UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

INGENIERIA AMBIENTAL

GUIA DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

RECOMENDACIONES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO

Antes de la práctica de laboratorio es obligatorio leer la guía y realizar el flujograma del

procedimiento a realizar. Al iniciar la práctica se realizará un quiz sobre el laboratorio a

desarrollar. Durante la práctica se deben registrar las observaciones y datos obtenidos en

la práctica.

MATERIAL DE LABORATORIO

Cada grupo debe llevar al laboratorio: jabón para lavar el material, papel absorbente. La

falta de los implementos anteriormente mencionados afectará la nota del informe de

laboratorio.

Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, a demás del equipo

especial (por ejemplo centrifugas, balanzas, muflas, estufas, espectrofotómetros, etc.) en

caso de pérdida o daño, deberá responder de ello, y rellenar la correspondiente ficha.

Antes de empezar con el procedimiento experimental o utilizar algún aparato revisar todo

el material, y su manual de funcionamiento en su caso.

El material al igual que el lugar de trabajo debe quedar limpio, si esto no se cumple se

penalizara con la nota del informe.

NORMAS DE SEGURIDAD

El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir

descuidos o bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros

asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en

un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuación se

exponen una serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio:

- Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto de bata con

mangas largas, gafas de seguridad y guantes de látex. La bata deberá emplearse

durante toda la estancia en el laboratorio.

- Las gafas de seguridad siempre que se manejen productos peligrosos y durante la

calefacción de disoluciones. Los guantes deben utilizarse obligatoriamente en la

manipulación de productos tóxicos o caústicos.

- Retírese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de

accidentes mecánicos, químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y

sombreros. La responsabilidad por las consecuencias de no cumplir esta norma

dentro del laboratorio es enteramente del estudiante.

- Nunca deben llevarse lentes de contacto sin gafas protectoras, pues estos

retienen las sustancias corrosivas en el ojo impidiendo su lavado y extendiendo el

daño.

- Está prohibido fumar, beber o comer en el laboratorio.

- El pelo largo se llevara siempre recogido.

- Debe conocerse la toxicidad y riesgos de todos los compuestos con los que se

trabaje.

- Los frascos de los reactivos deben cerrarse inmediatamente despues de su uso,

durante su utilización los tapones deben depositarse siempre boca arriba sobre la

mesa.

- No se debe pipetear ninguna sustancia con la boca.

- Mantenga solo el material requerido para la sesión, sobre la mesa de trabajo. Los

frascos de reactivos deben permanecer en las baldas. Los demás objetos

personales o innecesarios deben guardarse o colocarse lejos del área de trabajo.

- Las vitrinas para gases tienen que utilizarse en todo trabajo con compuestos

químicos que pueden producir gases peligrosos o dar lugar a salpicaduras.

- No deben manipularse jamás productos o disolventes inflamables en las

proximidades de llamas.

- Si algún reactivo se derrama, debe retirarse inmediatamente dejando el lugar

perfectamente limpio.

- Las salpicaduras de sustancias básicas deben neutralizarse con un ácido débil

(por ej. Acido cítrico) y las de sustancias acidas con una base débil (bicarbonato

sódico).

- No deben verterse residuos sólidos en los fregaderos, deben emplearse los

recipientes para residuos que se encuentran en el laboratorio.

- Los ácidos y bases concentrados se encuentran en la vitrina del laboratorio. En

ningún caso deben sacarse de la vitrina, cuando se requiera un volumen de estos

reactivos se llevara el recipiente adecuado a la vitrina para tomar allí mismo la

cantidad necesaria.

- Cuando se tengan dudas sobre las precauciones de manipulación de algún

producto debe consultarse al profesor antes de proceder a su uso.

- Los recipientes utilizados para almacenar disoluciones deben limpiarse

previamente, eliminando cualquier etiqueta anterior y rotulando de nuevo

inmediatamente.

- No calentar nunca enérgicamente una disolución. La ebullición debe ser siempre

suave.

- El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero

como la toma del gas de la mesa.

- Las disoluciones y recipientes calientes deben manipularse con cuidado.

- Las heridas y quemaduras deben ser tratadas inmediatamente.

- En el caso de salpicaduras de ácidos sobre la piel lavar inmediatamente con agua

abundante, teniendo en cuenta que en el caso de ácidos concentrados la reacción

con el agua puede producir calor. Es conveniente retirar la ropa para evitar que el

corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

- Debe conocerse la ubicación de los elementos de seguridad (lavaojos, ducha,

extintor, salidas de emergencia) en el laboratorio, así como todas las indicaciones

sobre seguridad expuestas en el laboratorio.

