UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA BIOQUÍMICA APLICADA

AUTORES:Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos JaraIng. Marcia Juana Quequezana BedregalIng. Karina Morán MedinaMg. Liz Andrea Gutierrez QuequezanaMg. Jakeline Zanabria Galvez

AREQUIPA – PERÚ

2012

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioquímica aplicada en el laboratorio.

Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el desarrollo de la biología molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la bioquímica como consecuencia natural.

La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica han determinado el gran impulso que la bioquímica aplicada ha dado a la nueva tecnología de los bioprocesos.

Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el conocimiento previo de la biología y de la bioquímica aplicada.

La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de Ingeniería Química las destrezas básicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio práctico de la bioquímica.

Los Autores

ÍNDICE

PROLOGOÍNDICE

PRÁCTICA 1:.............................................................................DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS.

PRÁCTICA 2:.............................................................................CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DIÁLISIS.

PRÁCTICA 3:.............................................................................DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL.

PRÁCTICA 4:.............................................................................SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS.

PRÁCTICA 5:.............................................................................REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS.

PRÁCTICA 6:.............................................................................DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS.

PRÁCTICA 7:.............................................................................METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.

PRÁCTICA 8:.............................................................................INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae INMOVILIZADA.

PRÁCTICA 9:.............................................................................EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES.

PRÁCTICA 10:.............................................................................DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.

PRÁCTICA 11:.............................................................................CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.

PRÁCTICA 12:.............................................................................EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.

PRÁCTICA 1

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS

I. OBJETIVODeterminar la concentración de una solución de proteínas mediante la reacción de Biuret y el espectrofotómetro

II. FUNDAMENTO:

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solución alcalina. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen un color violeta característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solución alcalina.

El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir enlaces químicos entre los pares de electrones libres del átomo de nitrógeno presente en los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu+2 y las diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo tanto, se puede utilizar una proteína como patrón de calibración. La curva de calibración obtenida por este método, se hará utilizando como patrón solución de extracto de levadura, cuya concentración es de 8 mg/mL preparada con agua destilada.

Espectrofotometría. Principios básicos La reacción de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoíris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una longitud de onda específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz ( a la longitud de onda de máxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre luz incidente (Io) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absdorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs)óDensidaOptica (DO)

Laley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Siendo e el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la concentración de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayoría de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que 1 se puede ignorar. Así la concentración desconocida de la sustancia será:

C = Abs /e

III. MATERIALES Y EQUIPO

Espectrofotómetro

Gradilla para tubos de ensayo

Tubos de ensayo

Vasos de precipitado

Probetas, Pipetas

Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret

IV. PROCEDIMIENTO

Realización de una curva patrón: Como se desconoce el coeficiente de extinción molar (€) de las proteínas coloreadas con el reactivo biuret, se procederá a construir una curva patrón, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de proteína, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solución problema y determinar su concentración gráficamente y también por regresión lineal.Para ello se dispone de una solución de 10 mg/ml de proteína (extracto de levadura) a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf

Donde:

Ci = concentración de la solución madre inicial

Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial

Cf= concentración final de la solución a preparar

Vf= volumen total final de la solución a preparar

En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre (Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.

ConcFnal.Sol.a preparar

Volumen Sol. Madre inicial

Volumen agua

Volumen Rx.Biuret

Volumen Final

Abs 570nm

Tubo Mg/ml ml ml ml ml

Blanco

0 0,0 4,0 4 8

1 0,5 3,5 4 8

2 1,0 3,0 4 8

3 1,5 2,5 4 8

4 2,0 2,0 4 8

5 2,5 1,5 4 8

6 3,0 1,0 4 8

7 3,5 0,5 4 8

8 4,0 0,0 4 8

Muestra

4,0 0,0 4 8

Al añadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absobvancia.

Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro:

a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de máxima absorbancia para la reacción del biuret)

b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro.

c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia

de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentración.

e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.

f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abscisas y las Abs. en las ordenadas.

g) Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su concentración.

h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración y que la relación es lineal: Y = a + b X (Y = A + B x Conc.). Utilizando regresión lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar concentración que en este caso es de la muestra desconocida.

V. CUESTIONARIO5.1 ¿Cuál es la concentración de proteínas de la muestra?

5.2 ¿Se podría determinar la concentración de cualquier muestra de proteínas con esta curva patrón?

5.3 ¿Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la reacción del Biuret?

5.4 Investigue si existe alguna proteína en la que no esté presente ninguna aminoácido con anillo bencénico en su cadena lateral, e indique que consecuencias tendría sobre la determinación espectrofotométrica

VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA 2

CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DIÁLISIS

I. OBJETIVO

Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o solución que las contenga.

II. FUNDAMENTO

La diálisis es una técnica que separa las moléculas de acuerdo a su tamaño usando membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las macromoléculas que se deseen separar como las proteínas, los poros permiten la difusión de las moléculas de solventes, sales y otras moléculas pequeñas, pero bloquean el paso de proteínas por su gran tamaño.

Se usan membranas de celofán (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodión, u otras de naturaleza semipermeable.

Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusión por diferencia de concentración.

III.MATERIALES Y EQUIPOS

01 pliego de papel celofán.

1Kg de azúcar.

Solución de extracto proteico al 0.5%.

Pipeta de 10 ml.

Vaso de precipitados.

Piceta.

IV. MÉTODO

Preparar una bolsa con el papel celofán, de modo que no se presenten fugas al llenarla con una solución.

Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solución de proteína al 0.5%.

Comprobar la concentración de proteína con el espectrofotómetro a 280 nm.

Llenar la bolsa de celofán con 50 ml de solución proteica, usando para tal fin la pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.

Preparar un tazón con azúcar, y colocar allí la bolsa de celofán conteniendo la solución proteica.

