Guia p. Bioquimica y Nutricion_1

ASOCIACIÓNUNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUIA DE PRÁCTICA

BIOQUÍMICA Y NUTRICION

TERCER CICLO

BIOQUIMICA Y NUTRICION Página 1

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO

1.2.

3.4.5.

6.

Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y responsabilidad.Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y distintivo de laUniversidad.Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros y cuadernos.Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las indicaciones de losprofesores de práctica sobre el uso del material y equipos de laboratorio, así como elorden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un único informe, el cualconsta de las siguientes partes:

--------

Carátula.Objetivos.Marco Teórico.Desarrollo Experimental.Discusión de los resultados.Conclusiones.Cuestionario.Bibliografía

Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y gruporespectivo.

7.

8.

9.

El inicio de la pràctica es en la hora exacta programada. Se tendrà una tolerancia de 10minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podrà ingresar al laboratorio, por lo tanto se leconsiderarà como una inasistencia y no tendrà derecho a nota de informe de pràcticas.Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los grupos,calificándose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que acumule 30% deinasistencias no tiene derecho a nota práctica.Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecerá a lo largo delsemestre académico.

10. Por mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará cargo del material yequipos recibidos así como de la presentación de los informes.

11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el responsable de mesainformará del hecho al profesor de prácticas, TODO GRUPO ES RESPONSABLE DELDAÑO CAUSADO, y deberá repararlo a la brevedad posible, no más de una (01) semanadespués del incidente.

12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el fin de entregarlo enlas mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso contrario se le descontará unpunto en la nota de informe a todo el grupo.

13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la persona encargada dellaboratorio.

14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendoarrojar todos los desechos al tacho de basura.


PRACTICA No 1

ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES:

Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos que sefundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solucióncoloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas ò que se han hecho de talcalidad mediante reacciones químicas adecuadas.

Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación quedaabsorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luztransmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.

Io

Luz incidente

It

Luz transmitida

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectivadeterminadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar. La longitud de onda en laque las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud demáxima absorción” o “lambda máximo”.

Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luztransmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del número de moléculas que seinterpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo con laconcentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores estànconsiderados en la “Ley de Lambert y Beer”, que rige los principios de la colorimetría y cuyasformas de expresión son:

Log (Io/It) = E. I. c = A = D.O.

Donde:Io = Intensidad de la luz incidente.It = Intensidad de la luz transmitida.

E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de lasustancia y de la longitud de onda

I = Espesor del recipiente en cm.C = Concentración de la solución.A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Tramitancia (T) y la relación entre

ambas es logarítmica.


CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un fotocolorímetro,existen dos formas:

--

a)

b)

Método de la curva standard o curva de calibración.Factor de calibración.

CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios standares deconcentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gràfico en un sistema decoordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y lasconcentraciones en las abcisas (Eje X). En la recta obtenida (Función lineal), se puedeextrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra problema, hallando laconcentración de la misma en el eje de las abcisas.

FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que serelaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la intensidadque absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).

Así tenemos:

Fc = [ Standard ] / A

Donde:Fc = factor de calibración.A = absorbancia del tubo standard.[Standard ] = concentración del standard.

Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una muestradesconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones) se podrá usardirectamente la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd) que esmatemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:


Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IVBicromato de potasio 1 ml 2 ml 3 ml 4 mlAgua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml

Concentración (mg %)

Dil = Vol mp / Vol t

Dónde:Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.Vol t = Volumen total.

Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra problema seprocederá usando la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc . Fd

Dónde:A mp = Absorbancia de la muestra problema.Fc = Factor de calibración.Fd = Factor de dilución.[ MP ] = Concentración de la muestra.

EXPERIMENTO

1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%.Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de lostubos.Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de onda (ג)en el espectrofotómetro.

2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de absorbancia vsconcentración de bicromato de K .

3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la muestra problema queel profesor le hará entrega.

4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones standard utilizadas paraconstruir las curvas de calibración ajustadas.

5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:--

Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.Analíticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de calibración del standard.


Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5Concentration 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dlAbsorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200

CUESTIONARIO:

1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.2.- ¿Què diferencias existen entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro?.3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivaslongitudes de ondas.4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Tramitación.5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:

Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo que susaborbancias fueron:

Muestra A........................0.015Muestra B........................0.125Muestra C........................0.350


PRACTICA No 2

LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS:SU CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO

HUMANO

FUNDAMENTO BIOQUIMICO:

Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho de que todos ellostienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducto como electrolitos.Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza acìdica y los grupos NH2

como de carácter básico.Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los aminoácidos como ionesdipolares y la conducta de ellos durante su titulación con ácido y álcalis de modo que secomportan como verdaderas sustancias tampones, amortiguadores ò buffers, para elsostenimiento del pH del medio interno dentro de estrechos límites (7.35 a 7.45).Explicamos también el comportamiento amortiguador del ion dipolar glicina al añadirleiones H+ o al añadirle OH- impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguíneo. Larepresentación de un aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiereque se trata de una sustancia en la que el grupo amino actúa como una base conjugada y elgrupo COOH como un ácido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulación no es lacorrecta del estado iónico de un aminoácido en solución acuosa. La verdaderarepresentación es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente: (Estructura A)

HR C COO-

Estructura (A) NH3

HR C COOH

Estructura (B) NH2

Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al pHfisiológico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es, como ióncarboxilato R-COO-; y al mismo pH, la mayoría de los grupos amínicos estánpredominantemente en la forma protónica R-NH3+

La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de los tejidos. Laestructura (B) no puede existir a ningún pH. La conveniencia nos enseña sin embargo quela estructura (B) se use por razones didácticas y para explicar la mayoría de las ecuacionesque entrañan reacciones distintas a las de los equilibrios protónicos. La contribución másimportante a la conducta de una proteína como electrolito procede de los grupos ionizablesexistentes en las cadenas laterales de los aminoácidos. La curva de titulación de unaproteína ò aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por el númerode cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades deaminoácidos. Por estas razones las soluciones de proteínas tienen una poderosa capacidadtampón.


Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas biológicos y hasido estudiada con especial cuidado con relación a los amortiguadores de la sangre humanacuyo pH es controlado dentro de estrechos límites, tal como les expliquè en la clase teórica.Les dije que los valores de pH sanguíneo varían dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45,cuando la sangre alcanza valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando losvalores de pH se elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otrosdos sistemas tampones que son:

1) El Sistema bicarbonato/Acido carbónico (pK: 6,1)2) El sistema fosfato monosòdico/disòdico (pK: 6,8)

La proteína más importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que tiene grancapacidad tampón en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su elevado contenido dehistidina (grupo imidazol) Aproximadamente el 60% de la capacidad tampón de la sangretotal se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las proteínas del plasma (seroalbùminas yglobulinas).Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una sustancia que alionizarse genera iones Hidrógeno, H+, una base es toda sustancia capaz de aceptar estosiones hidrógeno. Como los àcidos ceden protones y las bases los captan, a cada ácido lecorresponde, como es lógico, una base conjugada. Es decir, si un ácido cede un protón, elion, así formado, puede captarlo de nuevo comportándose como base. Por lo tanto, losprocesos de cesión ò captura de protones transcurren de forma reversible:

Cesiòn de protonesAH A- + H+

Acido captación de protones Base

El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.Las soluciones que contienen àcidos débiles y sus sales se llaman soluciones tampón,buffers ò amortiguadores. Su finalidad es impedir ò amortiguar las bruscas variaciones delpH.El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuación deHenderson-Haselbach:

SALpH = pK + log ------------

ACIDO

A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón depende de lanaturaleza del àcido que la integra y de la proporción entre la sal y el àcido (logaritmo de larelación entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de cada uno de estoscomponentes. La eficacia amortiguadora es máxima cuando el cociente de la relaciónsal/àcido es próximo a la unidad.El objetivo de la presente pràctica es demostrar la capacidad tampón de un sistemaamortiguador empleando un àcido débil y la sal del àcido débil y estudiar la curva detitulaciòn ò valoración de un àcido débil HA, como el àcido acètico (0.1N) y una basefuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a diferentes proporciones relativas