- No debe llevarse a la boca ningún material de laboratorio; si algún reactivo es

accidentalmente ingerido, avise de inmediato al profesor o al técnico del

Laboratorio.

NORMAS DE TRABAJO

- Las disoluciones de reactivos, que no sean patrones ni muestras, se almacenan

en botellas de vidrio o plástico que deben limpiarse y rotularse perfectamente.

- Las balanzas deben dejarse a cero y perfectamente limpias después de finalizar la

pesada.

- Cerca de las balanzas solo deben permanecer los estudiantes que se encuentren

pesando (uno por balanza).

- Las sustancias patrón tipo primario anhidras se encuentran en el desecador y solo

deben extraerse el tiempo necesario para su pesada. El desecador debe

permanecer siempre cerrado.

- El material asignado a cada practica debe permanecer en el lugar asignado a

dicha práctica.

- No se debe utilizar material destinado a prácticas distintas a la que se está

realizando.

- Bajo ningún concepto se sacaran reactivos o material de prácticas fuera del

laboratorio.

CALENTAR

- Para recoger recipientes calientes como capsulas, crisoles, vasos, etc., utilizar las

correspondientes pinzas.

- También nos podremos ayudar de un paño del laboratorio.

- Cuando se calienten líquidos, evitar que la posible proyección pueda alcanzar a

cualquier persona o reactivo incompatible. Al calentar una solución en un tubo de

ensayo, debe hacerse bajo el nivel del líquido y constantemente agitando. No debe

apuntarse con el tubo al compañero o a sí mismo, pues puede proyectarse.

- Al calentar vidrio, dejar enfriar antes de cogerlo. Colocarlo sobre un material

térmicamente aislante, el vidrio caliente tiene el mismo aspecto que el vidrio frío.

- No manipular productos inflamables (benceno, tolueno, éter, etc.) en presencia de

mecheros encendidos. No destilar éter con llama o en presencia de mecheros

encendidos.

- Procure mantener la llama del mechero de color azul, ya que la llama amarilla

produce tizne.

PUESTO DE TRABAJO

- Conservar siempre limpios los aparatos y el puesto de trabajo. Evitar derrames de

sustancias, pero si cayera alguna, recogerla inmediatamente.

- Todas las practicas deberan realizarse con limpieza y, al terminar, toda el area de

trabajo deberá quedar ordenada y limpia.

MANEJO DE SUSTANCIAS

- No tocar los productos químicos con las manos. Usar papel, espátulas, etc. Usar

guantes para el manejo de reactivos corrosivos y/o altamente tóxicos. Una vez

finalizada la práctica de laboratorio lavarse las manos.

- Al usar cualquier tipo de reactivos, asegúrese que es el deseado y lea su etiqueta.

Si es transferido de recipiente etiquételo de nuevo.

- Todos los reactivos deberán manejarse con el equipo perfectamente limpio. Al

pipetear líquidos transfiéralos a otro recipiente para su uso. Los reactivos no

usados no se devuelven a los frascos.

- Nunca pipetee directamente del frasco.

- No manejar reactivos sin haber leído sus frases R y S, registrando sus

propiedades su preinforme.

- Dilución de ácidos: añadir lentamente el acido al agua contenida en un vaso,

agitando constantemente y enfriando el vaso receptor. Nunca añadir agua al

ácido.

- Al agitar moderadamente un tubo de ensayo golpee con la punta del dedo la base

del tubo. Cuando requiera una agitación vigorosa por inversión del recipiente,

tápelo con un tapón de vidrio esmerilado o papel Parafil. Nunca lo haga con la

mano.

RESIDUOS

- En el laboratorio se encuentran disponibles contenedores para la disposición de

residuos líquidos (acuosos, orgánicos, con metales, etc.) no se debe arrojar nada

por la cañería ni al piso del laboratorio. Si ocurre algún accidente avise

inmediatamente para aplicar el procedimiento adecuado.

- Todos los desperdicios sólidos y papeles deberán colocarse en los bidones de

basura, el material de vidrio roto deberá descartarse en el recipiente especial para

ese efecto.

LECTURA DE VOLUMEN

- En aquellos recipientes de cuello estrecho (pipeta, bureta, matraz aforado) se

forma un menisco que es la superficie cóncava o convexa que separa a la fase

liquida de la fase gas.

- Las fuerzas de adsorción entre la superficie del vidrio y el líquido provocan la

curvatura del menisco. La lectura del volumen ha de de realizarse de tal modo que

los ojos estén en un plano tangente al menisco. Ver Figura 1.