Untar toda la bolsa de celofán, con el azúcar, cubriéndola por completo.

Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azúcar, observando los cambios ocurridos.

Medir el volumen de líquido que quedó en la bolsa de celofán y comparar con el volumen inicial.

Mediar nuevamente la concentración de proteínas en el espectrofotómetro a 280 nm.

V. CUESTIONARIO

Señale las principales técnicas de separación de solutos por membrana, y las principales aplicaciones de cada una de ellas.

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Investigue la composición química de la membrana utilizada y explicar las razones de su porosidad.

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Efectúe los cálculos de variación en el volumen y la concentración de la proteína en solución.

Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solventes por osmosis.

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Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solutos por difusión debida a diferencias de concentración.

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VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL

I. OBJETIVO.

Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en una muestra desconocida.

II. FUNDAMENTO

El método de micro-kjeldahl es una simplificación hecha por HACH en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo análisis en un tiempo corto y con pequeñas muestras.

Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las proteínas a nitrógeno inorgánico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas

1.En la primera, se digiere el material por acción del ácido sulfúrico en presencia de oxidantes fuertes (peróxido de hidrógeno), de esta manera todo el carbono presente se libera como CO2 y nitrógeno como NH3, luego este se combina con el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio.

2.En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la acción de un álcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solución de ácido débil en presencia de colorante indicador.

3.En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte cuantificando el nitrógeno presente.

Luego se aplica la relación siguiente:

%N = ml.N.fc.meq.100

peso de muestra

donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrógeno en la muestra

ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml)

N. normalidad del ácido

Fc. Factor de corrección del ácido

meq.= peso del miliequivalente del nitrógeno

Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples con 16% de N, el porcentaje de proteínas será:

Proteína = 6.25xN

III.PROCEDIMIENTO

El proceso de determinación se hace en tres etapas:

DIGESTIÓN.

Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es sólido) y colocar en el matraz de digestión

Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz

Verificar que el control automático del digestor este en 440ºC y que haya succión en la columna de fraccionamiento.

Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado la temperatura indicada.

Añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de un embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, añadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare.

Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se haya enfriado.

Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.

DESTILACIÓN

El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un balón de destilación.

Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de ácido borrico al 4% (en volumen) adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloración violeta.

El balón de destilación que contiene el digesto se añade 13 a 15 ml de hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.

Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloración verdusca y su volumen sea más o menos 3 veces del volumen inicial)

TITILACIÓN.

Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y valorizarla.

Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

IV. CUESTIONARIO

Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.

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Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas simples y dos proteínas conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de determinación del nitrógeno

Efectué los cálculos y determine el contenido de proteínas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante la etapa de digestión

Explique el objetivo de la etapa de destilación.

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Explique porque la titulación se hace con ácido sulfúrico y no con un álcali.

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V. OBSERVACIONES

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VI. CONCLUSIONES

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VII. BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA 4

SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS

I. OBJETIVO:

Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de aminoácidos presentes en una muestra biológica.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.

Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o alcalina; éste proceso rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por métodos cromatográficos.

Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para formarlos son los a -aminoácidos.

Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.

In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.

El pKa de los grupos carboxílo y amino de los alfa -aminoácidos es aproximadamente 2 y 10 respectivamente.

Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá perdido un protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la forma ZWITTERION.

En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos que se incorporan a las proteínas.

Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)

Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos modificados que se hallan en las proteínas.

La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas, básicas, neutras) permite una gran complejidad funcional en las proteínas.

CROMATOGRAFÍA

Método de Separación

Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas.

En estos métodos se emplea:

- Fase estacionaria : Sólido/líquido

- Fase móvil : liquido/gas

“Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria por medio de una fase móvil que fluye”.

Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los componentes de la muestra.

Cromatografía en Capa Fina

Tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.

El soporte o Fase Estacionaria.

Es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido pueden ser.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.

En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.

III.PROCEDIMIENTO:

Primer Proceso: Sembrado de la muestra

Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.

Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y 2 mm de diámetro.

La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusión

Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de un solvente de elusión.

Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

“El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.

El solvente comienza a subir por capilaridad.

Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus componentes algunos migrarán rápidamente otros no.

Tercer Proceso: Visualización o Revelado

El producto puede verse:

Por sí mismo porque tiene color.

Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.

Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna donde está la mancha dando coloraciones amarillas profundas.

Usando métodos químicos, usando una sustancia química como revelado, ( en este caso ninhidrina en butanol)

Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia patrón en idénticas condiciones.

“La razón de estas distancias se designa por Rstd”

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras

Corrida cromatográfica. Elusión

Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)

Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa.

Revelado del cromatograma

- Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.

- Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello.

- Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa. Secar la placa con una secadora.

Identificación

Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rfde los estándares y luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.

Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una coloración azul violeta.

V. CUESTIONARIO:

5.1. Haga un esquema de los resultados observados.

5.2. Calcular los Rf de los estándares y muestras.

5.3. Identificar que aminoácidos están presentes en las muestras problemas.

5.4.

5.5. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de intercambio iónico y cuáles son sus aplicaciones.

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5.6. Qué métodos existen para el análisis de aminoácidos de las proteínas.

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5.7. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y alúmina.

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5.8. Haga el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.

5.9. La cromatografía en capa fina separa las sustancias según su peso molecular.? Fundamente.

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VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA 5

REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

I. OBJETIVOS:

Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos. Diferenciar experimentalmente monosacáridos, disacáridos y

polisacáridos. Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono en

reductores y no reductores. Estudiar las propiedades del almidón.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Se denominan carbohidratos o glucósidos los derivados aldehídicoscetónicos, reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensación según la cantidad de glucósidos o azúcares sencillos que se obtengan por hidrólisis de los policarbohidratos.

