PRCTICA No. 1: Desnaturalizacin y precipitacin de protenas

1.1 Marco terico

Se conoce como desnaturalizacin de protenas a todo proceso que, sin

ruptura o formacin de enlaces qumicos, determina una modificacin en las

propiedades de la protena nativa; es decir, en este proceso no se alteran los

enlaces peptdicos, mantenindose tambin la secuencia u orden en que estn

unidos los aminocidos. Se modifican nicamente el ordenamiento espacial.

Las protenas desnaturalizadas son qumicamente ms reactivas y ms

fcilmente hidrolizadas por enzimas. Para muchas protenas, el aspecto ms

visible de su desnaturalizacin es la disminucin de su solubilidad en agua.

La desnaturalizacin de protenas se puede realizar por incremento de la

temperatura, por adicin de cidos o lcalis concentrados, tambin puede ser

producida por algunos solventes orgnicos como alcohol o cetona.

1.2 Competencias

Reconocer la modificacin en las propiedades de protenas por

desnaturalizacin.

1.3 Materiales y equipos

Reactivos

Albmina (coger un huevo y perforar en un extremo, luego extraer la

clara y agregar agua destilada hasta veces el volumen inicial, al final

filtrar)

Acido clorhdrico cc

Alcohol etlico

Hidrxido de sodio 10%

HNO3 cc

HCl cc

NaOH cc

Sulfato de cobre 10%

Solucin de ferrocianuro de potasio K3Fe(CN)6

Materiales

cocinilla elctrica

Pipeta 5 ml (3)

Pisceta

Termmetro

Tubos de ensayo (12)

Gradilla

Fiola 100ml

Probeta 100 ml

Bagueta

Embudo de vidrio

Beaker 250 ml (3)

Gotero (8)

1.4 Procedimiento

Desnaturalizacin de albmina

En cada uno de 5 tubos de ensayo colocar 20 gotas de solucin de

albmina

El primer tubo se calienta poco a poco observando la temperatura

aproximada a la que tiene lugar la coagulacin.

Al segundo tubo se adiciona 30 gotas de alcohol etlico.

Al tercer tubo adicionar 5 gotas de cido clorhdrico concentrado.

Al cuarto tubo aadir 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Al quinto tubo, aadir 1 ml de solucin concentrada de NaOH.

Anotar en que casos se produce la coagulacin.

Precipitacin de protenas mediante cationes

A seis tubos adicionar las siguientes soluciones:

Al tubo A adicionar 20 gotas de agua

Al tubo B adicionar 20 gotas de solucin de albmina.

Al tubo C adicionar 20 gotas de agua ms 3 gotas de cido clorhdrico

al 10%.

Al tubo D adicionar 20 gotas de solucin de albmina ms 3 gotas de

HCl al 10%.

Al tubo E adicionar 20 gotas de agua ms 3 gotas de solucin de NaOH

al 10%.

Al tubo F adicionar 20 gotas de solucin de albmina ms 3 gotas de

solucin de NaOH al 10%.

A continuacin, adicione a cada tubo 2 ml de solucin de sulfato de

cobre al 10%, agitar los tubos y observe los resultados, haciendo las

comparaciones por pareja.

Precipitacin de protenas mediante aniones

Preparar 3 tubos idnticos a los tubos B, D y F del ensayo anterior. A

cada uno se adiciona 2 gotas de solucin de ferrocianuro de potasio.

Observe el tubo que presente precipitado de protena.

1.5 Resultados

TRATAMIENTO DESNATURALIZACIN DE LA

PROTENA

Calentamiento

Etanol

Acido clorhdrico

Acido ntrico

Hidrxido de sodio

TRATAMIENTO DESNATURALIZACIN DE LA

PROTENA

Cationes CuSO4 en medio cido

Cationes CuSO4 en medio bsico

Aniones K3Fe(CN)6 en medio

cido

Aniones K3Fe(CN)6 en medio

bsico

1.6 Conclusiones

Segn los resultados obtenidos concluya sobre la coagulacin y

desnaturalizacin de protenas.

PRCTICA No. 2: Pardeamiento Enzimtico

1.1 Marco terico

Se denomina Pardeamiento enzimtico a la transformacin enzimtica en sus

primeras etapas de compuestos fenlicos en polmeros coloreados,

frecuentemente pardos o negros. Es muy comn en frutas y vegetales

(manzana, pltano, palta, berenjena, championes, papas) que han sufrido

daos fsicos y/o exponen su tejido interno al aire y la luz. Frecuentemente es

considerado como perjudicial y debe tratar de prevenirse.