Beaker Nº Acido acètico0.1 N (ml)

NaOH0.1N (ml)

Agua destilada(ml)

pH

1 20 0 202 20 2 183 20 4 164 20 6 145 20 8 126 20 10 107 20 12 88 20 14 69 20 16 410 20 18 211 20 20 0

entre la sal y el àcido de una solución tampón. (el pKa del àcido acètico es 4.76) antes deagregar la base, el pH se debe solamente a la presencia del àcido. Pero tan pronto como seañade algo de la base (NaOH 0.1N), ésta reacciona con una cantidad equivalente del àcidoy forma una cantidad equivalente de sal y agua. El àcido débil más su sal disueltaconstituyen una solución tampón (par amortiguador), cuyo pH puede calcularse mediante eluso de la ecuación de H-H: pH = pK – log sal/àcido.Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios en el pH con laadición de volúmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N).Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los ml de baseagregados y obtendremos así la curva de titulaciòn para el àcido.Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH, instrumento que determina elpH en función de la fuerza electromotriz (p de Nernst) de una celda formada por unelectrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio muy sensible a loshidrogeniones.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:Potenciómetro.Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).Agua destilada.Solución de CH3-COOH 0.1N.Solución de NaOH 0.1N.Papel milimetrado ò cuadriculado.

PARTE EXPERIMENTAL:Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada señaladosen la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de los 11 beakers con elpotenciómetro:


En cada mesa los alumnos construirán su gráfica de valoración colocando en lascoordenadas los valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los volúmenesde NaOH 0.1N añadidos en cada beaker.

pH

ml NaOH añadidos

CUESTIONARIO:1.- Graficar la curva de valoración del àcido acètico 0.1N vs. NaOH 0.1N.

2.- Identificar el punto de semi-valoraciòn y máxima capacidad tampón.3.- Explique que es un par tampón, como funciona y porqué las proteínas sanguíneas

son amortiguadores.4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del organismo humano.


PRACTICA No 3

FACŢORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas son proteínas queintervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar supunto de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y en loscompuestos (llamados sustratos) sobre los que actúan.La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadaspor enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil paracalcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su actividad catalíticacon la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativael efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por lasconcentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la reacción, aumenta laconcentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos, entanto que la concentración de la enzima no se altere.

La actividad enzimática puede expresarse:a)b)c)

Por la desaparición del sustrato (S).Por la aparición de productos (P).Por modificación de cofactores (C).

El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:

[E] + [S]

C C'

[E] + [P]

Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:1)2)3)4)5)

Concentración de sustrato [S]Concentración de la enzima [E]pH del medioInfluencia de la temperaturaEfecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimática de laamilasa salival sobre el almidón.La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en componentes máspequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es producida por el páncreas exocrino y lasglándulas salivales para ayudar a digerir el almidón. La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa”por su capacidad para romper los enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de lospuntos de ramificación no se alteran. El producto final de la acción de la alfa-amilasa sobre elalmidón es la formación de dextrinas, maltosas y algunas moléculas de glucosa. El ph óptimo alcual actúa es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su activación.En la práctica la actividad enzimática se medirá por la desaparición del sustrato (disminución de laturbidez en los tubos que contienen almidón), la cual se determinará en el espectrofotómetro a 650nm.


Tubos No. I II III IV V VISolución almidón 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 mlBuffer fosfato pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 mlSolución salina (NaCl 1%) 2.8 ml 2.6 ml 2.4 ml 2.2 ml --- 2.2 mlAgua destilada --- --- --- --- 2.2 ml ---

Tubos No. I II III IV V VIHCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 mlde los tubos de reaccióncorrespondientes agregar

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Tubos No. I II III IV V VISolución amilasa 0.4 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 1.6 ml 1.6 ml

EXPERIMENTO A

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DELION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1)

2)

3)

4)

5)

6)7)8)

9)

Preparar los siguientes tubos:

Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37°C, durante 5 minutos. El tubo VI serviráde comparación para ver el efecto de la temperatura sobre la acción enzimática por lo quese deja a temperatura ambiente.Agregar la solución de enzima:

Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20 minutos, el tuboVI se mantiene a temperatura ambiente.Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la siguiente manera:

Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.Leer las absorbancias al espectrofotómetro a 650 nm.La diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indicará la actividad enzimática paracada tubo.Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimática en el eje Y vs concentración de laenzima [E] en el eje X.


Tubos No. I II III IV VSolución de almidón 1% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 mlBuffer fosfato pH 6.6 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 mlSolución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 mlAgua destilada 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml

EXPERIMENTO B

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAAMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con todos los cinco tubosde la misma manera que se hizo en el experimento anterior y leer las absorbancias dedichos controles a 650 nm. Dichas absorbancias se tomarán como lecturas iniciales.

3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el baño de agua a37°C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las lecturas deabsorbancia se tomarán ahora como lecturas finales.

5) Hacer la diferencia:

Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura final

El resultado de esta diferencia se considerará como actividad enzimática.

6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de una gráfica deactividad enzimática contra [S] (Ecuación de Michaelis-Menten) y una gráfica de doblesinversas: 1/actividad enzimática contra 1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk). Graficar enpapel milimetrado.


Tubos No. I II IIISolución de almidón 1% 5 ml 5 ml 5 mlSolución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 mlBuffer fosfato pH 6.6 2 ml --- ---Buffer fosfato pH 3.7 --- 2 ml ---Buffer fosfato pH 8.0 --- --- 2 ml

EXPERIMENTO C

EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

2)3)4)5)

Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución yodada, como en elexperimento anterior.

6) Realizar el estudio crítico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimática vs pH.

CUESTIONARIO:

1.-2.-3.-4.-5.-

Cuál es la importancia del Km.Qué efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.Como se clasifican las enzimas?A que se llaman zimògenos e isoenzimas.Que son cofactores y mencione ejemplos.


PRACTICA No 4

EVALUACIÓN NUTRICIONAL BIOQUÍMICA YANTROPOMETRICA

La evaluación nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud de un individuo. Esun requisito indispensable siempre que se desea mejorar, promover o mantener un buen rendimientofísico, un buen estado de salud y nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel derendimiento que se tiene y que se puede alcanzar.El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante un diagnóstico quepermita conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los posibles factores socioalimentarios,económicos y de composición corporal, que puedan afectar la participación y rendimiento de unapersona.Otros objetivos de realizar esta evaluación son:

Detectar déficit de nutrientes específicos, riesgo de desnutrición o sobrepeso.Brindar educación nutricionalSeleccionar personas de acuerdo a la composición corporal, orientar el trabajo físico y/o

reubicar al niño en una actividad física determinada

ESTADO NUTRICIONAL: Es la condición de salud resultante en el tiempo, del balance entre loconsumido y lo requerido. Está determinado por la calidad y cantidad de los nutrientes consumidosy por la utilización de estos en el organismo.

EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios, bioquímicos yclínicos, que correlacionados entre sí, permiten dar un diagnóstico nutricional y por tanto orientar eltratamiento o manejo nutricional. Una evaluación completa debe incluir:

1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.Determina y compara los diferentes componentes (hueso, músculo, grasa y residuo)Analiza según patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte, nivel de rendimiento)Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad física y estado

nutricional.

- Parámetros incluidos:Talla actual, talla/edad,Peso actual, peso usual, peso esperado, peso/talla (Ref. NCHS, Metropolitan life)Circunferencias (Volumen muscular)Diámetros (estructura ósea)Pliegues (% grasa)

2. Evaluación bioquímica: Permite conocer los niveles sanguíneos de los parámetros bioquímicos,indicadores del estado nutricional.

Confirma datos clínicos y dietariosSusceptible a variaciones en la interpretación según edad, sexo, factores hereditarios o

consumo inmediato de alimentos.