Se les clasifica como:

Polisacáridos (celulosa, almidón)Trisacáridos (rafinosa)Disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y Monosacáridos

Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o cetosas por el. número de átomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).

Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo y, además, algunas específicas. Todos son óptimamente activos. Por el calor y la acción de ácidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.

Los hidratos de carbono más abundantes de la biósfera están constituidos por el almidón y celulosa que son polímeros de glucosa presentes en plantas.

El almidón está distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y en tubérculos como reserva alimenticia para el momento de la germinación. Todos los tipos de almidón producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidón.

La hidrólisis del almidón catalizada por ácidos lo convierte en varias clases de dextrinas, en maltosa y por último en D (+) glucosa.

El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis puesto que la coloración va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgánico.

Los grupos funcionales existentes en el almidón y en la celulosa son los grupos hidroxilo y acetal. Estos polisacáridos tienen diferente configuración, siendo el almidón un glucósido y la celulosa un f -glucósido. También difieren en el tamaño teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidón.

III.MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivo Molisch

Reactivo Fehling

Reactivo Tollens

Reactivo Seliwanoff

Reactivo Barfoed

Sol. glucosa 1%

Sol. fructuosa 1%

Sol. sacarosa 1

Sol. lactosa 1%

Sol. almidón 1%

Sol. sacarosa 5%

Sol. HCl 10%

Sol. NaOH 10%

Sol. yodo - yodurado

Tubos de ensayo

Pipetas

Baño de agua hirviente

Pinzas

Baño hirviente

Vaso de precipitados

Luna de reloj

IV. PROCEDIMIENTO:

Reacciones genéricas de los carbohidratos

Reacción de Molisch

En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solución de glucosa al1%, 1 ml. de solución de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solución de sacarosa al 1%, 1 ml. de una solución de lactosa al 1%, 1 ml. de una solución de almidón al 1% y en el último 1 ml. de agua (testigo). A cada una agréguele 2 gotas

de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml. de ácido sulfúrico concentrado.

Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase entre los dos líquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.

Reacciones Específicas

Reacciones de Fehling

En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solución A de Fehling con 0.5 ml. de la solución B de Fehling, agrégueles 1 ml. de la solución de los carbohidratos utilizados en el experimento anterior.

Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay cambios de color, formación de precipitados.

Reacción de Tollens

En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens recientemente preparado, añadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.

Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay formación de espejo de plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reacción.

Realice una comparación de estos resultados con los de la prueba de Fehling.

Reacción de Seliwanoff

En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego añada 3 gotas de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a baño hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido.

Reacción de Barfoed

En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego añada 1 ml. de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a baño hirviente y observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que indicará la presencia de monosacáridos.

Los disacáridos también precipitan óxido cuproso, pero muy lentamente.

Hidrólisis de la Sacarosa

En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solución de sacarosa al 5%, llévelos a baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes iguales de agua para el primer tubo, ácido clorhídrico al 10% en el segundo tubo, e hidróxido sódico acuoso al 10% en el tercero.

Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuación la reacción de una porción de cada mezcla con la solución de Fehling. ¿Qué conclusiones deduce?

Ensayo del Almidón frente al Iodo

En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%, añada una gota de solución de Iodo - lodurada, observe el color de la solución. Luego caliente la solución coloreada a ebullición y observe el efecto, observe también qué efecto produce el enfriamiento de la solución.

Hidrólisis del Almidón

En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de almidón al 1%, añada 1 ml de ácido dorhídrico concentrado. Hierva la

solución y retire muestras de Y ml. a intervalos próximos, ensayando su reacción frente al iodo. Anote el color en los diferentes ensayos.

Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo, neutralícela y ensaye la reacción de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la hidrólisis del almidón (un disacárido y un monosacárido).

V. CUESTIONARIO:

5.1. Indique la composición de los reactivos utilizados en la práctica (R. Molish, R. Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de producción de la glucosa a nivel industrial.

5.3. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras de almidón?

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5.4. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis del almidón?

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VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA 6

DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

I. OBJETIVOS:

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de describir y demostrar de manera cualitativa las propiedades químicas de las proteínas en base a los siguientes aspectos:

Solubilidad de las proteínas.

Las propiedades electroquímicas de las proteínas.

El efecto ácido-básico en la solubilidad de las proteínas.

II. PRERREQUISITOS:

1. Salting In y Salting Out.

2. Agentes precipitantes de proteínas.

3. Propiedades fisicoquímicas del agua.

4. Ecuación de Henderson-Hasselbach.

III. INTRODUCCIÓN:

Se considera a las proteínas como polímeros biológicos de aminoácidos. En las proteínas existen 20 tipos de aminoácidos diferentes los cuales están en un número y secuencia determinados por el código genético.

Con respecto a su tamaño, las proteínas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variación de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la más simple la estructura primaria y la más compleja la estructura cuaternaria cuya conformación depende de diferentes fuerzas químicas de atracción y repulsión que son ejercidas sobre la estructura molecular de la proteína y por lo tanto son responsables de su estabilidad.

Por convención se acepta dividir a las proteínas en dos grupos: proteínas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades químicas y físicas. Sin embargo, para los fines que se persiguen en esta práctica se les mencionara en forma general.

Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son: La fuerza iónica del medio, el pH. la temperatura y la constante dieléctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de

estos factores, la proteína responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan drásticamente que desnaturaliza a la proteína. Por fortuna, en nuestro organismo, la variación de tales factores es mínima por lo que son imperceptibles los cambios en la proteína.

IV. MATERIAL:

13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm

1 pipeta de 10 ml

5 pipetas de 5 ml

1 pipeta de 5 ml

1 gradilla

V. METODOLOGÍA:

En esta práctica se trata de provocar cambios de solubilidad en proteínas que se encuentran en el organismo, mediante la modificación las propiedades de los solventes, para establecer una relación con los efectos que se pueden presentar en el organismo.

