1

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PÉPTIDO Ib-M6

CONTRA AISLADOS CLÍNICOS DE Escherichia coli

ANA MIREYA PICÓN JAIMES

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

BUCARAMANGA

2018

2

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PÉPTIDO Ib-M6

CONTRA AISLADOS CLÍNICOS DE Escherichia coli

Ana Mireya Picón Jaimes

Trabajo de grado para optar el título de Bacterióloga y Laboratorista Clínico

Directora

Ana Elvira Farfán García

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO BUCARAMANGA

2018

3

4

DEDICATORIA

A Dios quien ha sido mi guía y mi fortaleza en cada paso que doy, por permitirme conocer personas maravillosas quienes han sido de gran importancia para continuar con mi formación profesional.

Mi ejemplo a seguir Alexander y Lina Tatiana hermanos que parecen padres, que con esfuerzo y sacrificio sacaron adelante una familia con principios y valores. Mi preciosa madre quien me inculcó los valores para ser una persona de bien. La luz de mis ojos mis preciosos sobrinos la alegría de mi vida. En general, a mi familia mi más grande tesoro quienes han hecho parte de todo este proceso con sacrificio y amor.

5

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue realizada gracias a financiación de: Colciencias Proyecto IVº El Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la Universidad de Santander. Mis más sinceros agradecimientos a: Dra. Ana Elvira Farfán García, por permitirme ser parte de este trabajo y ser mi guía y apoyo durante esta experiencia. Sergio Prada, por su colaboración y disposición para entrenarme en todo lo necesario para emprender mi trabajo. Sin ustedes este trabajo no hubiese sido posible.

6

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 15

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18 2. JUSTIFICACIÓN 21 3. OBJETIVOS 22 3.1 OBJETIVO GENERAL 22 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22 4. MARCO REFERENCIAL 23

4.1 ESTADO DEL ARTE 23 4.2 MARCO CONCEPTUAL 26 4.2.1 Generalidades de los PDH 26 4.2.2 Historia de Impatiens balsamina 26 4.2.3 Taxonomía de Impatiens balsamina 27 4.2.4 Regiones 27 4.2.5 Familia de péptidos de Impatiens balsamina 27 4.2.6 Péptidos Ib-AMP4 29 4.2.7 Análogos de Ib-AMP4 29 4.2.8 Péptido Ib-M6 30 4.2.9 Historia de E. coli 31 4.2.10 Taxonomía de E. coli 31 4.2.11 Biología de E. coli 32 4.2.11.1 E. coli Verotoxigénica 33 4.2.11.2 E. coli Enterohemorrágica 33 4.2.11.3 E. coli Enteroagregativa y Enteropatógena 33 4.2.12 Mecanismo de resistencia 34

5. METODOLOGÍA 35 5.1 TIPO DE ESTUDIO 35 5.2 ÁREA DE ESTUDIO 35 5.3 UNIVERSO 35 5.4 POBLACIÓN 35 5.5 MUESTRA 35 5.6 VARIABLES 35 5.7 PROCEDIMIENTOS 36 5.7.1 Péptido Ib-M6 36 5.7.2 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 36 5.7.3 Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) 37 5.7.4 Inóculo cultivo 37

7

5.7.5 Inóculo bacteriano inicial 37 5.7.6 Concentración en tubo falcón 37 5.7.7 Concentración en pozo 37 5.8 ANÁLISIS DE LOS DATOS 37

5.9 ASPECTOS ÉTICOS 38 6. RESULTADOS 39 7. DISCUSIÓN 41 8. CONCLUSIONES 43 9. RECOMENDACIONES 44

BIBLIOGRAFÍA 45 ANEXOS 50

8

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla1.Indices terapéuticos y análogos lineales eliminados por disulfuro. 29 Tabla 2. Características bioquímicas de Escherichia coli 32 Tabla 3. Diseño de la MIC de las cepas E. coli BucAc/299 y STEC BucAc/234. 36 Tabla 4. Concentración mínima inhibitoria del péptido Ib-M6 comparada con la MIC de la Estreptomicina 39 Tabla 5. Concentración mínima inhibitoria del péptido análogo Ib-M6. 39 Tabla 6. Comparación de la MIC y MBC de las dos cepas utilizadas en el estudio. 40

9

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Planta Impatiens balsamina. 27 Figura 2. Vainas que contienen las semillas de la planta Impatiens balsamina 27 Figura 3. Estructuras génicas y alineamiento de secuencias peptídicas 28 Figura 4. Cinética de crecimiento bacteriano en presencia y ausencia del péptido 31 Figura 5. Escherichia coli 32 Figura 6. Concentración mínima bactericida del análogo Ib-M6 sobre las cepas bacterianas E. coli Buc/Ac299 y STEC Buc/Ac234 40

10

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Lectura de la placa. Cepa de E. coli comensal y cepa patógena Contra el péptido Ib-M6 50 Anexo B. Montaje MBC del péptido Ib-M6 51 Anexo C. MBC obtenidas en el primer triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234. 52 Anexo D. MBC obtenidas en el segundo triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234 52 Anexo E. MBC obtenidas en el tercer triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234 53 Anexo F. MBC obtenidas en el primer triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299 53 Anexo G. MBC obtenidas en el segundo triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299 54 Anexo H. MBC obtenidas en el tercer triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299 54

11

GLOSARIO

ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: Fenómeno de la desintegración o ruptura de los eritrocitos que provoca la liberación de hemoglobina.

AMINOÁCIDO: molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH; ácido). ANAEROBIO: ser vivo que solo se desarrollan en ausencia de oxígeno. ANÁLOGO: presenta similitud con alguna cosa. ANFIPÁTICOS: molécula que posee dos extremos un extremo polar hidrofílico y un extremo no polar hidrofóbico. BACTERIA: son microorganismos procariotas unicelulares carecen de núcleos. BACTERICIDA: sustancia o compuesto que producen la muerte del microorganismo. BACTERIOSTÁTICO: sustancia o compuesto que inhibe el crecimiento bacteriano BIOMOLÉCULA: compuesto químico que se encuentra en los organismos vivos, compuestas por sustancias químicas. ENZIMAS: moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas. HOMÓLOGO: presentan características similares a otra cosa que las hace ser similares. HONGO: organismo eucariota en los que se encuentran los mohos, levaduras y los organismos productores de setas. INFECCIÓN: Invasión y multiplicación de agentes patógenos en los tejidos de un organismo. MEMBRANA CELULAR: es una capa lipídica, formada por glucolípidos, y proteínas. MICROVELLOSIDADES: prolongaciones celulares delgadas localizadas en las membranas plasmáticas de las células diferenciadas. MORBILIDAD: cantidad de personas o individuos considerados enfermos o víctimas de una enfermedad en un espacio y tiempo determinados.

12

MORTALIDAD: cantidad de personas o individuos que mueren causa de una determinada enfermedad en un espacio y tiempo determinado. PÉPTIDO: pequeña cadena compuesta por un determinado número de átomos. Que cumple funciones de defensa en el ser vivo. POROS: es un orificio que permite la entrada de sustancias a la célula o salida de componente o productos de la célula al medio extracelular. PUENTES DISULFUROS: unión covalente entre dos átomos de azufre. Este tipo de enlaces se forman por la oxidación de dos grupos sulfhidrilo (SH), cada uno perteneciente a una molécula de cisteína. RESISTENCIA NATURAL: es una propiedad específica de las bacterias y su aparición es anterior al uso de los antibióticos. RESISTENCIA ADQUIRIDA: aparece posterior a un fracaso terapéutico, por mutaciones o compartir material genético con otro microorganismo. TOXINA: sustancia con propiedades venenosas producida en el cuerpo de un ser vivo.

13

RESUMEN

Título: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PÉPTIDO Ib-M6 CONTRA AISLADOS CLÍNICOS DE Escherichia coli. Autor: Ana Mireya Picón Jaimes Palabras clave: Péptido antimicrobiano, análogo Ib-M6, aislados clínicos de Escherichia coli. Descripción: El incremento de la resistencia entre las bacterias Gram negativas en especial en los patotipos de Escherichia coli causantes de enfermedad diarreica aguda (EDA), está dada por el uso indiscriminado de agentes antimicrobianos, mutaciones genéticas en las bacterias, conjugación de plásmidos, entre otros. Por lo cual, surge la necesidad de buscar nuevos fármacos antibacterianos efectivos contra patógenos resistentes. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la actividad mínima bactericida (MBC) del péptido Ib-M6 contra dos cepas de Escherichia coli STEC Buc/Ac234 y E. coli Buc/Ac299. La determinación de la MIC se realizó por el método de microdilución en caldo en placa de 96 pozos, y la actividad mínima bactericida por el método de recuento de células viables en agar sangre. Los resultados mostraron que el análogo Ib-M6 exhibió actividad antimicrobiana sobre las cepas de E. coli Buc/Ac299 y Buc/Ac234. Las dos bacterias fueron susceptibles a concentraciones del péptido con valores de MIC entre < 0.7 y 1.5 µM/mL. Los valores de MBC 12,5 µM/mL para la cepa comensal y 25 µM/mL para el aislado STEC, por lo que el péptido presentó tanto actividad bactericida como bacteriostática, demostrando su potencial antimicrobiano para inhibir y eliminar bacterias. Por lo que se sugiere determinar las propiedades farmacéuticas y citotóxicas del péptido Ib-M6.

