CITOMETRCITOMETRÍÍA DE FLUJOA DE FLUJO

Estudio de suspensiones celulares u otras partículas

biológicas.

Analiza en forma rápida y eficiente, células

individuales que fluyen a gran velocidad en un medio

líquido y atraviesan una luz monocromática láser.

Cada célula es evaluada según diversas

características: forma, tamaño, complejidad

citoplasmática, composición antigénica y bioquímica.

¿Cómo funciona un¿Cómo funciona un citómetrocitómetro??• Sistema de flujo

• Dispersión de la luz

• Detector de fluorescencia

• Separación y detección de la luz

• Amplificación de la señal obtenida

• Corrección de errores: solapamiento espectral

• Digitalización y almacenamiento de la información

• Análisis de datos mediante el empleo de un software apropiado.

CitómetroCitómetro de de flujoflujo

Rayo láser

Flujo de líquido

Muestra

Sistema de fSistema de flujo de célulaslujo de células

Espejo dicroico Muestra

Fuente de rayo láser

Dispersadordel rayo

Filtro óptico 525nm

Filtro óptico 670nm

Filtro óptico 580nm

Detector de luz verde

Detector de luz naranja

Detector de luz roja

Detector de luz dispersada a

90º

Detector de luz incidente

frontal

Componentes de un Componentes de un citómetrocitómetro de flujode flujo

Dispersión frontal de la luzDispersión frontal de la luz

Dispersión de Dispersión de la luz en la luz en forma forma

frontalfrontal::Forward Forward

scatterscatter (FS(FSCC))

Láser

Tamaño celularTamaño celular

Linfocitos < Linfocitos < MonocitosMonocitos < < PolimorfonuclearesPolimorfonucleares

Dispersión de la luz a 90ºCDispersión de la luz a 90ºC

Láser

Dispersión de la luz Dispersión de la luz a 90ºa 90º : : Side Side scatterscatter (SS(SSCC))

ComplejidadComplejidadcitoplasmática y citoplasmática y

gránulosgránulos

Linfocitos < Monocitos < Polimorfonucleares

Detectores de FluorescenciaDetectores de Fluorescencia

Detectores de Detectores de fluorescencia:fluorescencia:

VerdeVerde (FL1)(FL1), naranja, naranja(FL2)(FL2) y rojoy rojo (FL3)(FL3)

Láser

AgsAgs expresados en expresados en la superficie celular la superficie celular o intracelulares: o intracelulares:

fenotipo y fenotipo y funcionalidad.funcionalidad.

DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIA

TCTCTCTCPerCPPerCPPerCPPerCPQRQRQRQR

Cy5Cy5Cy5Cy5APCAPCAPCAPC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores

FluorocromosFluorocromos

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIDE INFORMACIÓÓNN

NN

1122334455667788......

1000010000

FSCFSC

2222334433442222......

SSCSSC

1111222211223388......

FLFL--11

1111334411112211......

FLFL--22

1122331122331122......

FLFL--33

1133334411113344......

FLFL--44

2222333355551122......

TIEMPOTIEMPO

1111111122222222......

Los pulsos de“Voltaje”detectados (señales analógicas) son transformadas en señales digitales y almacenadas en un

soporte informático

RepresentaciRepresentacióón n monoparammonoparaméétricatrica de datos.de datos.Histogramas:Histogramas: Se representa en cada valor de x Se representa en cada valor de x

(intensidad de fluorescencia) el n(intensidad de fluorescencia) el núúmero de cmero de céélulas (eventos) lulas (eventos) que emiten esa intensidad.que emiten esa intensidad.