PRÁCTICA DE LABORATORIO: PH Y SOLUCIONES BUFFERS

Objetivos

1. Identificar el pH de soluciones de interés.

2. Observar el efecto amortiguador de las soluciones buffer.

Materiales

· 2 vasos de precipitado de 50 mL

· 1 probeta de 50 mL

· 2 Pipetas aforadas de 1 mL

· Papel indicador

· Papel tornasol

· pH-metro

Reactivos

· Solucion Buffer*

· Acido clorhidrico 0.1M

· NaOH 0.1M

* Buffer: Mezclar 250mL acido acetico 0.1M y 250 mL de acetato de sodio 0.1M (recien

preparado).

Cada grupo debe llevar al laboratorio leche de magnesio, vinagre, gaseosa

Procedimiento

Experimento I

1. Envasar aproximadamente 10 mL de leche de magnesio en un vaso de precipitado

correctamente lavado.

2. Medir el pH con el papel tornasol y papel indicador universal.

Repita el procedimiento con vinagre, gaseosa y agua.

Experimento II

1. Medir el pH de la solución Buffer.

2. Colocar en la probeta 20 mL del buffer y completar hasta 50 mL con agua destilada.

Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.

3. Colocar en la probeta 25 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la

pipeta graduada 1.0 mL de HCl 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.

4. Colocar en la probeta 25 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0

mL de HCl 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.

5. Colocar en la probeta 25 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la

pipeta graduada 1.0 mL de NaOH 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.

6. Colocar en la probeta 25 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0

mL de NaOH 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.

Registre sus observaciones

Experimento I: Construir una tabla donde se muestren los valores de referencia de pH

para estas muestras y los valores experimentales. Analizar

Experimento II: Determinar el pH teórico de cada una de las soluciones preparadas y

compararlas con los resultados experimentales. Calcular el error.

PRACTICA DE LABORATORIO: PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE

CARBOHIDRATOS

Objetivo

1. Identificar una muestra problema a partir de reacciones químicas.

2. Identificar los diferentes tipos de carbohidratos

Fundamento

Los carbohidratos son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas, conocidos como aldosas

y cetosas respectivamente, estos grupos funcionales le confieren la base para la mayoría

de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. Asimismo los

carbohidratos se pueden clasificar por el número de carbonos que posee la estructura.

Cuando un carbohidrato es formado por una molécula se conoce como monosacáridos;

por dos, disacárido y por más de dos, polisacárido. Los disacáridos son dos

monosacáridos unidos gracias a un enlace glucosídico.

Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el

potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que

involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor.

Materiales

6 tubos de ensayo

Pinzas para tubo de ensayo

1 Gradilla

1 Mechero

1 Tripode

1 Malla de asbesto

1 Pipeta de 5 mL

1 Pipeta de 1 mL

1 Vaso de precipitado de 250 mL

Reactivos

Muestra problema

Blancos: agua, glucosa, fructosa, ribosa, sacarosa*

Acido sulfúrico concentrado

Acido clorhídrico concentrado

Solucion de NaOH

Reactivo de Molish

Reactivo de Barfoed

Reactivo de Bial

Reactivo de Seliwanoff

Reactivo de Benedict

* Debido a la sensibilidad de las pruebas, la concentración de las muestras de

carbohidratos debe oscilar entre 1 - 10 g/L.

Preparación de reactivos

Reactivo de Molisch: a-naftol al 10% en etanol.

Reactivo de Barfoed: disolver 13.3 g de acetato de cobre en aproximadamente 200 mL de

agua destilada y agregar 1.8 mL de acido acético glacial.

Reactivo de Bial: Anadir 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de H2O destilada, añadir

1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro ferrico al 1%.

Reactivo de Seliwanoff: tomar 3 mL de resorcinol al 0.5 % en agua, añadir 12 mL HCl

concentrado, añadir agua c.s.p. 35mL.

Reactivo de Benedict: disolver 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio en

800 mL de agua caliente, filtrar a través de papel de filtro en una probeta de 1000 mL,

completar hasta 850 mL.

Mientras tanto, disolver 17.3 g de sulfato de cobre en 100 mL de agua, completar hasta

150 mL.

Verter la primera solución en un vaso de precipitado de 2L y añadir lentamente la solución

de sulfato de cobre agitando continuamente.

