Curso básico de citometría de flujo

1

CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO.

Javier Godino.César Vallejo.

Desirée Perebom

Servicio de separación celular y

citometría

CITOMETRÍA DE FLUJO.

FUNDAMENTOS.

• Que es la citometría de flujo.

• Componentes de un citómetro de flujo.

• Dispersión de la luz.

• Fluorescencia. Fluorocromos, Compensación defluorescencias.

• Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo

2

La citometría de flujo es una técnica que permite

medir simultáneamente múltiples características

ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada

una de las células o partículas presentes en una

suspensión.

¿Qué es la citometría de flujo?

• Suspensión de células individuales .

- Buffer + EDTA o DNAsa.

- Células en frío.

- Lisados tisulares: Disgregación enzimática + filtrado

• Comprobar que el método de disgregación o recolección

del cultivo no afecta a los parámetros que queremos

medir.

Parámetros medibles

• Directos.

- Tamaño y complejidad celular

• Indirectos. Se añaden a la suspensión celular reactivos con

propiedades ópticas determinadas: FLUOROCROMOS.

- Unión a componentes nucleares: ADN.

- Parámetros metabólicos: pH, concentración de Ca2+

- Unión a proteínas de membrana o intracelulares a través

de anticuerpos conjugados a fluorocromos

3

¿Que es un citómetro?

•Sistema que hace pasar células de una en una haciendo

incidir sobre ellas un láser.

• Mide dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y

emisión de fluorescencia.Boquilla de inyección

Señal fluorescenteSeñal fluorescenteDispersiónDispersión

Láser incidente Láser incidente focalizadofocalizado

DispersiónDispersión

Partes de un citómetro de flujo

• Sistema de Fluidos– Crea un flujo constante de fluido envolvente– Transporta la muestra al punto de interrogación– Alinea las partículas de modo que pasen de una en una por

el punto de interrogación

• Óptica– Focaliza el láser de excitación– recoge y mide la luz emitida

• Electrónica– Convierte la señal óptica en un pulso electrónico – Envía la señal al procesador para ser analizado

• Software– Muestra gráficamente los datos– Controla la configuración del sistema

Sistema de fluidos del FACSAria

Plenum Cámara

Basura

Fluidoenvolvente

Carro de fluidos

Presión

Tubo de muestra

4

Enfoque hidrodinámico

Fluido envolvente Muestra

EnvolventeMuestra

Baja velocidad de inyección

Alta velocidad de inyección

El flujo laminar permite mantener las células en el centro

del flujo y evita la formación de turbulencias.


Flujo laminarFlujo laminar

Flujo turbulentoFlujo turbulento


5

10 psi

10.2 psi

10 psi

10.4 psi

10 psi

10.8 psi


• La diferencia entre las presiones de la muestra y la del

líquido envolvente determina el diámetro del “capilar

virtual”

Inte

nsid

ad d

e lu

z

Velocidad de muestra bajaVelocidad de muestra baja((difdif. presión bajo). presión bajo)

Velocidad de muestra altaVelocidad de muestra alta((difdif. presión alto). presión alto)

Haz láser

Muestra

Líquido de arrastre

Máxima iluminaciónMáxima iluminaciónCV bajosCV bajos

Iluminación variableIluminación variableCV altosCV altos

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

CD4 FITC

0

100

200

300

400

# C

ells


Haz del láser

Óptica de excitación

• Excitación mediante

fuentes de luz coherentes.

Láseres

• Un sistema de prismas

dirige la luz hacia la

cámara de flujo.