Fundamento Químico:Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solución en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitación proteica.

La adición de una sal a una solución proteica modifica la constante dieléctrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la proteína. Sin embargo, cuando se añade exceso de una sal, se neutralizan las cargas de la proteína y ésta tiende a precipitar. Este mismo efecto ocurre al añadir sales metálicas cargadas electropositivamente. Con la adición de un ácido o una base a una solución proteica se alcanza un estado en que hay el mismo número de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la proteína y tiende a precipitar. El pH que determina el número igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoeléctrico.

Experimento No. 1

Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.Preparar una solución de caseinato de sodio, tomando 250 mg de caseína, 20 mLde agua destilada y 5 mL de NaOH 1N. Cuando la solución sea perfecta, se agregan 5 mL de ácido acético 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 mL con agua destilada. Si la solución no está suficientemente clara, se puede filtrar. • Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuación

Tubo

pH

Agua destilada

Ac. Acetico 0.01N

Ac. Acetico 0.1

Ac. Acetico 1.0N

Caseinato de Sodio

1 8.38 0.62 0 0 1.0

2 7.75 1.25 0 0 1.03 8.75 0 0.25 0 1.04 8.5 0 0.5 0 1.05 8.0 0 1.0 0 1.06 7.0 0 2.0 0 1.07 5.0 0 4.0 0 1.08 1.0 0 8.0 0 1.09 7.4 0 0 1.6 1.010 5.8 0 0 3.2 1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad de la caseína en cada tubo. Reportar el punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor precipitación.

Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Hendersosn-Hasselbach.

Experimento No. 1

Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.

Tubo pH Solubilidad

123456789

Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína ?

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VI. CUESTIONARIO:

6.1. De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el agua.

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6.2. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca la adición de un ácido o una base fuerte.

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6.3. Explique cómo afecta un cambio en la constante dieléctrica del agua a la solubilidad de una proteína.

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6.4. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

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6.5. Qué es el Saltingout y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

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6.6. Qué relación existe entre el punto isoeléctrico y la solubilidad de una proteína.

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6.7. Qué es la ecuación de Henderson-Hasselbach y en que casos está indicado utilizarse.

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6.8. Mencione que propiedades fisicoquímicas de la albúmina le permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofóbicos a través de un medio acuoso.

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VII. OBSERVACIONES

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VIII. CONCLUSIONES

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IX. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA 7

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.

I. OBJETIVOS

1) Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica (fermentación) en levaduras.

2) Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la respiración celular.

3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reducción, modificación de pH e inhibidores en la interpretación de sus resultados.

II. ACTIVIDADES

Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).

La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)

El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO2.

III.PROCEDIMIENTOS.

3.1. Complete la siguiente batería de tubos:

Tubos 1 2 3 4

Suspensión de levadura 7%

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Sol. Glucosa

0 1 ml 1 ml 1 ml

Sol. NaF 0 0 1 ml 0

Agua destilada(43°C)

2 ml 1 ml 0 0

Sol.Rojo Neutro

0 0 0 1 ml

Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionándolo girar rápidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elástico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un baño de agua a 43°C.

3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solución en el tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua.

3.4. Cuál es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.

3.5. Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:

1. Solución de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua destilada a 43°C y completar a 100 ml con agua destilada a 43°C.

2. Solución de glucosa 0,1 M

3. Solución de NaF0,1 M

4. Solución rojo neutro 0,02 M

Papel pH.

IV. OBSERVACIONES

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V. CONCLUSIONES

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VI. BIBLIOGRAFÍA

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PRÁCTICA. 8

INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.

I.- OBJETIVOS

1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.

2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.

3) Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación

II.- ACTIVIDADES

Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).

La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)

El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO2 y por la concentración del producto formado o por la disminución de la concentración del sustrato (en grados Brix)

III.- MATERIALES.

- Material biológico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas- Reactivos: Agar-agar, solución de glucosa 5%- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodérmicas de

20cc, espátulas, picetas, papel toalla.- Equipos: Balanza, refractómetro, baño maría.

IV.- PROCEDIMIENTO

Acondicionamiento de materiales:Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua destilada. En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento y agitación constante.Calibrar el baño de maría a 40ªC, para mantener dentro del agar licuado.Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeración (aproximadamente 4ªC), por 30 minutos.Inmovilización de la enzima:

Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y homogenizar.Tomar con una hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves.Secar los pellets en papel toalla.

Obtención del mosto de uva:Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.Filtrar con una gasa el jugo obtenido.Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.Obtención de etanol:Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de una solución de glucosa al 5%). To0mar una alícuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alícuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix en el refractómetro para cada alícuota.

V .- CUESTIONARIO.

1.-Indique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o células.

Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solución. Permiten un uso

continuo, reutilización y control de las concentraciones de proteína empleada. Asimismo, es viable

mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en función del pH y la temperatura, además, al ser

inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolíticas, aumentando así la eficiencia del sistema. Sin

embargo, la inmovilización también puede presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la

enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilización, además, la velocidad de reacción puede

estar limitada por la velocidad de difusión de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.

L a i n m o v i l i z a c i ó n d e c é l u l a s e s l a u n i ó n o s u i n c o r p o r a c i ó n e n

u n s i s t e m a d e f a s e s ó l i d a e s p e c í f i c a q u e p e r m i t e e l i n t e r c a m b i

o d e sustratos, productos, inhibidores, etc. Pero, al mismo tiempo, separa la

b i o m a s a c e l u l a r c a t a l í t i c a d e l a f a s e q u e c o n t i e n e l o s s u s t r a t o s

y productos.L a t e c n o l o g í a d e i n m o v i l i z a c i ó n c e l u l a r d i s m i n u y e l a m a y o r í a d e

l o s problemas que plantea la fermentación utilizando células libres. Este sistema

tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa alinicio de la fermentación.