- Parámetros incluidos:Cuadro hemático (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos)Proteínas totales y diferenciales (albúmina / globulinas)Trasferrína y FerritinaGlicemia y Perfil de lípidos

3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.Observa y analiza signos y síntomas clínicos que puedan indicar deficiencias nutricionales:

- Parámetros incluidos:Sueño, fatiga, aspecto físico, piel, cabello, uñas, labios.Apetito / hambreCambios de pesoFrecuencia cardiacaCicatrizaciónLesiones frecuentesTiempo de recuperación de las lesionesComportamiento del deportista

4. Evaluación dietaría: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo dietario actual,comparándolo con la recomendación para la edad, sexo y gasto energético.Permite orientar, prescribir, calcular y diseñar un plan alimentario adecuado, ajustado a lasnecesidades nutricionales y calóricas, condición socioeconómica y hábitos del deportista.

- Parámetros incluidos:Encuesta nutricional:

- Historia socioalimentaria- Anamnesis alimentaria- Conductas alimentarias- Frecuencia de consumo de alimentos- Antecedentes personales y familiares

Evaluación cualitativa- Número de porciones diarias por grupos de alimentosEvaluación cuantitativa

Cantidad de kcal y nutrientes (grs promedio) consumidos, promedio / día.Determinación de la recomendación calórica y de nutrientes

- Comparar con el consumo para determinar excesos o déficit y diseñar fórmulaprescrita.

dietaría


Blanco(ml)

Standard (ml) Muestra(ml)

Suero diluido 1/20 --- --- 1Standard --- 1 ---Reactivo Biuret 4 4 4Agua destilada 1 --- ---

EXPERIMENTO “A”

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan en un medio alcalino con el ion cúprico delreactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo de color violeta cuya máximaabsorción se da a 540 nm.

NaOHCobre + proteína Complejo cupro-proteico

El dosaje de proteínas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la alteración en una delas fracciones puede ser balanceada por una alteración opuesta de otra fracción. Por lo tanto, esimportante que adicionalmente se determine la concentración de albúmina.La albúmina también va a ser dosada por el método de Biuret, pero previamente al suero se le haceun tratamiento con sulfato de sodio y eter etílico para lograr la separación de las globulinas ypermitir solo el dosaje de albúminas.

REACTIVOS:1.- Reactivo para proteínas (Biuret):

Solución de sulfato de cobre, hidróxido de sodio y tartrato.2.- Solución de sulfato de sodio al 22.6%.3.- Eter etílico.4.- Standard de proteínas:

Solución patrón calibrada y estabilizada equivalente a 10.4 g/dl de proteínas.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO:Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:

Mezclar y esperar 30 minutos.Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de proteínas (en g/dl), utilizando el método del Factor deCalibración.La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y standard paraobtener una absorbancia neta, sin la intervención del color propio del reactivo.


Blanco(ml)

Standard (ml) Muestra (ml)

Suero tratado --- --- 1Standard --- 1 ---Reactivo Biuret 4 4 4Sulfato de sodio 1 --- ---

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO:Preparar un tubo de la siguiente manera:

-----

Suero sanguíneo.................................0.3 ml.Colocar 5 minutos al baño maría a 37ºC.Solución de sulfato de sodio................5.7 ml.Mezclar. Eter etílico............................4.0 ml.Mezclar. Tapar el tubo y centrifugar.

Inclinando el tubo, extraer con una pipeta el suero tratado que se aprecia como un líquido claroque queda debajo del precipitado.

Mezclar y esperar 30 minutos.Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de albúmina (en g/dl) utilizando el método del Factor deCalibración, en forma similar que para el caso de las proteínas totales.

VALORES NORMALES:Proteínas: 6.0 – 8.0 g/dl.Albúmina: 3.5 – 5.5 g/dl.

CUESTIONARIO.-

1.-2.-3.-4.-

Qué diferencias hay entre desnutrición y malnutrición?Describa todos los tipos de proteínas plasmáticas y cuáles son sus funciones.Cuáles son los tipos de desnutrición que existen y como se valoran?Que sòn la transferrina, prealbùmina y proteína transportadora de retinol y cual es surol en la valoración del estado nutricional?

5.- Qué es el índice de Masa Corporal, como se halla y cual es su interpretación?


PRACTICA No 5

DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓNDE GLUCOSURIA

El mantenimiento de la glicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismossuperiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa unmetabolito energético principal. La coordinación de los procesos metabólicos implicados eneste cometido se lleva a cabo por la relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa osustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) vaseguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumentoorigina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa(por glucólisis, entre otras), aceleración de la glucogenogénesis y disminución de laglucogenólisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, unahormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina estédisminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveleselevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); así ocurre en las personas que sufrendiabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I".El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes,síntomas clínicos y comprobación de una hiperglicemia significativa.


Experimento A:

DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA(concentración de glucosa en suero)

FUNDAMENTO TEÓRICO

Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de laconcentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y además essevera. Una hiperglicemia superior a 124 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas,además se considera también un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos deposible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas.

La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y se puedellevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos últimos los másespecíficos.

Hay dos tipos de métodos químicos:

1. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presenciaen la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras superiores a lascorrespondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el deSomogy-Nelson.

2. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrirdeshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea orto-toluidina.

En cuanto a los métodos enzimáticos:

a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirseespectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia recomendado por lasorganizaciones internacionales.

b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta prácticapara medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema y de los standares. Seexplica a continuación:

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es utilizado por laperoxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada.La intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. Elesquema de la reacción es el siguiente:


Tubos: Blanco Standard MuestraSuero diluido (ml) --- --- 1Estándar de glucosa (ml) --- 1 ---Reactivo de glucosa (ml) 3 3 3

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 10 ml.Pipetas.Espectrofotómetro.Agua destilada.Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona,fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el suero. Hacer unadilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml deagua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes tubos:

Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 15 minutos. Luego de retirar del Baño María,agregar:

Agua destilada (ml) 2 1 1

Mezclar bien la solución. Leer las absorbancias para cada una de las muestras en elespectrofotómetro a 520 nm.


CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del factor de calibración.

VALORES NORMALES

La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.

Para el diagnóstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia en ayunas de 124 mg/dl òmayor de 200 mg/dl en cualquier momento. Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentrenentre lo normal y lo diabético, son clasificados en una categoría denominada “tolerancia alterada ala glucosa” y requieren observación y pruebas confirmatorias.


Tubos: I IIOrina normal (gotas) VIII ---Orina DM (gotas) --- VIIIReactivo de Benedict (ml) 5 5

Experimento B:

INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

FUNDAMENTO TEORICO

En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con losmétodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) sepresenta en la diabetes mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuandola glicemia es mayor de 180 mg/dl.

Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa, que reduce lassales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict elcual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.


Tubos de ensayo de 20 ml.Pipetas.Mechero de Bunsen.Reactivo de Benedict.Pinzas porta tubos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja enfriar. Si la orinacontiene glucosa, se observa un precipitado color verde, amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de lacantidad en que se halle presente. De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.

CUESTIONARIO:1.-2.-3.-4.-5.-

¿Qué es la diabetes mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del laboratorio?Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la glucosa.Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su importancia en la diabetes?


PRACTICA No 6

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSAPOST PRANDIAL

Definición de DM

La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por la presencia dehiperglicemia resultante de un defecto en la secreción de insulina, en la acción insulínica, o enambas.

Clasificación de DM

Diagnóstico

Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles elevados deglucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen daños en la microvasculatura de retina yriñón


Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglicemia que no llegan a cumplir loscriterios de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estospacientes presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a laglucosa y la glucosa en ayunas anormal.Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una prueba de tolerancia con75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son mayores a 110 peromenores a 126 mg/dl.


Experimento A:

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSAPOSTPRANDIAL

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo paradiagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero sipueden servir tanto para la Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que losniveles importantes en ambos casos son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa aingerir debe ser de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace lasolución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte del paciente.

Ayunas30 min1 hora

2 horas

70-110 mg/dl<200 mg/dl<180 mg/dl<140 mg/dl

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en niños se debe utilizar unacantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de glucosa por Kg de peso). Es desuma importancia recordar que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, sedebe pedir una muestra de orina al paciente, para hacerle un análisis cualitativo glucosa. Estodebido a que si el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que laglucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de glucosa elevados y laingesta de altas concentraciones de glucosa le podría provocar al paciente un shock hiperglicémico.

Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización Mundial de laSalud como por la American Diabetes Association, estas son las relacionadas con la DiabetesMellitus Gestacional.

La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta en ayunas de50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl sedesecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer laprueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y haceruna curva de tres horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valoresindicados en la siguiente tabla, se hace el diagnóstico de DMG.

Ayunas1 hora2 horas3 horas

105 mg/dl190 mg/dl165 mg/dl145 mg/dl

La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la glucosa acortada,donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.

Ayunas2 horas

70-110 mg/dl<140 mg/dl


Tubos: Blanco Standard Muestra(0’)

Muestra(30’)

Muestra(60’)

Muestra(120’)

Suero (uL) --- --- 10 10 10 10Estándar de glucosa (uL) --- 10 --- --- --- ---Reactivo de glucosa (ml) 1 1 1 1 1 1


Tubos de ensayo de 5 ml.Micropipetas automáticas de 10 uL.Espectrofotómetro.Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona,fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los 30 min, 60min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le dà de tomar al paciente 75 gr deglucosa disuelto en 300 mL de agua con unas gotas de limón. Las muestras de sangre extraídas de lapersona serán centrifugadas y se separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias seutilizará el método de la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 5 minutos. Mezclar bien. Leer las absorbanciaspara cada una de los tubos en el espectrofotómetro a 500 nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el método del factorde calibración.

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una gràfica de tiempo vs.Glicemia yapreciar lacurvadetoleranciaalaglucosa.

2.- Como seríaestacurvaenel caso deunapersonanormal,undiabéticoyunintoleranteala glucosa.

3.- Queimportanciatieneladeteccióndemicroalbuminuriaenunapersona.

4.- Quésonyenquecasossehaceundosajede péptidoC ydeinsulinaenunpacientediabético.

5.- Cuálessonlascomplicacionesagudasycrónicasdela diabetes?


PRACTICA No 7

DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA

La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fracción exocrinadel páncreas y en las glándulas salivales.Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosìdicos de los polisacáridoscomo almidón y glucógeno.En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a elevarse en las primeras 2 a 3 horasde la enfermedad, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque,declinando luego para volver a los niveles normales entre el 3º y 6º día. También se ve aumentadaen este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego deque la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales.También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gástrica o duodenalperforada, obstrucción intestinal, obstrucción de conductos biliares, pancreatitis crónica,hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de páncreas, administración de opiáceos y en generalcualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secreción de amilasa salival, seasocian también con elevaciones en los niveles de amilasa sérica.

PANCREATITIS AGUDA:

Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la función pancreática normaldebe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento agudo es superado.

Causas:

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Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)Pancreatitis de causa idiopática: 30%Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Pán-creas DivisumPancreatitis por condiciones metabólicas asociadasHipertrigliceridemiaHiperparatiroidismoHipercalcemiaHiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IVPancreatitis por Toxinas (Insecticidas)Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y CentralPancreatitis por MetanolPancreatitis traumática (Trauma abdominal)Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía pancreatobiliar,transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis


PANCREATITIS CRÓNICA:

Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño irreversible de la estructura yfunción pancreática. El curso clínico de la pancreatitis crónica puede consistir en ataquesrecurrentes agudos o una relativa progresión de síntomas.En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la Pancreatitis CrónicaObstructiva subsecuente a la pancreatitis crónica. Ésta es causada por la lesión obstructiva, es laforma más común de pancreatitis, la que se caracteriza por cambios crónicos irreversibles.

Causas:

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Pancreatitis AlcohólicaPancreatitis IdiopáticaPancreatitis Crónica TropicalPancreatitis HereditariaPancreatitis por HiperparatiroidismoPancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal

Experimento A:

DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra, produciéndose lahidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempoproduce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de unsustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en UnidadesAmilolìticas (Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogènicas(Somogy)/decilitro.

MATERIALES Y REACTIVOS:------

-

Espectrofotómetro.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Tubos de ensayo y cubetas de lectura.Baño maría a 37ºC.Reloj o timer.Sustrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfato 0.1 mol/l enNaCl 0.15 mol/l.Reactivo de yodo: solución 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.


Control MuestraSustrato 1 ml 1 ml

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:Preparar los siguientes tubos:

Dejar unos minutos en baño de agua a 37ºC y agregar:Muestra --- 20 uLIncubar a 37ºC. A los 7’30” exactos, agregar:Reactivo de yodo 1 ml 1 mlMezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar:Agua destilada 8 ml 8 mlMezclar por inversión.Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada.

Experimento B:DETERMINACIÓN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la muestra en lugar desuero es orina diluida la cual debe obtenerse de la siguiente manera:El paciente debe orinar descartando esta micción, dos horas después vuelve a orinar y recoge toda laorina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada.La determinación se efectúa con 20 uL de esta dilución, obteniéndose el resultado directamente enUnidades Amilolìticas/hora

CALCULO DE LOS RESULTADOS:Para ambos experimentos se empleará la siguiente fórmula:

Abs. Control - Abs. MuestraAmilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000

Abs. Control

Unidades: Una Unidad Amilolìtica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra,que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En estatécnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 ml de Sustrato durante7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidón durante 30minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilàsica de la muestra sería de 1000UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilàsica, la fracción de almidón digerido semultiplica por 1000.


Suero(UA/dl)

Orina(UA/hora)

Normal <120 <260Pancreatitis aguda 300 a 12000 Más de 900Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300Parotiditis 200 a 350 350 a 750Parotiditis con complicación pancreática Más de 350 Màs de 750Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis) Normal Normal

VALORES DE REFERENCIA:

CUESTIONARIO:1.- Explique como se produce la activación de las enzimas producidas por el páncreasexocrino?2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa, tripsina,elastasa y fosfolipasa A2?3.- Explique como se produce la digestión completa del almidón en nuestro tubodigestivo.4.- Cuàl es el cuadro clìnico de una pancreatitis aguda?5.- Què otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el diagnóstico depancreatitis?


PRACTICA N°08

CETOACIDOSIS DIABÉTICA

BASE BIOQUÍMICA.La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglucemia y otros desarreglos que se deben auna inadecuada acción de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea porque exista unreducido nivel circulante de Insulina ó una resistencia de los tejidos blanco a sus accionesLa Diabetes se divide en dos categorías:

a) Diabetes Tipo I ó Diabetes Insulina dependiente ó Diabetes juvenil (llamada así porque seinicia en la juventud) y la Diabetes tipo II ó no insulino dependiente (diabetes de inicio en laedad madura). Pueden haber tipos intermedios que se superponen.

(A) LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la dependencia de laInsulina significa que no solamente que la insulina es necesaria para el óptimo control de la glucosasanguínea, que también podría ser cierto para la forma tipo II, sino que “sin Insulina exógena elpaciente es más proclive a desarrollar CETOACIDOSIS diabética.

1.

2.

Se sabe que esto refleja una completa ó casi ausencia de insulina en estospacientes, en contraste con la falta parcial de insulina ó la resistencia a la insulinacaracterística de los pacientes del tipo II.Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su presencia enniños y adultos jóvenes y su presencia en las personas mas bien delgadas queobesas.

(B) LA DIABETES TIPO II común mente afecta a las personas de edad madura, y con sobrepeso.

1. Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce cetoacidosis.2. Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la severa

hiperglicemia.Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó alterarse latolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades que afectan laproducción ó la acción de la Insulina, tales como la pancreatitis crónica, el Síndrome deCushing, la acromegalia, la alteración de los receptores de insulina y otras.

El síntoma mas común que produce la hiperglicemia es la poliuria (Aumento del volumen urinario)y la polidipsia (incremento en la ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmótica inducidapor la glucosa. El incremento en la ingesta de agua es una respuesta a deshidratación y sed. Seproduce disminución de peso corporal, debido a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectoscatabólicos de la disminución de la acción de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos(Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metabólicas .Las infecciones de la piel,vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los casos no controlados debido a que lahiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. Las alteraciones en la retina son precoces.


