Manual Laboratorio Biotecnologia

MANUAL DE LABORATORIO

BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

INTRODUCCIN

La Biotecnologa es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de ndole mundial en

los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En pases como Colombia,

donde la inversin en investigacin es muy precaria; los aportes e iniciativas de

investigacin y desarrollo en el rea de la Biotecnologa Alimentaria, indudablemente,

contribuirn en brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen

muchas poblaciones de este y otros pases del mundo.

Dentro de las herramientas ms valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero

Agroindustrial y de Alimentos para suplir las necesidades de progreso cientfico,

tecnolgico y de Ingeniera, se encuentra la Interaccin armnica de los diferentes

aspectos de la Biotecnologa Alimentaria; para ello es indispensable la formacin de

profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniera en los procesos

biotecnolgicos realizados en la industria de Alimentos.

El desarrollo de la biotecnologa industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los

diferentes renglones de la economa nacional. Entre las industrias de alimentos que

generan o consumen productos biotecnolgicos se encuentran: las cerveceras y

malteras, productos lcteos fermentados, panificadoras, jugos y nctares, industrias

vincolas y licoreras, etc. La poltica nacional de ciencia y tecnologa, en uno de sus

programas orientados a fortalecer la competitividad del sector productivo y su insercin

en el mercado mundial, reconoce que los adelantos cientficos en biologa molecular y

biotecnologa han tenido gran impacto en los sistemas de produccin; y por ello es

prioritario el fomento a las investigaciones y a la formacin de nuevos profesionales en

estas reas.

Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniera de Alimentos y otras

Ingenieras o reas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue

diseado con mucho esmero y dedicacin para complementar y demostrar en el

laboratorio los referentes tericos discutidos previamente en el aula de clases. Surge,

entonces como una herramienta pedaggica que fortalecer el proces de enseanza-

aprendizaje en el desarrollo de programas acadmicos relacionados con la Biotecnologa

Alimentaria.

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRCTICAS MICROBIOLGICAS EN EL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA

Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen

procesos biolgicos microbianos, est expuesto a recibir cualquier clase de infeccin,

dependiendo del microorganismo con el que entre en contacto, ya sea directamente o por

contaminacin cruzada. Para prevenir este tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con

las normas de bioseguridad dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad

son una recopilacin de los procedimientos de laboratorio ms esenciales que constituyen

la base de tcnicas microbiolgicas y biotecnolgicas apropiadas; stas son

fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse, en ningn

momento, con equipos especializados; ya que estos no sern ms que un complemento para

facilitar el trabajo y en algunos casos para disminuir la exposicin a sustancias

peligrosas.

Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se trabaje con

material microbiolgico se clasifican en: De orden personal, de orden del laboratorio y de

orden del trabajo microbiolgico.

a) DE ORDEN PERSONAL:

Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera del mismo.

Las prendas contaminadas se deben esterilizar antes de lavarlas.

No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc. en los

mesones de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello.

Dentro del laboratorio no se permitir al personal comer, beber, fumar ni aplicar

cosmticos.

Se debern lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como tambin, despus

de haber manipulado material contaminado y/o infeccioso.

No se deber pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se colocarn en la

boca

No se llevar calzado sin puntera o que no sea cerrado.

No se debe hacer uso de pauelos o bata de laboratorio para limpiar objetos o

instrumentos de trabajo.

No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida, quemadura o rasguo en

las manos o antebrazos; estas deben ser tratadas inmediatamente.

Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contrado alguna

enfermedad como consecuencia del trabajo.

Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos;

se utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales.

No se deber pipetear con la boca; se deben usar pipetas automticas, pera de goma o

auxiliar de pipeteo.

b) DE ORDEN DEL LABORATORIO:

Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas slo en caso de emergencia.

No permitir la entrada de nios a las zonas de trabajo

No debe haber material que no tenga relacin con el trabajo

Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores

Las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn al menos una vez al da y en

caso de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente peligrosas.

No olvidar cerrar la vlvula del gas al terminar cada jornada de trabajo.

La seal internacional de riesgo biolgico debe colocarse en las puertas de los locales

en donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.

c) DE ORDEN DEL TRABAJO MICROBIOLGICO

Estudiar, con anterioridad, las tcnicas y protocolos de las prcticas y experimentos

de laboratorio; esto evitar confusiones y dinamizar el trabajo.

Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metdica; evitando

movimientos y gasto de energa innecesarios.

Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones. Esto

evitar contratiempos desagradables por la prdida de datos importantes.

El material de trabajo (Caldos de fermentacin, cepas, medios, etc) deben ser

tocados, nicamente, con instrumentos estriles; nunca con material contaminado y

mucho menos con las manos.

Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y despus de cada jornada.

Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con papel

absorbente impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de 15 minutos.

Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodn que sirva como

filtro para proteger a la muestra y al manipulador.

Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas, esptulas,

pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones desinfectantes.

El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales para su

posterior esterilizacin.

Al depositar lquidos, virtalos por las paredes.

Recuerde que siempre se debe adicionar cidos al agua y nunca agua a los cidos,

porque ocasiona salpicaduras peligrosas.

No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorizacin

Las asas deben esterilizarse antes y despus de usarse flamendolas en la llama del

mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensin y luego dejarla enfriar por

espacio de 20 segundos cerca de la llama.

Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este ltimo

Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y despus que introduzca

asas o pipetas

Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o est

sembrando

Trabaje lo ms cerca posible al mechero.

RECUERDE SIEMPRE!

Las improvisaciones son el primer paso para un accidente

En todo momento est consciente de lo que hace

En caso de un accidente, acte rpidamente sin perder la calma

Pregunte al profesor si no est seguro de lo que va a hacer

Tenga mucho sentido comn

EXPERIMENTO N 1

TCNICAS PARA MEDICIN DE BIOMASA

1. INTRODUCCIN:

El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los

constituyentes qumicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares,

conduce a un aumento del nmero de individuos en la poblacin.

Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una poblacin (ciclo

celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento

de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo continuo.

Para determinar el nmero total de clulas de un cultivo, el mtodo de eleccin es el

recuento microscpico directo. Para clulas de levadura, puede emplearse un

hemocitmetro. Es necesaria una ampliacin de 100X a 400X para visualizar la cmara de

recuento y las clulas en suspensin. Para clulas bacterianas se usa frecuentemente una

cmara de Petroof-Hauser o una de Neubauer y una ampliacin de 1000X a causa del

pequeo tamao de las bacterias. El recuento microscpico directo tiene la ventaja de

que permite observar directamente la morfologa de las clulas estudiadas. Las

morfologas aberrantes o atpicas podran indicar unas condiciones subptimas de

crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados.

El mtodo ms usado para medir el crecimiento microbiano es secar volmenes conocidos

de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de

clulas que sedimentan rpidamente, como las levaduras, esto usualmente implica

centrifugacin de muestras del cultivo en tubos de centrfuga prepesados. Para clulas

bacterianas difciles de concentrar por centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran

a travs de membranas hidroflicas con un tamao de poro de 0,2 m.

Otro mtodo muy utilizado es el de determinacin de biomasa por densidad ptica. Se

aprovecha la proporcionalidad de la densidad ptica a la masa celular, cuando no se tienen

en el medio de fermentacin otros slidos en suspensin. Este mtodo se basa en la Ley

de Beer y Lamberty; en este caso, se asume que la absorcin del rayo incidente es

proporcional a la concentracin de clulas presentes.

2. OBJETIVO:

Desarrollar la habilidad para medicin la biomasa microbiana que interviene en los

bioprocesos a travs del conocimiento de las tcnicas ms utilizadas para este fin.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:

a) Materiales

Cmaras de Neubauer

Microscopios

Estufa

Desecador

Balanza analtica (6 cifras decimales)

Espectrofotmetro

Centrfuga

Pipetas graduadas

Pipetas automticas

Auxiliar de pipeteo

Beakers

Erlenmeyers

Tubos para centrfuga

Pinzas

b) Reactivos

Cultivo de Levadura

Agua destilada

Solucin salina isotnica estril (0,85%)

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparacin del cultivo madre:

Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces

cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estril.

4.2. Preparacin de las soluciones problema:

En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de levadura a

partir del cultivo madre, as:

TUBO 1 2 3 4 5 6

ml de agua 10 8 6 4 2 0

ml de cultivo 0 2 4 6 8 10

Cada dilucin de levadura ser medida con las siguientes tcnicas:

4.3. Medicin de la biomasa microbiana por conteo directo en cmara de Neubauer:

Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeo (0,1 0,3 mL) con la

pipeta automtica. Depositar una alcuota en la superficie pulida de la cmara de

Neubauer cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensin entrar en la cmara por

capilaridad. Una cmara llenada adecuadamente contiene clulas slo en el espacio

contenido entre el cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que se

deposite en los surcos.

Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el

enrejado con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para contar las levaduras se

utiliza el cuadro central (Ver figura 1). El cuadro central est sealado con un crculo y

contiene 25 cuadros, cada uno rodeado por un borde de tres lneas. Cada uno de los 25

cuadros a su vez contiene 16 cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo

que se hagan visibles tanto las lneas como las clulas. Se deben contar las clulas que se

encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los cuatro de las esquinas y el del centro).

