Articulo Científico-Actividad Alelopática

XXII COCIPEFYB/UNSAAC 2012 1

“ACTIVIDAD ALELOPÁTICA, CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS

Y ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DEL EXTRACTO POLAR DE LA CORTEZA DEL

Theobroma obovatum”.

Heinz REBATTA1, Bianca SORIA2, Priscila SUÁREZ1

Notas de Autores:

1,2 Estudiantes del VI nivel/XII ciclo de la FFBQ - UNAP.

1 [email protected], Calle Urubamba #264, movistar: 958601783.


SUMARIO

Se evaluó la actividad alelopática de la corteza de Theobroma obovatum mediante el método del

bioensayo con semillas germinadas de Lactuca sativa. El contenido de los diversos compuestos

fenólicos se realizó por cromatografía líquida de alta rendimiento (HPLC) y se elucidó

estructuralmente por medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-

Masa), del extracto polar de esta corteza. El contenido de polifenoles totales se determinó, por el

método de Folin - Ciocalteu a partir de una curva patrón utilizando como estándar catequina.

Los resultados de la actividad alelopática obtenida mostraron que presenta un EC50 de el

contenido de fenoles se relaciona muy bien con la actividad mostrada por el extracto de la planta

estudiada.

Palabras claves: alelopática, cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, cromatografía líquida de

alta rendimiento, elucidar, fenoles totales y Theobroma obovatum.


ABSTRACT

It was evaluated the activity allelopathic of the bark of Theobroma obovatum by the bioassay of

lettuce germinated method. About the concentration of the different phenolics components were

determined by liquid chromatography of high performance (HPLC) and the polar extracts of this

bark were elucidated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-Mass). The

content of total phenolics were determined starting from a patron curve of the standard reagent of

catechin, by the Folin - Ciocalteu method. The allelopathic activity is referred to the bioassay

with germinated seeds of Lactuca sativa. The obtained results showed that the phenols content is

related very well with the activity allelopathic shown by the extract of the studied plant.

Key words: allelopathic, chromatography of gases coupled to spectrometry of mass, liquid

chromatography of high yield, to elucidate, total phenols and Theobroma obovatum.


AGRADECIMIENTO

Agradecemos al Dr. Víctor Sotero Solís, al Dr. Kember Mejía Carhuanca, a la Blga. Elsa

Rengifo Salgado, a la Ing. Érika Dávila y a la Ing. Claudia Merino, por la asesoría, apoyo,

esfuerzo y conocimientos que nos brindaron en la realización del trabajo.


CONTENIDO

Introducción………………………………………...……………………………………………..7

Metodología……………………………………………………………………..………………...8

Material Vegetal…………………………………………………….…...………………...8

Preparación del Extracto Polar……………………………………………....…………….8

Actividad Alelopática – Bioensayo con Lactuca sativa…………………………………..8

Método de Folin – Ciocalteu………………………………………………….…………...9

Cuantificación por HPLC……………………………………………………….…………9

Elucidación por GC-Ms………………………………………………………………….10

Resultados………………………………………………………………………………….…….11

Discusiones………………………………………………………………………………...…….20

Conclusiones…………………………………………………………………………….……….21

Referencias bibliográficas…………………………………………………………………….….22

TABLAS

Tabla 1. Concentración Mínima Inhibitoria……………………………………………………...11

Tabla 2. Polifenoles totales de T. obovatum……………………………………………………..12

FIGURAS

Figura 1. Actividad Alelopática – Bioensayo con Lactuca sativa……………………………….11

Figura 2. Curva Estándar de Catequina………………………………………………………….12

Figura 3. Espectros HPLC de Ácido Clorogénico…………...…………………………………..13

Figura 4. Espectro de HPLC del extracto polar T. obovatum……………………………………14

Figura 5. Curva de calibración de ácido clorogénico...………………………………………….14

Figura 6. Perfil Cromatográfico…………………………………………………………………15


Figura 7. (a) Phenol……………………………...………………………………………………16

Figura 8. (b) Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl)………………………………………………16