14

ABSTRACT

Tittle: EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF PEPTIDE Ib-M6 AGAINST CLINICAL ISOLATES OF Escherichia coli. Author: Ana Mireya Picon Jaimes Keywords: Antimicrobial peptide, Analog Ib-M6, Clinical isolates of Escherichia coli. Description: The increment of the resistance among Gram negative bacteria, especially the Escherichia coli pathotypes –cause of the Acute Diarrheal Disease (ADD) - is due to the indiscriminate use of antimicrobial agents, gene mutations in bacteria, plasmid conjugation, among others. Therefore, there is the necessity to look for new antibacterial drugs effective in treating resistant pathogens. Hence, this work is intended to evaluate the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimal Bactericidal Activity (MBC) of the peptide lb-M6 in comparison to two strains of Escherichia coli STEC Buc/Ac299. The determination of the MIC was performed by the broth microdilution method on a 96-well plate, and the determination of the minimal bactericidal activity by the viable cell recovery method on blood agar. The results showed that the analog Ib-M6 displayed antimicrobial activity on strains of E. coli Buc/Ac299 and Buc/Ac234. The two bacteria were susceptible to peptide levels with MIC values between <0.7 and 1.5 μM / mL. The values of MBC 12.5 μM / mL for the commensal strain and 25 μM / mL for the isolated STEC. So that, the peptide showed bactericidal activity as a bacteriostatic. Demonstrating its antimicrobial potential to inhibit and eliminate bacteria. Therefore, suggested to determine the pharmaceutical and cytotoxic properties of peptide Ib-M6.

15

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos son pequeños seres vivos, que suelen estar presentes en casi cualquier ambiente y algunos de ellos cumplen funciones necesarias en los procesos fisiológicos del ser humano, animales y plantas. No obstante, algunos afectan negativamente la salud del ser humano, desafortunadamente esto ha ido ocasionando problemas de salud pública, más comúnmente en países en vía de desarrollo como África, Asia y Latinoamérica, aunque también afecta poblaciones marginales de países industrializados (Gómez, 2014; Sánchez et al, 2006). Escherichia coli es una bacteria Gram negativa que se ha visto involucrada en la mayoría de infecciones en el ser humano, principalmente gastrointestinales, genitourinarias y pulmonares (Díaz et al, 2006). El origen de las infecciones de tracto urinario (ITU) es el más frecuente (80%-90%), siendo más propensas en el sexo femenino, las ITU se caracteriza por altas tasas de incidencia y morbilidad en la población pediátrica y adulta en diferentes regiones del mundo (Díaz et al, 2006, Zarate et al, 2006). Asimismo, en la mayoría de las infecciones gastrointestinales, principalmente en enfermedad diarreica aguda (EDA), entre 0,8 y 2 millones de niños menores de 5 años de edad mueren en el mundo a causa de EDA, siendo considerada la segunda causa global de mortalidad infantil. Se estima que mil millones de episodios de diarrea ocurren anualmente en niños de todo el mundo (Sánchez et al, 2006). Los agentes infecciosos asociados a la alta morbimortalidad de la EDA incluyen virus, bacterias y parásitos. Dentro de las causas virales de EDA, la más importante es rotavirus, asociado a aproximadamente 440 mil muertes anuales, de las cuales 82% ocurren en los países más pobres del mundo. Las causas bacterianas de EDA ocupan un segundo lugar en frecuencia, siendo Escherichia coli enteropatógenas las más importantes (Gómez 2014). Por otra parte, el aumento en la resistencia a los agentes antibacterianos en los últimos años, ha sido un problema de difícil alcance gracias a la globalización, la automedicación, el uso de antibióticos sin prescripción médica y las mutaciones genéticas. Además, los piensos formulados para uso alimentario en animales, los cuales en su mayoría contienen antibióticos; y el consumo de los fármacos antimicrobianos en la industria ganadera es excesivo, debido a la alta demanda de consumo de carne generada por los seres humanos (Casana 2017). Por ejemplo, en Estados Unidos, el 70% de los antibióticos se usa en animales y el 30% en humanos.

16

Como consecuencia el hallazgo de tratamientos efectivos es cada vez más difícil, toda vez que se ha incrementado la morbilidad y mortalidad por infecciones resistentes (Mosquito et al. 2011, López et al. 2010). Debido a esto, es necesario la búsqueda de nuevos tratamientos farmacológicos, con el fin de controlar las infecciones ocasionadas por microorganismos resistentes (Cabrera 2007). Diversas especies de plantas, microorganismos y animales producen péptidos de defensa al hospedero, que podrían ser la opción para combatir infecciones microbianas (Tailor et al, 1997; Thevissen et al.,2005). Por otra parte, los PDH son compuestos específicos que tienen acción más rápida en comparación con los fármacos antimicrobianos convencionales, con menos efectos tóxicos o secundarios en las células eucariotas (Tailor et al, 1997; Thevissen et al,2005). Los PDH son de cadena corta, algunos son ricos en cisteína o arginina y muchos de ellos están presentes en las semillas de diferentes especies de plantas. Los PDH de plantas se agrupan en varias familias y muchos comparten características generales, como la carga positiva, la presencia de enlaces disulfuro (que estabilizan la estructura) y un mecanismo de acción dirigido al exterior de la célula (Hammami et al, 1997). No obstante, en algunas ocasiones los péptidos pueden sufrir degradaciones antes de llegar a su sitio de acción, debido a las condiciones del medio donde se encuentren. La mayoría de los péptidos son sensibles a altas concentraciones de sales, y a la degradación por proteasas, lo cual ha sido mejorado con diversos métodos de bioconjugación y modificaciones para mejorar su rendimiento. Aun así, los péptidos de defensa al hospedero siguen siendo una buena alternativa para tratar de combatir las infecciones (Thevissen et al, 2005). Los péptidos se pueden usar de forma nativa, es decir, extraídos directamente de la fuente o sintéticos. Diversas secuencias aminoacídicas de los AMPs se han modificado para crear análogos con mayor actividad biológica. Dentro de este contexto, PDH altamente homólogos de la familia Ib-AMP (Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3, Ib-AMP4), identificados por primera vez en la planta balsaminácea Impatiens balsamina (Taylor et al., 1997), han mostrado alta efectividad contra bacterias y hongos principalmente. El péptido Ib-AMP1, ha mostrado actividad lítica frente a Candida albicans y permeabilización de la membrana de Aspergillus flavus (Lee et al, 1999). Al igual que el péptido Ib-AMP1, los Ib-AMP2 e Ib-AMP3 han sido estudiados por su actividad antifúngica y bactericida, siendo efectivo contra un gran número de bacterias y hongos. Sin embargo, son sensibles a medios con alta fuerza iónica, especialmente aquellos suplementados con CaCl2 y KCl, lo que afecta su actividad (Thevissen et al, 2005).

17

De igual manera, análogos del péptido Ib-AMP4 con modificaciones en su cadena polipeptídica, mostraron inhibición de hongos, bacterias y mayor estabilidad frente a altas concentraciones de sal (Thevissen et al 2005; Fan 2013). Adicionalmente, estudios de Flórez y cols en el 2014, mostraron que modificaciones a la cadena polipeptídica de Ib-AMP4, mejoraron su estabilidad en medios de alta fuerza iónica y de igual forma su actividad biológica contra E. coli (Flórez et al., 2014). Las seis variantes lineales se sintetizaron realizando sustituciones de Triptófano, ubicado en la posición 15 y los residuos de cisteína ubicados en las posiciones 6, 7 y 16 por residuos de metionina, con el objetivo de preservar el número de átomos de azufre en la estructura de los análogos (Flórez et al 2014). De estos análogos, el Ib-M6 con cambios en su cadena de aminoácidos que modifican la hidrofobicidad del dominio C-terminal y carga neta, lo hacen con mayor capacidad antimicrobiana (Flórez et al, 2014), y por ser un análogo del Ib-AMP4 tiene mayor resistencia a las degradaciones por altas concentraciones de sales, lo que sin duda alguna, llama la atención y genera gran interés el estudio de esta biomolécula como promisoria para la industria farmacéutica (Flórez et al, 2014).

Con base a lo anterior, este trabajo se orientó hacia la evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (MBC) del péptido antimicrobiano Ib-M6, contra los aislados clínicos E. coli shigatoxigénica (STEC) Buc/Ac234 y E. coli Buc/Ac299.

18

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La resistencia antibacteriana según la Organización Mundial de la Salud (OMS), es uno de los mayores problemas de salud pública a nivel mundial impidiendo el control en las enfermedades, lo que conlleva a un aumento de la morbi-mortalidad (Galán et al, 2014). Debido a esto, un creciente número de infecciones como la neumonía, la tuberculosis, la septicemia, o las enfermedades causadas por alimentos, son cada vez más difíciles y en ocasiones imposibles de tratar (OMS 2018). Existen dos tipos de resistencia en las bacterias: la natural o vertical y la resistencia adquirida u horizontal. La primera condicionada por determinantes genéticos propios de cada familia, especie o grupo bacteriano y aparece antes de estar en contacto con algún antibiótico (Tafur et al, 2008). Por el contrario, la resistencia adquirida es variable, y se conoce como una modificación en la composición genética de las bacterias. Algunos de ellos son cambios puntuales en su ADN, modificaciones en el sitio blanco, inactivación metabólica, impermeabilidad de la membrana o la adquisición de plásmidos, transposones e integrones (Tafur et al, 2008; Calderón et al, 2016). Asimismo, el uso indiscriminado de los antibióticos en humanos, animales y en la agricultura ha aumentado la resistencia bacteriana, de igual forma las migraciones de poblaciones es uno de los factores que interfieren en las mutaciones genéticas en bacterias, conllevando a la resistencia bacteriana de tipo adquirida (Betancor et al, 2008). Debido al aumento de la resistencia microbiana a los medicamentos disponibles y el declive en la aparición de nuevos medicamentos, diversos estudios con el fin de implementar nuevas alternativas han surgido como, por ejemplo, los PDH de origen animal, vegetal, de microrganismos, sean nativos o sintéticos, los cuales presentan propiedades antimicrobianas favorables. De igual forma, se han realizado modificaciones en estos péptidos con el fin de obtener análogos mucho más efectivos que el péptido nativo (Zhdanov, 2014; Fan et al, 2012). Los PDH, son moléculas sintetizadas a nivel ribosomal y se encuentran haciendo parte de la inmunidad innata de seres vivos como plantas, animales, bacterias o protozoos. Algunos péptidos actúan de forma directa atacando el patógeno, mientras que otros modulan el sistema inmune del hospedero con el fin de atar el microrganismo (Cardillo et al 2018). Los PDH varían de 4 a 40 aminoácidos de longitud y exhiben formas lineales, cíclicas o aciladas. Los péptidos son en su mayoría catiónicos, anfipáticos, hidrófobos y presentan diferentes estructuras secundarias.