El enzima responsable del Pardeamiento enzimtico recibe el nombre de

polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente

cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal

sustrato.

A pesar del nombre genrico de Pardeamiento (browning en ingls), los

colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo

del alimento y de las condiciones del proceso. En algn caso, como en las

pasas, el t o el cacao el Pardeamiento enzimtico contribuye al desarrollo de

los colores caractersticos de estos productos, aunque como se ha indicado, en

otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin del color,

los productos formados pueden reaccionar con las protenas,

insolubilizndolas.

Por otra parte, puede producirse tambin una perdida nutricional, ya que la

polifenoloxidasa no oxida directamente al acido ascrbico, esta vitamina puede

destruirse al reaccionar con intermedios de la reaccin.

Control de la reaccin de Pardeamiento

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce

fundamentalmente mediante la compartimentalizacin de los sustratos. El

enzima se encuentra en los plstidos y cloroplastos (en los vegetales

superiores), y tambin en el citoplasma celular, mientras que los compuestos

fenlicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesculas. Cuando se

rompe la compartimentalizacin por dao mecnico, como el triturado, corte o

congelacin y descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir.

Tambin se produce la inhibicin del enzima por los productos de la reaccin.

Adems de mantener la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento se

puede frenar actuando sobre diferentes factores:

Inactivando la enzima (blanqueo, uso de inhibidores)

Minimizando el contacto con el oxgeno

Creando condiciones desfavorables para la actividad enzimtica

(descenso de pH, bajas temperaturas, reduccin de Aw)

Tratamiento con antioxidantes (ac. Ascrbico, dixido de azufre, etc.)

1.2 Competencias

Determinar el efecto del calor, pH, de la adicin de diferentes compuestos en la

reaccin de Pardeamiento.

1.3 Materiales y equipos

Muestras: manzana, papa, yacn

15 placas petri

Equipo de Bao mara

3 tubos de ensayo pyrex

1 pisceta

2 pipeta de 10 ml

3 lunas reloj

3 beaker de 250 ml

1 cocina elctrica

1 rejilla de asbesto

1 gradilla para tubos de ensayo

1 termmetros

2 fiolas de 100 ml

3 baguetas

1 embudo de vidrio

1 balanza

1 espatula

Licuadora o mortero (para extraer el jugo)

1 pinza de madera

Gasa

Cuchillo

Soluciones de acido ctrico al 0.1, 0.5 y 1 %

Solucin de bisulfito de sodio al 0.1, 0.5 y 1%

Zumo de limn

Agua destilada

1.4 Procedimiento

1.4.1. Formacin de Pardeamiento enzimtico

De forma rpida pelar 3 manzanas y extraer el zumo (diluido con 100 ml

de agua)

De forma rpida filtrar con gasa

Colocar 15 ml de zumo en un Beaker de 100 ml y otros 15 ml en una

placa petri

Dejar reposar por 15 minutos y observar cual de las 2 muestras se

encuentra con mayor grado de pardeamiento.

1.4.2. Efecto de la temperatura

Parte A

Colocar 5 ml de zumo de manzana en cada uno de los tubos de ensayo:

tubos A, B y C.

Tubo A: colocarlo a bao maria a 50 C por 15 minutos

Tubo A: colocarlo a bao maria a 100 C por 15 minutos

Tubo C: mantenerlo a temperatura ambiente

Comparar el grado de pardeamiento en los tubos de ensayo

Parte B

Colocar al mismo tiempo, 4 trozos de vegetal previamiente pelado

(manzana, papa o yacn) en agua hirviendo

Sacar los trozos despus de 30, 60, 90 y 120 seg.

Enfriarlos en agua y cortar cada trozo por la mitad

Observar cual es el menor tiempo necesario para inhibir el

pardeamiento enzimtico de la muestra.

1.4.3. Efecto del pH

Tomar 5 placas petri y rotule con las letras A,B,C,D y E.

Rpidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente

pelado en cada una de las placas petri

Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones:

A: solucin de cido ctrico al 1 %

B: solucin de cido ctrico al 0.5 %

C: solucin de cido ctrico al 0.1 %

D: zumo de limn

E: agua

Dejar durante una hora y comparar el Pardeamiento que haya tenido

lugar.

1.4.4. Efecto del bisulfito de sodio

Tomar 4 placas petri y rotule con las letras A, B, C y D.

Rpidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente

pelado en cada una de las placas petri

Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones:

A: solucin de bisulfito de sodio al 1 %

B: solucin de bisulfito de sodio al 0.5 %

C: solucin de bisulfito de sodio al 0.1 %

D: agua

Dejar durante una hora y comparar el pardeamiento que haya tenido

lugar.