• Enfoca el láser sobre el

flujo de células

6

Óptica de emisión

• Una vez que el láser incide la célula responde emitiendo luz

a varias longitudes de onda, en función de que fluorocromos

hayamos usado → Tenemos que separar la fluorescencia

asociada a cada característica celular: FILTROS

Óptica de emisión: Filtros

400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm

Tra

nsm

itta

nce

Tra

nsm

itta

nce


Tra

nsm

itta

nce

Tra

nsm

itta

nce


7


Tra

nsm

itta

nce

Tra

nsm

itta

nce


Óptica de emisión: Espejos

Óptica de emisión

PMT 4

PMT 3

DicroicosFiltros

BandpassFilters

Laser

Cámara de flujo

PMT 2

FSC

SSC

PMT 1

8

Óptica de emisión

PMT 1

PMT 4

PMT 3

DicroicosFiltros

BandpassFilters

Laser

Cámara de flujo

PMT 2

FSC

SSC

Óptica de emisión

SSC

PE

PE-Cy7

FITC

PerCP-Cy5.5

PE-Txred

Óptica de emisión

9

Detectores

• Convierten la señal luminosa en corriente eléctrica. La

intensidad de esta señal es proporcional a la luz que llega.

• En citometría se usan de 2 tipos ambos basados en el

efecto fotoeléctrico:

- Fotodiodos de silicio: Los fotones que inciden en una

placa de silicio liberan electrones.

• Menos eficientes se usan para medir la dispersión

frontal (FSC)

- Tubos fotomultiplicadores: Mas eficientes: Se usan para

medir fluorescencias y dispersión lateral (SSC)

Tubo fotomultiplicador

ELECTRONICACreación de un pulso de voltaje

Tiempo

LaserLaser

Vol

taje

1

LaserLaser

Tiempo

Vol

taje

2

Tiempo

LaserLaser

Vol

taje

3

10

Área, altura, anchura

Time (µs)

Vol

tage

Pulse area(A)

Pul

se H

eigh

t(H

)

Pulse Width (W)

400

(Vol

ts)

0

10

(Vol

ts)

Rel

ativ

e B

righ

tnes

s

Cha

nnel

Num

ber

6.21 volts

1.23 volts

3.54 volts

10

1

.1

.01

.001

10

100

1000

10,000

1

256

196

64

0

128

(1mV)

(Vol

ts)

0

10

(Vol

ts)

Rel

ativ

e B

righ

tnes

s

Cha

nnel

Num

ber

6.21 volts

1.23 volts

3.54 volts

10

1

.1

.01

.001

10

100

1000

10,000

1

256

196

64

0

128

(1mV)

UMBRAL

Umbral de adquisición (Treshold)

• Eliminamos las señales muy bajas que en general

corresponden a restos celulares que no nos interesan

11

Láser (488 nm) Forward scatter tamaño (488 nm)

Side scatter Complejidad (488 nm)

Dispersión frontal (FSC)

� se mide en la dirección de la luzincidente (2-5 grados) a la mismaλ

� Relacionado con el tamaño/superficie celular (relación linealsólo para partículas esféricas)

Dispersión lateral (SSC)

� Medido perpendicularmente ala dirección de la luz incidente ala misma λ

� Relacionado con la complejidadcelular (granularidad)

Medición del tamaño y la complejidad celular

Representación de la información: Histogramas

LaserLaser

Tamaño- FSC

Tiempo

Vol

taje

LaserLaser

Tiempo

Vol

taje

Tamaño- FSC


12

LaserLaser

Tiempo

Vol

taje

Tamaño- FSC


FSC

Tamaño- FSC


LaserLaser

Tamaño/Complejidad

Tiempo

Vol

taje

Tamaño

Tiempo

Vol

taje

Complejidad

Representación de la información: Diagrama de

puntos

13

Tamaño y complejidad:

Células sanguíneas

Granulocitos

Debris Linfocitos

Monocitos

Fluorescencia

� El fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente y

se excita

� Disipa la energía absorbida de forma prácticamente

instantánea:

� Vibración y generación de calor

� emisión de un fotón de mayor longitud de onda

(menos energético)

hλ

S0

S2

S1

Absorción Emisión

Moléculas orgánicas pequeñas.Isotiocianato de fluoresceina(FITC)

Proteínas. Ficoeritrina (PE)

Fluorocromos

14

Quantum dots

• Nanoesferas de material semiconductor: Cd+ Se o Te.