CETOACIDOSIS DIABETICA:

Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante es insuficientepara permitir una utilización de la glucosa por los tejidos periféricos y para inhibir la producciónde glucosa y el catabolismo tisular. El incremento del Glucagon y el aumento de las hormonas queaumentan en respuesta al stress (como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona delcrecimiento) contribuyen a los desarreglos metabólicos. La insuficiente cantidad de insulina reducela utilización periférica de glucosa y junto con el exceso de glucagon incrementan la producciónhepática de glucosa a través de la estimulación de la gluconeogénesis y la glucogenolisis y lainhibición de la glicólisis.La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos suministra unflujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para la gluconeogénesis. El resultado es lahiperglicemia .La diuresis osmótica resulta de la elevación de la glucosa ( y cuerpos cetónicos ) ygenera hipovolemia, deshidratación y pérdida de sodio, fosfato de potasio y otras substancias por laorina. La depleción del volumen estimula la liberación de catecolaminas lo cual se opone a laacción de la insulina en el hígado y contribuye a la LIPOLISIS.

CETOGENESIS:

La lipòlisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de catecolaminas moviliza losacidos grasis libres desde sus depósitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con elglicerol para formar triacilgliceroles, el hígado desvíasus rutas metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagon incrementa el nivel decarnitina, que capacita a los ácidos grasos a entrar en la mitocondria, donde ellos sufren betaoxidación hacia cuerpos cetónicos. Además el glucagon disminuye el contenido hepático demalonil CoA, que es un inhibidor de la oxidación de acidos grasos.ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos cetónicos (acetoacetato y betahidroxibutírico) excede la capacidad corporal de metabolizarlos ó excretarlos. Sus H+ sontamponados por el bicarbonato, conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH sanguíneo.Se encontrará entonces: hiperglicemia, hipercetonemia, acidosis metabólica, disminución delbicarbonato, disminución del pH sanguíneo y presencia en la orina de glucosa (glucosuria) ycuerpos cetónicos ó cetonuria.

OBJETIVO DE LA PRACTICA.-Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y presencia de cuerposcetónicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabética.


EXPERIMENTO A:DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO

Reactivos y materiales:

HCl 0.01 NNoah 0.01 NFenoltaleína 20 mg% solución alcohólicaAlcohol corriente ó caprílico.Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..Pipetas de 5 ml graduadas al décimoPipetas de 1 ml graduadas al centésimoBeakers de vidrio de 100 ó 50 mlBaguetas de vidrioBaño María de 37°CReloj de intervalos

Método:En un beaker de vidrio colocar:5 ml de HCl 0.01 N1 ml de suero2 gotas de alcohol

Agitar y luego reposo 2 min.Añadir 3 gotas del indicador fenoltaleína.Colocar a 37° C en Baño Marìa por 10 minutos.Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado pálido.

Anotar la cantidad de NaOH gastado.

Cálculos:(5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de HCO3-

Considerar que:a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 –

b) Vol. de muestra usada en la titulación: 1 mlc) Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro

Valores Referenciales (Normales):

BIOQUIMICA Y NUTRICION

22 á 34 mMol/Litro

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EXPERIMENTO B:INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA

Test de Rothera.- Esta prueba depende de la la reacción entre la Acetona y elnitroprusiato para formar un complejo coloreado púrpura rojizo. Indica la presencia deacetoacetato y/o acetona.

Reactivos:Cristales de sulfato de amonioSolución de Nitroprusiato al 10% en solución acuosa, la cual deberá ser fresca.Amoniaco solución (Hidróxido de amonio concentrado)Muestra problema: orinaTubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamentePipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminalesEspátulas ó bajalenguas de madera.Baguetas de vidrio.

Procedimiento:NO SE DEBERA PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDOHACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y añadirle conla espátula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales. Disolver con bagueta.Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10%. Mezclar bien

Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca , lentamente, en zonadeslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur ó pipeta de vidrio. Deberán quedar dos capasbien definidas. Esperar unos minutos y ver la formación de un anillo morado en la intefaseen caso positivo para cuerpo cetónicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formación de cuerpos cetònicos y porque se producen.2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.3.- Como se diagnostica a un paciente que está en cetoacidosis diabética?.4.- A qué se llama: exceso de bases y reserva alcalina.5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje tanto debicarbonato en sangre como de cuerpos cetònicos en orina.


PRACTICA Nº9

PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO

El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones tanto enindividuos sanos como enfermos.Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnósticalimitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o menos predecible en un gran número decondiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación deateromas dado que las complicaciones arterioescleròticas prevalecen en individuos hipercolesterolèmicos.Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de contraer enfermedadcardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de mes de 40 años) con colesterolemia menor ò iguala 200 mg% es 3 veces menor que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entreindividuos con más de 260 mg%.Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución de las lipoproteínasencargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad), considerada como el “factor protector” yLDL (lipoproteínas de baja densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funcionesbiológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y losresultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL ycolesterol LDL no pueden tomarse como índices predicitivos de riesgo, sino que es necesario conformar unperfil lipìdico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A:

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis enzimática delos èsteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce lacopulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por laperoxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.

LipasaEsteres de colesterol

Colesterol + O2

PODH2O2 + 4-AF

colesterol + ácidos grasosCHOD

colesten-3-ona + H2O2

4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + 4 H2O


Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Muestra --- --- 20 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

REACTIVOS:Standard: solución de colesterol 200 mg%Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y peroxidasa (20U/l).Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada,5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2partes de enzimas previamente homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.

PROCEDIMIENTO:En tres tubos colocar:

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor de calibración.Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg%

VALORES DE REFERENCIA:Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y de ejercicio. Sin embargo,es preferible no hacer referencia a valores “normales”, pues la norma promedio de una población nonecesariamente refleja ausencia de riesgo patológico en el caso de colesterol.

Menos de 200 mg% valor deseable200 a 239 mg% valor fronteraMayor de 240 mg% valor alto

Experimento B:DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO :Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan proecipitando selectivamente las lipoproteínas debaja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrán de PM 500,000 enpresencia de iones Mg++.

En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación delcolesterol ligado a las mismas, empleando el sistema más conveniente.

REACTIVOS :REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de Cl2Mg.H2O


Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Sobrenadante --- --- 100 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

PROCEDIMIENTO :En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo Precipitante.Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.Dejar 15 minutos en refrigeración. No colocar en el congelador.Centrifugar a 3000 rpm.Usar el sobrenadante como muestra.

En tres tubos colocar:


CALCULOS:De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la concentración del standard es de 45.7mg%.

VALORES NORMALES:30 – 65 mg%

Experimento C:DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO :Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas selectivamentemediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadantequedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el colesterol ligado a las mismas se determinaempleando el sistema más conveniente.Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterolunido a las LDL.

REACTIVOS :REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol (PM600).

PROCEDIMIENTO :En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y añadir 0.1 ml de Reactivo Precipitante.Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.Centrifugar a 3000 rpm.Usar el sobrenadante como muestra.


Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Sobrenadante --- --- 100 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

En tres tubos colocar:


CALCULOS :

LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración)

La concentración del standard es de 62.4 mg%.

VALORES NORMALES :Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%Riesgo moderado : 140 a 190 mg%Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%

CUESTIONARIO:

1.-2.-3.-4.-5.-

Què es RIESGO CORONARIO y como se calcula?Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.


PRACTICA Nº10

PERFIL LIPIDICO II: TRIGLICERIDOS

Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo por lotanto una potente forma de almacenamiento de energía.El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se producecon gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad física, stress, edad, etc.). Poreste motivo es de esperar que los triglicéridos (uno de los más importantes vehículos para eltransporte de ácidos grasos) varíen también su concentración en respuesta a estos factoresfisiológicos.Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a nivelesanormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de esta condición, se asocia con numerosaspatologías, tales como enfermedad hepática, renal, hiperlipidemias esenciales, etc.Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en individuos obesos, enlos cuales tiene importancia pronostica, respecto a la probabilidad de desarrollar enfermedadcardíaca coronaria. Alrededor del 50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren enlas arterias coronarias son triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triglicéridos con lapatogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho deque un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhibenhipertrigliceridemia.

Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación enzimática de glicerol apartir de glicéridos.Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las moléculas delos triglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para remover los ácidos grasos. Ladeterminación enzimática del glicerol ha sido usada durante muchos años; sin embargo, en estosmétodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso deenzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, haposibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmenteenzimáticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de altastemperaturas y mezclas de adsorción para la remoción de fosfolìpidos. Estudios recientes se hanconcentrado en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicéridos.


Experimento A:DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO :Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a partir deglicéridos.La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por unalipoprotein lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.

Lipoprotein lipasaTriglicéridos Glicerol + 3 ácidos grasos

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerolkinasa.

Glicerol kinasaGlicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa (GPO),con producción de agua oxigenada.

GPOGlicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de unaquinonimina roja.

POD2 H2O2 + 4-AF + clorofenol

REACTIVOS PROVISTOS :

4-(p-benzoquinona monoimino)fenazona + 4 H2O

---

Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de triglicéridos.Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerolfosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).


Tubos Blanco Standard MuestraMuestra --- --- 10 uLStandard --- 10 uL ---Reactivo de Trabajo 1 ml 1 ml 1 ml

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO :

--

Standard: listo para usar.Reactivo de trabajo:5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porciòn de Buffery luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar yfechar.

MATERIAL REQUERIDO :------

Espectrofotómetro.Probeta, micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Frasco de vidrio color ámbar.Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas.Baño de agua a 37ºC.Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO :Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:

Mezclar.Incubar 10 minutos en baño de agua a 37ºC.Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada.

CALCULO DE LOS RESULTADOS :Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los cálculos.Para hallar la concentración de triglicéridos en el suero problema, se debe utilizar el método delfactor de calibración.

Triglicéridos (mg%) = M x Fc

Fc = 200 / S

M = Abs muestra – Abs blanco

S = Abs standard – Abs blanco


VALORES DE REFERENCIA :

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientesvalores de triglicéridos:Deseable: < 150 mg%.Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.Elevado: 200 – 499 mg%.Muy elevado: > 500 mg%.

CUESTIONARIO :1.-2.-3.-4.-5.-

Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.Explique la importancia biológica de los triglicéridos.Como se produce la digestión y absorción de los triglicéridos.Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de la lipasa lipoproteìca.Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el dosaje de triglicéridos.


PRACTICA Nº11

MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA

Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo proteico (síntesis ydegradación).Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos compartimientos:

b)c)

Compartimiento Proteico Visceral.Compartimiento Proteico Somático ò esquelético.

Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de Transferrina, Pre-albúmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida(albúmina es de 20 días) rinde una estimación razonable del compartimiento proteico visceral. Enesta práctica utilizaremos la Proteína Total y la Albúmina sérica.Las proteínas del compartimiento somático ò esquelético la evaluaremos mediante la relación entrela excreción de la creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la persona, relación que es un fielíndice de la masa muscular esquelética.Así mismo mediante el Peso y la Talla se evaluará la masa corporal total.

Experimento A:DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBÚMINA

EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO :

Determinación de Proteínas Totales:Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan con el ión cùprico, en medio alcalino, para dar uncomplejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a laconcentración de proteínas totales en la muestra.Determinación de Albúmina:La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la BromoCresolsulfon Ftaleìna (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. Elaumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúminapresente en la muestra.

REACTIVOS :Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polièter (AAP).Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (en polioxietilèn lauril éter).Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con tìtulo conocido de proteínas (Biuretò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).


Blanco Standard MuestraAgua destilada 50 uL --- ---Suero Patrón --- 50 uL ---Muestra --- --- 50 uLReactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Blanco Standard MuestraSuero Patrón --- 10 uL ---Muestra --- --- 10 uLReactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

MATERIAL REQUERIDO :

Espectrofotómetro.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Tubos de ensayo.Baño Marìa a 37ºC.Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES :En tres tubos colocar:

Mezclar los tubos.Incubar durante 15 minutos en baño maría a 37ºC.Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA :En tres tubos colocar:

Mezclar los tubos.Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.Leer en espectrofotómetro a 625 nm.

CALCULO DE LOS RESULTADOS :

Proteínas totales (g/dl) = M x fcAlbùmina (g/dl) = M x fc

Albúmina (g/dl)Relación A/G = ---------------------------------------

Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)

VALORES DE REFERENCIA :PROTEÍNAS TOTALES : 6,1 a 7,9 g/dl.ALBÚMINA : 3,5 a 4,8 g/dl.RELACION A/G : 1,2 a 2,2


fc = P.T. (g/dl) / Sfc = Alb. (g/dl) / S

Página 45

Blanco Standard MuestraStandard --- 0,5 ml ---Orina diluìda (1:50) --- --- 0,5 mlAgua 1 ml 0,5 ml 0,5 mlReactivo 1 2 ml 2 ml 2 mlReactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Experimento B:DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

FUNDAMENTOS DEL METODO :La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizaciòn con àcidopìcrico, obteniéndose un cromògeno que se mide a 510 nm.

REACTIVOS :Reactivo 1: àcido pìcrico 41,4 mmol/l.Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.Standard: soluciòn de creatinina 2 mg%

MATERIAL REQUERIDO :Espectrofotometro.Tubos de ensayo.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO :Recolectar orina de 24 horas.Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:

Mezclar por inversión.Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.Leer en espectrofotómetro a 510 nm.CALCULO DE LOS RESULTADOS :

MCreatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V

S

Siendo:V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.M = Absorbancia neta del tubo muestra.S = Absorbancia neta del tubo standard.

VALORES DE REFERENCIA :900 a 1,500 mg/24 horas.


PROMEDIOPOBLACIONAL

DESNUTRICIÓN

Relación CrU 24h / Talla(mg 24h/m)

Hombres: 830Mujeres: 680

Hombres: < 660Mujeres: < 430

Relación Peso / Talla(Kg/m)

Hombres: 37Mujeres: 34

Hombres: < 30Mujeres: < 29

Proteínas totales (g/dl) 7 <6Albúmina (g/dl) 4 < 3,5

VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de dichapersona sabiendo que es varòn, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen urinario en 24 horasfuè de 1000 ml.2.- Como hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido mujer?3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.4.- Què son las globulinas y cuáles son sus clases?5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas totales,albúmina, globulina y creatinina.


PRACTICA N°12

METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA

Base Bioquímica.-La bilirrubina es un pigmento amarillo, que se produce en el ser humano a partir del

Núcleo HEM (que es una Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol macrocíclico, molécula que tieneinsertado un átomo de Hierro ).Sobre este núcleo HEM actúa la enzima Oxigenasa Heme de losmicrosomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa meteno del anillo tetrapirrólico y se abre lamolécula, convirtiéndose en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentementehidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reducción la realiza la enzima citosólica biliverdinareductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME catabolizado por estaruta se produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de ión férrico. La producción diaria de bilirrubina apartir de todas sus fuentes en el hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de labilirrubina total producida se deriva de la molécula del HEM de la Hb liberada a partir de loseritrocitos senescentes que son destruídos en el sistema retículo endotelial del hígado, bazo ymédula ósea. El 15% remanente se produce a partir de la destrucción de las células precursoras delos eritrocitos en la médula ósea ( llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene delcatabolismo de otras proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina, citocromos,peroxidasas y que están distribuídas a través de todo el organismo.Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada al hígadoasociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los hepatocitos , se transporta yse conjuga al acido glucurónico ( UDP – glucuronilo transferasa) para producir mono ydiglucuronato de bilirrubina los cuales se excretan en la bilis.

Y después de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los glucorónidos debilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del intestino delgado, y por laacción catalítica de la betaglucuronidasa del hígado, células epiteliales intestinales y las bacterias.