El cuadro central (marcado con el crculo) tiene un rea de 1 mm2 y una profundidad de

0.1 mm.

Tenga en cuenta los Siguientes aspectos:

Para aquellas clulas que estn tocando las lneas de los bordes, slo cuente aquellas

que estn en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitar que se

repita el conteo.

Si cuenta ms de 50 o menos de 20 clulas por cuadro, repita la toma de muestra o

cambie la dilucin que est usando.

Limpie la cmara con agua destilada estril y squela con gasa o algodn despus de

cada lectura.

Figura 1. Cmara de Neubauer

4.4. Medicin de la biomasa microbiana por densidad ptica:

Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa rosca una dilucin de

cada una de ellas de tal forma que la concentracin final de solutos no sobrepase las

1000 ppm. (mxima concentracin de slidos ledas por el espectrofotmetro)

1 mm

1 mm

Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotmetro a 540 nm.

4.5. Medicin de la biomasa microbiana por peso seco celular:

Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales de

levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda de una

pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a evaporacin en

estufa el agua restante a una temperatura de 90C durante 20 horas. Pese los tubos y

vuelva a evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:

Calcule y reporte la concentracin de cada una de las diluciones problemas (clulas/ml,

Absorbancia y gr de clula/L) .

Elabore una grfica de No Clulas/ml vs Absorbancia. Calcule el valor de R2

Elabore una grfica de gr de clulas/L vs Absorbancia. Calcule el valor de R2

Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin de la biomasa

microbiana.

Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las tcnicas utilizadas en el

experimento.

Qu son los colorantes supravitales y para qu se usan?

UNIVERSIDAD DE SUCRE

PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGA

EXPERIMENTO N 2

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO

DNS (cido 3,5 - dinitrosaliclico)

1. INTRODUCCIN:

Este mtodo nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en

los tambin llamados azcares reductores. Esto involucra la oxidacin del aldehdo

presente en el grupo funcional. Simultneamente, en presencia de calor el cido 3,5-

dinitrosaliclico (DNS) se reduce a cido 3-amino,5-nitrosaliclico bajo las condiciones

alcalinas, desarrollndose un color amarillo caf:

oxidacin

grupo aldehdo grupo carboxilo

reduccin

DNS cido 3-amino,5-nitrosaliclico

Se adiciona sulfito (no necesario para la reaccin del cambio de color) en el reactivo para

absorber el oxgeno disuelto, ya que ste puede interferir con la oxidacin de la glucosa.

En la reaccin se muestra que una mol de azcar reaccionar con una mol de DNS. Sin

embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometra de la

reaccin es mucho ms complicada que lo previamente descrito. El tipo de reaccin

lateral depende de la naturaleza exacta del azcar reductor. Diferentes azcares

reductores arrojan distintas intensidades de color ; as, se hace necesario calibrar para

cada azcar. Adems de la oxidacin de los grupos carbonilos en el azcar, otras

reacciones laterales como la descomposicin de azcar tambin compiten para la

disponibilidad del cido 3,5-dinitrosaliclico. Como consecuencia, la carboxymetil celulosa

puede afectar la curva de calibracin alterando la intensidad del color desarrollado.

Este es un mtodo conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es

relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraos no son conocidos, uno

puede incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en

muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azcar se adiciona a esta

muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a

la cantidad incrementada de azcar. Altas concentraciones de protena interfieren en la

determinacin de los azcares reductores. Otra de las ventajas de este mtodo es que el

color final desarrollado es estable hasta 24 horas, es sencillo y rpido.

2. OBJETIVO:

Aplicar una tcnica sencilla, rpida y eficaz para determinar azcares reductores en

caldos y medios de fermentacin que permitan conocer los rendimientos en sustrato y/o

productos.


a) Materiales

Tubos de ensayo tapa rosca

Pipetas de 1, 5 y 10 ml

Pipeteador automtico

Auxiliar de pipeteo

Matraz aforado de 1000 ml

Frasco color mbar

Espectrofotmetro

Vortex

b) Reactivos

Solucin del cido 3,5 dinitrosaliclico, 1% :

o DNS: 10 g

o Fenol: 2 g

o Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g

o Hidrxido de sodio: 10 g

o Aforar a 1 litro con Agua destilada

Conservar refrigerado dentro del frasco color mbar.

Solucin estndar de glucosa :

Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada, conservar en

refrigeracin hasta el momento de usarla.

4. PROCEDIMIENTO:

Establecer una escala estndar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de tubos de

ensayo, previamente lavados y sumergidos en solucin de cido sulfrico al 5%

durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de solucin estndar y

completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla al momento de

registrar los datos:

Tubo ml. de s/n

estndar

ml. de agua

destilada

Concentracin

final (ppm)

Absorbancia

(575 nm)

1 0.0 1.0 0 -

2 0.2 0.8 200 -

3 0.4 0.6 400 -

4 0.6 0.4 600 -

5 0.8 0.2 800 -

6 1.0 0.0 1000 -

La determinacin de azcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra

convenientemente diluida. La curva estndar y las muestras sufren las siguientes

operaciones:

Adicionar 1 ml del reactivo DNS

Agitar fuertemente en un vortex

Poner a ebullicin durante 5 minutos

Enfriar rpidamente (bao de hielo)

Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo

Agitar fuertemente en un vortex

Leer absorbancia a 575 nm.


Grafique la curva de calibracin (Concentracin vs Absorbancia) para la determinacin

de azcares reductores con el mtodo del DNS. Muestre todos los resultados

obtenidos. Calcule el valor de R2.

Calcule la concentracin en azcares reductores (Glucosa) de la muestra problema.

Consulte otros mtodos utilizados para la determinacin de azcares reductores y

glucosa. Qu ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnologa?

ADVERTENCIA!

El reactivo DNS es altamente txico, cancergeno y abortivo. Mucho cuidado al

manipularlo. Usar siempre guantes de ltex.

6. REFERENCIAS:



BIOTECNOLOGA

EXPERIMENTO N 3

DETERMINACIN DE ETANOL POR EL MTODO DE WINNICK

1. INTRODUCCIN:

La determinacin de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la

fermentacin alcohlica es una de las principales preocupaciones del biotecnlogo; ya que

ste es un anlisis que requiere de una dotacin adecuada de equipos de medicin o, por

otro lado, de una cantidad considerable de volumen de muestra, como en el caso del

mtodo de destilacin.

El mtodo de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol etlico a

travs de la accin oxidante de la solucin 0.4 N de dicromato de potasio en cido

sulfrico 10N, posterior valoracin con Tiosulfato de sodio.

Se diluye la muestra de forma que la cantidad de dicromato utilizada sea suficiente para

oxidar todo el etanol, formando acetaldehdo; de otra manera debe repetirse la prueba

usando una mayor dilucin de la muestra.

El exceso de dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de Tiosulfato de

sodio gastado en titulacin se emplea para determinar el porcentaje de etanol en la

muestra teniendo en cuenta la respectiva dilucin. Las reacciones que se manifiestan en

el proceso son:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O

K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I

2Na2S2O3 + 2I Na2S4O6 + 2NaI

2. OBJETIVO:

Aplicar una tcnica rpida y sencilla para la determinacin de alcohol etlico en caldos de

fermentacin alcohlica que pueda ser usado en determinaciones de velocidad de

reaccin.


a) Materiales:

Microburetas

Soporte universal

Erlenmeyers de 50 ml

Balones aforados de 250 y 500 ml

Pipetas de 1, 5 y 10 ml

Balanza

Beakers

Varillas de agitacin

b) Reactivos:

cido Sulfrico 10 N

Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N

Solucin de Yoduro de potasio 3N (KI)

Solucin reactivo de almidn soluble

Tiosulfato de sodio 0.1 N+

4. PROCEDIMIENTO:

a) Preparacin de Reactivos:

CIDO SULFRICO 10N:

Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua destilada

hasta aforar a 500 ml.

ADVERTENCIA ! : Se presenta una reaccin altamente exotrmica; por lo que se debe

adicionar lentamente el cido al agua (nunca lo contrario). Hacer esto con el baln sumergido en bao de agua con hielo. Al enfriarse la solucin, se produce una

contraccin de volumen que se debe corregir adicionando ms agua destilada hasta

alcanzar el volumen final.

DICROMATO DE POTASIO 0.4 N EN H2SO4 10 N:

Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100C durante 4-6 horas y

disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.

SOLUCIN DE YODURO DE POTASIO 3 N:

Disolver 49.8 gr. De yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y aforar en un

baln de 100 ml.

SOLUCIN REACTIVO DE ALMIDN SOLUBLE:

Pesar 1 gr. de almidn soluble. Verter lentamente con agitacin constante en 200 ml de

agua destilada hirviente. Hervir hasta obtener un lquido ligero y translcido. Dejar

decantar y usar nicamente el lquido sobrenadante.

En un recipiente limpio y bien tapado, esta solucin puede durar hasta dos meses. El

reactivo es propenso a contaminarse con hongos.

TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N:

Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solucin.

b) Determinacin:

Realizar una curva patrn en tubos de ensayo con tapa que contengan 5 ml. de las

siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% de etanol. A stas diluciones y a la

muestra se someten al siguiente proceso:

Realizar una dilucin 1:9 (muestra: agua) para cada tubo.

