ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 6: EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS

“TINCIONES”

1.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN:

Por su tamaño, las bacterias pueden ser observadas únicamente con ayuda de un microscopio, existiendo 2 maneras de visualizarlas:

1.1.- Examen microscópico en fresco (vivas): Permite el estudio de la morfología bacteriana in vivo, por lo que conservan rasgos fundamentales como la movilidad. Por medio de este procedimiento se observan los microorganismos sin modificaciones, ya que la fijación y la acción de los colorantes alteran muchas de sus condiciones naturales.

a) Preparación húmeda: es la forma más simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos.Consiste en la suspensión de un inóculo de cultivo en agua u otro líquido, colocando una gota de esta suspensión en un portaobjetos común y cubrirlo con un cubreobjetos. Este procedimiento requiere utilizarmicroscopía de contraste de fases.

b) Preparación de la gota pendiente: ésta técnica requiere de un portaobjeto con una concavidad o depresión circular en su centro, llamado portaobjeto excavado (o célula de Kacli). Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos, su disposición o agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias químicas, teniendo como principal ventaja la ausencia de corrientes de capilaridad

Técnica:- Colocar un anillo delgado de vaselina alrededor de la depresión central del portaobjetos- Depositar una gota de solución fisiológica en el centro de un cubreobjetos y emulsionar en ella el material a examinar si proviene de un cultivo sólido (material patológico ) o utilizar una gota de cultivo si es líquido.- Invertir el portaobjetos de manera tal que la excavación central quede encima de la gota del cubreobjetos.- Presionar el portaobjetos y luego invertirlo con un movimiento rápido. La gota que contiene el materialquedará pendiendo sobre la excavación del portaobjetos.- Observar al microscopio poniendo aceite de inmersión directamente sobre el cubreobjetos.

c) Coloración Vital: Consiste en soluciones diluidas de diversas sustancias que impregnan las bacterias sin llegar a inmovilizarlas (ej.: azul de metileno, rojo neutro; en general, soluciones acuosas al 0,05%). Después se procede del mismo modo que para la observación sin coloración vital.

1.2.- Examen microscópico en preparaciones fijadas o teñidas (muertas): Las preparaciones fijadas o teñidas permiten el estudio de la morfología de las bacterias muertas y tiene la ventaja de poder conservarse por tiempo indefinido, permitiendo observarlas cuando se desee.

Todas las técnicas de tinción exigen pasos que son fundamentales:a) Frotis o Extensión: Los portaobjetos deben estar absolutamente limpios y desengrasados. Si el material a examinar es un líquido, se coloca en el centro una gota, si se trata de microorganismos cultivados en un medio sólido, se coloca en el centro del portaobjetos una gota de suero fisiológico o agua destilada estéril y se le agrega un pequeño inóculo del cultivo sólido. Para ambos casos, la muestra se extiende con el asa de loop en una capa delgada y uniforme, sin llegar hasta los bordes.

b) Fijación: Con este procedimiento se logra que el material ya extendido se adhiera firmemente al portaobjetos, evitando así que se desprenda durante los lavados. El método más empleado es el calor seco que consiste en someter rápidamente la preparación a la llama del mechero Bunsen. Se toca la parte inferior del portaobjeto con el dorso de la mano opuesta para calcular la intensidad del calor empleado, la cual jamás debe calentarse hasta quemar la piel.

c) Tinción: Tiene por objeto aumentar el contraste y hacer más evidentes las estructuras celulares, de manera que puedan observarse a microscopía óptica de campo claro.

2.- TIPOS DE COLORANTES:Los colorantes empleados en bacteriología son productos sintéticos y aunque varían mucho en su naturaleza química, en la práctica se dividen en 2 grupos:

2.1.- Ácidos: Son sales de ácidos. Tienen mayor tendencia a combinarse con el citoplasma de las células de organismos superiores. Ejemplo: eosina, rojo congo.