Prueba de Molisch

Anadir 1 mL de la solución de carbohidrato a un tubo de ensayo rotulado, posteriormente

agregar 2 gotas del reactivo de Molisch, mezclar. Cuidadosamente agregar

aproximadamente 0.5 mL de H2SO4 concentrado por las paredes del tubo, de tal forma

que se formen dos capas. Un color rojo violeta en la interfase entre el ácido y la solución

acuosa indica una prueba positiva para carbohidratos.

Prueba de Barfoed

A 1 mL de reactivo de Barfoed agregar 0.5 mL de solución de carbohidrato en un tubo de

ensayo debidamente rotulado y mezclar. Poner el tubo en baño de agua hirviendo. La

aparición de un precipitado rojo antes de los 6 min indica la presencia de un

monosacáridos. La aparición de un escaso precipitado rojo después de 9 min indica la

presencia de disacárido o polisacárido.

Prueba de Bial

En un tubo de ensayo agregar 2.5 mL de reactivo de Bial y luego agregar

aproximadamente 1 mL de la muestra. Llevar a baño de maría hirviente durante 3 min. La

aparición de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indica la presencia

de una pentosa. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde, pero esta es

opaca.

Prueba de Seliwanoff

Anadir 1 mL del reactivo de Seliwanoff a 0.5 mL de la solución de carbohidrato en un tubo

de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y colocar el tubo en un baño de agua hirviendo

por 4 minutos. Un color rojo intenso es prueba positiva para cetohexosas. El color es más

fuerte si se continúa calentando, pero en este caso las aldohexosas también darán color

rojo.

Prueba de Benedict

A 2 mL del reactivo de Benedict añadir 8 gotas de la solución de la muestra de

carbohidrato en un tubo de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y calentar la solucion

en un bano de agua hirviente durante 5 minutos. Un precipitado verde; amarillo o rojo,

indica resultado positivo para azucares reductores. Los diferentes colores que pueden

aparecer se deben al tamaño de las partículas formadas: Las partículas grandes forman

precipitados rojo y las partículas pequeñas un precipitado verde. Examinar el color y la

cantidad de precipitado obtenido. Una pequeña cantidad de precipitado no es prueba

positiva.

Prueba de Sacarosa

A 5 mL de la muestra de carbohidrato agregar 5 gotas de HCl concentrado, calentar

durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, enfriar y agregar NaOH hasta que la

solución sea neutra o débilmente alcalina. Con la solución hidrolizada realizar la prueba

de Seliwanoff.

Observaciones

No olvide plantear el diagrama de flujo para cada prueba.

PRACTICA DE LABORATORIO: PRUEBAS DE IDENTIFICACION LIPIDOS

Objetivo

Reconocer algunas propiedades físico-químicas representativas de los lípidos.

Fundamento

Los lípidos son aquellos compuestos que son solubles en compuestos orgánicos e

insolubles en agua.

Saponificación

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose

en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Estos se combinan con

los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las

sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrolisis de los

triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar

a la formación de ácidos grasos y glicerina.

Lieberman-Buchard

El anhídrido acético reacciona con el colesterol en solución clorofórmica para producir un

color característico azul-verdoso. La naturaleza exacta del cromoforo es desconocida pero

la reacción probablemente incluye la esterificación del grupo hidroxilo en la posición 3

junto con otros arreglos en la molécula.

Materiales

· Tubos de ensayo

· Gradilla

· Varillas de vidrio

· Mechero

· Vaso de precipitado

· Pipetas

· Papel de filtro

Reactivos

· Éter etílico

· Cloroformo

· Alcohol etílico

· Solución de NaOH al 20%

· Cloroformo

· Anhídrido acético

· H2SO4 concentrado

· Acido graso (ácido oleico)

· Colesterol

Cada grupo debe llevar al laboratorio aceite de oliva y mantequilla.

PROCEDIMIENTO

Experimento I. Solubilidad

Etiquetar cinco tubos de ensayo con el nombre del disolvente: agua, éter, cloroformo,

alcohol frio y alcohol caliente. Colocar un pedazo de grasa en cada tubo. Verter 1 mL del

solvente en el tubo correspondiente (el alcohol se calienta previamente en el baño María,

tenga en cuenta el punto de ebullición del mismo). Mezclar bien y observar si hay algún

grado de dilución. Colocar en un papel de filtro una gota del líquido contenido en cada

tubo. Esperar a que se seque. Anotar los resultados (clasificar como insoluble, poco

soluble, medianamente y muy soluble).

Repetir el experimento reemplazando la grasa por 1 mL de aceite.

Experimento II. Saponificación

Tomar do tubos de ensayo limpios, en el primero colocar 2 mL de ácido oleico; en el

segundo colocar una muestra de grasa hasta una altura de 0.5 cm aproximadamente.