19

Principalmente, actúan provocando la formación de poros en la membrana celular bacteriana, sin embargo, exhiben diversos mecanismos de acción que depende de la longitud de su cadena, del tipo de aminoácidos, de las interacciones entre éstos y de la conformación que adquieren cuando entran en contacto con las membranas celulares (Zhdanov, 2014). En relación con lo anterior, los Ib-AMP son una familia de péptidos de defensa al hospedero identificados por primera vez en las semillas de la planta I. balsamina (Taylor et al., 1997). Los Ib-AMP son péptidos que cumplen funciones en la defensa de la planta, principalmente se encuentran haciendo parte de la respuesta inmediata no especifica contra las infecciones. Los cuatro péptidos de esta familia, Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3 y Ib-AMP4, poseen cadenas cortas de aminoácidos, α-helicoidales que mediante diversos estudios se ha evidenciado que pueden provocar la formación de poros en la membrana celular bacteriana (Thevissen et al 2005). El péptido antimicrobiano Ib-AMP4 de I balsamina, tiene 20 aminoácidos en su cadena polipeptídica. Se ha probado su actividad antimicrobiana contra bacterias Gram negativas tales como, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas solanacearum y Gram positivos Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis. Aún no se conoce con certeza el mecanismo de acción, pero dadas las investigaciones existe la probabilidad que esté relacionado con la perforación de la membrana celular, formando canales, que imposibilitan la respiración celular y hacen que las células tengan fugas de manera que los iones y metabolitos sean liberados (Fan et al, 2012). Por otra parte, debido a la necesidad de nuevos tratamientos se ha propuesto que el Ib-AMP4, podría ser una buena opción gracias a su seguridad en los fibroblastos y eritrocitos humanos aún a concentraciones de 200 mg/ml, demostrado a nivel experimental por Tailor y colaboradores (Tailor et al, 1997). Los péptidos Ib-AMP4 han demostrado tener un buen comportamiento con las células humanas y a su vez ser efectivos contra un numeroso grupo de bacterias y hongos. A causa de esto, se decide estudiar los Ib-AMP4 con el fin de crear variantes que posean características del péptido original, pero con mayor efectividad (Flórez et al, 2014). El análogo Ib-M6 variante sintética del péptido nativo Ib-AMP4, fue modificado con el fin de obtener una actividad antimicrobiana más efectiva. Al péptido se le modificó cambios en su carga neta, estructura anfipática y dominio C-terminal, reemplazando ciertos residuos de aminoácidos por arginina y triptófano (Flórez et al, 2014), como resultado se obtiene un péptido efectivo frente a E. coli K12 con valores de IC50 de 1 µM.

20

Por lo cual, este trabajo permitirá responder a la siguiente pregunta: ¿cuál es la concentración mínima inhibitoria (CMI) que se necesita del análogo Ib-M6 para inhibir el crecimiento de las cepas E. coli Buc/Ac299 y STEC BUC/Ac234 y ¿cuál es la concentración mínima bactericida necesaria para eliminar el 99% de los microorganismos evaluados?

21

2. JUSTIFICACIÓN

Las enfermedades infecciosas bacterianas representan un importante problema de salud pública, que actualmente enfrenta la humanidad y amenaza el tratamiento adecuado y efectivo de las enfermedades infecciosas, que son causadas principalmente por patógenos que han adquirido la capacidad de resistir a los antibióticos convencionales que se usan en la actualidad (Galán et al, 2014). Las bacterias como todos los seres vivos exhiben mecanismos biológicos útiles para resistir a diversos cambios ambientales. Aunque la resistencia a los antibióticos hace parte de una expresión natural de la evolución y la genética, principalmente la resistencia bacteriana ha sido el resultado del mal uso de los antibióticos y el uso indiscriminado de productos (Lee 2015; Moncayo 2014), que conducen a que las bacterias se doten de mecanismos (bioquímicos, genéticos, moleculares y celulares) que causan mutaciones y con ellas la resistencia a los antimicrobianos (Zhdanov, 2014; Fan et al, 2012). Debido a la creciente resistencia a los antibióticos por parte de los patógenos, la investigación y el desarrollo de nuevos antibióticos se ha hecho más lento (Cabrera et al. 2007). A causa de esto, los medicamentos han perdido efectividad a la hora de combatir las infecciones. Por lo que surgen nuevas investigaciones con el fin de descubrir nuevos agentes antimicrobianos, uno de estos son los péptidos de defensa al hospedero derivados de plantas. El péptido Ib-M6, un análogo del péptido Ib-AMP4, fue modificado con el fin de aumentar su actividad antimicrobiana, se cree que su mecanismo de acción está basado en la perforación de la membrana celular que garantiza la perdida de iones y metabolitos (Flórez et al, 2014). El objetivo de este estudio, es evaluar la actividad antimicrobiana bactericida o bacteriostática del péptido Ib-M6 frente a microorganismos Gram negativos principalmente aislados clínicos de E. coli in vitro.

Los resultados de la actividad biológica permitirán contribuir al conocimiento de estos péptidos como moléculas promisorias para el tratamiento de infecciones causadas por E. coli, aplicables a infecciones extraintestinales como las ITU, neumonía, sepsis, entre otras, con la posible extrapolación a otros agentes bacterianos y posteriormente el diseño de bioconjugados para mejorar su efectividad en modelos in vitro.

22

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antibacteriana del péptido Ib-M6 en aislados clínicos de Escherichia coli

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar la concentración mínima inhibitoria del péptido Ib-M6 en aislados clínicos de E. coli

• Evaluar la concentración mínima bactericida del péptido Ib-M6 en aislados clínicos de E. coli

23

4.MARCO REFERENCIAL

4.1 ESTADO DEL ARTE Los péptidos son considerados las moléculas biológicas más pequeñas que hacen parte del proteoma de una planta, la mayoría de los PDH son ricos en cisteína, lo que facilita la formación de numerosos puentes disulfuro que generan estabilidad a la estructura del péptido (Hammami et al. 2009). Los PDH se componen de 12 a 100 aminoácidos en su cadena peptídica. Estos tienen múltiples funciones esenciales en el crecimiento de la planta, en la interacción simbiótica, y en los mecanismos de defensa de la planta como la defensa antimicrobiana (Tavormina et al 2015). Los péptidos de defensa al hospedero (PDH), encontrados en las semillas de I. balsamina han mostrado una actividad antimicrobiana contra patógenos Gram positivos como Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus y Gram negativos como Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas solanacearum (Tailor et al 1997; Thevissen et al 2005), sin presentar citotoxicidad en las células de humanos, plantas cultivadas e insectos. Los AMPs fueron designados Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3, Ib-AMP4, y se caracterizan por modificaciones postraduccionales. (Thevissen et al 2005). Debido a todos los enormes beneficios que mostraron estos péptidos, Tailor y sus colaboradores en 1997, quisieron estudiar el origen de los Ib-AMP y su actividad antimicrobiana contra hongos y bacterias. Para esto, se llevó a cabo la extracción de la fracción proteica básica de las semillas de I. balsamina, los péptidos fueron purificados por RP-HPLC y posteriormente se analizaron por SDS-PAGE (Tailor et al 1997). Finalmente, se identificaron cuatro pequeños péptidos ricos en cisteína con propiedades antibacterianas y antifúngicas, tres de ellos presentaron susceptibilidad a los medios suplementados con altas concentraciones de sales como CaCl2 y KCl, solo el Ib-AMP4 presentó resistencia al medio debido a sus pequeñas variaciones en la cadena peptídica (Tailor et al, 1997). Los péptidos de defensa al hospedero, en su mayoría presentan carga positiva que los hace más afín por la carga negativa de los microorganismos, facilitando la interacción del péptido con la bacteria y provocar el desequilibrio del patógeno (Hammami et al. 2009). Basados en estas características Thevissen y sus colaboradores en el 2005, realizaron modificaciones sustituyendo algunos aminoácidos como glicina 9 o valina 39 por arginina, con el fin de mejorar la actividad antifúngica de los AMPs. Como resultado se obtuvieron variantes del péptido con un aumento en su carga neta positiva (Thevissen et al, 2005).