M1

Intensidad de Fluorescencia

Nº

de e

vent

os

HistogramasHistogramas

SSCSSC

FSCFSC

FLFL--11

FLFL--22

FLFL--33

GranularidadGranularidad

Fluorescencia Fluorescencia verdeverde

TamañoTamaño

Fluorescencia Fluorescencia naranjanaranja

Fluorescencia Fluorescencia rojaroja

RepresentaciRepresentacióón n biparambiparaméétricatrica en 2Den 2DDiagrama de puntos / Diagrama de puntos / dotdot plotplot

++

++----

RepresentaciRepresentacióón n simultsimultáánea de dos nea de dos parparáámetrosmetros XX e e YY..

XX representa el representa el valor de la sevalor de la seññal de al de un parun paráámetrometro..

YY representa el valor representa el valor de la sede la seññal del otro.al del otro.

++++--

--

FLFL--11

FLFL-- 22

Diagrama de Diagrama de dotdot plotplot densitdensityy

RepresentaciRepresentacióón 3D n 3D CountourCountour plotplot / Diagramas de contornos/ Diagramas de contornos

X, Y mX, Y máás una tercera dimensis una tercera dimensióón. n.

Una superficie tridimensionalLa altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros.

Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos

Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés.

SelecciSeleccióón de la informacin de la informacióónnGatesGates (Puertas) / ventanas ((Puertas) / ventanas (windowswindows))

M1

M2

GatesGates biparambiparaméétricostricos..

R1

R2

R3

R4

Se pueden utilizar puertas biparamétricasdefinidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros.Se emplean para estudiar las características de subpoblacionescelulares.

0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosGranulocitos MonocitosMonocitos

Linfocitos T y BLinfocitos T y B

AnAnáálisis de una poblacilisis de una poblacióón de sangre n de sangre perifperiféérica obtenida por buffer de lisisrica obtenida por buffer de lisis

FSS= TAMAÑO

SSC=

GRA

NULA

RIDAD

Simple positivo: CD4+CD3-: Mn

10 3

104

101

102

01010

310

410

110

210

0

PE-C

D4

PerCP-CD8

Intensidad de fluorescencia verdeAnti CD3 FITC

Nº de eventos

Li T

10 3

104

101

102

01010

310

410

110

210

0

PE-C

D4

FITC-CD3

Simple positivo: CD4+

Simple positivo: CD8+

Doble positivo: CD4+CD3+: LiT CD4+

Doble negativo: CD4-CD3-: LiB,

CD y Ma.

Simple positivo: CD4-CD3+: LiT CD8+

CCélélulasulas de sangre de sangre perifperiféréricaica: : AntiAnti CD3 CD3

FITC, FITC, antianti CD4 PE y CD4 PE y antianti CD8 CD8 PerCPPerCP

MicroscopMicroscopíaía vs Citometrvs Citometríaía de Flujode Flujo•Muestra fijada

•Cualitativo o semicuantitativo

•Sensibilidad depende del operador

•Reproductibidad media

•Patrones estructurales definidos

•Distribución espacial.

•Nº limitado de células

•Células en suspensión.

•Cuantitativo

•Alta sensibilidad y reproductibilidad

•Medida multiparamétrica en grandes nº de célulasindividuales.

•Patrones estructurales cualitativos

•No informa distribución espacial.

Trabajo Trabajo PrPrácácticotico Nº 4Nº 4::

Estudio de las cEstudio de las célélulasulas del sistema inmunedel sistema inmune1- Obtención de células:

Rata de bioterionormal

•Sacrificio del animal

•Extracción de órganosBazo, Timo, Nódulo linfáticos y células de peritoneo

Disgregación de losórganos en malla metálica

2- Aislamiento de células: BAZO

•Buffer de lisis:

Lisis de GR Suspensióncelular

Buffer Hipotónico

Pellet de Células

SuspensiSuspensiónónde CMN y de CMN y

PMNPMN

•Gradiente de densidad: Ficoll-Hypaque Aislamiento de CMN

SuspensiSuspensiónón de CMNde CMN

3-Ensayo de viabilidad: exclusión de azul de tripán: determinar el % de células viables.

4-Caracterización Morfológica