Agregar 2 mL de NaOH al 20%. Agitar enérgicamente y colocar los tubos al baño María

durante 30 minutos. Después de dejar en reposo, se pueden observar 3 fases: una inferior

clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra

intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipidia de aceite/grasa

inalterado.

Experimento III. Reacción de Lieberman-Buchard

Agregar 1.5 mL de disolución de colesterol en cloroformo un tubo de ensayo, luego

agregar 5 gotas de anhídrido acético y dos gotas de H2SO4 concentrado (este último por

las paredes del tubo), mezclar suavemente. Observar y anotar los cambios de coloración

que se producen.

PRACTICA DE LABORATORIO: PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LOS

AMINOÁCIDOS

Objetivo

Reconocer la presencia de aminoácidos identificando sus características químicas.

Fundamento Teórico

Los aminoácidos son compuestos químicos que cumplen varias funciones dentro de la

célula, entre ellas:

1. Constituyen las unidades monoméricas de las proteínas.

2. Representan la única fuente de nitrógeno metabólicamente utilizable.

3. Aportan entre un 10% y un 20% de la energía que utiliza diariamente la célula.

Desde el punto de vista químico pueden definirse como moléculas orgánicas que poseen

al menos un grupo amino y uno carboxilo. Los aminoácidos proteínicos dictados por el

código genético son veinte y se caracterizan por tener enlazados sus grupos amino y

carboxilo a un mismo átomo de carbono (alfa).

Este grupo de moléculas cuenta con una parte constante representada por el carbono alfa

(Cα), el grupo carboxilo (COOH) y el grupo amino (NH2), por consiguiente todos los

aminoácidos tienen algunas propiedades físico-químicas comunes, aunque debido a que

cada uno posee una cadena lateral o grupo R diferente, los 20 aminoácidos muestran

características especiales y únicas que permiten su clasificación.

Reacciones químicas de los aminoácidos

- Reacción de la Ninhidrina: Esta prueba tiene como finalidad detectar grupos amino

libres. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina en un pH entre 4 y 8, cuando son

expuestos a un exceso de la misma y sometidos a calentamiento (100ºC); si éstos tienen

un grupo amino libre, reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído

con un átomo de carbono menos que el aminoácido precursor. La ninhidrina reacciona

con el amoniaco liberado, formando un complejo azul o púrpura (llamado púrpura de

Ruhemann).

La prueba de ninhidrina en la prolina, genera coloración amarilla debido a que este

aminoácido presenta un grupo imino en vez de un amino. Los polipéptidos, las proteínas

y otros compuestos aminados pueden también reaccionar con la Ninhidrina dando

coloración azul pero sin liberar CO2.

- Reacción de Admakiewic: Esta prueba es específica para grupos indol, los cuales

tienen la característica de reaccionar con aldehídos mediante condensación en presencia

de un agente deshidratante como el ácido sulfúrico. La reacción genera moléculas con

coloración violeta que se aprecian en la interfase del ácido sulfúrico y la solución.

Las proteínas y péptidos que contengan aminoácidos que contengan este grupo, también

darán resultado positivo a la reacción de Adamkiewicz.

-Reacción Xantoproteica: Esta reacción reconoce el grupo fenil presente en una

molécula, con el cual el ácido nítrico forma compuestos amarillos, debido a la nitración del

grupo fenilo que posea una molécula orientadora para posiciones orto del anillo.

Si en este punto se modifica el pH de la solución adicionando un hidróxido de alguno de

los metales alcalinos, se obtiene la sal correspondiente que toma coloración anaranjada.

Los polipéptidos, las proteínas y otros compuestos que posean grupo fenilo, también

darán resultado positivo en esta reacción.

- Reacción de los tiogrupos: Este ensayo detecta la presencia de grupos sulfhidrilo o tiol

(-SH), presente en algunos aminoácidos, y por consiguiente, en algunos péptidos y

proteínas.

La reacción ocurre en presencia de acetato de plomo en medio alcalino, donde debido a

la presencia del tiol, se da la formación de sulfuro de plomo que se observa en la solución

mediante un precipitado oscuro.