1.4.5. Tratamiento de los tejidos y su efecto en la reaccin de Pardeamiento

Parte A

Cortar la muestra (manzana, papa o yacn) previamente pelado en 4

Dejar una parte en una placa petri

Una cuarta parte del vegetal cortarlas en trozos y colocarlo en una

placa petri

Otra cuarta parte desmenuzar y colocarlo en una placa petri

Comparar el Pardeamiento que se produce en las muestras

Parte B

La cuarta parte dividirla en 2

A una parte dividirla mediante rotura y a otra cortarla usando cuchillo.

Colocar sobre placas petri

Observar el color desarrollado y cual pardea ms rpidamente

1.5 Resultados

Compare el grado de Pardeamiento obtenido en la prctica con alguna fuente

bibliogrfica.

1.6 Conclusiones

Segn los resultados obtenidos concluya sobre el efecto de la temperatura, pH,

bisulfito y la influencia de los tejidos vegetales sobre el Pardeamiento

enzimtico en la muestra utilizada.

PRCTICA N 3: Determinacin cuantitativa de protenas

en harinas y en leche

1.1. Marco terico

El gluten es una protena de los cereales insolubles en agua, que se hidrata

dos veces su peso de agua, est compuesto de dos fracciones, una prolamina

llamada gliadina y una glutelina llamada glutenina que se separan por

precipitacin selectiva con etanol y cido. Las gluteninas son las responsables

de las propiedades elsticas y cohesivas de la harina de trigo en el proceso de

elaboracin del pan.

El trigo es el nico cereal cuya harina rinde cantidades considerables de gluten

y se utiliza esta determinacin como ndice de calidad de harinas. El gluten

hmedo en harinas normales de trigo debe ser igual o mayor a un 25 % y las

cifras normales de gluten seco son 9 a 12% en trigo blando y de 11 a 17% en el

trigo duro. El lmite mnimo admitido es de 5.5%.

Por otro lado, la casena es la principal protena de la leche, se encuentra

dispersa como un gran nmero de partculas slidas tan pequeas que no

sedimentan, y permanecen en suspensin. Estas partculas se llaman micelas

y la dispersin de las mismas en la leche se llama suspensin coloidal. En

estado puro la casena es de color blanco, sin olor e inspida; puede ser

extrada por filtracin usando un filtro de porcelana y las partculas de casena

tal como se presentan en la leche pueden ser observadas con un ultra

microscopio o por uso de un campo oscuro.

La casena se encuentra en la leche en combinacin con el calcio en forma de

caseinato de calcio. Este es precipitado por enzimas y alcoholes y por cidos a

un pH de 4.6. Los mtodos oficiales del AOAC para determinacin de casena

se basan en la precipitacin de la casena y determinacin de nitrgeno en el

precipitado lavado. La casena precipita a menor temperatura que otras

protenas.

Un mtodo sencillo y muy empleado en plantas de alimentos es el mtodo

Walker, el cual es utilizado para determinar protenas totales. Este mtodo se

basa en el hecho de que las protenas y sus productos derivados estn

relacionados con ciertos aminocidos. Estas sustancias poseen propiedades

bsicas debido al grupo amino (NH2) y cidas por el grupo carboxilo (COOH).

Las protenas reaccionan con el formaldehido para formar derivados los cuales

no poseen el grupo amino y por ende pierden sus propiedades bsicas. Las

protenas tienen reaccin neutra a la fenolftalena pero cuando son tratadas

con formaldehido tienen reaccin cida. La naturaleza general del cambio

puede ilustrarse de la siguiente manera:

La glicilglicina se deriva de dos molculas de glicina:

2 (NH2.CH2.COOH) NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2

Glicina Glicilglicina

NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2 + 2(HCHO) 2(CH2N.CH2.COOH) + H2O

Glicilglicina formaldehido cido

1.2. Competencias

Conocer los procedimientos a seguir para la determinacin cuantitativa de

protenas en leche (casena) y harina de trigo (gluten).

1.3. Materiales y equipos

1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos

1 equipo de titulacin

Erlenmeyer de 250 ml (1)

Pipeta de 10 ml (1)

Propipeta

Luna de reloj (2)

Beaker de 250 ml (2)

Bagueta

Estufa

Balanza

Esptula

Solucin de yodo en yoduro de potasio 0.001 N

Solucin de fenolftalena al 1%

Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N

Solucin de formaldehido neutro al 40%

Agua destilada

1.4. Procedimiento

1.4.1. Determinacin de gluten en harinas de trigo por mtodo de lavado

Pesar 100 g de harina. Anote el peso de la muestra (Pm),

mezclarla con 55 ml de agua potable en un beaker hasta obtener

una masa homognea, tape y deje reposar durante 20 minutos.