2.2.- Básicos: Son sales de bases. Las células bacterianas son ricas en ácidos nucleicos que llevan cargas negativas en forma de grupos fosfato, los que se combinan con los colorantes básicos cargados positivamente, por lo cual el cuerpo bacteriano se tiñe uniformemente. Por esta razón, en bacteriología se emplean casi exclusivamente colorantes básicos. Ejemplo: Fucsina fenicada, Cristal violeta, Azul de metileno.

3.- CLASIFICACIÓN DE TINCIONES:

3.1.- Tinción simple: es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante y sirve para observar tamaño y forma celular. Los colorantes más comunes utilizados son: azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina.

Técnica: - frotis y fijación de la muestra- colorante durante un minuto, cubriendo la totalidad del frotis fijado- lavar con agua para retirar exceso de colorante- dejar secar al aire- observar al microscopio con objetivo de inmersión

3.2.- Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reacción con los colorantes utilizados. Entre ellos la tinción de Gram y la de alcohol-ácido resistente son las más usadas.

a) Tinción Gram: es la técnica de uso más común en microbiología y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades físicas de la pared celular.

Técnica:- frotis y fijación de la muestra- cristal violeta durante un minuto- lavar con agua- solución de yodo (lugol) durante un minuto - lavar con agua- alcohol durante 30 seg.- lavar con agua- safranina por 30 seg.- lavar con agua y secar al aire

- examinar al microscopio con objetivo de inmersión

Bacterias Gram (+) (violeta) Bacterias Gram (-) (rojas)- Staphylococcus - Escherichia- Streptococcus - Shigella- Corynebacterium - Klebsiella - Bacillus - Enterobacter

- Serratia- Proteus- Salmonella- Pseudomonas- Brucella

b) Coloración doble por el método de Zielhl–Neelsen: se emplea para diferenciar microorganismos ácido-alcohol resistentes, principalmente el bacilo de la tuberculosis, de aquellos que no son ácido-alcohol resistentes.Técnica:- frotis y fijación de la muestra- fucsina concentrada de Zielhl por 3-5 minutos, calentando la preparación con la llama del mechero, evitando que la preparación se seque y/o el colorante hierva- decolorar con alcohol-ácido (alcohol de 95º con 3% en volumen de ácido clorhídrico concentrado), hasta que desprenda el colorante- lavar con agua- azul de metileno por 2 minutos - lavar con agua- lavar con agua y secar al aire- examinar al microscopio con objetivo de inmersión

Bacterias ácido–alcohol resistentes: color rojo.Bacterias no ácido–alcohol resistentes: color azul.

3.3.- Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la célula bacteriana, como también algunos microorganismos que dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias.

a) Tinción de Esporas:Al ser muy impermeables a los colorantes, se hace necesario usar técnicas especiales.

Técnica:- frotis y fijación de la muestra

- cubrir frotis con papel filtro- teñir con Verde Malaquita a emisión de vapores por 10 a 15 min.- enfriar y lavar con agua- aplicar Safranina por 30 segs a 1 min.- lavar con agua y secar al aire - observar al microscopio con objetivo de inmersión

Las esporas aparecen de color verde y la célula vegetativa roja. La vaporización del colorante sobre la muestra incrementa la penetración de éste en los recubrimientos impermeables de la espora.

b) Tinción de Cápsula: Usada para los géneros Klebsiella y Streptococcus. Muchas bacterias están rodeadas por una envoltura mucosa o cápsula, pero sólo en algunas se encuentra bien desarrollada. Esta se compone de polisacáridos, polipéptidos y polímeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran por el calor, nunca se podrá utilizar calor en ninguno de los pasos de la tinción. La cápsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un halo transparente alrededor de la célula. La técnica de la tinción negativa incorpora materiales tales como tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes para penetrar la célula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la separación de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado contiene muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es probable que sean reales y no artificiales.

Técnica:- sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con asa de loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar.- extender la muestra y dejar secar al aire.- cubrir con Safranina por 30 a 45 segs.- dejar secar - observar al microscopio con inmersión.

La cápsula se verá como un halo transparente rodeando la célula de color rojo y el resto de la preparación aparecerá de color negro.