Adicionar exactamente 1 ml de solucin de Dicromato de potasio 0.4 N en H2SO4 10 N

dentro de un erlenmeyer pequeo (20-50 ml).

Adicionar 2 ml de la solucin a estudiar

Dejar en reposo durante 5 minutos

Transcurrido el tiempo, adicionar 1 ml de solucin de yoduro de potasio 3N y mezclar.

Adicionar 2 gotas de solucin de reactivo de almidn soluble.

Titular con solucin volumtrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitacin cuidadosa

hasta obtener un cambio ntido hacia un color azul marino.

Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de construir la

curva de calibracin.


Grafique la curva de calibracin para las diluciones de alcohol realizadas. Calcule el

valor R2 y muestre la ecuacin que explique la curva.

Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva de

calibracin.

Consulte otros mtodos para determinar alcohol etlico. Explique las ventajas y

desventajas para su uso.

6. REFERENCIAS:



BIOTECNOLOGA

EXPERIMENTO N 4

EVALUACIN DE CULTIVOS LCTICOS

1. INTRODUCCIN:

Las Bacterias lcticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en la leche a

cido lctico, como es el caso de Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Esta capacidad bacteriana puede ser explotada industrialmente para obtener productos como el Yogurt y el Kumis. El Yogurt es un producto obtenido por la

simbiosis entre el Lactobacillus bulgaricus y Streptococos thermophylus; los cuales se pueden obtener de la leche desnatada concentrada por evaporacin.

Una de las etapas ms importantes del proceso de obtencin del producto fermentado es

el cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolcticas responsables del proceso

de acidificacin. Este cultivo consta exclusivamente de especies termoflicas; que para

el caso del yogurt son : L. bulgricus y St. Thermophylus. El cultivo no debe contener especies no termoflicas. La produccin de cada una de las especies vara a lo largo del

proceso; al comienzo es de 1:1 a 2:5. Durante la incubacin se favorece el desarrollo de

St. Thermophylus hasta el punto de alcanzar una proporcin de 5:1 que se equilibra nuevamente al final del proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el aroma caracterstico del yogurt.

2. OBJETIVO:

Conocer y evaluar la fabricacin de cultivos lcticos utilizados en la industria del yogurt a

travs de un seguimiento en el comportamiento de la acidez, el pH, relacin cocos/bacilos

y rendimientos (YP/S , YX/S) a intervalos regulares de tiempo.


a) Materiales:

Balanza

Frascos tapa rosca de 250 ml

Erlenmeyer de 500 ml

Pipetas de 5 y 10 ml

Pipetas de 1 ml

Tubos de ensayo

pHmetro

Bureta

Bao Mara

Cmara de Neubauer

b) Reactivos:

NaOH 0,1 N

Fenolftaleina 2%

Azul de metileno

Leche descremada en polvo

Cultivo Lctico de Yogurt

Agua destilada estril

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparacin del Cultivo.

En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo descremada (8%,

12%, y 16%)

Pasteurizar en bao mara a 80C por 30 minutos.

Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuacin:

Volumen total x % deseado

gr de Leche = -----------------------------------------

100 - % de Humedad Leche P.

Volumen de agua = Volumen deseado - gr de leche en polvo

Enfriar a 43 C.

Inocular cada concentracin con 3% de cultivo de yogurt. AGITAR BIEN!

Incubar a 43 C por 3 horas. NO AGITAR!

Refrigerar a 4 C por 2 horas. NO AGITAR!

4.2. Actividad Del Cultivo Madre:

Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.

Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas de

fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color rosa plido

por 30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de cido lctico:

ml NaOH gastado x 0,1N x meq-gr cido lctico

% cido Lctico = --------------------------------------------------------------- x 100

ml muestra

4.3. Relacin Cocos Bacilos:

Realizar conteo en cmara de Neubauer cada 60 minutos y observar la relacin coco -

bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul de metileno en la dilucin

para colorear las bacterias)

4.4. Rendimientos ( YX/S, YP/S) :

Realizar los balances de masa respectivos y encontrar los rendimiento de Sustrato en

biomasa (YX/S) y sustrato en producto (YP/S), considerando que para una concentracin

de 12,5 % de slidos existen 4,7% de lactosa.


Grafique el incremento de slidos Vs acidez.

Grafique el incremento de slidos Vs pH

Grafique el incremento celular de cada bacteria en funcin del tiempo

Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y muestre los

rendimientos globales de la fermentacin. Compare resultados.

Qu problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto porcentaje, en

productos como el yogurt?

Qu efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de slidos dentro de un cultivo

lctico?

6. REFERENCIAS:



BIOTECNOLOGA

EXPERIMENTO N. 3

EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE VINO DE FRUTAS

1. INTRODUCCIN:

La historia de la fermentacin se remonta ms all de nuestros conocimientos. El

hombre, tal como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha, aparece en la

escena con una jarra de vino. Su realidad vincola se aproxima ms a nuestra experiencia

de vida con la expansin de la dominacin griega, iniciada 1000 aos a. C., fue entonces

cuando el vino lleg por primera vez a los pases en los que se sentara su verdadero

hogar: Italia y Francia. Los ltimos noventa aos han presenciado la revolucin industrial

de los licores y, sobre todo, en los ltimos 25 aos el fundamento cientfico de la

elaboracin de los licores ha clasificado la situacin de tal modo que tcnicas que antes

parecan imposibles hoy son fciles de realizar.

Los microorganismos que intervienen en la fermentacin del vino son principalmente

levaduras del gnero Saccharomyces, y dentro de este gnero, la especie que ha sido tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae. Var. Ellipsoideus

La fabricacin del vino ms que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta comnmente

ms usada, tambin pueden usarse muchas otras frutas como los melocotones, ciruelas,

manzanas y duraznos para la fabricacin de vinos. Los procedimientos de fabricacin del

vino de uva casero son bastante sencillos. Simplemente se inocula el jugo de la uva con un

cultivo iniciador de levaduras adquirido en un supermercado. La fermentacin primaria

tarda aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayora del azcar

originalmente presente en el jugo se convierte en etanol por accin de las clulas de

levadura, al mismo tiempo se produce dixido de carbono. El exceso de clulas de

levadura son posteriormente removidas del mosto de uva junto con otros sedimentos, y

una fermentacin secundaria ms lenta permite desarrollar el sabor final del vino. Puede

adicionarse azcar (sacarosa o glucosa) para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol

deseado o para modificar el sabor del vino. El tipo de vino puede ser clasificado segn el

color del vino. Otra clasificacin est basada en el contenido de azcar presente en el

producto final, como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Clasificacin de vinos segn el contenido de azcar.

TIPO DE VINO GRAVEDAD ESPECFICA CONT. DE AZCAR (%P/P)

Vino Seco 1.085 1.100 21 25

Vino semi dulce 1.120 1.140 29 33

Vino Dulce 1.140 1.160 33 - 37

2. OBJETIVO:

Evaluar el efecto del contenido de azcar (Fructosa) en el proceso de la fermentacin

del vino de frutas.


a) Materiales:

Fermentador estril de 1 L. (Erlenmeyer)

Manguera estril

Gasa estril

Cinta de enmascarar y bistur

Rollo de papel aluminio

Beaker de 500 ml

Colador

Mortero grande

Pipetas estriles de 1, 5 y 10 ml.

Bao mara

Tubos de ensayo estriles

b. Reactivos:

4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, pia, maracuy

Fructosa

Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae) Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio

Agua destilada

4. PROCEDIMIENTO:

Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 15 Brix) y sanidad. Lavar la uva con

abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta. Macerar manualmente

(Usar guantes) en un recipiente grande para sacar el jugo de la uva (mosto).

Curar el fermentador, previamente limpio y estril, con sulfuroso. Pesar 1 gr. de

Azufre y cubrirlo con un pedazo de algodn alrededor de una varilla delgada. Quemar

el azufre y flamear en el interior del fermentador con los gases sulfurosos para

evitar la posterior contaminacin del vino. Evitar un exceso de sulfuroso en el

fermentador que pueda alterar las caractersticas organolpticas. En su defecto, se

puede usar Metabisulfito de sodio al 1,5% para el curado del fermentador

esparciendo esta solucin por toda la superficie del recipiente.

Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relacin 2:1 (Mosto :

Agua). Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada ensayo y agitar.

(Ver tabla).

Sacar la muestra inicial y determinar: Azcares reductores, %Alcohol, pH y Acidez.

Ensayo Conc. de Fructosa adicionada (gr/L)

1 50

2 100

3 200

Pasteurizar el mosto en bao mara a 65C durante 20 minutos. Agitar suavemente 2 o

3 veces para distribuir el calor.

Enfriar en bao de hielo hasta temperatura ambiente (28 30C)

Inocular el mosto con un preinculo de Levadura S. Cerevisiae para vino (2%). . Adicionar al fermentador y agite hasta disolver.

Tapar el fermentador con la gasa estril (Bien ajustada) y conectar la manguera como

se muestra en la figura.

Permitir que se realice la fermentacin primaria por un periodo de 8 das.