Además, facilita el sistema de operación delp r o c e s o d e f e r m e n t a c i ó n c o n t i n u a ,

e v i t a n d o e l p a s o d e e l i m i n a r

l a s c é l u l a s d e l f e r m e n t a d o r . L a i n m o v i l i z a c i ó n c e l u l a r

d e s a c o p l a e l c r e c i m i e n t o m i c r o b i a n o d e l o s p r o c e s o s m e t a b

ó l i c o s d e i n t e r é s industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han

empleadoeste sistema de células inmovilizadas para la obtención de

variadosproductos de interés industrial, como asimismo, en el tratamiento

dedesechos de residuos líquidos y sólidos.

2- Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?.

P o r s u s p r o p i e d a d e s d e a c c i ó n p r o t e c t o r a , s u t e x t u r a ,

e l a s t i c i d a d , transparencia relativa y reversibilidad es muy empleado como

agentede suspensión, estabilización y espesamiento.Por existir muy pocos

microorganismos que metabolizan el Agar-Agar oque elaboran enzimas capaces de

degradarlo, le confiere una mayorestabilidad, con respecto a geles de otros

coloides naturales, que

loh a c e n m u y ú t i l c u a n d o e s u s a d o c o m o m e z c l a c o n o t r o s

g e l e s , polisacáridos y proteínas, en el sentido que la degradación marcada

noo c u r r e c u a n d o s u s d i s p e r s i o n e s s o n m e z c l a d a s . U n g e l

c o n u n a concentración de 1,5% en peso, funde entre 60ºC y 97ºC.Una

característica muy importante en la calidad del Agar-Agar, es su resistencia a

ser vencido, en estado de gel, por la presión. Esta fuerzade gel debe ser medida bajo

ciertas condiciones y se define como lapresión en gr/cm2 de superficie que

resiste un gel, de concentración1,5% en peso y durante 20 segundos a 20ºC.

3.- Explique las características coagulantes del agar-agar.

Por sus propiedades de acción protectora, su textura, elasticidad, transparencia relativa y reversibilidad es muy empleado como agente de suspensión, estabilización y espesamiento.

Por existir muy pocos microorganismos que metabolizan el Agar-Agar o que elaboran enzimas capaces de degradarlo, le confiere una mayor estabilidad, con respecto a geles de otros coloides naturales, que lo hacen muy útil cuando es usado como mezcla con otros geles, polisacáridos y proteínas, en el sentido que la degradación marcada no ocurre cuando sus dispersiones son mezcladas. La temperatura de fusión de un gel es función de la concentración y del peso molecular. Un gel con una concentración de 1,5% en peso, funde entre 60ºC y 97ºC.

La viscosidad de las dispersiones de Agar-Agar es altamente influida por el tipo de alga

y las condiciones del proceso utilizado. La viscosidad de una dispersión de Agar a 45ºC

permanece relativamente constante, entre pH 4,9 y 9,0, que no es muy afectada por el

tiempo, ni por la fuerza iónica, cuando el pH está entre 6,0 y 8,0. Sin embargo, cuando

comienza la gelificación, la viscosidad aumenta con el tiempo, a temperatura constante.

4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las células

de levadura, si estas están atrapadas en la matriz de agar-agar.

Se ha descubierto que en algunos casos es mejor inmovilizar (reducir el movimiento) de

algunas levaduras para que pueda atacar enzimáticamente mejor y con mayor eficiencia

sobre el substrato de hidratos de carbono evitando que los microorganismos se difundan

facilitando su recuperación (los biocatalizadores suelen ser caros), para ello se emplean

'fijadores' como agar, alginato de calcio, astillas de madera de bálsamo, etcétera.14

5- Presente al menos un caso detallado de aplicación de la

inmovilización de enzimas.

Aplicaciones médicas

Existen muchas enfermedades causadas por una alteración o carencia de una determinada enzima.También hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones terapéuticas. Eltratamiento con estas enzimas inmovilizadas permitiría una acción más prolongada, ya que serían másresistente a la acción de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento deleucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. En la actualidad se hadiseñado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada (19). La tripsina ola colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, úlceras, etc.; paraacelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y también para inhibir el crecimiento dealgunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas ofibras que formarán parte del tejido de apósitos y vendas (20).

Aplicaciones en la Industria Alimentaria

Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparación y la conservación de losalimentos. Normalmente, las enzimas solubles añadidas son inactivadas por calentamiento una vez queel tratamiento ha concluido. En ocasiones se permite que continúe su actividad para que los alimentosdesarrollen el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La inmovilización permite que lasenzimas puedan ser reutilizadas repetidamente en operaciones continuas o discontinuas. De todasmaneras, existen limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos económicos y sanitariosinherentes al procesado de alimentos (28). A continuación se resumen algunas de las aplicacionesconocidas de las enzimas inmovilizadas en la industria alimentaria:1) En la hidrólisis de proteínas:Las enzimas proteolíticas se emplean en la modificación del contenido proteico de los alimentos.De esta forma se han conseguido hidrolizados de proteínas de trigo mediante el uso de pepsina yproteasa coinmovilizadas en chitosan (21). Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en ladisminución del contenido de lactoglobulina en la leche (29), en la industria quesera y en la solubilizaciónde concentrados proteínicos de pescado.En la obtención de edulcorantes y aditivos alimentarios (21):En la obtención industrial del ácido L-málico interviene la fumarasa de Brevibacterium flavumatrapada en k-carragenato. Este es un aditivo importante para zumos de frutas, refrescos, mermeladasy dulces. También, las enzimas inmovilizadas permiten la obtención industrial de edulcorantes alimentarios

como el aspartamo, fructooligosacáridos, diversos dipéptidos, etc.