Materiales

Reactivos General

Agua destilada

Acetato de plomo 10%

Ácido nítrico concentrado

Ácido sulfúrico concentrado

Albúmina 1%

Cisteína 0.01M

Fenilalanina 0.01M

Fenol 0.1%

Formaldehído

Hidróxido de potasio 40%

Hidróxido de sodio 20%

Metionina 0.01M

Ninhidrina 0.1%

Sacarosa 0.01%

Solución de aminoácidos

Solución desconocida

Triptófano 0.01M

Gradillas para tubos de ensayo

Pinza para tubo de ensayo

Pipetas de 1mL

Pipetas de 2mL

Pipetas de 5mL

Tubos de ensayo

Vaso de precipitado para baño de agua

Mecheros

Pipeteadores

PROCEDIMIENTO

1. Reacción de la Ninhidrina: Etiquetar cinco tubos de ensayo con el nombre de la

solución: Albúmina, metionina, solución de aminoácidos, sacarosa y solución

desconocida, adicionar 1,5 mL de cada una de las anteriores soluciones en el

respectivo tubo, finalmente en cada uno de los tubos agregar 0,5 mL de reactivo

Ninhidrina, agitar todos los tubos de ensayo y mantenerlos en baño de agua en

ebullición durante 5 min. Observar los resultados obtenidos en cada uno de los

tubos, especificando si el resultado es positivo o no.

2. Reacción de Adamkiewicz: Etiquetar 3 tubos de ensayo con el nombre de la

solución: Albúmina, triptófano y solución desconocida, adicionar 0,5 mL de cada

una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo, adicionar en cada uno de

los tubos 3 gotas de formaldehido, agitar los tubos y adicionar cuidadosamente

1mL de ácido sulfúrico, de forma lenta por la paredes del tubo sostenido en una

gradilla. Es una reacción altamente exotérmica y si no se realiza

cuidadosamente pueden producirse salpicaduras y quemaduras. Una vez

termine la reacción no se deben agitar los tubos. Observar los resultados

obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es positivo o no.

3. Reacción Xantoproteíca: Etiquetar 5 tubos de ensayo con el nombre de la

solución: albúmina, triptófano, fenol, fenilalanina y solución desconocida, adicionar

2 mL de cada una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo y finalmente

adicionar en cada uno de los tubos 1 mL de ácido nítrico (adicionar

cuidadosamente el ácido), mantener los tubos en baño de agua en ebullición

durante 30 segundos. Posteriormente enfriar los tubos y adicionar en cada uno de

los tubos 5 mL de la solución de hidróxido de sodio al 20%. Observar los

resultados obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es

positivo o no.

4. Reacción de los Tiogrupos: Etiquetar 4 tubos de ensayo con el nombre de la

solución: albúmina, cisteína, metionina, solución desconocida, adicionar 1 mL de

cada una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo, adicionar a cada uno

de los tubos 1 mL de hidróxido de potasio y 3 gotas de acetato de plomo. Posterior

mantener los tubos de ensayo en agua en ebullición durante 10 minutos. Observar

los resultados obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es

positivo o no.

Al final de la práctica cada grupo debe entregar una hoja con los respectivos

resultados.

PRACTICA DE LABORATORIO: CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE

AMINOACIDOS

Objetivos:

- Aplicar la cromatografía en la detección de aminoácidos.

- Realizar los cálculos del Factor de Retención (FR).

Fundamento:

La cromatografía es una técnica de separación que presenta distintas variantes. En toda

separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra

estacionaria, que se mueven una con respecto a la otra manteniendo un contacto íntimo.

La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen

entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un

tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación.

Los métodos cromatográficos pueden aplicarse a la separación, identificación y análisis

cuantitativo de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, lípidos e

hidratos de carbono.

En esta práctica, vamos a utilizar la cromatografía ascendente sobre papel. La fase

estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes orgánicos y

agua. La celulosa retiene cierta cantidad de agua entrelazada entre sus fibras y da lugar a

un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra que es aplicada sobre ella

y posteriormente se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Según la

solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto a las dos fases así será

su movilidad.

Materiales

General Reactivos A cargo de cada

grupo

- 4 Tubos de ensayo

- Pinza para tubo de

ensayo

- 1 Gradilla

- 1 Pipeta 1 mL

- 1 Pipeta 5 mL

- 1 Vaso de precipitado

de 250

- 1 Probeta 100 mL

- 1 vidrio de reloj grande

- Estufa de

calentamiento a 100°C

- Mezcla de solventes para la

cromatografía: n-butanol:ácido

acético glacial: agua (12:3:5) (aprox

5 mL de la mezcla de solventes para

cada grupo) Preparar el mismo día

de la práctica.

- Solución de ninhidrina al 0,5% en

acetona

- Solución 1. lisina, prolina y

fenialanina al 1%. (1mL por cada

grupo)

- Solución 2. Ácido glutámico, valina

y leucina

- 3 Capilares

- Papel aluminio

- Regla graduada

- Atomizador pequeño

Lápiz

Guantes de látex o

nitrilo.