Luego de los 8 das, realizar un frotis del velo de crecimiento y colorear con azul de

lactofenol, observe la morfologa; realice una siembra en agar malta; incube durante 5

das a temperatura ambiente y anote los resultados obtenidos.

realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en el fondo

del fermentador, evitar la agitacin) a otro fermentador en las mismas condiciones de

esterilidad y curado.

Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentacin secundaria

por un periodo de 8 das ms. Realizar otro Frotis para observar la morfologa

microbiana.

MONTAJE DEL FERMENTADOR PARA LA PRODUCCIN DE VINO

TAPN O GASA MANGUERA ESTERIL

MOSTO AGUA DESTILADA

FERMENTADOR

Al cabo de los 8 das, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar por 2

semanas ms.

Filtrar el vino obtenido, lo ms higinicamente posible con ayuda de un papel filtro y

utilizando una bomba de vaco.

Pasteurizar a 65C por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4C.

Degustar el vino y anotar sus caractersticas sensoriales.

Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su envejecimiento.

Determinar en cada trasciego: Azcares reductores, porcentaje de alcohol etlico,

pH y acidez expresada en cido lctico.

NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentacin debe estar

previamente estril para evitar una contaminacin. Utilice siempre el mechero para sacar

las muestras.


A travs de un grfico de barras analice los resultados obtenidos entre la

concentracin de azcar adicionada Vs. Porcentaje de alcohol obtenido.

A travs de un grfico de barras analice los resultados obtenidos entre la

concentracin de Azcares reductores Vs. %Alcohol.

Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Yp/s) puntuales y globales de cada

ensayo. Analice los resultados.

Realice los balances de masa de cada proceso y calcule los rendimientos de cada uno.

Incluya costos - beneficios.

Cmo evitar la contaminacin por bacterias acticas en la produccin industrial de

vino?

Cules son los principales defectos fsicos de los vinos?

Qu anlisis organolpticos le hara a un vino?

Qu diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional?

Qu exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?

6. REFERENCIAS:



BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

EXPERIMENTO N 6

CINTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EN FERMENTACIN BATCH

SUMERGIDA

1. INTRODUCCIN:

El conocimiento de la cintica del cultivo permite predecir el desarrollo de la

fermentacin y evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseo

de estrategias de produccin y optimizacin de procesos. Las clulas consumen los

nutrientes requeridos para crecimiento y los convierten en nuevas clulas y productos

metablicos. La velocidad de estos procesos vara con el desarrollo del cultivo. A medida

que las clulas crecen se acumulan en el medio los productos finales del metabolismo

celular. Frecuentemente, estos componentes alteran el pH y la reologa del medio;

factores decisivos sobre la actividad celular y los mecanismos de transporte.

El procedimiento apropiado para una fermentacin batch es, primero que todo, inocular

un frasco pequeo de caldo nutriente con un cultivo puro; ya sea de una caja de petri,

tubo de cultivo lquido o tubo inclinado con agar slido. El frasco inoculado debe agitarse

constantemente a temperatura controlada. Una vez alcanzada la fase de crecimiento, se

inocula una pequea cantidad de medio de cultivo de este frasco a otro de mayor volumen.

Este proceso se repite una o dos veces ms con el objetivo de adaptar la cepa microbiana

a las condiciones y nutrientes del medio a utilizar en el estudio de la cintica

fermentativa. Un proceso similar se lleva a cabo a nivel industrial, de tal manera que se

van aumentando los volmenes de medio para, finalmente, ser inoculado al fermentador

de mayor volumen.

Cuando se trabaja con cultivos puros, se debe operar con el cuidado de evitar la

contaminacin que puede presentarse por cualquier exposicin al aire, agua, tacto, etc.;

de tal manera que, todo elemento que entre en contacto con el interior del fermentador

debe ser previamente esterilizado.

2. OBJETIVO:

Estudiar la cintica del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en fermentacin batch sumergida y determinar experimentalmente los parmetros cinticos de la ecuacin de

Monod.


a) Materiales:

Erlenmeyer de 1L

Agitador magntico

Manguera de venoclisis estril

Jeringas desechables de 5 ml

Tapones de caucho con orificios

Balanza analtica

Tubos de ensayo previamente secos por 24 horas.

Bistur

Silicona

b) Reactivos:

Levadura (Saccharomyces cerevisiae) C6H12O6 (Glucosa anhidra)

NaNO3

K2HPO4

MgSO4.7H2O

KCl

FeSO4.7H2O

CaCl2

(NH4)2SO4

4. PROCEDIMIENTO:

a) Preparacin del preinculo:

Inocular aproximadamente 2 gr. de levadura en 300 ml de medio de cultivo (diseado

segn necesidades nutricionales de la levadura y utilizando los nutrientes disponibles).

Agitar. Incubar a 28-30 C por 18 24 horas.

c) Diseo, Formulacin y preparacin del medio nutriente:

Agitador magntico

Utilizando la composicin de una levadura tpica y la disponibilidad de los nutrientes

antes mencionados, disear el medio de crecimiento que ser utilizado para la

produccin de 8 gr de levadura /L de medio. (Traer clculos listos).

Introducir los nutrientes en un fermentador (erlenmeyer) de 1 L, adicionar agua

destilada hasta completar 720 ml (Tener en cuenta el 2% de prdidas en la

esterilizacin). Agitar muy bien con una varilla de vidrio; si es necesario, se debe

calentar un poco mientras se agita.

Tapar el fermentador con una gasa y esterilizar en autoclave a 121C, 15 PSI durante

15 minutos.

c) Inoculacin y Fermentacin:

Inocular el fermentador con 80 ml de preinculo (10% del volumen final). Realizar

este paso lo ms aspticamente posible.

Instalar los accesorios del fermentador aerobio; (ver figura).

Realizar la fermentacin a 28 C, 300 rpm, y 1,5 vvm (Volumen de aire por volumen de

medio por minuto) durante 36 horas continuas.

Determinar cada 2 horas: Peso seco celular (X) y Concentracin de Glucosa (S).

MONTAJE DEL FERMENTADOR BATCH

Muestreo

Trampa de

gases

Bomba de

Aire


Graficar Log. [X] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento.

Graficar [S] Vs. Tiempo. Analizar el comportamiento.

Determinar experimentalmente los parmetros cinticos de la ecuacin de Monod:

Velocidad especfica de crecimiento (max.), Constante de saturacin (Ks) y el

rendimiento de sustrato en biomasa (Yx/s).

Aplicar los mtodos integral y diferencial (utilizar las relaciones lineales de

Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee) de anlisis del modelo de Monod en la

fase exponencial del crecimiento microbiano.

Qu se entiende por crecimiento diuxico?. Explique.

NOTAS:

Lleve todos los materiales necesarios para el experimento: Bata, tapaboca, gorro,

alcohol, algodn, mangueras, silicona, jeringas, bistur, etc.

Siempre tenga presente la prudencia dentro del laboratorio y no olvide las normas de

bioseguridad: No comer, no fumar, no dormir, mantener la calma ante situaciones de

peligro y actuar siempre con conciencia...

Trabaje en orden y mantenga siempre limpio y despejado su lugar de trabajo; evite la

contaminacin visual y auditiva.

Organice previamente con sus compaeros la distribucin de espacios y tiempos en el

trabajo prctico. Lleve una tabla organizada de registro de datos y distribuyan

homogneamente los turnos de trabajo.

6. REFERENCIAS:




EXPERIMENTO N 7

EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE VINAGRE DE FRUTAS

(FERMENTACIN ACTICA)

1. INTRODUCCIN:

La fermentacin actica es la oxidacin del alcohol etlico a cido actico por bacterias

que tienen esta capacidad y muestran un alto rendimiento como el Acetobacter aceticum, A. Schuzenbachii y A. Curvum. El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se obtiene mediante la fermentacin por oxidacin de una solucin diluida de etanol. El

proceso metablico se basa en la conversin, bajo accin de la alcohol deshidrogenasa, en

acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en cido actico por la accin de la

acetaldehdo deshidrogenasa:

C2H5OH ---- CH3CHO + H2O CH2CH(OH)2 ---- CH3COOH + H2O

Consecuentemente se requieren 2 etapas; una anaerobia de produccin de etanol con

levaduras y otra aerbica para su oxidacin con Acetobacter sp. El vinagre es descrito como un producto derivado por fermentacin con un contenido mnimo de 4% (p/p) de

cido actico y caracterstico sabor derivado de la materia prima utilizada. As existen

vinagres de frutas, miel, malta, vino, sidra, etc; siendo los tres ltimos los ms comunes.

Como producto de partida para su obtencin se recomienda el etanol, que se obtiene por

fermentacin de las levaduras como Saccharomyces cerevisiae. En la segunda fase el alcohol producido es oxidado por las bacterias acticas formndose cido actico, poco

aldehdo, steres y acetona que le comunican sabor.

En los procesos modernos, se emplean casi que exclusivamente, como materia prima,

alcoholes baratos que proceden de industrias de fermentacin o alcohol etlico sinttico

en solucin acuosa de 4 a 11 volmenes, enriquecido con melaza de caa o remolacha,

fuentes inorgnicas, oligoelementos y biocatalizadores.

