar al fosfato inorgnico (PO4

-3) y algunas enzimas que utilizan fosfato inorgnico pueden utilizar tambin arsenato. La produccin de ATP en la glucolisis es inhibida por el arsenato identifique las enzimas que pueden ser afectadas.

Adems de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis Cules son?

Enumere algunos inhibidores de la glicolisis.

Bibliografa Movak M, Strehaiano, P, Moreno M, Goma G. Alcoholic fermentation: On the

inhibitory effect of ethanol. Biotechnol. Bioeng. 1981; 23: 201-211.

David Nelson, Michael Cox. Lehninger Principios de Bioqumica. Quinta Edicin. Ediciones Omega S.A. Barcelona, Espaa. 2009. Traduccin de: David Nelson, Michael Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Fifth edition. W.H. Freeman Company. New York, United States. 2009.

PRCTICA # 9 ELECTROFORESIS DE PROTENAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA




5-324

Objetivo Comprender e identificar los conceptos bsicos, tericos y prcticos, relacionados

con la separacin de protenas a travs del mtodo de electroforesis

Aspectos Tericos El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas cargadas elctricamente a travs de un gel u otro tipo de matriz en un campo elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas poseen carga elctrica, cuya magnitud depende del pH y composicin del medio en que se encuentren. Con tcnicas electroforticas, es posible separar de acuerdo a su tamao o masa molecular los diferentes componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otras biomolculas cargadas. Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin. La electroforesis de protenas se realiza en geles, la ms comn es la poliacrilamida (PAGE, del ingls Polyacrylamide gel electrophoresis). La PAGE se desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad de dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos, unin a receptores, etc.). Otra modalidad de electroforesis, es la desnaturalizante, ms comn, donde se somete a las protenas a migracin asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms empleado es el dodecilsulfato de sodio o SDS, un detergente, el cual otorga una carga neta negativa a la protena que les permite migrar a travs del gel de poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo una relacin carga/masa similar. Una tercera forma de realizar la electroforesis de protenas, es desnaturalizarlas y posteriormente ponerlas en contacto con un agente reductor, que provoca la ruptura de los puentes disulfuro. Esta metodologa permite

evidenciar si la protena problema esta formada por de una cadena polipeptdica y se conoce como electroforesis en condiciones reducidas. En esta prctica se pretende separar las protenas del suero fetal bovino tanto en condiciones desnaturalizantes como reducidas.

Materiales Cmara de electroforesis vertical y accesorios.

Micropipetas de 20, 200 y 1000 L.

Gradillas de plstico.

Reactivos Solucin de poliacrilamida al 12% .

Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 .

Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8.

Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% .

Persulfato de amonio (APS) al 10% recin preparado.

N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solucin stock).

Agua destilada.

Buffer de muestra.

Azul de coomasie R-250.

Agente Fijador.

Agente decolorante. Nota: Precaucin, la acrilamida y bisacrilamida como monmeros son potentes neurotoxicos acumulativos que se absorben rpidamente por la piel, no pipetear con la boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.

Seccin experimental

Armar la cmara de electroforesis ensamblando el molde para el gel utilizando vidrios de 0.75 mm de espesor, segn las especificaciones del profesor.

Mezclar en dos tubos los reactivos para la preparacin del gel separador y espaciador en las cantidades descritas con excepcin del persulfato de amonio, que se agrega en el momento antes de adicionar los geles.

Primero preparar el gel INFERIOR o de separacin.

COMPONENTES CONCENTRACIN FINAL CANTIDADES

EN l 20% 15% 12% 10%

Agua desionizada

367 1167 1683 2000

Amortiguador inferior

1250 1250 1250 1250

SDS 50 50 50 50

Acrilamida/ bisacrilamida

3333 2500 2000 1667

TEMED 6 6 6 6

Persulfato de amonio

30 30 30 30

El volumen que se adiciona a cada uno de los tubos es de 3600 l

sta mezcla gelifica aproximadamente en 30 a 45 minutos.

Preparar el Gel superior o de apilamiento.

COMPONENTE CANTIDAD Agua desionizada 1500 l

Buffer superior 630 l

SDS 33 l

Acrilamida/ bisacrilamida 330 l TEMED 5 l

Persulfato de amonio 20 l

Se coloca inmediatamente el peine para formar los pozos donde posteriormente ser sembrada la muestra. Esta mezcla gelifica aproximadamente en 30-40 minutos. Una vez gelificado se procede a quitar el peine deslizndolo suavemente y se lava delicadamente con agua destilada para eliminar algunos residuos no gelificados.

o Ensamblar la cmara segn las instrucciones del profesor.

o Sembrar 20 l de la muestra a evaluar y 10 l de marcador de peso

molecular.

o Llenar la cmara con el amortiguador de corrida 1x: 180 ml en el tanque interior y 120 ml en el exterior. Colocar el gel en la cmara y correr las muestras a 120 V (voltaje constante) hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60 min).

o Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. Sacar el gel y eliminar la parte del gel espaciador.

o Colocar los geles en una solucin fijadora por media hora.

o Teir el gel con colorante Coomassie, sumergindolo durante 1 hora con

agitacin constante. Luego se elimina el exceso del colorante con varios cambios de decolorante.

o Registrar los resultados fotografiando el gel.

Preguntas Cul es la influencia de:

o El pH del gel de apilamiento sobre la calidad de las bandas. o La concentracin de monmero en el gel de separacin sobre la

capacidad para diferenciar dos protenas con pI muy parecidos.

Bibliografa

Lomonte B, Rojas L. Inmunologa manual de laboratorio. Universidad de Costa rica. Facultad de Microbiologa, 1996.

Manual de Laboratorio

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