Coloque la masa en la palma de la mano izquierda y amasarla

bajo el goteo continuo del agua hasta que se arrastre todo el

almidn, evitando que el agua arrastre porciones de la masa.

Para comprobar la presencia de almidn, coloque en una luna

de reloj unas gotas de la solucin de yodo 0.001 N. La aparicin

del precipitado oscuro indica la presencia de almidn.

Al terminar los lavados prense la masa entre las manos bien

secas, repetidas veces hasta obtener un cuerpo muy adherente,

pese sobre una luna de reloj tarada para obtener el gluten

hmedo. Peso del gluten hmedo (P1).

Para obtener el gluten seco, coloque el gluten hmedo sobre un

vidrio de reloj tarado y lleve a la estufa a 105C por una hora.

Retire de la estufa y con una navaja o guillette bien afilado haga

unos cortes longitudinales y lleve nuevamente a la estufa a

140C de 1 a 2 horas hasta peso constante para obtener el peso

del gluten seco (P2).

Clculos:

1.4.2. Determinacin de casena en leche

Pipetear 9 ml de leche en un matraz de 250 ml y adicionar 1 ml

de solucin de fenolftalena al 1%.

Titular con la solucin de hidrxido de sodio hasta obtener un

color rosado profundo homogneo.

Adicionar 2 ml de formaldehido neutro al 40% al matraz y el

color se tornara blanco nuevamente.

Anotar la lectura de la bureta, adicione el lcali nuevamente

hasta obtener nuevamente un color rosado homogneo. Anotar

el volumen en ml de lcali requeridos para virar el color de la

muestra a rosado.

Clculo:

Cada mililitro de solucin de hidrxido de sodio 0.1 N es igual a

1.63 % de casena de leche, entonces el volumen gastado en la

titulacin despus de la adicin de formaldehido multiplicado por

1.63 nos reportara el porcentaje de casena en la leche.

1.5 Resultados

Compare los resultados obtenidos en el laboratorio con los datos tericos de

referencias bibliogrficas.

1.6 Conclusiones

Segn los resultados obtenidos concluya al respecto sobre el contenido de

gluten y de casena de cada de las muestras evaluadas.

PRCTICA N 4: Coagulacin enzimtica de la leche

1.1. Marco terico

Leche es la materia prima principal para la elaboracin de quesos es la leche.

Una leche de buena calidad asegura la obtencin de quesos de buena calidad.

Debe asegurarse que la misma cumpla con los siguientes requisitos:

Calidad fsico-qumica y microbiolgica: como se discutir ms adelante existen

factores que afectan la coagulacin de la leche que est ligado a su

composicin (cantidad de protenas soluble, balance salino, pH, etc.) por otro

lado la carga microbiana por razones obvias afecta la calidad sanitaria, la

inocuidad del queso y la vida til del mismo. La leche debe estar libre de

inhibidores (residuos de detergentes, cloro, antibiticos, etc.) especialmente en

la elaboracin de quesos con la utilizacin de cultivos lcticos, lo cual no quiere

decir que en aquellos que no se utilicen cultivos iniciadores, pueda permitirse la

presencia de residuos qumicos. Debe recordarse la influencia sobre la salud

pblica de dichos residuos. No debe ser almacenada por largos periodos,

preferiblemente debe ser fresca. El almacenamiento prolongado de la leche a

temperaturas de refrigeracin por supuesto, produce cambios en el balance

salino y reduccin del tamao de la micela de casena por un aumento de la

cantidad de casena soluble (-caseina) y paralelamente aumenta el grado de

hidratacin de la micela, todo lo cual se traduce en problemas para la

coagulacin enzimtica de la leche. La mayora de estos efectos pueden

corregirse si la leche se mantiene por 30 minutos a una temperatura de 30-36

C antes de la coagulacin. Otro efecto y quizs ms perjudicial es el

crecimiento de bacterias psicrfilas a las cuales en su mayora tienen la

capacidad de producir enzimas lipoliticas y proteolticas capaces de soportar

temperaturas de pasteurizacin y que alteran los componentes de la leche

causando bajas en el rendimiento y alteracin de las caractersticas

organolpticas de los quesos.

Enzimas coagulantes: en los quesos elaborados mediante coagulacin

enzimtica o mixta, las enzimas coagulantes constituyen un elemento esencial.