Figura 9. (c) Mequinol…………………………………………………………………………...17

Figura 10. (d) Phenol, 3,4-dimethoxy…………………………………..………………………..17

Figura 11. (e) Phenol, 2-propyl…………………………………………………………………..18

Figura 12. (f) Homovanillyl alcohol……………………………………………………………..18

Figura 13. (g) Phenol, 3,4,5-trimethoxy…………………………………………………………19


INTRODUCCIÓN

Theobroma obovatum, de la familia Malvaceae, es un árbol pequeño que se desarrolla en bosque

húmedo de tierra firme con suelo fértil alcanzando hasta 15 m de alto con el tronco de 10 a 25

cm de diámetro; las ramas jóvenes y brotes están cubiertos de pelos lanosos deciduos. Su fruto es

elíptico a obovado, de 5-7 cm de largo y 3-4 cm de ancho. Su área principal de distribución, es

en el occidente de Brasil y en Perú [1].

El término alelopatía fue utilizado por primera vez por Hans Molisch en 1937. Rice en 1984 la

definió como los efectos perjudiciales o benéficos que son, ya sea directa o indirectamente, el

resultado de la acción de compuestos químicos que, liberados por una planta, ejercen su acción

inhibitoria en otra [2] [3]. Esta definición ha sido modificada y actualmente se utiliza la de la

Sociedad Internacional de Alelopatía (SIA), en la cual se incluyen bacterias, hongos y algas [4].

En la búsqueda de compuestos naturales con actividad alelopática se han encontrado diversos

compuestos como fenólicos, compuestos nitrogenados y otros.

Los fenoles es el origen de funciones biológicas tales como la antimutagénica, anticancerígena,

antienvejecimiento y también para fines agroindustriales como herbicidas, plaguicidas y

fungicida de manera natural sin afectar el ambiente y salud humana, por lo tanto se formula el

siguiente problema: ¿Presenta actividad alelopática y compuestos fenólicos, el extracto polar de

la corteza de Theobroma obovatum?

El objetivo principal de este estudio fue evaluar la actividad alelopática, determinar los

compuestos fenólicos y elucidar dichas estructuras del extracto polar de la corteza del T.

obovatum.


METODOLOGÍA

Material Vegetal.

Se colectó la parte biológica de corteza en buenas condiciones de la especie amazónicos en

estudio que hayan alcanzado la madurez vegetativa, que será colectada del Centro de

Investigaciones Allpahuayo (CIA) del IIAP, ubicado en el km 26.7 de la carretera Iquitos -

Nauta, en el ámbito de la Reserva Nacional Allpahuayo - Mishana, en el Distrito de San Juan,

Provincia de Maynas, Región Loreto.

Se trabajará con la parte de corteza, debido a que según la etnobotánica, se pueden encontrar los

principios activos.

Se someterá a secado por estufa a 33º C por 14 días, y posteriormente pulverizar.

Preparación del Extracto Polar.

Pesar 20 g de corteza seca pulverizada de T. obovatum. Se adicionará 180 ml de etanol 96%, para

luego llevar a reflujo por 30 minutos y dejar reposar y enfriar en oscuridad hasta el día siguiente.

Filtrar la muestra con papel filtro y embudo, en oscuridad, luego lavar el residuo del papel filtro

con 100 ml (repetir 2 veces). Concentrar en rotavapor, y dejar secar en la estufa, extrayendo del

balón y obtener la muestra seca y concentrada llamado Extracto Polar, guardar en un frasco a -

20º C, hasta el análisis.

Actividad Alelopática – Bioensayo con Lactuca sativa [5] [6].

Germinada las semillas, se prepara las placas de control y de extracto a cinco concentraciones

establecidas. Se pesa 1 g de corteza pulverizada, luego adicionar 10 ml de etanol 96%, colocar el

disco de papel filtro a cada microplaca y preparar los patrones del extracto polar a 50; 10; 3; 1;

0,3 mg/ml. Se adiciona 100 µl del extracto a la concentración requerida, dejando evaporar el

solvente por 20 horas, luego de agrega 700 µl de agua destilada, para sustituir el solvente


evaporado. Transferir 5 semillas previamente germinadas a cada microplaca, incubando las

microplacas a 20°C por 52 horas, en oscuridad y finalmente medir el crecimiento. Todas las

muestras fueron analizadas por triplicada.