2. OBJETIVO:

Evaluar el proceso de obtencin de vinagre de frutas (Pltano, banano o mango),

realizando un seguimiento a sus variables ms importantes: Alcohol, acidez, pH, Aireacin

y examen microscpico.


a) Materiales:

Licuadora

Cuchillos

Coladores

Recipientes grandes

Frasco de vidrio con tapa (Fermentador)

Gaza

Beakers

Erlenmeyers de 100 ml

Pipetas estriles de 1, 5 y 10 ml

Portaobjetos

Buretas

pHmetro

60 cm de manguera de 1/2 de dimetro.

b) Reactivos:

Pltanos, bananos y mangos bien maduros (4 Kg. de cada uno)

NaOH 0,1N

Fenolftalena

Sobre de levadura (Saccharomyces cerevisiae)

Cepa de Acetobacter sp.

Reactivos para determinar alcohol

2. PROCEDIMIENTO:

Seleccionar frutas con un alto ndice de madurez, libres de enfermedades y ataque de

insectos.

Licuar, a baja velocidad, la fruta que ha sido previamente lavada y pelada hasta

obtener 3 litros de zumo. Si es necesario, adicione agua en relacin 2:1 (Zumo:Agua).

Pasteurizar los 3 litros de zumo de fruta a 65C por 20 minutos. Enfriar a 28 -30C

en un bao de hielo a 4C. Uno de los grupos debe trabajar con la flora nativa de la

fruta; por lo tanto no debe pasteurizar, como tampoco inocular.

Diluir 2 gr. de levadura comercial en 300 ml de mosto, agitar bien.

Inocular la dilucin de levaduras en el resto del mosto, agitar bien. Determinar la

concentracin de alcohol, acidez expresada en cido actico y pH inicial.

Realizar un orificio de 1 pulgada de dimetro a la tapa del fermentador, introducir la

manguera de desfogue y rellenar el espacio con gasa bien ajustada. Realizar una

trampa de gases. Tapar bien el fermentador y permitir que ocurra la fermentacin

alcohlica durante 8 das a 28-30 C.

Finalizado el tiempo de fermentacin alcohlica, determinar la concentracin de

alcohol alcanzada (debe estar entre 10 14%, si es necesario estandarice utilizando

alcohol etlico) , el pH final (debe estar entre 3-4, ajustar si es necesario).

Determinar estas variables cada 4 das una vez empezado el proceso.

Finalizada esta etapa, el lquido claro se transvasa e inocula con Acetobacter aceti. (diluir esta bacteria en un 5% del mosto y agitar bien).

Tapar el fermentador con una gasa para dejar entrar oxgeno al proceso. Permitir que

se d la fermentacin actica hasta alcanzar un 4-5% de cido actico

(aproximadamente 2 semanas).

Filtrar el vinagre obtenido con papel filtro o un cedazo fino y determinar %de acidez,

pH, alcohol residual y examen microscpico (realice un frotis de la Acetobacter en medio YGC).

Pasteurizar a 65C por 20 minutos. Enfriar inmediatamente en un bao de hielo a 4C.

Envasar en botellas de vidrio transparente previamente esterilizadas.


Graficar el desarrollo de: %alcohol, %acidez y pH Vs. Tiempo para cada etapa del

proceso (Fermentacin alcohlica y actica).

Calcule los rendimientos obtenidos para este proceso, segn la fruta utilizada.

Qu controles deben realizarse a lo largo del proceso de acetificacin y por qu?

Qu alteraciones pueden presentarse durante el proceso de elaboracin del vinagre

de frutas?. Cmo se pueden evitar estas alteraciones?. Explique.

Qu parmetros de calidad exige el ministerio de salud en materia de vinagre de

frutas?

6. REFERENCIAS:




EXPERIMENTO N 8

DETERMINACIN DEL COEFICIENTE VOLUMTRICO DE TRANSFERENCIA DE

OXGENO (KLa)

1. INTRODUCCIN:

En los procesos de fermentacin aerbicos es necesario un suministro adecuado de

oxgeno que satisfaga los requerimientos metablicos de los organismos empleados. La

oxidacin de la fuente de carbono y su transformacin en clulas, productos y CO2

establece una demanda de oxgeno que es esencial satisfacer a travs de la aireacin y

mezclado del cultivo. Es indispensable conocer los requerimientos de oxgeno del cultivo

para asegurarse de que su suministro sea suficiente.

En una fermentacin aerbica por lotes la masa celular y por consiguiente la demanda de

oxgeno aumenta exponencialmente. En estas condiciones generalmente no es posible

mantener constante la concentracin de oxgeno disuelto (CL) en el caldo de

fermentacin, por la necesidad de equilibrar la velocidad de demanda de oxgeno (VDO)

con la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) mediante la manipulacin de las

variables de operacin.

El oxgeno suministrado usualmente mediante burbujeo de aire al caldo es transferido

desde una burbuja hacia el lquido y luego hacia la pared celular y a travs de la pared.

La mayor resistencia a la transferencia de oxgeno se presenta en la superficie de

separacin gas-lquido entre la burbuja y el volumen del lquido. Este fenmeno se

manifiesta mediante una diferencia de concentraciones que limita la velocidad de

transferencia de oxgeno:

VTO = dCL / dt = KLa. (C* - CL)

Donde, VTO: velocidad de transferencia de oxgeno g/(litro. s) ; KLa : coeficiente

volumtrico de transferencia de masa, s-1 ; C* : Concentracin de oxgeno en el caldo, g/L

2. OBJETIVO:

Determinar y evaluar el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLa) en un

caldo de fermentacin con variaciones en la velocidad de agitacin utilizando el mtodo

dinmico de desgasificacin.


a) Materiales:

Fermentador de 1 Litro de capacidad

Medidor de oxgeno disuelto (Oxmetro)

Gasa

Mangueras para suministro y salida del aire

Jeringa para toma de muestras

Silicona

Cronmetro

Agitador magntico

Sistema de aireacin

Cmara de Neubauer

Microscopios

b) Reactivos:

Cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) Caldo de fermentacin (igual que en el experimento N6)

4. PROCEDIMIENTO:

Inocule en un 10% del volumen de fermentacin el preinculo de levadura (24 horas de

adaptacin) en el fermentador de 1L que contiene el caldo de fermentacin estril.

Realice el arreglo correspondiente de los accesorios del fermentador (mangueras,

tapn, agitador, suministro de oxgeno, etc).

Antes de accionar el suministro de aire, realice una lectura del oxgeno disponible con

el sistema agitado.

Suministre la mayor cantidad de aire posible (1-2 vvm). Espere que el sistema logre

estabilizarse en cuanto a la concentracin de oxgeno disuelto (10 minutos).

Asuma el tiempo cero y comience a medir cada 10 segundos el oxgeno disuelto

durante 10 minutos continuos.

Agitador magntico

Suspenda el suministro de aire y continu midiendo la misma variable (cada 5

segundos) hasta alcanzar una concentracin de oxgeno disuelto similar a la inicial

cuando el sistema no era aireado.

Reiniciar la aireacin y anotar inmediatamente (cada 5 segundos) la concentracin de

oxgeno disuelto hasta alcanzar la concentracin del tiempo cero.

Nota: Cada grupo de trabajo realizar la experiencia a una velocidad de agitacin

diferente: 300, 600 y 900 rpm.

MONTAJE DEL SISTEMA

Filtro

Sensor

Filtro

Trampa de

gases


Grafique CL Vs. Tiempo. Utilice todos los resultados continuos del proceso.

Calcule la velocidad de respiracin del cultivo [(O2).x].

Reporte las diferencias entre la transferencia de oxgeno hacia la solucin y la

demanda de oxgeno por la respiracin del cultivo [KLa.(C* - CL) - (O2).x].

Bomba de

Aire

OXMETRO

Calcule el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLa) para el cultivo

sumergido en fermentacin batch de la Saccharomyces cerevisiae en glucosa. Compare el resultado obtenido con el reportado en la bibliografa. Analice las

diferencias si las hay. Consulte las principales ventajas y desventajas que pueda tener este mtodo en

comparacin a los otros que ya usted conoce. Qu otros factores pueden alterar el valor del KLa en un sistema de fermentacin?.

Explique.

6. REFERENCIAS:




EXPERIMENTO N 9

OBTENCIN DE ENZIMAS (GLUCOAMILASA DEL A. niger)

1. INTRODUCCIN:

Cada microorganismo produce una gran variedad de enzimas, la mayora de las cuales slo

se fabrican en pequeas cantidades y estn implicadas en procesos celulares. Sin

embargo, algunos microorganismos producen ciertas enzimas en mayores cantidades y en

lugar de mantenerlas dentro de la clula, la excretan al medio. Habitualmente, las

enzimas extracelulares son capaces de digerir materiales nutrientes insolubles tales

como celulosa, protena y almidn, siendo transportados los productos de la digestin al

interior de la clula, en donde son utilizados como nutrientes para el crecimiento.

Comercialmente se producen enzimas, procedentes de bacterias y de hongos; el proceso

usualmente es aerbico. Generalmente la enzima se forma en pequeas cantidades

durante la fase activa de crecimiento, pero se acumula en grandes cantidades durante la

fase estacionaria del crecimiento.

El Aspergillus niger es un hongo filamentoso perteneciente a los Deuteromicetos (hongos imperfectos) y se encuentra presente en la microflora del aire. El A. niger es denominado comnmente Moho negro. Las especies de los Aspergillus producen

numerosas enzimas extracelulares muy utilizadas en biotecnologa.