La bilirrubina no conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaeróbica intestinalpara formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados Urobilinógenos queluego se reducen y forman tres productos: estercobilinógeno, mesobilinógeno y urobilinógeno.Hasta el 20% de los urobilinógenos producidos diariamente son reabsorvidos desde el intestinohacia la circulación pára ir al hígado (Circulación entero. hepática). La mayor parte delurobilinógeno reabsorvido es capatado por el hígado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2 a5 % entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte mas baja del tracto intestinal,los tres urobilinógenos se oxidan espontáneamente y producen los pigmentos estercobilina,mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos adquieren color marrón y que son los pigmentos quele dan color a las heces. Existen enfermedades congénitas y enefermedades adquiridas que afectanuno ó más de los pasos involucrados en la producción, capitación, depósito, metabolismo yexcreción de la bilirrubina y la hiprbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estostranstornos. Esta bilirrubinemia puede ser a predominio No conjugado (Indirecta) ó Conjugado(Directa) dependiendo del tipo de desorden.

La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede del mg %,existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción de mas bilirrubinade la que el hígado normal puede excretar o a la insuficiencia de un hígado dañado para excretar la


Estado Bilirrubina SéricaMg%

UrobilinogenoUrinario

BilirrubinaUrinaria

Urobilinógenofecal

NORMAL

Iictericia

Hemolítica

Hepatitis

Ictericia

Obstructiva

Conjug: 0.1 a 0.4 mgNo Conjug 0.2 a 0.7

Elevac. No Conjug

Elevaciones de

Ambas,con pred.Conjug

Elevación de ambas apredominioConjugada

0.a 4 mg/24 hs

Aumentado

Disminuido

Ausente

Ausente

Ausente

Presente

Presente

40 a 280 mg/ 24hs

Aumentado

Disminuido

Escaso o

ausente

bilirrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de daño hepático, la obstrucción delos conductos excretorios del hígado, previniendo la excreción de la bilirrubina, también causaráhiperbilirrubinemia. En todos estos transtornos, la bilirrubinase acumula en la sangre y cuandoalcanza una cierta concentración (aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de lostejidos los cuales adquieren color amarillo, este transtorno se denomina ictericia. La concentracionde bilirrubina en el suero es de gran valor, por eso en la presente practica la emplearemos.

Dentro de las causas de Ictericia Hemolítica tenemos:Anemias hemolíticas, ictericia fisiológica neonatal (Inmedurez hepática para captación, conjugacióny secreción de la bilirrubina), Sindrme de Crigler-Najar ( Alteración de la conjugación debilirrubina),Enfermedad de Gilbert, Hiperbilirrubinemia tóxica(Agentes farmacológicos).

Experimento A:DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA

FUNDAMENTO:El suero sanguíneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanílico + Nitrito de sodio) y seproduce un complejo coloreado de color rojo violáceo debido a la presencia de bilirrubinaconjugada al ac. Glucurónico (Directa) color que desarrolla directamente. La Bilirubina noconjugada (Indirecta) requiere además la presencia de cafeína ó alcohol metílico para que sedesarrolle el color. Entonces para obtener la producción de color debido a ambas bilirrubinasdebemos añadir cafeína ó metanol y tendremos la producción de un color debido a la suma deambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparadosespectrofotométricamente con el color producido por una solución standard de bilirrubina deconcentración conocida.


ReactivosTubo

Blanco

(B)

TuboBilir Directa

(D)

TuboBilir Total

(T)

TuboStandard deBilirrubina

(mg %)Muestra (suero) 200 uL 200 uL 200 uL ---Agua destilada 2,5 ml 2.5 ml --- ---Sol Cafeína --- --- 2.5 ml 2,5 mlAcidoSulfanílico

200 uL --- --- ---

Reactivo Diazo --- 200 uL 200 uL 200 uLStandard 200 uL

REACCTIVOS NECESARIOS:

- Acido Sulfanílico en medio ácido- Solución acuosa de nitrito de sodio- Alcohol metílico ó solución de cafeína amortiguada- Agua destilada- Standard de Bilirrubina- Preparación de reactivo Diazo (Sol. Nitrito de sodio + Sol ácido sulfanílico), según instruccionesdel profesor.- Muestras problema

METODOLOGIA.-

Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados, según la siguiente tabla:

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro en cero deAbsorbancia con Agua destilada.Anotar los resultados de cada lectura.CALCULOS:Bilirrubina Total mg% = ( T - B ) x FactorBilirrubina Conjugada (Directa) mg % = ( D – B ) x FactorBilirrubina No Conjugada (Indirecta ó Libre) = (Bilirrub.Total – Bilirrub.Directa)

VALORES DE REFERENCIA:-

-

Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/%Total: hasta 1.0 mg/%

Recién nacidos =Nacidos a término Prematuros

Sangre de cordón 2.5 mg%Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg%Hasta las 48 horasDel 3º al 5º día

7.5 mg%12.0 mg%

12.0 mg%24.0 mg%

Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes delnacimiento.En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan màs en alcanzar la normalidad, dependiendo delgrado de inmadurez hepàtica


Experimento B:

INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA

El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuentra entodas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en elintestino como hemos señalado en las clases teóricas por la acción de las bacterias sobre lospigmentos biliares excretados por el hígado. También dijimos que luego que se excreta labilirrubina conjugada al conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no esreabsorvida sino que o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma enUROBILINOGENO ( y derivados asociados) por acción de las bacterias del colon. Elurobilinógeno se puede reabsorver en el intestino delgado (Ïleon) y en el colon y pasa a lacirculación portal , llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se excretacon la orina .Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno ( como en laenfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la hemólisis, la excreción diaria delurobilinógeno aumentará en forma significativa Por el contrario,si no pasa bilis al intestino, comoen la colostasis u obstrucción biliar extra hepática interfieren en la fase final del catabolismo de labilirrubina y ocasiona un descenso notable en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno.Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil para diferenciar las posiblescausa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de los conductos biliares, laurobilina estará ausente en la orina.La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una excesivadestrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del parénquima hepático. En lasnefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina

Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno en orina (MétodoCualitativo).:

Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetilaminobenzaldehido, para rendir un complejo coloreado rojo cereza

Reactivo de Ehrlich:

Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de agua y y 75 mlde HCl concentrado.

P rocedimiento : A 2 ml de orina en un tubo de prueba, añadirle 0.5 ml del Reactivo de Ehrlich ymesclar bien. Observar el color de la mixtura.

Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán color. Cantidadesaumentadas (patológicas) del pigmento urobilinógeno producirán un color rojizo cereza que seobserva bien mirando el tubo desde arriba del tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco.

En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de las tirasreactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas están impregnadas enel área correspondiente de una sal de metoxibenceno diazonio estable que produce con elurobilinógeno, casi instantáneamente un complejo de color rojo azoico. Se considera normal que en


la zona reactiva para urobilinógeno no se produzca decoloración alguna o que los colores queaprezcan sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es específica para elurobilinógeno.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formación de la bilirrubina.

2.- En que casos se produce una elevación de la bilirrubina total, tanto a expensas de la bilirrubinadirecta como de la indirecta.

3.- Como se forma el urobilinògeno y qué importancia tiene?4.- Què es la ictericia y como se evalúa.5.- Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina.


PRACTICA Nº13

TRANSAMINACION

IMPORTANCIA CLINICA:Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan latransferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoàcido, en una de las más importantesreacciones del metabolismo proteico. El interés clìnico está centrado especialmente en dos de ellas:TGO (transaminasa glutámico oxalacètica) y TGP (transaminasa glutámico pirùvica).Estas enzimas tienen acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica encondiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad será evidencia de un deterioro delos tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes corazón ehígado.Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento dela actividad de la TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima, tan abundanteen músculo cardìaco.En este caso no existirà aumento en la actividad sérica de TGP ò será mínimo.En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habráun incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición desíntomas clínicos como ictericia.En este caso, la TGP será el enzima predominante debido; a su gran concentración en el tejidohepático.Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en traumas accidentales oquirúrgicos y en distrofias musculares y miosis.