Toallas absorbentes.

PRACTICA DE LABORATORIO: DESNATURALIZACION Y CUANTIFICACION DE

PROTEINAS

Objetivos

1. Comprobar la desnaturalizacion de proteinas por diferentes efectos.

2. Cuantificar una muestra problema en solucion.

Fundamento

Desnaturalización

La estructura covalente de las proteínas posee un carácter informacional secuencial, que

determina la estructura tridimensional biológicamente activa, terciaria o cuaternaria según

la proteína. La función se ejerce mediante el reconocimiento molecular, el cual se

establece en virtud de la disposición espacial de las cadenas laterales de determinados

residuos de aminoácidos; por tanto, el nivel estructural terciario o cuaternario posee un

carácter informacional-conformacional, que permite el funcionamiento de la proteína. La

presencia de determinados agentes físicos o químicos provoca la ruptura de algunas

interacciones no covalentes, y si están presentes, la de los puentes disulfuros y con ello

se produce, en mayor o menor grado, la perdida de la estructura tridimensional de la

proteína y por ende su función. Este fenómeno se conoce como desnaturalización.

Resulta oportuno precisar que la desnaturalización no afecta los enlaces peptídicos, por lo

que se mantiene el nivel primario.

Cuantificación

En la prueba de Biuret el sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que

contienen dos o más enlaces peptidicos dando un complejo de coloración violeta, la

intensidad del color obtenido es una medida del numero de enlaces peptidicos. Las

proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau para dar un complejo coloreado,

el color que se forma es debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La

intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes y

cambiara según la clase de proteína.

Materiales

· 6 Tubos de ensayo

· Pipeta graduada de 1 mL

· Pipeta graduada de 5 mL

· Termómetro

· Vaso de precipitado de 250 mL

· Gradilla

· Malla de asbesto

· Tripode

· Espectrofotómetro

Reactivos

Proteínas* (5g/L albumina, caseína, gelatina)

Solución de clara de huevo**

Patrón de proteínas (solución de albumina5 mg /mL). Prepárese fresco.

Patrón de proteína (solución de albumina 0.2 mg/mL). Prepárese fresco.

Acido clorhídrico 1 M

Hidróxido de sodio 1 M

Acido nítrico (conc.).

Etanol 96%

Acetona

Reactivo de Biuret. (Disuelva 3 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 9 g de tartrato

sódico potásico en 500 mL de hidróxido de sodio 0.2 M; añada 5 g de yoduro potásico y

complete hasta 1 L con hidróxido de sodio 0.2 M.)

Solución alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 gl/L en NaOH 0.1 M).

Solución de sulfato de cobre-tartrato sódico potásico (5 gl/L CuSO4.5H2O en tartrato

sódico potásico 10 g/L). Prepárese fresco mezclando las dos soluciones preparadas por

separado.

'Solucion alcalina'. Preparese el mismo dia mezclando 50 mL de (1) y 1 mL de (2).

Reactivo de Folin-Ciocalteau. (Diluya el reactivo comercial con un volumen igual de agua,

el mismo día que se va a utilizar. Esta es una solución de tungstato de sodio y molibdato

de sodio en acido fosfórico y acido clorhídrico.

*La caseina se disuelve en un poco de NaOH diluido y las otras proteínas en solución

salina.

** diluir 1.0 mL de clara de huevo hasta 25mL con solución salina

PROCEDIMIENTO

Experimento I. Desnaturalización por pH extremo

A 2 mL de la solución de proteína, agregar lentamente por las paredes del tubo 2 mL de

HNO3 concentrado hasta que se formen dos capas; luego mezcle cuidadosamente los

dos líquidos. Anotar sus observaciones.

Realizar las pruebas para todas las proteínas.

Experimento II. Desnaturalización por calor

En un tubo de ensayo colocar 4 mL de solución proteínica, luego colocar el tubo en un

baño de agua hirviendo durante 10 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Anotar sus

observaciones.

Realizar las pruebas para todas las proteínas.

Experimento III. Precipitación por solventes orgánicos

A 2 mL de la solución de proteína, añadir 2 mL de etanol y agitar cuidadosamente. Repetir

el procedimiento pero adicionando 2 mL de acetona en lugar de etanol.

Realizar las pruebas para todas las proteínas.

Experimento IV. Prueba de Biuret

A 3 mL de la solución de proteína (5 mg de albumina/mL), añadir 4.5 mL del reactivo de

Biuret, mezclar y calentar a 37 °C durante 10 minutos. Dejar enfriar y leer la absorbancia a

540 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas

en la Tabla 1. Determinar la concentración de proteínas de una muestra problema

después de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia).