24

Para evaluar la actividad antifúngica, los péptidos fueron expuestos a hongos y levaduras en medios con altas concentraciones de sal. Como resultado el Ib-AMP4 mostró la mayor actividad antifúngica (Thevissen et al, 2005), y al igual que en el estudio realizado por Tailor y colaboradores 1997, el Ib-AMP4 presentó mayor actividad antifúngica y resistencia al medio tamponado con aumento en la fuerza iónica debido a sus altas concentraciones de sales, lo que confirma lo favorecedor que es la composición de su cadena peptídica para combatir microorganismos (Tailor et al, 1997). Cabe señalar que Wang y colaboradores en el 2009, con el objetivo de investigar los efectos antimicrobianos de los disulfuros pertenecientes a la estructura peptídica del AMP1, buscaron eliminar los aminoácidos ácido glutámico para aumentar la carga neta positiva del péptido y a su vez eliminaron los residuos de cisteína, para evaluar los efectos de los puentes disulfuros en su especificidad antimicrobiana (Wang et al, 2009). Las bacterias Gram positivas y Gram negativas se sometieron a la acción del nuevo péptido y a su vez su citotoxicidad fue probada en eritrocitos humanos. Como resultado, se obtuvo que la variante del AMP1 presentó un incremento en su carga neta positiva, la cual la hace más afín con los componentes de carga negativa de la membrana celular del microorganismo que facilitan su penetración. Por otra parte, se demostró que los enlaces disulfuros no interfieren en la capacidad antimicrobiana del péptido, ya que las variantes de los péptidos son incluso mejores que los AMP1 nativos (Wang et al, 2009). Por esta razón Flórez y colaboradores en el 2014, decidieron trabajar con el péptido Ib-AMP4 del cual se sintetizaron seis variantes lineales, se purificaron por RP-HPLC y su masa se determinó por MALDI-TOF. Las variantes se clasificaron en dos grupos. En los que se sustituyeron la cisteína de la posición 20 y la arginina de la posición 18 por arginina y triptófano respectivamente clasificados en el grupo WR (variantes Ib-M1, Ib-M2, Ib-M3), y el otro grupo WW (Ib-M4 a Ib-M6) conformado por aquellas variantes que recibieron modificaciones en el aminoácido cisteína de la posición 20 por triptófano. Y finalmente, cada grupo que presentaba glicina, triptófano y prolina en las posiciones 8, 9 y 10, fueron sustituidos por arginina con el fin de aumentar su carga neta positiva e hidrofobicidad (Flórez et al, 2014). Por otra parte, Escherichia coli K-12 fue cultivada aeróbicamente en caldo Müller Hinton, la actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de macrodilución en caldo y la actividad hemolítica se determinó por espectrofotometría. Los resultados muestran que la distribución de las cargas positivas juega un papel importante en la interacción con la membrana celular de la bacteria. Se encontró que el péptido Ib-M6 exhibió la IC50 más bajo siendo esta de 1 µM y en general los resultados en su mayoría fueron significativos, las variantes presentaron IC50 muy bajas a excepción del Ib-M2 y Ib-M4 que presentaron valores de 50 µM y 100 µM respectivamente (Flórez et al, 2014).

25

Por lo que se determinó que la variante Ib-M6 es la mejor alternativa sintética y con esta finalidad se evaluó su actividad hemolítica en los glóbulos rojos humanos, siendo del 29% a concentraciones de 100 µM. Sin embargo, para una concentración de 1 µM que corresponde a la IC50 del Ib-M6 no se observó degradación de los eritrocitos (Flórez et al 2014). Por otro lado, Fan y colaboradores estudiaron el péptido Ib-AMP4, pero recombinado con una proteína de fusión de E. coli JM109 y BL21 / DE3, las cuales presentan características similares a la proteína que presenta E. coli en sus mecanismos de resistencia, esto juega a favor del péptido debido que facilita la expresión del microorganismo, lo que podría estar relacionado con su mecanismo de acción rápido y eficaz contra cepas patógenas principalmente en aquellas que están implicadas en procesos sépticos (Fan et al, 2013). También se usó como vector el plásmido pET32 (con promotor lac), con el fin de

presentar una mayor actividad antimicrobiana contra aislados clínicos de E. coli

obtenidos del Hospital ZhongDa de la Universidad del Sureste de China. Por otra

parte, el promotor lac facilita la expresión de aislados clínicos, enzimas de

restricción, ligasas y quinasas. Considerando lo anterior, se sintetizó el ADN del Ib-

AMP4 por el método de GeneRain el cual tiene un sitio de escisión rEk, que permite

la inserción del ADN en el plásmido pET32a.

La actividad antimicrobiana se determinó por el método de microdilución en placa

de 96 pocillos realizándose cada experimento por duplicado, la actividad hemolítica

se evaluó en placa de 96 pocillos y fotométricamente se midió la liberación de

hemoglobina.

Los resultados obtenidos en especies de bacterias Gram negativas como

Enterobacter, Serratia, Escherichia y Gram positivas como Enterococcus,

Streptococcus y Staphylococcus, mostraron MIC con valores muy bajos entre 2 a

16 µg/mL. Y en cuanto a la actividad hemolítica a concentraciones por debajo de

100 μg / mL, el péptido no causo hemolisis ni inhibió la producción celular (Fan et al

2013).

26

4.2 MARCO CONCEPTUAL 4.2.1Generalidades de los PDH. Los PDH son pequeñas moléculas de 4 a 40 aminoácidos aproximadamente, principalmente con carga positiva e importantes propiedades antibacterianas y antifúngicas. Se cree que el principal mecanismo de acción contra los diferentes patógenos es la ruptura de membranas, conocido como la formación de poros en la membrana. Muchos de los PDH son ricos en cisteína, permitiendo la formación de puentes disulfuros los cuales les confiere una alta estabilidad química, térmica y proteolítica (Cardillo et al 2018). Los PDH α helicoidales anfipáticos, se pueden unir a una membrana lipídica y formar poros allí con eventual degradación de la membrana. Son el grupo de péptidos más grande con propiedades antimicrobianas o antivirales. Logran ser absorbidos por la membrana celular causando poros en ella lo que ocasiona graves daños en la célula bacteriana. Por otra parte, la membrana lipídica desempeña un papel de resistencia y soporte a la bacteria, esta tiene enzimas y principalmente proteínas que le dan curvatura y forma a la célula. La interacción del péptido con la bacteria puede afectar las proteínas que cumplen esta función (Zhdanov et al, 2014). Los PDH extraídos de plantas se encuentran en diferentes partes como, flores, raíces, tallos y hojas. Son producidos a nivel del ribosoma y hacen parte de la defensa inmunológica del hospedero. La mayoría de péptidos son ricos en cisteína, lo que facilita la formación de numerosos puentes disulfuro que les confieren una alta estabilidad química, térmica y frente a enzimas peptidasas (Hammami et al., 2009). La estructura de los PDH obtenidos en plantas tienen características similares a los obtenidos de animales e insectos, con un mecanismo de acción similar al reportado hasta el momento por los diferentes autores, el cual consta de la unión a la membrana seguida en la mayoría de los casos por la permeabilización y ruptura de la misma. (Salas et al., 2015).

4.2.2 Historia de Impatiens balsamina. Pertenece a la familia de las balsamináceas, están formadas por más de 1.000 especies entre ellas I. glandulifera, I. balfourii, I. parviflora, I. noli-tangere, entre otras (Muñoz et al, 2010). Crece de 20–75 cm de altura, suele comportarse como anual en ciertos climas, tiene tallos rectos y muy ramificados; sus hojas están dispuestas en forma elíptica; sus cápsulas glabras, alargadas, fusiformes y sus flores tienen colores rosa, rojo, malva, lila o blanco (Meenu et al. 2015).

27

4.2.3 Taxonomía. I. balsamina es una planta que pertenece al Reino Plantae, a la clase Magnoliopsida, Orden Ericales, de la familia Balsaminaceae, del género Impatiens y su especie I. balsamina. 4.2.4. Regiones. Se han identificado especies de Impatiens, especialmente en zonas tropicales y regiones subtropicales, áreas como África tropical, India, Asia, sur de China, norte de Europa y Rusia (Fischer, 2004; Gray-Wilson, 1980; Song et al., 2003; Utami, 2012; Yu et al., 2016).

Figura 1. Planta I. balsamina. Imagen tomada de: http://tropical.theferns.info/viewtropical.php?id=Impatiens+balsamina

4.2.5. Familia de péptidos de Impatiens balsamina. Los PDH aislados de las semillas de I. balsamina (Tailor et al, 1997), representan cuatro péptidos básicos relacionados de 20 aminoácidos, cada uno definido por dos enlaces disulfuro que forman una estructura de bucle distintiva (Patel et al., 1998).

Figura 2. Vainas que contienen las semillas de la planta Impatiens balsamina. Imagen tomada de: https://jardineriaplantasyflores.com/fichas/impatiens-balsamina-puro-color/

28

Los péptidos aislados de I. balsamina estudiados por Lee y colaboradores en 1997, El Ib-AMP1 fue transformado a dos formas, oxidada y reducida. La actividad antifúngica mostró mejores resultados en la forma oxidada del péptido, con una CMI de 50 µM para Candida albicans y 2.5 µM Aspergillus flavus, mientras que la forma reducida del péptido reportó CMI de 20.0 µM para C. albicans y 10 µM en A. flavus. Este resultado sugiere que el puente disulfuro en Ib-AMP1 desempeña un papel importante en su actividad antimicótica. De igual forma, demostraron que Ib-AMP1 se une a la superficie celular y penetra en la membrana de los hongos, los Ib-AMP son considerados únicos ya que no tienen homólogos (Lee et al, 1999). Figura 3. Estructuras génicas y alineamiento de secuencias peptídicas. Tomado de (Tailor et al, 1997)

A. Estructura generalizada de 333 aminoácidos predichos producto de la traducción primaria. Las regiones sombreadas representan los dominios de cada péptido, la región sin sombrear corresponde a las propeptídicas.

B. Indica cuales, que alineación y que cantidad de aminoácidos presenta cada péptido.

Al igual que en el estudio de Tailor y colaboradores en 1997, Wang y colaboradores en el 2009 estudiaron los péptidos Ib-AMP1 determinando sus variantes y probando su actividad antimicrobiana, la cual presentó una actividad antimicrobiana a concentraciones muy bajas en todas las variantes, en comparación con la MIC del péptido nativo como se observa en la tabla 1.

29

Tabla 1. Índices terapéuticos y análogos lineales eliminados por disulfuro. Tomado de: (Wang et al, 2009)

4.2.6. Péptidos Ib-AMP4. El péptido Ib-AMP4 consta de 20 aminoácidos, pertenecen a la planta I. balsamina y fue el primero en ser extraído. Su secuencia (QWGRRCCGWGPGRRYCRRWC) conserva los enlaces disulfuros (Fan et al, 2013). Su mecanismo de acción se cree que está relacionado con el ataque selectivo de la membrana celular, formación de canales porosos, que inhabilitan la respiración celular y deja fugas en las células para que los metabolitos y los iones puedan difundir fuera de las células (Nguyen et al. 2011). Además, se ha propuesto que Ib-AMP4 podría ser seguro en seres humanos contra infecciones, ya que no mostró actividad hemolítica en los eritrocitos ni perturbación en la bio-membrana de los fibroblastos (Wu et al 2013). De igual manera en el estudio de Fan y colaboradores en el 2013, estudiaron el Ib-AMP4 en combinación con una proteína de fusión en E. coli, esta escisión ocasionó que la proteína activara el Ib-AMP4 y sus propiedades antimicrobianas. Como resultado el Ib-AMP4 se dirigió selectivamente hacia las membranas bacteriana y el uso de 200 μg / mL de Ib-AMP4 solo causó un 15% de hemólisis de glóbulos rojos y un 8% de inhibición de la proliferación celular (Fan et al, 2013).