FUNDAMENTOS DEL METODO:Una reacción de trasnominación consiste en la interconversión de un grupo amino (NH2-CH-COOH) de un aminoácido, con un grupo cetónico (O=C-COOH) de un cetoácido. Este intercambioestá catalizado por enzimas conocidas con el nombre de transaminasas. En el suero humano, por logeneral, se determinan dos tipos principales: la Glutámico Oxalacética (TGO) y Glutámico Pirúvica(TGP).Ellas catalizan las siguientes reacciones:

TGOl-aspartato +

l-alanina +

-cetoglutarato

-cetoglutaratoTGP

oxalacetato + glutamato

piruvato + glutamato

El oxalacetato y el piruvato así formados, reaccionan con el reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4 –DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio alcalino (NaOH) producen un complejocoloreado cuya intensidad es proporcional a la actividad enzimática de transaminasas en lamuestra.


Blanco MuestraSustrato (TGO ò TGP) 0.5 ml 0.5 ml

Muestra (suero) --- 100 UlAgua destilada 100 uL ---

REACTIVOS:

1.- Sustrato TGO:Solución conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfa-cetoglutarato en bufferfosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.2.- Sustrato TGP:Solución conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfa cetoglutarato en bufferfosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.

3.- Reactivo 2,4-DNFH:Solución conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en ácido clorhídrico1 mmol/l.Esta solución es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.

4.- Standard de Calibración:Solución de piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibraciòn.Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva deTGO.

5.- Hidróxido de Sodio para Enzimas:Solución de hidròxido de sodio 4 mol/l

Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua destilada para asíalcanzar la concentración requerida de NaOH 0.4mol/l.Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco de plástico y no devidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los vapores pueden contaminarambos reactivos.

EXPERIMENTO A

DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO ò TGP EN SUERO:Preparar los tubos:

Colocar en baño de agua a 37ºC unos minutos y luego agregar:

Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:

Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 ml

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37ºC. Luego agregar:

NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 ml

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el espectrofotómetro a 505nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua destilada.NOTA: Para el cálculo de resultados se debe emplear una curva de calibración.


Tubo Agua destilada(ml)

Sustrato (ml) Standard decalibración (ml)

TGO(U/l)

TGP(U/l)

I 0.2 1.00 0.00 0 0II 0.2 0.95 0.05 7 9III 0.2 0.90 0.10 12 18IV 0.2 0.85 0.15 20 25V 0.2 0.80 0.20 28 37VI 0.2 0.75 0.25 37 46VII 0.2 0.70 0.30 48 56VIII 0.2 0.60 0.40 81 79IX 0.2 0.50 0.50 --- 113

EXPERIMENTO B

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA CURVA DECALIBRACIÓN

Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de calibración para TGOy otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:Pipetear en dos series de tubos:

Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibración de TGO y sustrato TGP para la curva decalibración de TGP, respectivamente.Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.Mezclar. Incubar 10 minutos a 37ºC.Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.Leer la tramitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El color es establedurante solo 30 minutos.Restar a cada lectura la obtenida con el tubo Nº1, obteniéndose las Absorbancias Netas.Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical, y en el ejehorizontal las U/l de TGO ó TGP según sea el caso, que se indica en la tabla superior.Determinar en el gráfico los puntos correspondientes a cada tubo. Uniéndolos se obtienen las curvasrespectivas para TGO y TGP.Tener en cuenta que para cada técnica debe utilizarse el gráfico correspondiente.

VALORES DE REFERENCIA:Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si bien se han halladoindividuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se encuentren entre12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos.

CUESTIONARIO:

1.-2.-3.-4.-5.-

Explique en que consiste el fenómeno de transaminaciòn y donde se realiza en el organismo?Que relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?Señale cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de transaminasas?Existe variación de transaminasas con la edad?


PRACTICA Nº14

BALANCE NITROGENADO

El objetivo de esta práctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado.Explicaremos los parámetros más representativos de la excreta nitrogenada en general.Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24 horas y la excreciòn denitrógeno creatinìnico urinario en 24 horas empleando la fórmula de nitrógeno total estimado(NTE), según Ramírez Velazco.

FORMULA: BN = INGESTA N – (NTE + 2)

NTE = N. UREICO + N. CREATININICO

Excreciòn fecal : 2 gr/24 horas.

N Ingerido : gr de proteínas/6.25

Nota: Si el paciente presenta albuminuria, añadir a la excreta:Proteína urinaria/6.25

EXPERIMENTO A :DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

La creatinina se forma endógenamente en el metabolismo muscular y es removida de la sangre porfiltración glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en los túbulos. Por lo tanto, es elriñón el que regula, como único órgano excretor, el nivel de creatinina en la sangre. Si se restringela función renal aumenta la creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesión orgánica. Unaumento continuo aunque escaso del nivel de creatinina en suero debe considerarse como un signode pronóstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable restricción de la función renal.Como se forma en el organismo, los factores exógenos no pueden influir su nivel sérico. Por estemotivo la determinación simultánea de la creatinina en suero y orina permite el càlculo delclearence o depuración de creatinina y representa un método excelente de la medida de la filtraciónglomerular.

FUNDAMENTOS DEL METODO:En un medio alcalino que contiene picrato, la creatinina presente en la muestra, reacciona con ésteformando un complejo rojizo, cuya mayor absorción se dà a 530 nm.

Creatinina + picrato


Complejo creatinina-picrato

Página 56

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)Orina diluida --- --- 0.02Standard --- 1.0 ---Agua 2.5 1.5 2.5Reactivo 1 3.5 3.5 3.5Reactivo 2 1.0 1.0 1.0

REACTIVOS:Reactivo 1.- Solución de ácido pícrico 0.05MReactivo 2.- Solución de hidróxido de sodio 0.75N

PROCEDIMIENTO:Recolectar orina de 24 horas.Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000 ml la prueba deberealizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los cálculos en vez de multiplicar el resultadopor 2000, debe multiplicarse por el volumen total (ml).Preparar los siguientes tubos:

Mezclar bien.Después de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm contra elblanco.

CALCULOS:Abs muestra

Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000Abs standard

VALORES NORMALES: 500 – 1500 mg/24 h.

Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrógeno creatinìnico.

EXPERIMENTO B :DETERMINACIÓN DE UREA URINARIA

El producto final más importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es excretada en laorina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada función excretora ypor consiguiente de la función renal.La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de excreciòn renal insuficiente, dichascausas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales se altera la circulación por el riñón yPost-renal por obstrucción de las vías urinarias. Por ello la información más exacta con respecto a lahabilidad excretora de la urea por los riñones requiere de una comparación de la concentración deurea en sangre (BUN) y en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una dietahiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor proteico.


Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)Standard --- 0.01 ---Orina diluida --- --- 0.01Enzima 2 gotas 2 gotas 2 gotas

FUNDAMENTOS DEL METODO:

La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amoníaco y dióxido de carbono, mediante unareacción catalizada por la enzima ureasa:

UreasaUrea + H2O CO2 + 2 NH3

El amoníaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio formando azul deindo fenol. La intensidad de color azul es proporcional a la cantidad de urea en la muestra.

REACTIVOS:Reactivo 1.- Solución de fenol y nitroprusiato de sodio.Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625NEnzima.- Solución de ureasa.

PROCEDIMIENTO:Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.Preparar los siguientes tubos:

Mezclar e incubar los tubos en un baño maría a 37°C por 5 minutos.Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del Reactivo 2.Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a 37°C por 5 minutos.Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nmvs el blanco.

CALCULOS:Abs muestra

Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de diluciónAbs standard

Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.


VALORES NORMALES:Nitrógeno ureìco.- 7 a 14 gr/24 hrs.Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.

BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)

BN = ...................... gr/24 hrs.

CUESTIONARIO:1.- Con los datos obtenidos en la práctica, calcular el balance nitrogenado del pacientesabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24 horas .2.- De donde proviene la creatinina?3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?4.- A que se llama BUN y que representa?5.- Para que sirve la depuración de creatinina en orina de 24 horas?


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