Método de Folin - Ciocalteu [7].

Realización de curva de calibración, con estándar de catequina Q.P. mediante el siguiente

procedimiento.

Cód.

Catequina

(mg/ml)

Vol. MeOH

(µl)

Vol. Cateq.

(µl)

Vol. Final

(µl)

Concent.

(µM)

Concent.

( mM)

STD0 0 1000 0 1000 0 0

STD1 0.1 667 333 1000 344 0.344

STD2 0.3 700 300 1000 1033 1.033

STD3 1 667 333 1000 3445 3.445

STD4 3 793 207 1000 10335 10.335

Seguidamente adicionar 20 µL del extracto en tubos de 2.5 ml, adicionar 1.58 ml de agua

ultrapura, posteriormente se adicionó tanto a estándares como a extractos 100 µl de la solución

de Folin-Ciocalteu, homogenizar en el vortex e incubar al ambiente por 1min, adicionar 300 µl

de la solución de NaCO3 al 20%, incubar al ambiente por 2 horas.

Para determinar la cantidad de compuestos fenólicos producidos durante la reacción, se colocó 1

ml de la muestra en cubetas de poliestireno de 1 cm x 1 cm x 4.5 cm, leyéndose la absorbancia

en el espectrofotómetro UV-Vis a 700 nm. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado.

Cuantificación por HPLC

Medir 2 ml de la muestra diluyendo en 5 ml de agua/metanol (2:8) y 2 mM de fluoruro de sodio,

homogenizar con ayuda del vortex y centrifugar a 5000 rpm por 45 minutos de 2-5°C. Se

procede a filtrar 1 ml de muestra e inyectar al equipo de HPLC.


Se prepara las siguientes soluciones de estándares de compuestos fenólicos (catequina,

epicatequina, epigallocatequina y quercetina) de 0,03125; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 y 1 mg/ml

diluidos en agua/metanol (2:8).

Luego se prepara la fase móvil agua/metanol (88:12).

Elucidación por GC-Ms.

Columna : BR-5ms FS 15 m. x 0.25 mm x 0.25 µm Max T°: 350

m/z : 35 – 500

Tiempo : 35.00 min

Tipo : Full Scan

Flujo : 1 ml/min

Horno : 200° C


RESULTADOS

Figura 1. Actividad Alelopática – Bioensayo con Lactuca sativa.

Tabla 1. Concentración Mínima Inhibitoria.

PROMEDIO (mm) DESV. EST. % INHIBICIÓN

Hipocótilo Radícula Hipocótilo Radícula Hipocótilo Radícula

Control 8 17 0.8367 4.3932 0 0

50 mg/mL 4 2 0.4472 0.0000 50 88.24

10 mg/mL 6 4 0.8367 0.5477 25 76.47

3 mg/mL 7 8 0.5477 1.1402 12.5 52.94

1 mg/mL 8 12 0.8367 0.0000 0 29.41

0,3 mg/mL 8 17 0.5477 2.4900 0 0

En la figura 1, se observa que el extracto polar T. obovatum a una concentración de 3 mg/mL

logra inhibir el crecimiento de L. sativa en un casi 53%, a diferencia de las concentraciones de

10 y 50 mg/mL, que logran inhibir más del 50% del crecimiento de L. sativa a un porcentaje de

76 y 88 respectivamente.


Método de Folin - Ciocalteu.

Figura 2. Curva Estándar de Catequina

Tabla 2. Polifenoles totales de T. obovatum

Especie Vegetal Polifenoles Totales

(gEC/100g)

T. obovatum 30,9333 ± 0.4618

El valor de absorbancias obtenidas para cada uno de las concentraciones evaluadas (0.00; 0.10;

0.30; 1.00 y 3.00 mg/ml) se sustituyó en la ecuación de la curva de calibración de catequina que

se muestra en la figura 2; en donde “y” es igual a la absorbancia y “x” es igual a la

concentración.

En la tabla 2, el extracto polar de la corteza de T. obovatum destaca la alta concentración de

polifenoles totales.