4.2.7. Análogos de IbAMP4. Los péptidos análogos son variantes sintéticas de los péptidos nativos (Flórez et al. 2014), en las cuales se modificó su cadena peptídica eliminando o remplazando aminoácidos para convertirlos en péptidos bactericidas, gracias a su aumento de carga positiva frente a determinados microorganismos. Las modificaciones en la cadena polipeptídica generan en los análogos mayor actividad antimicrobiana. Un ejemplo de ellos es la modificación del N-terminal del péptido Ib-AMP1 donde se ha eliminado el ácido glutámico con el fin de aumentar su carga neta positiva y así tener mayor afinidad con la bacteria (Wang et al. 2009).

30

Al igual que este, las modificaciones realizadas en los análogos del Ib-AMP4 por Flórez y colaboradores, donde se cambian los aminoácidos cisteína y arginina por arginina y triptófano respectivamente en las variantes Ib-M1, Ib-M2 e Ib-M3, y los aminoácidos cisteína por triptófano en los análogos Ib-M4, Ib-M5 e Ib-M6. Finalmente, en ambos grupos las posiciones 8, 9 y 10, fueron sustituidos por arginina con el objetivo de aumentar su hidrofobicidad, carga neta positiva y presentar mayor actividad antimicrobiana (Flórez et al, 2014). 4.2.8. Péptido Ib-M6. El análogo Ib-M6, una variante sintética del péptido nativo Ib-AMP4 obtenida por síntesis en fase sólida. La actividad antimicrobiana de estos AMP está determinada por su carga neta e hidrofobicidad, los cambios en estas propiedades dan como resultado un aumento o disminución de la actividad antimicrobiana. De igual manera, el resultado es dependiente del péptido y el microorganismo estudiado (Flórez et al, 2014). El péptido análogo Ib-M6, fue modificado con el fin de obtener una actividad antimicrobiana más efectiva. El péptido tuvo modificaciones en su carga neta, estructura anfipática y dominio C-terminal, reemplazando ciertos residuos de aminoácidos por arginina y triptófano (Flórez et al, 2014). La actividad antibacteriana contra E. coli K-12, con la excepción de la variante Ib-M4, cada una de las variantes sintéticas aumentó la actividad antibacteriana. El Ib-M6 exhibió la concentración de la IC50 más baja 1 µM. A consecuencia de su baja concentración de IC50 para obtener excelentes resultados se ha definido la secuencia de Ib-M6 como la mejor alternativa sintética, por esta razón se determinó su actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos. Dando como resultado un 29% de hemólisis para la concentración más alta ensayada (100 µM), sin embargo, para una concentración de µM que corresponde al valor de la IC50 no se observó degradación de los eritrocitos (Flórez et al, 2014). En la figura 4 se observa la cinética de crecimiento que presento la bacteria E. coli-K12 sola y frente a diferentes concentraciones del péptido Ib-M6, presentando inhibición de la bacteria incluso a la concentración más baja 1 µM, indicando la actividad antimicrobiana que tiene el análogo frente a cepas de E. coli.

31

Figura 4 . Cinetica de crecimiento bacteriano en presencia y ausencia del peptido, tomado de: (Florez et al, 2014).

• E. coli K-12 en la ausencia del péptido (cuadrados llenos).

• E. coli en presencia del péptido Ib-M6 a concentraciones de 5 µM (círculos llenos).

• E. coli en presencia del péptido Ib-M6 a 4 µM (triángulos llenos).

• E. coli en presencia del péptido Ib-M6 a de 2 µM (diamantes llenos).

• E. coli en presencia del péptido Ib-M6 a de 1 µM (círculos abiertos).

4.2.9. Historia de E. coli. E. coli es una bacteria que fue aislada y descrita por el pediatra alemán Theodore Escherich en 1885, quien demostró su existencia como hospedero habitual del intestino. En 1919, Castellani y Chalmers le dieron el nombre de Escherichia coli en homenaje a Escherich (Margall et al. 1997).

4.2.10. Taxonomía de E. coli. Escherichia coli es un bacilo Gram negativo anaerobio facultativo del Phylum Proteobacteria perteneciente a la clase Gamma Proteobacteria, Orden Enterobacteriales de la familia Enterobacteriaceae, genero Escherichia y especie E. coli. Este microorganismo presenta un metabolismo tanto fermentativo como respiratorio y puede ser inmóvil o móvil debido a los flagelos peritricos. Se encuentra haciendo parte del microbiota normal del intestino en humanos y animales de sangre caliente. A su vez, E. coli posee características bioquímicas que facilitan su identificación (Guadalupe 2002) como se observa en la tabla 2.

32

Tabla 2. Características bioquímicas de Escherichia coli. modificado de Guadalupe 2002.

4.2.11. Biología de Escherichia coli. E. coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, con un tamaño promedio de 1,1-1,5 µM de ancho y 2,0-6,0 µM de largo. Pueden ser microorganismos inmóviles, o móviles aquellos que presentan flagelos peritricos (Persson et al, 2007). La mayoría de estos microorganismos son comensales en el tracto digestivo del hombre y los animales de sangre caliente, constituyendo una de las especies bacterianas más abundantes en esta localización (Souza et al, 2009, Rodríguez et al. 2002, Urrestarazu et al.1999). E. coli extraintestinal. Patógeno extraintestinal, posee rasgos de virulencia que le permiten invadir, colonizar e inducir enfermedades en cualquier parte del cuerpo humano. Siendo más comunes las infecciones de tracto urinario (ITU), meningitis neonatal, neumonías, sitios quirúrgicos y sepsis. La mayoría de estos microorganismos se consideran zoonóticos, aislándose de productos como carnes y aves de corral (James et al, 2007).

Figura 5. Escherichia coli Imagen tomada de https://wickhamlabs.co.uk/wp-content/uploads/2016/09/FACT-SHEET-1-e-coli.pdf

33

Las cepas patógenas de E. coli son aquellas que presentan mecanismos de virulencia dándole el característico nombre de patotipos de E. coli. La mayoría de los episodios diarreicos son ocasionados por algunos de los patotipos diarreogénicos. Su transmisión, puede darse por contacto persona a persona, a través de una zoonosis o consumo de alimentos contaminados y aguas no tratadas (Margal et al, 1997, Colegio de medicina veterinaria, 2009). Con base en su mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de Escherichia coli causantes de diarrea se clasifican en seis grupos: enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica también conocidas como productoras de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (EHEC o VTEC o STEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC), enteroagregativa (EAEC) y adherencia difusa (DAEC) (Margal et al, 1997, Colegio de medicina veterinaria, 2009) 4.2.11.1. E. coli Verotoxigénica. Es un patógeno de carácter zoonótico. Este microorganismo puede producir dos tipos de toxinas Vt1 y Vt2. Una cepa puede presentar genes que expresen una o las dos verotoxinas, dado que las verotoxinas son homólogas a la toxina shiga de Shigella dysenteriae, estas se denominan E. coli productora de toxina shiga (STEC) (Rodríguez et al 2002). 4.2.11.2. E. coli Enterohemorrágica. Posee factores de virulencia responsables de las complicaciones intestinales y sistémicas que ocasionan cuadros de colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). Una característica fundamental, es la capacidad para causar lesiones de adherencia/destrucción (A/E) en el epitelio intestinal humano, ocasionando la destrucción de las microvellosidades (Rodríguez et al 2002). El SUH ocurre en un 5 y 10% de los casos y produce anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal (Farfán et al, 2016). En los adultos mayores, la tasa de letalidad por el SUH puede elevarse al 50% (Rodríguez et al 2002).

4.2.11.3. E. coli Enteroagregativa y Enteropatógena. El patotipo EAEC no solo están asociados a diarrea en niños, también son los principales agentes etiológicos de la diarrea del viajero. La adherencia localizada, difusa y agregativa son características de este patotipo. Por otra parte, las cepas EPEC son frecuentes en los brotes epidémicos, presentados en lugares cerrados como guarderías y hospitales. La enfermedad causada por esta bacteria se ha asociado a la alta mortalidad (10-40%), principalmente en los países en vías de desarrollo. Para el año 2010, se notificaron 121.455 muertes frecuentes en los brotes epidémicos en lugares cerrados como guarderías y hospitales (Farfán et al, 2016). Por otro lado, su mecanismo de acción se basa en causar translocación de señales intracelulares, y aplanamiento de las vellosidades gracias a la adherencia inicial al enterocito (Rodríguez et al 2002).

34

4.2.12. Mecanismos de Resistencia. Las cepas de E. coli, a menudo adquieren resistencia por medio de conjugación de plásmidos que llevan genes de resistencia. La STEC, hace parte del tracto digestivo de animales rumiantes, principalmente bovinos. Se ha reportado que la fuente de contaminación se da generalmente por consumo de alimentos y aguas contaminadas, o por contacto directo con el microorganismo. Las bacterias que se encuentran en el tracto gastrointestinal de los animales, pueden trasmitir los genes de resistencia a las bacterias patógenas para el humano (López et al. 2010). Por otra parte, la resistencia antibiótica, un fenómeno natural originado por mutaciones genéticas entre los microorganismos y la transferencia horizontal de genes, ocasionan los mecanismos moleculares de resistencia, dentro de los cuales se destacan los mecanismos de inactivación enzimática, alteraciones del sitio blanco y alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular. De igual manera, el uso indiscriminado de antibióticos ha contribuido con esta problemática (Mosquito et al. 2011; López et al. 2010). Los antibióticos aparte de ser una herramienta útil para combatir las infecciones bacterianas. Lamentablemente, influyen en los mecanismos de variación genética (mutaciones, recombinación, transposición e intercambio genético). Las concentraciones inferiores a las inhibitorias, ayudan a facilitar el proceso de resistencia a fármacos (Fica, 2014, Mosquito et al. 2011).