6- Qué otros métodos para la inmovilización se utilizan?

II.1 Clasificación de métodos de inmovilizaciónLos métodos de inmovilización de enzimas se clasifican en dos rubros: métodos reversibles y métodos irreversibles (Gupta y Mattiasson, 1992).

2.1.1 Métodos de Inmovilización IrreversiblesEl concepto de inmovilización irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente, por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biológica o el soporte. Los procedimientos más comunes de inmovilización irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado, atrapamiento y micro encapsulado.a) Formación de enlaces covalentesLa inmovilización de proteínas por métodos basados en la formación de enlaces covalentes están entre los más usados. La ventaja de estos métodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el soporte. De igual manera, las enzimas en este método no son liberadas en la solución en uso. Sin embargo, para lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad catalítica no deben involucrar un enlace covalente con el soporte aunque esto puede resultar difícil de lograr en algunos casos. Los métodos covalentes de inmovilización son empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de enzimas en el producto.

Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico por enlace covalente, las enzimas se encuentran orientadasespacialmente en el soporte

b) Formación de enlaces cruzadosCon esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilización se da por un enlace directo entre enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de unión. Generalmente se añade el agente de bajo peso molecular (ej. glutaraldehído) a la enzima en solución, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar agregados (Figura 2). Este método tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios pequeños de pH y temperatura en las condiciones de operación (Gódia-Casablancas, 2005).

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (líneas negras).c) AtrapamientoEl método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas dentro de una red polimérica que permite al sustrato y a los productos pasar a través de ellos y retener las enzimas (O’Driscoll, 1976). Este método difiere de los métodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos métodos de atrapamiento de enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o atrapamiento por fibras (Dinelli et al, 1976), microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusión. El uso práctico de estos métodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a través de las membranas o geles. Atrapamiento por inclusión. Con este método la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fácil difusión de productos.

Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusión dentro de una matriz de gel.A) gel húmedo. B) esferas del gel seco y triturado.

2.1.2 Métodos de Inmovilización ReversibleEn el método de inmovilización reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo condiciones no extremas. El uso de métodos reversibles para la inmovilización de enzimas es altamente atractivo, principalmente por razones económicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimática decae. Existen distintos método de inmovilización reversible, que a continuación se describen:

Por adsorciónEl método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo

(monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atraídas y retenidas por medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para después lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya que la unión es débil y no afecta su conformación, sin embargo, esta característica hace que al mismo tiempo la unión sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.

Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico. A) Por adsorción, la región positiva de la proteína interactúacon el soporte negativo.

Adsorción no específica. El método de inmovilización reversible más simple es la adsorción no específica, el cual se basa en la adsorción física o enlace iónico (Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorción física las enzimas son unidas a la matriz a través de puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrofóbicas; mientras que enlaces iónicos de enzimas son producidos a través de uniones con sales. La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilización no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la interacción (ej. pH, resistencia iónica, temperatura y polaridad del solvente). La inmovilización por adsorción es fácil de realizar y usualmente preserva la actividad catalítica de la enzima. Dichos métodos son, por lo tanto, atractivamente económicos, pero pueden presentar problemas como la liberación de enzimas cuando las interacciones son relativamente débiles. De igual forma es difícil encontrar condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas.

Adsorción hidrofóbica. Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas, donde la adsorción hidrofóbica ha sido utilizada como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. Consiste en variables experimentales conocidas como el pH, concentración de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la proteína. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitución del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. El éxito de la inmovilización reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976; Caldwell et al, 1982). Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofóbicos ha sido tambiénmostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979).

Quelación o enlace metálico. Sales de metales de transición o hidróxidos depositados en la superficie de soportes orgánicos han podido ser enlazados gracias a la coordinación de los grupos nucleofílicos en la matriz. Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio, siendo este método conocido como inmovilización por enlace metálico (Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metálica o el hidróxido es precipitado en el soporte (ej. celulosa, quitina, acido algínico y bases de sílice) por calentamiento o neutralización. Debido a los factores estéricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinación del metal, por lo tanto algunas de las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos

de enzimas.

La elusión de proteínas enlazadas puede ser fácilmente lograda por competencia con ligantes solubles o disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado lavándolo con un fuerte quelante como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Estos soportes metálicos han sido utilizados ampliamente en cromatografía de proteínas (Porath, 1992; Kagedal, 1998).

Formación de enlaces disulfuro. Estos métodos son únicos, porque aunque se forma un enlace covalente estable entre la matriz y la enzima, es posible que se rompan los enlaces por medio de una reacción utilizando agentes apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Además, debido a que la reactividad de los grupos tiol pueden ser modulados mediante la alteración del pH, la actividad es alta para métodos que usan enlaces disulfuro, con la condición de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson, 1998). Puntos críticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilización sea dirigida a un sitio y/o por un método específico, los enlaces químicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y un método de estabilización único no asegura que las interacciones sean 100% propias del método (Wood et al., 1997).

VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS ¿ C u á l e s e l f u n d a m e n t o d e l r e f r a c t ó m e t r o ?Lo que hace el refractómetro es utilizar una muestra (en nuestro casode mosto) para proyectar la curva que produce la luz en una retícula que contiene una escala permitiendo determinar el ángulo que forma lal u z . E s t e v a l o r e s t á r e p r e s e n t a d o e n g r a d o s B r i x y n o s i n d i c a e l porcentaje de sacarosa presente en la muestra

VI.- CONCLUSIONESRESULTADOS Y DISCUSIÓN:- L a p r i m e r a m e d i d a d e a z ú c a r r e a l i z a d a n o s d a c o m o r e s u l t a d o 1 2 grados Blix.- L a s e g u n d a m e d i d a r e a l i z a d a l u e g o d e m e d i a h o r a n o s d a c o m o resultado 10,6 grados Blix.- L a t e r c e r a m e d i d a r e a l i z a d a a l d í a s i g u i e n t e , l u e g o d e 1 7 h o r a s , n o s da como resultado 8,8 grados Blix.- A l p a r e c e r e n u n p r i m e r m o m e n t o s e c o n s u m i ó g r a n c a n t i d a d d e a z ú c a r y s e p r o d u j o e t a n o l , p e r o e n d e t e r m i n a d o m o m e n t o e s t e consumo se redujo.CONCLUSIONES:

-Los pellets producidos en el laboratorio favorecen la fermentación.-Al medir la cantidad de azúcares consumidos podemos determinar la cantidad de alcohol etílico producido.

VIII.- BIBLIOGRAFÍAhttp://html.rincondelvago.com/agar-agar.html

http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%206/5.html

http://tuinventas.com/attachments/article/1582/arroyo.pdf

PRÁCTICA 9

EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES

I. OBJETIVO.

Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su actividad catalítica.

II. FUNDAMENTO.

Las enzimas son proteínas con acción catalítica.

Las proteínas se encuentran en el interior de las células en un estatus particular, a pH fisiológico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias.

La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven las características estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.

Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica, debido a la enzima ureasa presente en la cáscara.

La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato úrea provoca la hidrólisis de esta con la consiguiente liberación de amoniaco y anhídrido carbónico, según la siguiente reacción.

NH2

O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2

NH2

La actividad ureásica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color amarillo-anaranjado (complejo cuya fórmula se supone sea HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a 420 nm.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

150 gr. De cubierta de frejol, solución de úrea0.3 M, agua destilada

Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.

Espectrofotómetro, Baño María, Balanza, Equipo de filtración, papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Balón de 500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.

IV. PROCEDIMIENTO.

Extracción de la Enzima.

Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fría) , después de 24 horas remover la cáscara por fricción, y proceder a escurrir el agua.

Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO4HNa2) , y 200ml. De solución EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua destilada fría, mezclar ambas soluciones, y enfriar a 4ºC. En un balón de 500 ml.

Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500 ml.

Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar cuidando se mantenga baja la temperatura.

Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.

Centrifugar la suspensión a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solución por un filtro rápido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.

Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido, llevar a refrigeración.

Preparar un cuadro de resultados.

CASCARA

BUFFER

AGUA

EXTRACTO

FINAL (ml)

Determinación de presencia de proteínas en el extracto por espectrofotometría.

Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.

Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml de reactivo biuret.

Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar la presencia de proteínas.

Anotar la lectura de Absorbancia.

Comprobación de La actividad enzimática.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco.

En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer fosfato.

Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.

Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.

Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.

Después de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8 ml.

Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.

Calibrar el espectrofotómetro a 420 nm.

Medir la absorbancia. La muestra de extracto dará coloración y un alta absorbancia por el amoniaco liberado.

V. CUESTIONARIO.

Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la extracción de la enzima ureasa.

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Diga que pruebas se tienen de haber extraído realmente enzimas vegetales.

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Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y la refrigeración.

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Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extracción utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES

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VII.CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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PRACTICA 10

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA

I. OBJETIVO

Determinar la capacidad catalítica o actividad enzimática de la enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.

La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico de la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza.

La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml de solución que transforma o produce 1 mg de sustrato ó producto por minuto medidas en las condiciones optimas de operación de la enzima.

La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cáscara de frejol.

La ureasa cataliza la descomposición de la úrea según la reacción:

NH2

CO + H2O 2NH3 + CO2

NH2

La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de cualquier reacción puede ser determinada midiendo:

1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reacción

2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.

Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 ó NH3) producidos en un tiempo determinado.

Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por medios espectrofotométricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color anaranjado castaño.

2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O

La intensidad del color formado será directamente proporcional a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medirá la absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado).

III.DESARROLLO EXPERIMENTAL.

Materiales.

Preparar 50 ml de solución de urea 0.3 M.

Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M

Reactivo Nessler.

50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4ºC)

100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-4milimoles/ml)

Material de vidrio.

02 fiolas de 50 ml.

02 fiola de 100ml.

08 tubos de ensayo.

01 gradilla para tubos.

01 espectrofotómetro.

baño de hielo.

Incubadora a baño maría.

Determinación de la curva de calibración.

Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio según la tabla siguiente:

Patrón Nº

Concentración (NH3) mol/ml

SO4(NH3)2

nmol/ml

ml de SO4(NH3)2

Buffer (ml)

Nessler (ml )

Volumen final ml

Absorbancia

420 nm.

Blanco

00 0.0 0.0 7.50 0.5 8.0

1 5.0 0.01 7.49 0.5 8.0

2 10 0.02 7.48 0.5 8.0

3 15 0.03 7.47 0.5 8.0

4 20 0.04 7.46 0.5 8.0

5 25 0.05 7.45 0.5 8.0

6 30 0.06 7.44 0.5 8.0

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de calibración.

Medida de la actividad ureasica.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco.

En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer fosfato.

Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.

Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solución de ureasa y 4.8 ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.

Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.

Después de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubación e introducir en baño de hielo para detener la reacción.

Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen total 8 ml, agitar.

Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.

Leer la absorbancia a 420 nm.

IV. CUESTIONARIO

1.- Efectúe los cálculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reacción enzimática.

3.- Calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa en nmol de NH3 producido/min.

4.- Explique por qué durante la reacción debe incubarse a 37ºC

5.- Realizar los cálculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada tubo patrón usados en la construcción de la curva de calibración.