Determinación de la Concentración del Extracto por HPLC.

Figura 3. Espectros por HPLC a diferentes concentraciones de Ácido Clorogénico.


Figura 4. Extracto polar T. obovatum.

Figura 5. Curva de calibración de ácido clorogénico.


Cuantificación del Extracto:

F.D.= 3,5

Elucidación por CG-Masa.

Figura 6. Perfil Cromatográfico.

x x


Relación de probables compuestos según espectrograma general:

Figura 7. (a) Phenol

Figura 8. (b) Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl)


Figura 9. (c) Mequinol

Figura 10. (d) Phenol, 3,4-dimethoxy


Figura 11. (e) Phenol, 2-propyl

Figura 12. (f) Homovanillyl alcohol


Figura 13. (g) Phenol, 3,4,5-trimethoxy


DISCUSIONES

Según Fujii (2007), estudio y demostró que los altos y óptimos resultados de actividad

alelopática, son de extractos de hojas frescas, pero en el presente estudio demostramos que en el

extracto de corteza seca y pulverizada, brinda un porcentaje favorable de inhibición del

crecimiento de la radícula de L. sativa.

Sotero et al., (2011), determinó la concentración de fenoles totales de Theobroma cacao L. con

un valor (g/100g GAE) de 12,1015 ± 0,0218 [9], en comparación del extracto de corteza de T.

obovatum nos presentó una alta concentración de polifenoles totales (g/100g CE) de 30,9333 ±

0.4618, demostrando que éste brinda una concentración mucho mayor que T. cacao L.

En la elucidación, los picos más altos del espectrograma general, son posibles compuesto ajenos

a los fenólicos tales como hexanol; diisoctil ftalato y algunos ácidos carboxílicos y alcanos, caso

contrario los compuestos de mayor interés (fenólicos) en el presente estudio, corresponden a

picos de menor elevación como se mencionan en los resultados.


CONCLUSIONES

- Las concentraciones 50; 10; 3 mg/ml del extracto polar de T. obovatum tienen diversos

niveles de poder inhibitorio más del 50% sobre la semilla germinada de Lactuca sativa,

donde destaca la tercera concentración, ya que el propósito de la alelopatía es lograr una

inhibición mayor o igual que el 50% a la mínima concentración.

- Cuantificación de ácido clorogénico del extracto polar de la corteza de T. obovatum, es

0,0215g/100g.

- La elucidación de compuestos bioactivos (fenólicos), presentó moléculas, tales como Phenol;

Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl); Mequinol; Phenol, 3,4-dimethoxy; Phenol, 2-

propyl; Homovanillyl alcohol; Phenol, 3,4,5-trimethoxy.

- Este estudio contribuye al conocimiento de la actividad alelopática del extracto de la corteza

de T. obovatum del tipo polar, en particular de los compuestos fenólicos.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2. Vyvyan J. 2002. Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals.

Tetraheadron. (58), 1631-46.

3. Bhowmik P, Inderjit C. 2003.Challenges and opportunities in implementing allelopathy for

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En: Cutler H, Cutler S. Biologically active natural products: Agrochemicals. 1° ed. 15-31.

5. Ebana K, Okuno K. 2007. Rice Allelopathy. En: Fujii Y, Hiradate S. Allelopathy: New

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6. Kato-Noguchi H, Tanaka Y. 2004. Allelopathic potencial of Citrus junos fruit waste

processing industry. Bio Tech. Japón. (94), 211-14.

7. Vela E. 2012. Evaluación de la actividad alelopática in vitro del extracto metanólico de

Attalea moorei, Attalea salazarii y Attalea sp. [tesis pre grado]. Universidad Nacional de la

Amazonía Peruana. Facultad de Farmacia y Bioquímica. 49.

8. Gil M, Tomás-Barberán F. High-performance liquid chromatography of honey flavonoids.

Journal of Chromatography. (643), 41-46.

9. Sotero V. 2011. Evaluación de la actividad antioxidante y compuestos fenólicos en pulpa y

semillas de cuatro frutales amazónicos de la familia Sterculiaceae. Soc. Química. Lima-

Perú.

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