35

5.METODOLOGÍA

5.1 TIPO DE ESTUDIO

Estudio experimental in vitro en el cual se evaluó la actividad antibacteriana del péptido Ib-M6, péptido sintético análogo de la familia Ib-AMP4 y obtenido comercialmente, contra dos aislados clínicos: Escherichia coli STEC y una cepa comensal de E. coli. 5.2 ÁREA DE ESTUDIO El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas –LIBB- del programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander. 5.3 UNIVERSO Cepas de Escherichia coli patógenas y no patógenas.

5.4 POBLACIÓN

Cepas de Escherichia coli shigatoxigénica y E. coli comensal, aisladas de materia fecal de niños menores de cinco años de edad con enfermedad diarreica aguda (EDA) procedentes de Bucaramanga y su área metropolitana (Farfán et al, 2017).

5.5 MUESTRA BIOLÓGICA

Se utilizaron dos cepas: Una cepa de E. coli shigatoxigénica y una cepa de E. coli comensal previamente almacenadas a -80°C en caldo Luria con glicerol al 15%. 5.6 VARIABLES

• Medición de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

• Evaluación de la actividad mínima bactericida (CMB)

• Concentración del péptido

36

5.7 PROCEDIMIENTOS

5.7.1. Péptido Ib-M6. Comprado comercialmente a Biomatik en Estados Unidos. 5.7.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Para la determinación de la CMI del péptido Ib-M6 contra las cepas de E. coli Buc/AC299 y STEC Buc/AC234, se realizaron diluciones seriadas ½ de caldo Müller Hinton (MH), usando un protocolo de microdilución en placa de polietileno con 96 pocillos, el procedimiento se llevó a cabo en cámara de bioseguridad con previa asepsia, aplicando los protocolos de bioseguridad y control de calidad para evitar contaminación. Para este, se emplearon dos controles: control negativo (caldo MH) y control positivo (caldo MH y suspensión bacteriana), este último fue independiente para cada cepa (Quintana et al. 2005, Gil et al. 2016). Los experimentos fueron realizados por triplicado (Tabla 3), obteniéndose reproducibilidad en los resultados (Fan et al. 2013, Gil et al. 2016). La lectura de los resultados se realizó por observación directa y espectrofotometría a 630 nm (Flórez et al., 2014, Jepson et al., 2016).

Tabla 3. Diseño de la MIC de las cepas E. coli BucAc/299 y STEC BucAc/234.

37

5.7.3. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB). Para determinar la CMB, se usó el método de recuento de células viables en agar sangre, el procedimiento fue realizado en cámara de bioseguridad con previa asepsia, aplicando los protocolos de bioseguridad y control de calidad para evitar contaminación. Brevemente, se extrajeron 100 µL de los pozos en los cuales no se observó crecimiento visible de la bacteria (inhibición de crecimiento), esta suspensión fue inoculada en placas de Petri estériles con agar sangre, debidamente rotuladas con la concentración correspondiente. Posteriormente, se incubaron durante 24 horas a 37 °C (Quintana et al. 2005, Gil et al. 2016). 5.7.4. Inóculo cultivo. Para realizar las soluciones de trabajo con microorganismos, previamente se descriopreservaron las cepas de E. coli BucAc/234 y BucAc/299. Se tomaron aproximadamente 200 µL de cada una de las cepas e inoculados en tubos de 5 mL con medio luria bertani (LB). Posteriormente, los tubos fueron incubados a 37ºC durante 24 horas, para garantizar el crecimiento de las bacterias. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. 5.7.5. Inóculo bacteriano inicial. Para realizar el inóculo bacteriano de la placa, se tomaron 600 µL del cultivo bacteriano (LB) y se suspendieron en 5 mL de Solución Salina Estéril al 0.9% hasta que la concentración del inóculo fue visualmente igual al patrón 0.5 de la escala de McFarland, y su absorbancia por espectrofotometría a 625 nm este entre 0.08 y 0.1, este contendrá aproximadamente 1-2x108 unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL). 5.7.6. Concentración en tubo falcón. Para lo cual, se tomaron 1000 µL del inoculo bacteriano inicial y se adicionaron en 9000 µL de caldo MH contenidos en un tubo falcón, para obtener una concentración final de 5x105 UFC/mL. 5.7.7. Concentración en pozo. Finalmente, se tomaron 100 µL del inoculo 5x105 UFC/mL y fueron agregados a cada uno de los pozos para tener una concentración de 5x104 UFC/pozo excepto, las columnas 1 y 7 las cuales fueron usadas como control negativo y separador entre cepas respectivamente.

5.8 ANÁLISIS DE LOS DATOS

Los triplicados de cada una de las cepas fueron tabulados en Excel usando las

siguientes variables: Medición de la concentración mínima inhibitoria (Wang et al.

2009, Jepson et al. 2016, Gil et al. 2016, Quintana et al. 2005), evaluación de la

actividad mínima bactericida ((Fan et al. 2013, Gil et al. 2016, Quintana et al. 2005)

y concentración del péptido (Wang et al. 2009). De igual forma se realizaron

promedios de cada microorganismo con el fin de determinar la CIM.

38

5.9 ASPECTOS ÉTICOS Resolución número 8430 de 1993. Por la cual, se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud. La resolución establece que toda investigación debe ser realizada bajo aspectos éticos, con el fin de garantizar protección al investigador. El Título IV Bioseguridad de las investigaciones, Artículo 63. Dicta que las instituciones en las que se realizan investigaciones con microorganismos patógenos, deben contar con las instalaciones y equipos necesarios para garantizar un manejo seguro cumpliendo con todas las normas de bioseguridad y el personal capacitado para la manipulación de estos microorganismos. El Articulo 66. Establece que el investigador principal junto con el comité de ética en investigaciones y el representante legal de la institución investigadora, determinaran el tipo de laboratorio en el cual se debe manipular el microorganismo teniendo en cuenta el grado de riesgo que este representa. Es importante tener en cuenta la contingencia física de las instalaciones y seguir el protocolo estandarizado con el fin de minimizar riesgos que puedan llegar a ocasionar liberación del material infeccioso según lo estipulado por el articulo 71 (Ministerio de Salud 1993).

39

6. RESULTADOS

La actividad antimicrobiana del péptido análogo Ib-M6, fue evaluada probando su CIM contra un aislado clínico y uno comensal (Tabla 4). Estas cepas fueron E. coli BucAc/299 y STEC BucAc/234 Tabla 4. Concentración mínima inhibitoria del péptido Ib-M6 comparada con la CIM de la Estreptomicina

Cepa MIC (μM) Estreptomicina

MIC (μM) Péptido Ib-M6

BucAc/299 3.1 1.5

STEC BucAc/234 100 <0.7

En la evaluación de la actividad antimicrobiana mediante el método de microdilución en caldo, se encontró que el péptido análogo Ib-M6 presentó actividad antimicrobiana sobre ambas cepas. Los resultados se resumen en la tabla 5. El análogo Ib-M6 exhibió un amplio espectro de actividad sobre las cepas Buc/Ac299 y Buc/Ac234. Las dos bacterias fueron susceptibles a concentraciones del péptido con valores de CIM entre <0.7 y 1.5 µM. Tabla 5. Concentración mínima inhibitoria del péptido análogo Ib-M6 en los triplicados.

Cepa A B C MIC µM

Buc/Ac299 1.5 1.5 1.5 1.5

STEC Buc/Ac234

<0.7

3.1

<0.7

<0.7

En la determinación de la actividad mínima bactericida del análogo Ib-M6 sobre las cepas bacterianas, se observó que la MBC para la cepa comensal se alcanza a una concentración de 12.5 µM, la cual es más baja que la concentración que se necesita para inhibir el 99% de las bacterias en la cepa STEC, la cual fue de 25 µM. En la figura 6 se observan las concentraciones de MBC obtenidas para cada una de las cepas.

40

Figura 6. Concentración mínima bactericida del análogo Ib-M6 sobre las cepas bacterianas E. coli Buc/Ac299 y STEC Buc/Ac234 medidas por el método de recuento de células viables en agar sangre. La MBC fue establecida por el crecimiento de no más de 10 colonias en la concentración de 12,5 µM para la cepa comensal y 25 µM para la cepa STEC.

Al comparar los resultados de las dos cepas, se puede llegar a determinar que el péptido análogo tiene un efecto bactericida sobre las cepas E. coli comensal y el aislado clínico STEC. Por otra parte, la CIM se mostró a menor concentración (<0.7 µM) en la bacteria patógena que en la cepa comensal (1.5 µM). Con lo cual, se determina que el péptido tiene potencial antimicrobiano para inhibir el 50% de los microorganismos de cada cepa, pero a diferentes concentraciones. A su vez, el péptido Ib-M6 tiene actividad bactericida contra ambas bacterias, debido a que logró inhibir el 99% del crecimiento bacteriano de los dos aislados clínicos, siendo menor la concentración para inhibir la cepa comensal (12,5 µM). Tabla 6. Comparación de la CIM y MBC de las dos cepas utilizadas en el estudio.