Experimento V. Método de Folin-Lowry para determinación de proteínas

A 1 mL de la muestra (solución de albumina 0.2 mg/mL) agregar 5 mL de 'solución

alcalina'. Mezclar vigorosamente y dejar reposar a temperatura ambiente por 10 minutos o

más. Agregar 0.5 mL de reactivo diluido de Folin-Ciocalteau en forma rápida y mezclando

inmediatamente. Después de 30 minutos leer la absorbancia contra el blanco apropiado a

750 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas

en la tabla 2. Determinar la concentración de proteínas de una solución problema después

de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia).

Observaciones

Tabular sus resultados, realizar las curvas de calibración y comparar los métodos de

cuantificación de Folin y Biuret.

PRACTICA DE LABORATORIO: CINETICA ENZIMATICA

Objetivos

1. Identificar los factores que afectan la actividad enzimática de la a-amilasa.

2. Determinar la actividad enzimática de la a-amilasa de acuerdo a las diferentes

propiedades que presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas.

3. Determinar experimentalmente las condiciones optimas de temperatura, pH y

concentraciones de enzima y sustrato para la a-amilasa.

Fundamento

La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones

catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por

los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir por:

- la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo.

- la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo.

En esta práctica de laboratorio se comprobara la influencia de la concentración del

sustrato (S), de la enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética de la enzima a-

amilasa salival en su acción sobre los enlaces a1-4 del almidón. Al reaccionar el almidón

con lugol se produce un color azul, y con base en la desaparición del almidón en la unidad

de tiempo podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación

de los factores que influyen en ella.

Materiales

· 5 Tubos de ensayo

· placa de porcelana con excavaduras

· vasos de precipitado

· bano de agua termostatado

· cronometro

· pipeta graduada 1mL

· pipeta 10mL

· gotero

Reactivos

· Solucion de la enzima*

· Agua destilada.

· Solucion de almidon al 1%.

· Cloruro de sodio 1%

· Disoluciones tampon de pH 5.0; 6.8 y 8.0.

· Reactivo de Lugol diluido (lugol:agua 1:2)

· Hielo

*Solucion de la enzima: Se prepara colectando 0.5 mL de saliva (previo enjuague de la

boca con agua

destilada) y diluyendolo hasta 20 mL con agua destilada.

** Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 mL de agua destilada.

Observaciones

Registrar los datos obtenidos de los diferentes experimentos y analice.

Recomendaciones a tener en cuenta para la presentación de Informes

El informe se debe elaborar a mano, hojas tamaño carta y paginadas. El informe será

entregado en la siguiente práctica. Las tablas y figuras deben colocarse en la misma página en que se mencionan o en la siguiente. Para su numeracion se utilizan numeros arabigos en orden consecutivo y no se debe emplear la abreviatura “No.” ni el signo “#”. El titulo de la tabla o figura se debe escribir en la parte superior de la misma. Toda tabla y/o figura se debe relacionar dentro del texto. El informe debe incluir:

- Título de la práctica: debe ir en letra mayúscula. - Fecha de realización de la práctica. - Nombre de los autores. - Numero del grupo y subgrupo. - Resumen: mínimo 5 líneas. - Palabras clave: se plantean 5 a 8 palabras clave o frases que identifiquen los

principales aspectos del trabajo. - Introducción: describir el planteamiento general del tema, dando la información

necesaria en forma concisa y precisa haciendo referencia solamente a la bibliografía directamente relacionada. No se deben incluirrevisiones amplias de bibliografía (no se aceptan páginas de internet, ni repetir lo que está en la guía). En este ítem se incluyen los objetivos de la práctica dentro del texto.

- Datos y cálculos: los datos que se colectan durante la práctica se deben ordenar en tablas (si es posible), asimismo los cálculos se deben presentar en forma ordenada, si un tipo de cálculo se repite, solo se plantea una vez. Siempre que sea posible calcular el error experimental.

- Análisis de resultados: deben presentarse de forma precisa incluyendo, si da a lugar tablas y figuras (las cuales dan origen al análisis y discusión de los resultados), la discusión debe estar enfocada a la interpretación de los datos experimentales. Cuando sea necesario se deben plantear las reacciones.

- Conclusiones: deben estar respaldadas por los resultados y el análisis, una conclusión es clara, corta y concisa.

- Bibliografía: se deben referenciar los autores, titulo, volumen, país y ano de publicación.