Muchas especies de Aspergillus se desarrollan bien a 37C, siendo el rango global de

temperatura entre 25 37C. Estos mohos se desarrollan a concentraciones cidas altas

y variadas, pH entre 2 y 9, siendo 5,5 el ptimo. El A. niger es considerado un microorganismo GRAS (seguro) para la produccin de enzimas utilizadas industrialmente;

tales como: -amilasa, glucoamilasa, celulasa, pectinasa, catalasa, glucosaoxidasa,

proteasa y lipasa.

2. OBJETIVOS.

Obtener un extracto crudo de la enzima glucoamilasa a partir de una fermentacin batch

sumergida del Aspergillus niger .


a) Materiales.

Fermentador de 500 ml

Agitador magntico

Bomba de aire

Manguera de venoclisis y suministro de aire

Bistur

Guantes estriles

Gasa

Algodn

Silicona

Jeringa

Cmara de Neubauer

b) Reactivos

NaOH 0.1 N

HCl 0,1N

Solucin salina estril (0,85%)

Agua estril

Medio de crecimiento (descrito abajo)

4. PROCEDIMIENTO

a) PREPARACIN DEL MICROORGANISMO:

La cepa pura de Aspergillus niger debe ser repicada en agar PDA y/o Saboreau para su correspondiente masificacin y conservacin. Se incubar a 30C durante 4-5 das.

posteriormente, si no es utilizada de inmediato, se conservar en refrigeracin a 4 C

hasta el momento de usarse.

b) MEDIO DE CRECIMIENTO:

Para la produccin de la biomasa y de la enzima en estudio, el A. niger se har crecer en un medio lquido compuesto por:

- KNO3 2gr.

- KCl 0.5gr.

- MgSO4.7H2O 1gr.

- FeSO4 0.02 gr.

- Peptona 20 gr.

- Maltosa 20 gr.

- Agua destilada 1 L

- Tween 80 0.1 %

- Aceite 0.1%

- pH final 5.5

c) FERMENTACIN:

- La inoculacin al fermentador de 300 ml se realiza raspando suavemente una caja de

agar que contenga el hongo sobre una solucin salina isotnica estril; adicionndolo al

medio de cultivo antes mencionado en una concentracin del 10%. Tratar de alcanzar

una concentracin inicial de esporas del orden de 2 5 x 107 esporas/ ml, contadas en

cmara de Neubauer.

- Realizar el montaje del fermentador para un sistema aireado y agitado como se ha

construido en los experimentos anteriores. (300 rpm y 1.8 vvm).

- Permitir que ocurra la fermentacin por un periodo de 96 horas bajo las condiciones

antes anotadas. Tomar muestras cada 24 horas para rectificar el pH del medio

(Ajustar si es necesario utilizando base o cido).

- Despus de las 96 horas de fermentacin, determinar la concentracin de biomasa

lograda y filtrar el caldo de fermentacin con ayuda de una bomba de vaco; de tal

forma que se logre la separacin del micelio y del extracto de enzimas.

- Centrifugar el extracto obtenido a 2500 rpm x 15 minutos (previo enfriamiento a 4-

6C para evitar desnaturalizacin de la enzima). Descartar el residuo.

- Guardar el extracto en refrigeracin para determinarle su actividad enzimtica en el

prximo experimento.

ADVERTENCIA !

Tener mucho cuidado al manipular las esporas del hongo. Use siempre la bata, tapaboca y

gorro. Lvese bien las manos antes de salir del laboratorio.


Calcule los rendimientos de sustrato en producto obtenidos (Yp/s)

Calcule los rendimientos de sustrato en biomasa obtenidos (Yx/s)

Consulte qu otros microorganismos son utilizados para la produccin de glucoamilasa.

Consulte el diagrama de flujo utilizado a nivel industrial para la obtencin de esta

enzima.

Investigue en qu procesos es utilizada esta enzima.

6. REFERENCIAS:




EXPERIMENTO N 10

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y PARMETROS DE LA

ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)

1. INTRODUCCIN:

La bsqueda de informacin para encontrar informacin para determinar las propiedades

de las enzimas, para su uso a nivel industrial en el diseo de bioreactores es necesario

discriminar modelos que nos permitan calcular la velocidad intrnseca de reaccin, uno de

los modelos mas usados son los modelos de Michaelis Menten y Briggs y Haldane.

El mecanismo del modelo de Michaelis - Menten se puede describir de la siguiente

manera:

E : Enzima

S: Substrato

ES: Complejo enzima-substrato

P : Producto

K : Constantes de reaccin.

Cuando se mezcla la enzima mas el substrato, se forma un complejo ES e

inmediatamente, se rompe para formar E + S e E + P . Para Conseguir el modelo

matemtico, Michaelis - Menten se asume lo siguiente:

a El estudio se basa en velocidades iniciales, la concentracin de producto en este

caso puede ser considerada despreciable, de forma que la reaccin inversa prcticamente

ocurrir.

b la mezcla de enzima con el substrato ocurre la formacin de un complejo ES, que

permanece a una concentracin constante, 0][

dt

ESd

complementando tenemos:

1k

2k

3k

4kPE ESSE

03][2][4]][[1]][[][

KESKESKPEKSEdt

ESd

KmES

SE

K

KK

][

]][[

1

32

Nota: la constante Km, es la constante de Michaelis-Menten, puede ser

aproximadamente igual la constante de disociacin del complejo [ES], as la constante K3

es generalmente menor que K1 y K2, asi mismo:

1

2

1

32

K

K

K

KKKm

Por otro lado, el total de enzima que participa en la reaccin [Eo] es igual a suma de la

enzima libre [E] con una enzima en forma de complexo [ES], que ser:

ESEE0

Visto as K3 es menor que K1 e K2, la transformacin de ES en E + P ser la etapa

limitante del proceso, que es

03 EKv

De la misma forma, toda la enzima esta participando da reaccin, entonces la velocidad

de reaccin estar en su mximo:

03max EKv

entonces tenemos:

][

][

]][[][

]][[

][][

]][[

][

][

max SKm

S

Km

SEE

Km

SE

ESE

Km

SE

Eo

ES

v

v

][

][max

SKm

Svv

: Ecuacin de Michaelis-Menten

De esta ecuacin se tiene que:

Se [S] >> Km v = v max (reaccin de orden cero)

Se [S]

DNS

4. PROCEDIMIENTO:

Preparar 5 soluciones de maltosa con las siguientes concentraciones: 5%, 10%, 15%,

20% y 25% en biorreactores de 500 ml.

Estabilizar el pH a 4,3 con una solucin Buffer citrato; HCl o NaOH 0,1N;

dependiendo del pH inicial.

Estabilizar la temperatura de biorreaccin segn se asigne a cada grupo (25C, 45C y

65C).

Estabilizar la velocidad de agitacin segn se asigne a cada grupo (200, 400 y 600

rpm).

Realizar una dilucin en agua destilada (1:50) de la enzima glucoamilasa fngica a

utilizar (densidad 1,2 gr/ml).

Adicionar 1 ml de solucin enzimtica en cada biorreactor agitado continuamente bajo

las condiciones ambientales de cada trabajo.

Tomar, exactamente, 1 ml de muestra en los siguientes tiempos: 0, 5, 10, 15, 20, 25, y

30 minutos de biorreaccin.

Inactivar la enzima en agua hirviendo (100C) durante 5 minutos, posterior choque

trmico en bao de hielo (4C).

Determinar la concentracin de glucosa (Producto) presente en cada muestra

utilizando la tcnica del DNS.


Calcular la actividad enzimtica de la glucoamilasa fngica (A. niger) expresada en U.I

(cantidad de la enzima que produce 1 mol de glucosa/minuto) y en AGU (1 AGU es la

cantidad de enzima que fragmenta 1 mol de maltosa/minuto).

Calcular el nmero de recambio de la enzima (# molculas de sustrato transformadas

por unidad de tiempo por molcula de enzima).

Graficar la formacin de producto en funcin del tiempo ( [P] vs [t] ) y calcular las

velocidades iniciales para cada concentracin de sustrato.

Graficar las velocidades iniciales en funcin de cada concentracin de sustrato ( [Vel.]

vs [S] ).

Determinar los parmetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) utilizando los mtodos

de Limeweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Langmuir.

6. REFERENCIAS:



LABORATOIOS DE BIOTECNOLOGA

EXPERIMENTO N 11

DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY

1. INTRODUCCIN:

Las protenas reaccionan con el reactivo de Folin Ciocalteu para dar un complejo de

color azul (debido a la reaccin del cobre alcalino con la protena). La intensidad del color

depende del nmero de aminocidos aromticos y enlaces peptdicos presentes. El color

cambiar segn la clase de protena. La solucin azul muestra una absorbancia mxima a

750 nm.