Cepas CIM µM MBC µM

BucAc/299 comensal 1.5 12.5

BucAc/234 STEC >0.7 25

0

5

10

15

20

25

30

25

0 0 0

12,5

0 0 0

MBC

Buc/Ac234 Buc/Ac299

41

7. DISCUSIÓN

Con el fin de evaluar la actividad antimicrobiana del péptido análogo Ib-M6, se realizó el método de microdilución en caldo y la técnica de recuento de células viables en agar sangre. Para lo cual, se usaron dos aislados clínicos de Escherichia coli, la cepa Buc/AC299 identificada como cepa comensal y la cepa STEC Buc/AC234 cepa patógena, obteniéndose como resultado un efecto bactericida para ambas bacterias con concentraciones de 12,5 µM para la cepa comensal y 25 µM para la cepa STEC como lo muestran la figura 6. De igual forma, el péptido presentó un alto potencial antimicrobiano con CMI < 0.7 µM y 1.5 µM, indicando su efectividad para inhibir el crecimiento de la bacteria. Observar tabla 5. En el estudio realizado por Fan y colaboradores en el 2012, se usó el péptido recombinante Ib-AMP4 y su sinergia con el monoterpeno timol, para determinar la actividad antimicrobiana contra bacterias Gram negativas como Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca y Escherichia coli. El Ib-AMP4, exhibió una amplia actividad contra las bacterias con valores de CIM entre 0.49 y 3.5 µM en las bacterias que fueron sensibles, y CIM entre 15 y 63 µM para los microorganismos menos sensibles a las fusiones del péptido con los monoterpenos o con los antibióticos (Fan et al, 2012). En el presente estudio se trabajó con la variante Ib-M6 contra dos aislados clínicos de E. coli. La cepa comensal Buc/Ac299 y la cepa STEC Buc/Ac234 ambas aisladas de materia fecal de niños menores de cinco años con EDA. Por otra parte, Wang y colaboradores realizaron una investigación con otro péptido de I. balsamina, el Ib-AMP1 y a partir de este sintetizaron cuatro análogos lineales con modificaciones en los aminoácidos de su cadena peptídica, generando cambios en su carga neta e hidrofobicidad. Estos análogos, fueron expuestos a E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium, B. subtilis, S. epidermidis, S. aureus, Staphylococcus aureus meticilino resistente (MRSA) con resultados de CMI entre 4 y 32 µM. Aunque las investigaciones no fueron realizadas con el mismo péptido ni con los mismos microorganismos, si presentan resultados similares tanto en su actividad antimicrobiana como en sus cambios de carga positiva e hidrofobicidad, por las modificaciones de a.a en sus cadenas (Wang et al 2009). Es importante destacar que los péptidos de donde se sintetizaron las variantes provienen del mismo precursor, posiblemente por esta razón es que sus análogos también tienen propiedades y características similares aun siendo de diferentes péptidos. Con las modificaciones realizadas en el Ib-AMP1, se determinó que los análogos que carecían del aminoácido cisteína mostraron 3.7 a 4.8 veces mayor actividad antimicrobiana en comparación con el péptido nativo. Al igual que lo mencionado anteriormente el Ib-M6 del Ib-AMP4, presentó una mejora en la actividad

42

antimicrobiana con una IC50 a concentraciones de 1 µM, gracias a las modificaciones realizadas en su cadena polipeptídica (Flórez et al, 2014). Por otro lado, el análogo Ib-M6 presentó la IC50 más baja, aunque en general se obtuvieron excelentes variantes con propiedades antimicrobianas y concentraciones muy bajas para inhibir el 50% de la población bacteriana. A excepción del Ib-M4 que no aumentó su actividad antimicrobiana (Flórez et al, 2014); Por esta razón se decidió trabajar con el análogo Ib-M6, el cual presentó mejores resultados frente a su actividad contra E. coli K12 en la investigación realizada por (Flórez et al 2014). En el presente estudio, el Ib-M6 no fue sometido a modificaciones. Por otra parte, se realizó un ensayo para evaluar su CMI y CMB, para determinar la CMI se expuso los dos aislados clínicos de E. coli frente al péptido, con el objetivo de probar su actividad y comparar si los resultados eran similares a los obtenidos por Flórez y colaboradores. Posterior a la incubación durante 24 horas a más o menos 37ºC, se realizó la lectura en el lector de placa obteniéndose resultados bastante favorables y similares a los obtenidos por Flórez y colaboradores. La CMI para el aislado clínico STEC fue <0.7 µM y para la cepa comensal fue de 1.5 µM, comprobándose una vez más que el análogo Ib-M6 tiene propiedades antimicrobianas muy bien establecidas. Por otra parte, se evaluó la actividad bactericida de este péptido por el método de recuento de células viables en agar sangre. Donde se utilizaron cajas de Petri con agar sangre, las cuales fueron inoculadas con 100 µL de los pozos o concentraciones de la placa, en los que no se observó turbidez o actividad bacteriana (posterior a las 24 horas de incubación de la placa). Posteriormente las cajas de Petri fueron llevadas a incubar durante 24 horas a 37ºC. Los resultados obtenidos para la MBC fueron de 12.5 µM para la cepa comensal y 25 µM para la cepa STEC, con lo cual se determina que el péptido Ib-M6 presenta actividad bactericida frente a ambos microorganismos, sin embargo, se necesita de una mayor concentración del Ib-M6 para eliminar las bacterias STEC. Por otra parte, aunque no se realizó actividad hemolítica como en los estudios de (Flórez et al, 2014; Fan et al, 2012 y Tailor en 1997), si comparamos los resultados de la MBC con los valores obtenidos por estos investigadores en la actividad hemolítica, se podría decir, que a concentraciones de 12,5 µM y 25 µM no se presenta actividad hemolítica, debido que lo reportado por los investigadores fue de 100 µM para presentar hemolisis en los glóbulos rojos. Sin embargo, para determinar lo mencionado anteriormente, debería realizarse un ensayo donde se evalué la actividad hemolítica del péptido y comprobar lo dicho. Pero en general, se puede determinar que los resultados obtenidos son promisorios para seguir realizando investigaciones de actividad antibacteriana con el análogo Ib-M6.

43

8. CONCLUSIONES

➢ El análogo Ib-M6, presentó actividad antibacteriana contra los dos aislados clínicos de Escherichia coli. Aunque las dos cepas fueron inhibidas a concentraciones muy bajas, el péptido presentó una mayor actividad sobre la cepa STEC con una CMI <0.7 µM, mientras que para el aislado clínico comensal fue de 1.5 µM.

➢ El péptido Ib-M6, presentó actividad bactericida contra ambas bacterias, la MBC en la cepa Buc/Ac299, se presentó a una concentración más baja (12,5 µM). Mientras que la MBC en el aislado clínico STEC Ac/234 fue de 2 µM. Indicando que se necesitó el doble de la concentración del péptido para eliminar la cepa STEC.

➢ Los resultados obtenidos en este estudio fueron bastante satisfactorios, lo que hace más interesante al péptido Ib-M6 para realizar más investigaciones sobre su mecanismo de acción, estabilidad y citotoxicidad en estudio in vitro con células, animales y posteriormente en humanos.

44

9. RECOMENDACIONES

Realizar estudios en el análogo Ib-M6, con el fin de determinar su mecanismo de acción. Llevar a cabo nuevos estudios de actividad antibacteriana del péptido Ib-M6 contra otras bacterias de importancia clínica como Gram negativas y Gram positivas, con el objetivo de evaluar su efectividad en otras especies de bacterias.

Evaluar la citotoxicidad del análogo Ib-M6, en el mayor tipo de líneas celulares humanas posibles, pues hasta el momento, solo se ha evaluado en eritrocitos, fibroblastos y células vero. Esto con la intención de verificar la baja toxicidad del péptido en el ser humano.

45

BIBLIOGRAFÍA CABRERA, Cristina. GOMEZ, Rommel y ZUÑIGA, Andrés. La resistencia de bacterias a antibióticos, antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y adaptación. En: Colombia Medica. Junio, 2007, vol. 38, no. 2, p. 149-154. CARDILLO, Alejandra. MARTINEZ, María. ROMERO, Stella. CASCONE, Osvaldo. CAMPERI, Silvia y GIUDICESSI, Silvana. Péptidos antimicrobianos de plantas. En: farm. 2018, vol.160, no.1, p28-46. CASANA, Clara. El uso de antibióticos en la industria alimentaria y su contribución al desarrollo de resistencias. Determinantes de la diseminación de la resistencia a la colistina. Trabajo de grado Farmaceuta. Facultad de Farmacia. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE, 2018. 22 p. Colegio de Medicina Veterinaria. E. coli enterohemorrágica. Marzo, 2009, p.1-12. FAN, X. REICHLING y J. WINK, M. Antibacterial activity of the recombinant antimicrobial peptide Ib-AMP4 from Impatiens balsamina and its synergy with other antimicrobial agents against drug resistant bacteria. En: Original articles. November, 2012, vol.68, no.7, p. 628-30. -------- SCHAFER, Holger. REICHLING, Jurgen y WINK, Michael. Bactericidal properties of the antimicrobial peptide Ib-AMP4 from Impatiens balsamina produced as a recombinant fusion-protein in Escherichia coli. En: Biotechnol. May, 2013, vol.8, p.1213–1220. -------- KORYTOWSKY, Agatha. MAKKY, Ali. TANAKA, Motomu y WINK, Michael. Ib-AMP4 insertion causes surface rearrangement in the phospholipid bilayer of biomembranes: Implications from quartz-crystal microbalance with dissipation. En: membranes. October, 2017, vol. 1860, no.2, p. 617-623. FARFAN, Ana. ZHANG, Chengxian. IMDAD, Aamer. ARIAS, Monica. SÁNCHEZ, Nayibe. SHAH, Rikhil. IQBAL, Junaid. TAMBORSKI, Maria and GÓMEZ, Oscar. Case-Control Pilot Study on Acute Diarrheal Disease in a Geographically Defined Pediatric Population in a Middle Income Country. En: International Journal of Pediatrics. July, 2017, vol. 2017, p. 1-11. --------ARIZA, Sandra. VARGAS, Fabiola. VARGAS, Lizeth. Mecanismos de virulencia de Escherichia coli enteropatógena. En: Revista Chilena de Infectología. Agosto, 2016, vol.33, no.4, p. 438-450