Tradicionalmente se utiliza la quimosina o renina, extrada del cuarto estomago

(cuajar) de los becerros lactantes. Pero debido al aumento en la demanda de

cuajos se han desarrollado tcnicas para la utilizacin de enzimas provenientes

de microorganismos y vegetales.

Los cuajos microbianos son elaborados principalmente a partir de cultivos de

mohos de la especie rhizomucor. Actualmente se elabora quimosina producida

por fermentacin con microorganismos modificados genticamente, con lo cual

se obtiene una enzima bastante similar a la quimosina de origen animal; el

extracto comercial contiene quimosina 100% a diferencia del producido por

maceracin del estomago el cual puede contener 90-95% de quimosina y 10-

15% de pepsina.

Fuerza del cuajo: antes de utilizar cualquier enzima coagulante debe

conocerse su fuerza lo cual permite utilizar las dosis necesarias sin caer en los

errores que conlleva emplear dosis bajas o muy altas a las necesarias. La

fuerza del cuajo se define como la cantidad de leche en mililitros, que cuaja a

35C en 40 minutos, cuando se le adiciona un gramo o mililitro de cuajo.

El cloruro de calcio se utiliza para corregir problemas de coagulacin que se

presenta en la leche almacenada por largo tiempo en refrigeracin y en leche

pasteurizada. Su uso permite disminuir las prdidas de rendimiento en estos

casos y permite obtener una cuajada ms firme a la vez que permite acortar el

tiempo de coagulacin.

La dosis mxima a utilizar e del 0.02% (1 g por cada 5 litros de leche). Una

dosis excesiva conduce a una cuajada dura y quebradiza y con sabor amargo.

La sal se adiciona con el objetivo principal de darle sabor al queso, aunque

adems sirve para alargar la vida til de los mismos al frenar el crecimiento

microbiano al disminuir la actividad de agua. El porcentaje ideal depende del

tipo de queso y del gusto del consumidor aunque se puede decir que puede

estar entre el 2 3%.

1.2. Competencias

Evaluar la coagulacin enzimtica de la leche fresca y determinar la fuerza del

cuajo.

1.3. Materiales y equipos

1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos

4 Beaker (250 y 500 ml)

1 Probeta de 100 ml

1 Bagueta

1 Balanza

1 equipo de bao mara

1 pastilla de cuajo Marshall

Cocinilla elctrica

Sal yodada

Tubos de ensayo (9)

2 pipetas (5 y 10 ml)

2 propipetas

1 cucharita esptula

1 luna reloj

1 fiola de 100 ml

1.4. Procedimiento

1.4.1 Efecto de la temperatura sobre una reaccin catalizada por una enzima

a) Poner 10 ml de leche cruda o pasteurizada dentro de una serie de 6

tubos de ensayo grandes. Etiquetarlos del 1 al 6. Colocar el tubo 1

en bao mara a 30 C x 5 minutos hasta que alcance los 30C,

aadir 0.5 ml de cuajo y homogenizar. Determinar el tiempo que se

necesita para la coagulacin.

b) Repetir el mismo procedimiento a 40, 50, 60, 70 y 80C.

1.4.2 Efecto en la reaccin del tratamiento previo de la leche por el calor

a) Etiquetar 3 tubos de ensayo del 1 al 3 de llenarlos de la siguiente

forma:

1 10 ml de leche cruda

2 10 ml de leche pasteurizada

3 10 ml de leche hervida y enfriada

b) Poner los 3 tubos en bao mara a 35C hasta que la leche alcance

esta temperatura, agregar 0.5 ml de cuajo y anotar el tiempo de

coagulacin.

1.4.3 Produccin de queso

a) Preparar una solucin de cuajo a partir del cuajo en pastilla y

llevarlo a una fiola de 100 ml y adicionarle 0.1 g de sal.

b) En un Beaker Calentar 100 ml de leche fresca en bao mara a

37C, agregar 5 ml de cuajo

c) Repetir la misma operacin anterior en leche pasteurizada o

esterilizada.

d) Esperar unos 10 minutos y evaluar la cuajada formada mediante un

corte cruz.

e) Corte en cubito y agregar agua caliente para optimizar la cuajada

f) Evaluar la firmeza de la cuajada en las muestras.

1.5 Resultados

Compare los resultados obtenidos, y elabore un cuadro con ellos.

1.6 Conclusiones

Segn los resultados obtenidos concluya al respecto sobre la fuerza del cuajo y

la importancia del tipo de leche en la coagulacin enzimtica.