Las variaciones por este mtodo pueden ser debidas por el pH, el tiempo de la reaccin,

la concentracin de los reactivos o las interferencias de sustancias como azcares y

productos celulsicos. En este mtodo el color no es estrictamente proporcional a las

concentraciones ms altas de protenas. Este mtodo es desaconsejable cuando las

muestras presentan un fuerte contenido de ligno celulosa y/o contienen fenoles;

adems, tiene un rango de linealidad entre 0 300 mg/L . Dentro de sus principales

ventajas est el permitir la medicin del contenido de protenas en fracciones

enzimticas, mediciones en mezclas de tejidos con protenas y mediciones de cantidades

muy pequeas de protenas o de soluciones muy diluidas.

2. OBJETIVO:

Ofrecer al estudiante una tcnica rpida y sencilla para la determinacin de protenas

enzimticas en caldos de fermentacin.


a) Materiales:

Espectrofotmetro

Balanza analtica

Agitador de tubos (Vortex)

bao de mara

Centrfuga

Tubos de ensayo

Gradillas

Pipetas de 1 y 5 ml

Balones aforados de 100 o 50 ml

Frasco de color mbar.

b) Reactivos:

Tartrato doble de Na y K.

Carbonato de calcio

Sulfato de cobre

Reactivo de Folin Ciocalteu

Seroalbmina bovina

Agua destilada

4. PROCEDIMIENTO:

Realizar una curva de calibracin de 0 a 300 mg/L. En 7 tubos de ensayo que estn

muy bien lavados, adicione: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ml de solucin de

seroalbmina bovina y completar a 1 ml con agua destilada.

A 1 ml de muestra, convenientemente diluida, y a cada tubo de la curva patrn,

adicionar 0,5 ml de NaOH 2 N y agitar en vortex.

Calentar sin agitacin en bao de mara a temperatura de ebullicin durante 10

minutos.

Enfriar en bao de hielo y adicionar 0,5 ml de cido sulfrico 2,6 N y agitar en vortex.

Adicionar 0,9 ml de solucin A y agitar en vortex. llevar a 50 C por 10 minutos y

posteriormente enfriar.

Adicionar 0,1 ml de solucin B y agitar en vortex; reposar en la oscuridad por 10

minutos. Adicionar 3 ml de solucin C y agitar en Vortex; llevar a 50 C por 10 minutos

y enfrar.

Leer la absorbancia a 750 nm.

4.1. PREPARACIN DE REACTIVOS:

Solucin A: Disolver o,5 g de tartrato de sodio y potasio en 12 ml de agua destilada y

25 g de carbonato de sodio en 125 ml de NaOH 0,1N.

Solucin B: Disolver 1 g de sulfato de cobre en 90 ml de agua destilada y 20 g de

tartrato de sodio y potasio en 10 ml de NaOH 1N.

Solucin C: Diluir el reactivo de Folin-Ciocalteu con agua destilada en relacin 1:14 al

momento de usarlo.


Grafique la curva de calibracin (linealizada) para la determinacin de protenas por el

mtodo de Lowry. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.

Calcule la concentracin de protenas en la muestra problema.

Consulte otros mtodos utilizados para la determinacin de protenas en extractos

enzimticos. Qu ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnologa?.

6. REFERENCIAS:




EXPERIMENTO N 12

AISLAMIENTO DE ENZIMAS POR PRECIPITACIN

CON SULFATO DE AMONIO

1. INTRODUCCIN:

El aislamiento de enzimas es un proceso de fundamental importancia en biotecnologa

alimentaria, especialmente cuando tenemos disponibles caldos o extractos donde se

encuentran solubilizadas varias protenas enzimticas extradas de una misma clula

microbiana. La solubilidad de una protena depende de la cantidad presente y de la

concentracin de la sal presente en la solucin. A concentraciones bajas, la presencia de

sal estabiliza varios grupos cargados de la molcula de protena, atrayendo as protenas

a la solucin y aumentando la solubilidad de la protena. Esto es comnmente conocido

como Salting-in. Sin embargo, cuando la concentracin de sal es aumentada, se alcanza un punto de mxima solubilidad de la protena . Adems, si se incrementa la

concentracin de sal, esto implicar que menos agua habr disponible para la

solubilizacin la protena. Finalmente, la protena comienza a precipitar cuando no hay

suficientes molculas de agua para interactuar con las molculas de protenas. Este

fenmeno de precipitacin en presencia de sales en exceso es conocido como Salting-Out.

Muchos tipos de sales han sido empleadas para efecto de separacin y purificacin de

protenas. De estas sales, el sulfato de amonio ha sido la ms ampliamente utilizado

debido a su alta solubilidad y bajo costo. Como las enzimas son protenas, la purificacin

puede ser llevada a cabo siguiendo el mismo procedimiento de una protena; pero se debe

poner mucha atencin para evitar la perdida de la actividad enzimtica por

desnaturalizacin bajo condiciones adversas.

2. OBJETIVO:

Recuperar enzimas por precipitacin con sulfato de amonio a partir de soluciones que las

contengan.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

a) Materiales:

Tubos ependorf

Pipetas

Balanzas

Centrifuga

Buretas

a) Reactivos:

Solucin de enzimas

Solucin saturada de Sulfato de amonio (NH4)2SO4

4. PROCEDIMIENTO:

Para la solucin saturada de sulfato de amonio: Adicione 750 g de sulfato de amonio a

1000 ml de agua destilada en un beaker; agite la solucin a la temperatura del

laboratorio con un agitador magntico durante 15 minutos hasta saturacin. Deje

decantar el sobrenadante despus que los slidos no disueltos hayan sedimentado. No

es necesario filtrar.

4.1. Aislamiento de Fungal Glucoamilasa.

Realice la lectura de la absorbancia de la solucin de enzima a utilizar en un

espectrofotmetro a 577 nm. de longitud de onda. Esta medida ser usada en el

calculo del rendimiento de recuperacin de la enzima.

Pipetear 4 ml de la solucin de glucoamilasa cuya concentracin debe estar en 20 g/L

de la enzima.

Adicione por goteo lento, mientras agita, solucin de sulfato de amonio saturada hasta

que se empiece a formar un precipitado. Realice la lectura del volumen de sal gastado

Es importante evitar la no uniformidad de la concentracin de la sal durante su

adicin. Concentraciones localizadas o puntos muertos podran iniciar

prematuramente la precipitacin de otras protenas y afectar la pureza de la protena

a cristalizar. Es de anotar que la precipitacin de la protena no es instantnea, y esta

podra llegar a requerir de 15 a 20 minutos para alcanzar el equilibrio.

Centrifugar la mezcla a 10000 rpm por 15 minutos. Recolecte el precipitado muy

cuidadosamente, descargando el sobrenadante lentamente con ayuda de una pipeta. En

caso que los cristales de la enzima precipitados al adicionar la sal no sean demasiado

pequeos, se puede obviar la centrifugacin y proceder con una filtracin.

Reconstituya la solucin original de la enzima adicionando 4 ml de agua destilada al

precipitado. Esta agua puede ser adicionada as : Primero 2 ml y agite para redisolver

el precipitado, transfiera la mayor cantidad posible de esta solucin en otro tubo

limpio. Contine lavando el primer tubo con otro ml de agua y adicinelo tambin en el

segundo tubo donde reposan los 2 ml. Finalmente, adicione el resto de agua para

completar los 4 ml en este tubo.

Mida la absorbancia de la solucin de enzima reconstituida con un espectrofotmetro

a 577 nm. de longitud de onda

4.2. Aislamiento De Proteasas:

Proceda de igual forma que en el asilamiento de la fungal glucoamilasa; excepto que

debe adicionar 4 ml de una solucin de Proteasa y el sobrenadante puede ser retirado

por centrifugacin.


Del volumen de sulfato de amonio saturado adicionado a la solucin de protena para la

precipitacin, calcule la concentracin en trminos de porcentaje de saturacin.

A partir de la absorbancia leda antes y despus del aislamiento, calcule el porcentaje

de la enzima recuperada.

Consulte otros mtodos para el aislamiento de enzimas. Ventajas y desventajas.

6. REFERENCIAS:

- JAKOBY, W.B. Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and

Related Techniques, in Methods in Enzymology; Vol. 22; Jakoby, W.B, Academy Press,

1971.




EXPERIMENTO N 13

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS CON

ALGINATO DE SODIO

1. INTRODUCCIN:

El mtodo de atrapamiento de enzimas en alginatos es el mtodo ms simple de

inmovilizacin. Los alginatos son disponibles comercialmente como alginatos de sodio

solubles en agua. El Alginato, comercialmente est disponible como cido algnico, sal de

sodio y comnmente llamado Alginato de sodio, es un polisacrido lineal aislado

normalmente desde algas marinas, de all el nombre de Alginato. El coopolimero consiste

de dos cidos urnicos: cido D- Mannurnico (M) y Acido L- Gulurnico, que es el

componente de los esqueletos de las algas, y tiene propiedades fuertes y flexibles.

El cido algnico puede ser soluble o insoluble en agua dependiendo del tipo de sal

asociada, en sales de sodio, lcalis metlicos y amonio es soluble, mientras que en sales de

cationes polivalentes Ej. Calcio, es soluble con excepcin del magnesio. Los cationes

polivalentes son los responsables del entrecruzamiento de las molculas polimricas. El

proceso simplemente cambia iones calcio por iones sodio

2 Na(Alginato) + Ca++ -------> Ca(Alginato)2 + 2 Na+

El enlace inico que forma la estructura del gel es termoestable sobre un rango de 0 a

100 C; sin embargo es fcilmente redisuelto por inmersin del gel de Alginato en una

solucin conteniendo altas concentraciones de sodio, potasio y magnesio.