46

FICA, Alberto. Resistencia antibiótica en bacilos gram negativos, cocáceas gram positivas y anaerobios. Implicancias terapéuticas. En: Revista Médica Clínica Las Condes. Abril, 2014, vol. 25, p.432-444. FLOREZ, J. PERULLINI, Mercedes. JOBBA Matias y CANO, Herminsul. Enhancing Antibacterial Activity Against Escherichia coli K-12 of Peptide Ib-AMP4 with Synthetic Analogues. En: Pept Res Ther. January, 2014, vol.20, no.3, p.365–369. GALAN, Juan. MORENO, Ana y BAQUERO, Fernando. Impacto de los movimientos migratorios en la resistencia bacteriana a los antibióticos. En: Esp Salud Pública. Diciembre, 2014, no. 6, p. 467-475. GARCIA, Viviana. GARIBOGLIO, María. ZALOFF, Ana. ÁLVAREZ, Mónica. SUCIN, Mónica. MOREIRA, Gloria. LOSCH, Liliana y MERINO, Luis. Prevalencia de bacterias enteropatógenas en niños que asisten a un hospital pediátrico en Resistencia, Chaco, Argentina. En: Facultad de Medicina de la Universidad Nacional del Nordeste. 2017, vol.1, p.15-20. GIL, Marielsa. GONZALEZ, Marialbet. ORLANDI, Oleyna. UGAS, Katlhen. NICITA, Graciela y PEROZO, Esther. Actividad bacteriostática y bactericida de extractos etanólicos de propóleos venezolanos y europeos sobre Escherichia coli Y Staphylococcus aureus. En: MedULA Diciembre, 2016, vol. 25, no 1, p.6-12. GOMEZ, Oscar. Enfermedad diarreica aguda por Escherichia coli enteropatógenas en Colombia. En: Chilean Infectol. Junio, 2014, vol.31, no.5, p.577-586. GONZALEZ, Melaine. SAN JUAN, Javier. MORALES, Fidel y OTERO, Anselmo. Péptidos antimicrobianos: potencialidades terapéuticas. En: Cuban Journal of Tropical Medicine.2017, vol. 69, no 2, p.1-15. HAMMAMI, Riadh. BEN, Jeannette. VERGOTEN, Gerard. And FLISS, Ismail. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. En: Nucleic Acids. October, 2009, vol. 37, p.963-968. HSUAN, Wen. DI, Rong y MATTHEWS, Karl. Activity of the plant-derived peptide Ib-AMP1 and the control of enteric foodborne pathogens. En: Food Control. Febrero, 2013, vol.33, p.142-147. HSUAN, Wu. DI, Rong y MATTHEWS, Karl. Antibacterial Mode of Action of Ib-AMP1 Against Escherichia coli O157:H7. En: Probiotics & Antimicro. February, 2013, vol. 5, p.131–141.

47

JEPSON, Alys. SCHWARZ, Jana. RYAN, Lloyd. RVADNOV, Maxim y POON, Wilson. What Is the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Pexiganan Acting on Escherichia coli? A Cautionary Case Study. En: Biophysics of Infection. May 2016, vol.915, p.33-48. LEE, Dong. SHIN, Song. KIM, Dae. SEOL, Moo. KANG, Joo. LEE, Younghoon. KIMI, Lyong y HAHM, Kyung. Antifungal mechanism of a cysteine-rich antimicrobial peptide, Ib-AMP1, from Impatiens balsamina against Candida albicans. En: Biotechnology Letters. October, 1999, vol.21, p.1047–1050. LOPEZ, Carmen. GRANDE, José. LUCAS, Rosario y GELVEZ, Antonio. Resistencia a biocidas de diferentes cepas de Escherichia coli. En: Anales. Diciembre, 2010. vol.23, no.1, p121-136. MARGAL, Nuria. DOMÍNGUEZ, Ángela. PRATS, Guillem y SALLERAS, Lluís. Escherichia coli enterohemorrágica. En: Salud Pública. Septiembre, 1997, vol.71, p. 437-443. MONCAYO, Álvaro. La resistencia a los antibióticos y la falta de interés de la industria farmacéutica. En: Infectio. Junio, 2014, vol.18, no.2, p.35-36. MOSQUITO, Susan. RUIZ, Joaquín. BAUER, José y OCHOA, Theresa. Mecanismos moleculares de resistencia antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea. En: Peru Med Exp Salud Publica. Septiembre, 2011. vol.28, no.4, p. 648-656. MUÑOZ, F y NAVARRO, C. CXXVI. BALSAMINACEAE. Ver 2. Septiembre, 2010. NGUYEN, Leonardo. HANEY, E y VOGE, H. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. En: Cell press. September, 2011, vol. 29, no 9, p. 464-472. PATEL, Sunil. OSBORN, Rupert. REES, Sarah y THORNTON, Janet. Structural Studies of Impatiens balsamina Antimicrobial Protein (Ib-AMP1). En: Biochemistry. Octubre, 2017. vol. 37, p. 983-990. PERSSON, Soren. OLSEN, Katharina. ETHELBERG, Steen y SCHEUTZ, Flemming. Subtyping Method for Escherichia coli Shiga Toxin (Verocytotoxin) 2 Variants and Correlations to Clinical Manifestations. En: Clinical microbiology. Junio, 2007. vol.45. no. 6, p. 2020–2024. QUINTANA, Horna. DIAZ, Silvia. TABOADA, Vicente y ORTIZ, Tamariz. Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida de ciprofloxacina en bacterias uropatógenas aisladas en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas. En: Med Hered. Febrero, 2005. vol.16, no.1, p. 39-45.

48

RODRÍGUEZ, Guadalupe. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli. En: Salud Publica Mex. Abril 2002, vol.44, no.5, p. 464-475. SALAS, Carlos. BADILLO, Jesús. RAMIREZ, Guadalupe y OLIVER, Carmen. Biologically Active and Antimicrobial Peptides from Plants. En: BioMed Research International. Octubre, 2014, vol, 2015, p. 1-11. SÁNCHEZ MERINO, GUILLÁN MAQUIEIRA, FUSTER FOZ, MADRID GARCÍA, JIMÉNEZ RODRÍGUEZ y GARCÍA ALONSO. Sensibilidad microbiana de Escherichia coli en infecciones urinarias extrahospitalarias. En: Actas Urol Esp. Diciembre, 2003. vol.27, no.10, p. 783-787. SÁNCHEZ, Samanta. ROPMENCIN, Paola. GUACHALLA, Luis y IÑIGUEZ, Volga. Caracterización geno-fenotípica de aislados de Escherichia coli (AEEC) de pacientes pediátricos con procesos diarreicos infecciosos en la ciudad de La Paz: Implicancias para el diagnóstico y epidemiología de las enfermedades diarreicas agudas. En: Chilean magazine of pediatrics. August, 2006. vol.77. no.4, p.412-427. SCHEUTZ, F. STROCKBINE, N.A. y GENUS, I. (2005) Escherichia castellani and Chalmers in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Brenner, D. J., et al., Eds., Springer Inc., New York, 607-623. SOUZA, Valeria. CASTILLO, Amanda. ROCHA, Martha. SANDNER, Luisa. SILVA, Claudia y EGUIARTE, Luis. Ecología evolutiva de Escherichia coli. En: Interciencia. Octubre, 2001, vol. 26, no.10. TAILOR, Ravi. ACLAND, David. ATTENBOROUGH, Sheila. CAMMUES, Bruno. EVANS, Ian. OSBORN, Rupert. RAY, John. REES, Sarah y BROEKAERT, Willem. A Novel Family of Small Cysteine-rich Antimicrobial Peptides from Seed of Impatiens balsamina Is Derived from a Single Precursor Protein. En: BIOLOGICAL CHEMISTRY. Septiembre, 1997, vol.272, no.39, p.480–2448. URRESTARAZU, María. LIPRANDI, Ferdinando, PEREZ, Eva. GONZALEZ, Rosabel y PEREZ, Irene. Características etiológicas, clínicas y sociodemográficas de la diarrea aguda en Venezuela. En: Panam Salud Publica. Septiembre 1999, vol. 6, no.3, p. 149- 156. VENTOLA, Lee. The Antibiotic Resistance Crisis. En: P&T. April, 2015, vol. 40, no. 4, p.277-283. WANG, Peng. BANG Jeong-Ky. KIM, Hak. KYOUNG,Jim. KIM,Yangmee y YUB, Song. Antimicrobial specificity and mechanism of action of disulfide-removed linear analogs of the plant-derived Cys-rich antimicrobial peptide Ib-AMP1. En: Peptides, September, 2009, vol.30, no.12, p. 2144-2149.

49

World Health Organization. Antimicrobial Resistance. Disponible en http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/. XIANG YU, Sheng. JANSSENS, Steven. YUN ZHU, Xiang. LIDÉN, Magnus. GANG GAO, Tian y WANG, Wei. Phylogeny of Impatiens (Balsaminaceae): integrating molecular and morphological evidence into a new classification. En: Cladistics. Febrero, 2015, vol.32, no.2, p. 179-197. ZHDANOV, Vladimir. Interaction of amphipathic α-helical peptides with a lipid membrane: Adsorption and pore formation. En: Physica A. Enero, 2014, v.401 p.45–51.

50

ANEXOS

Anexo A. Lectura de la placa. Cepa de E. coli comensal y cepa patógena Contra el péptido Ib-M6

51

Anexo B. Montaje MBC del péptido Ib-M6

52

Anexo C. MBC obtenidas en el primer triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234.

Anexo D. MBC obtenidas en el segundo triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234

53

Anexo E. MBC obtenidas en el tercer triplicado de la cepa STEC Buc/Ac 234

Anexo F. MBC obtenidas en el primer triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299

54

Anexo G. MBC obtenidas en el segundo triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299

Anexo H. MBC obtenidas en el tercer triplicado de la cepa comensal Buc/Ac299