6.- Encontrar la equivalencia por el cálculo del factor de equivalencia y por la determinación analítica de la ecuación de la curva.

7.- Diga si la curva de calibración obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por qué.

8.- Explique por qué es necesario contar con un blanco en las determinaciones de actividad enzimática.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad específica.

I. OBSERVACIONES

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II. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________

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III.BIBLIOGRAFÍA________________________________________________________________________________________

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PRACTICA 11

CINETICA ENZIMATICA EN UREASA

I. OBJETIVO.

Verificar la variación de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la concentración del sustrato.

II. FUNDAMENTO.

La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa, para formarse amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente ecuación.

NH2

CO + H2O 2NH3 + CO2

NH2

Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometría a l = 420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.

Cinética de MichaelisMenten.

La velocidad de las reacciones enzimáticas varían con la concentración del sustrato según una cinética autosaturante que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.

V = Vmax. [S]

Ks + [S]

La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma:

La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la Linearización de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

Donde los parámetros anteriores se relacionan por la ecuación de una recta.

1 = 1 + [S]

vVmaxKs

III.MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.

20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M

50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM.

Agua destilada.

reactivo Nessler.

Baño de hielo.

Equipos y material de vidrio.

fiolas de 50 y 100 ml.

07 tubos de ensayo de 10 ml.

02 matraz de 100 ml.

pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.

Equipo de baño maría.

01 espectrofotómetro Espectronic 20D+

01 termómetro de 0- 100 ºC

IV. PROCEDIMIENTO.

Preparación de muestras.

Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de amonio al 5x10-4 M

Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0.3 M

Calibración del Espectrofotómetro.

A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de concentración del producto formado (NH3), y por

tanto de actividad de la enzima se trazará una curva de equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs. Concentración. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de concentración conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se usará soluciones de sulfato de amonio.

Preparar solución madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su equivalencia con nmol de úrea. Completar la siguiente tabla.

Tabla Nº 1

PATRON nº Sol. de sulfato(ml)

Contenido nmol de sulfato

Contenido nmol de NH3

Equivalencia en nmol de úrea

1 50

2 100

3 150

4 200

5 250

6 300

Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de la práctica anterior.

Completar la siguiente tabla.

Tabla Nº 2

Muestra Nº Volumen de sulfato tomado ( ml)

NH3 en la muestra (nmol)

Absorbancia

Blanco

1

2

3

4

5

6

Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación que relaciona DO vs

[NH3], haciendo los tratamientos estadísticos que sean necesarios.

Pruebas cinéticas.

A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se muestra.

Preparar solución madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

Tabla Nº 3

Tubo Urea

µMol

Urea o.3M ml

Buffer fosfato ml

Incubar 37°C

3 min

Ureasa

ml

Incubar 37°C

15 min

Baño hielo

Nessler

ml

Reposar

5 min.

Volumen final

ml

Abs

420 nm.

Blanco

0 0 7.0 0.5 0.5 8

1 60 0.2 6.8 0.5 0.5 8

2 120 0.4 6.6 0.5 0.5 8

3 180 0.6 6.4 0.5 0.5 8

4 240 0.8 6.2 0.5 0.5 8

5 300 1.0 6.0 0.5 0.5 8

6 360 1.2 5.8 0.5 0.5 8

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la curva de calibración), y completar la tabla 4

Tabla Nº 4Muestra [urea] en

nmol/ml x10-

2

Densidad óptica(Abs)

Nmol de NH3

producidos

Nmol de urea que reaccionan

1 0.12 1.03 3.04 4.05 5.06 6.0Blanco -

Tratamiento de datos.

Para cada muestra calcular la velocidad de reacción mediante la relación v = P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de reacción enzimática ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

Tabla 5

Muestra [S] nmol/ml. 1/[S] V(nmol/min.) 1/v

1

2

3

4

5

6

Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una línea recta.

Determinar gráficamente los valores de Vmax. Y Ks.

Escribir la ecuación que representa a esta reacción enzimática.

V. OBSERVACIONES________________________________________________________________________________________

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VI. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________

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VII. BIBLIOGRAFÍA________________________________________________________________________________________

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PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO

I. OBJETIVO

Extraer ADN de un tejido animal

II. MARCO TEORICO

El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el almacenamiento y la transferencia de la información genética. Son componentes fundamentales de la célula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.

Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando núcleo proteínas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.

El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula y también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas cantidades.

Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la síntesis de proteínas, y por tanto de las enzimas necesarias para el funcionamiento celular.

Por otra parte el ADN es el vehículo de la herencia que se transmite de padres a hijos de generación en generación.

III. FUNDAMENTO:

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los núcleos, para ello se tritura el hígado de pollo en un mortero.

Al añadir una solución hipertónica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de los núcleos, el detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del ADN, El alcohol tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado de acridina.

IV. MATERIALES

Hígado de pollo 10 gr Cloruro de sodio 2M Etanol 96|° SDS 20% Arena Varilla de vidrio vasos de precipitados Mortero Embudo Pipetas Probetas Gasa

V. METODOLOGÍA

1.- Triturar 10 gr de hígado de pollo, dentro de un mortero, con la adición de 5gr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas celulares.

2.- Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta obtener una papilla.

3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de tejido que quedaron sin romper membranas.

4.- Medir el volumen del filtrado final.

5.- Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de precipitados.

6.- Añadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío, por las paredes, logrando se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.

8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma dirección tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

VI. CUESTIONARIO1. ¿De qué está formada la cromatina?

2. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el hígado?, ¿para qué añadimos arena al triturado?

3. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M?4. ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina?5. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y etanol,

con que finalidadVIII. OBSERVACIONES________________________________________________________________________________________

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IX. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________

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X. BIBLIOGRAFÍA________________________________________________________________________________________

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