Manteniendo la relacin sodio: calcio 25:1 ayuda a la desestabilizacin del gel, en todo

caso se recomienda incluir iones de calcio 3 mM en el sustrato. Por otra parte, bferes

de citrato o fosfato pueden causar desestabilizacin del gel de Alginato. El Alginato es

ampliamente usado en los productos alimenticios, farmacuticos, textiles y la industria

del papel. Por las propiedades del Alginato es utilizado como espesante, estabilizante,

formacin de geles y formacin de pelculas

2. OBJETIVO:

Inmovilizar enzimas utilizando la tcnica de inmovilizacin por atrapamiento con Alginato

de sodio.


a) Materiales

Beakers

Probeta Graduada

Balanza

Pipetas

Gotero o jeringa

Agitador de vidrio

b) Reactivos

Alginato de sodio

CaCl2

Enzimas

4. PROCEDIMIENTO:

Prepare una solucin de 2 al 4% (W/W) de Alginato de sodio con una solucin buffer

apropiada para el funcionamiento de la enzima. Adicione Alginato de sodio en polvo a

agua en agitacin y no al contrario para evitar la formacin de grumos, contine con

la agitacin hasta completa disolucin, deje en reposo por 30 minutos para eliminar

burbujas de aire que puedan quedar atrapadas posteriormente y producir flotacin de

las esferas formadas.

Preparar una solucin de cloruro de calcio (CaCl2 .6H2O) 0.15 a 0.2 molar

Disolver de 15 a 20 mg de enzima en 1.0 ml del buffer preparado para la enzima.

Disolver esta cantidad de enzima En 50 mililitros de solucin de Alginato.

Las perlas o esferas se forman por goteo de la solucin de Alginato ya sea por gotero

o jeringa a una altura suprior a 20 cm sobre la superficie de la solucin de cloruro de

calcio previamente agitada ( ver figura) , el tamao de las perlas depender de la

presin que se ejerza sobre el Alginato por el equipo que produzca el goteo; el tamao

parea estas condiciones es de aproximadamente de 0.5 a 2 mm de dimetro.

Mantenga la agitacin de la solucin por 20 30 minutos. antes de filtrar las perlas.

Lave las perlas con una cantidad apreciable del buffer apropiado

Mantngalas en un lugar fresco bajo condiciones de esterilidad para su posterior uso.


Es posible la utilizacin de Alginato en la inmovilizacin de clulas?, explique las

ventajas y desventajas.

Explique un modelo terico que explique la perdida de actividad Enzimtica en la

utilizacin de enzimas inmovilizadas

Cmo determinara usted experimentalmente la perdida de Actividad Enzimtica en

la inmovilizacin de enzimas?

6. REFERENCIAS:

S. Ohlson, P.-O. Larsson, and K. Mosbach, Steroid transformation by living cells

immobilized in calcium alginate, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 7, 103, 1979. J. Vaija, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 7, 51, 1982. J. M. Lee and J. Woodward, Biotech. Bioeng., 25, 2441, 1983. F. Gordon, immobilization of encimes and cells, Methods in Biotechnology, Humana

Press, 1977




EXPERIMENTO N 14

EVALUACIN EXPERIMENTAL DEL CALOR GENERADO POR METABOSLIMO

MICROBIANO

1. INTRODUCCIN:

Las clulas consumen los sustratos que proveen la energa y las materias primas

requeridas para la sntesis de nueva masa adicional. La energa libre de las sustancias

nutritivas utilizadas es mayor que la de las clulas y productos del metabolismo. Las

clulas utilizan eficientemente la energa qumica, pero, como en todos los procesos

reales, parte de la energa disponible en el sustrato es liberada como calor.

El balance de energa de un proceso es uno de los aspectos importantes de la

Biotecnologa Alimentaria por la necesidad de mantener una temperatura ptima para

crecimiento o para formacin de productos. El calor generado por metabolismo o calor de

reaccin puede calcularse a partir de una serie de mediciones de la temperatura media

del caldo de fermentacin en un reactor operado en condiciones inestables y realizando

el respectivo balance de calor en el sistema (Aproximacin de Uhlich). El biorreactor

puede ser un tanque provisto de agitacin, intercambiador de calor y sensor de

temperatura. Las prdidas de calor por radiacin y evaporacin son despreciables.

2. OBJETIVO GENERAL:

Realizar el balance de energa en un proceso de fermentacin discontinuo operado en

estado inestable y evaluar experimentalmente el calor generado por la actividad

metablica durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en una fermentacin batch sumergida.


b) Materiales:

Biorreactor de 6 Litros, tipo batch con agitacin mecnica y serpentn de

enfriamiento.

Bao termostatado con recirculacin de agua.

Termmetros

Soportes

Mangueras para recircular el agua

Erlenmeyer de 500ml

c) Reactivos:

Cepa de Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Medio de crecimiento (Diseado y formulado por el estudiante)

Agua destilada

Glucosa

Sulfato de Amonio

Fosfato de Potasio

Sulfato de Sodio

4. PROCEDIMIENTO:

Realizar, con buenas prcticas microbiolgicas, un preinculo (600 ml) con el mismo

medio que va a ser utilizado para la fermentacin. Incubar por 18-24 horas. La

frmula emprica de la levadura a utilizar es: CH1.64N0.16O0.52P0.01S0.005.

Realizar el montaje del biorreactor de 6 litros con sistema de agitacin mecnica,

aireacin, serpentn de enfriamiento, termmetros y adaptado al bao termostatado

con recirculacin de agua. (Ver figura).

Inocular el preinculo al caldo de fermentacin en un 10% del volumen final a trabajar

en el experimento (5400 ml de caldo + 600 ml de preinculo).

Iniciar el bioproceso en condiciones estables, (dT/dt)=0, activando todos los sistemas

que intervienen (Agitacin 300 rpm, recirculacin de agua a la temperatura inicial del

caldo). Tomar la lectura de temperatura cada 5 minutos durante los primeros 40

minutos. Ir graficando la temperatura registrada en funcin del tiempo (Ver grafica).

Esta primera etapa corresponde al perodo comprendido entre t=A y t=B. El

intercambiador remueve el calor generado en el biorreactor. La ecuacin de balance

de energa aplicable en esta etapa del ensayo es:

QMET + QAG = QINT = FMa.CpA.(TFE TFA) (Ec. 1)

Donde,

QMET, QAG, QINT = Calor generado por metabolismo, calor generado por agitacin y

dispersin de gases y Calor intercambiado, respectivamente., (KW Kj/s).

FMa= Velocidad de flujo de masa de agua (Kg/s)

CpA = Calor especfico del agua (Kj/Kg.C).

TFE TFA = Temperaturas del agua efluente y afluente al intercambiador,

respectivamente, (C).

Desconectar el sistema de recirculacin de agua (Intercambiador). Realizar las

lecturas de temperatura cada 20 minutos durante 120 minutos. En esta etapa el calor

de intercambio es Cero (QINT =0), en el tiempo t=B, seguir graficando.

El calor generado por metabolismo se acumula en el sistema y la ecuacin de balance de

energa aplicable en esta etapa es:

QMET + QAG = QAC (Ec. 2)

QAC = V.CP.(dT/dt) =V.HR.rS (Ec. 3, Uhlich))

Donde:

QAC = Calor Acumulado en el Biorreactor (KW)

(dT/dt) = Variacin de la temperatura del caldo de fermentacin con el tiempo, (C/s). Es

la pendiente de la curva en le figura entre t = B y t = C.

CP = Capacidad calorfica global del biorreactor (4,228 Kj/LC)

V= Volumen del caldo (Litros)

rS = Velocidad de consumo del sustrato (Mol de C en sustrato/L.s)

HR = Calor de reaccin (Kj/mol de C en sustrato)

Finalmente, el intercambiador se conecta nuevamente en el tiempo t= c (Ver figura).

El calor acumulado en el reactor es removido del sistema y la ecuacin de balance de

energa aplicable en esta etapa del experimento, inmediatamente despus de t= c es:

QAC = QINT

La velocidad de consumo del sustrato se realizar cada 20 minutos utilizando la

tcnica del DNS para determinar glucosa.

Fig.1 MONTAJE DEL BIORREACTOR.

Motor (TFe) H2O Termmetro

(TFa) H2O

Aislante Trmico

Aire

Bomba de Aire

Temperatura (T)

A B C D

Tiempo (t)

Figura 2: Grfica Tiempo Vs. Temperatura


Realice el balance global de energa en el sistema. Consulte propiedades trmicas de

las sustancias y materiales de construccin utilizados.

Calcule el calor generado por la actividad metablica del microorganismo utilizado en

la fermentacin a travs de la ecuacin de Uhlich.

Grafique el comportamiento de la temperatura en funcin del tiempo durante cada

etapa del bioproceso.

Grafique el comportamiento del sustrato en funcin del tiempo.

Proponga otra metodologa para determinar el calor generado por la actividad

metablica de un microorganismo.

6. REFERENCIAS:

Manual Laboratorio Biotecnologia

Documents

Transcript of Manual Laboratorio Biotecnologia