• Rodeadas de ZnS y un polímero orgánico.

• Funcionalizadas para poder unirse aanticuerpos.

Quantum dots

• Funcionan como fluorocromos. Alrecibir un fotón emiten otro de mayorlongitud de onda.

• La λ a la que emiten es proporcionalal tamaño del núcleo del materialsemiconductor.

Quantum dots

• Ventajas:

- Pico de absorción ancho: Con unláser excitamos muchos QD.

- Pico de emisión estrecho: Mejorcompensación.

- Más estables.

• Inconvenientes:

- Poca disponibilidad.

- Toxicidad: Liberan metalespesados.

- ¿Conjugación con anticuerpos?,¿marcaje intracelular?

15

Brilliant violet

• Polímeros orgánicos conductores• Ultra brillantes. Entre PE y APC.• Un solo láser (405) excita todos los BV

Cytometry Part A 81A: 456466, 2012 PK Chattopadhyay

Fluoresceina (FITC)

400 nm 600 nm 700 nm500 nm

ExcitationEmission

Inte

nsid

ad re

lativ

a

Fluorocromos

Ficoeritrina (PE)

400 nm 600 nm 700 nm

ExcitationEmission

500 nm

Inte

nsid

ad re

lativ

a

Fluorocromos

16

Fluoresceina (FITC) Ficoeritrina (PE)

400 nm 600 nm 700 nm500 nm

ExcitationEmission

Fluorocromos

Inte

nsid

ad re

lativ

a

λλλλ=488 nm

Excitación

λλλλ=520 nm

Emisión

Inmunofenotipado

λλλλ=580 nm

17

• La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o

colorante debido a la excitación por el láser es emitida en

todas direcciones.

• Situamos el detector a 90º para minimizar interferencias.

• La especificidad de la detección está controlada por la

selección de longitudes de onda por parte de espejos y

filtros ópticos.

Láser Detector FSC

Detector de FLs(PMT3, PMT4 etc.)

EthidiumEthidium

PEPE

ciscis--Parinaric acidParinaric acid

Texas RedTexas Red

PEPE--TR Conj.TR Conj.

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 532 610 632488407

Los citómetros de flujo pueden llevar incorporados diversos

láseres de forma simultanea.

18

488488

Compensación de Señales Fluorescentes

505505--520520 570570--590590

Inte

nsid

ad R

elat

iva

Inte

nsid

ad R

elat

iva

Longitud de ondaLongitud de onda

FITCPE

Células marcadassólo con FITC


Muestra compensada

F CompensadaPE = F Medida PE - % FFITC

Compensación de Señales

Fluorescentes

19

PE

FITC

SIN COMPENSAR COMPENSADA

Universidad de Purdue



Universidad de Purdue

El valor de la compensación depende de la intensidad de la señal

PE

FITC

PE

PE

FITC

• COMP BEADS: Mezcla de bolas de látex de 2 tipos:

- Recubiertas de anticuerpos anti cadena κ.

- “Desnudas”

• Al añadir cualquier anticuerpo con cadenas ligeras κ se

unirá a las partículas recubiertas y no a las desnudas.

• Preparamos tantos tubos como fluorocromos vamos a

usar y encada uno añadimos un anticuerpo con un

fluorocromo diferente


20

Compensación de Señales Fluorescentes. Comp Beads

• La compensación es correcta cuando la media de la

fluorescencia para PE es igual para las 2 poblaciones


• Fluorocromos en tándem

• El desplazamiento de λ entre absorción y emisión espequeño: Limita los fluorocromos utilizablessimultáneamente→ FLUOROCROMOS EN TANDEM

APC Cy7Láser Emisión

21

• Cuidado con los flurocromos en Tándem. El “fluorocromo

lejano” se puede excitar directamente al pasar por un láser

adecuado.

PE Cy7

Láser azul

770 nm

Láser azulLáser azul

Láser rojo

PE Cy7 770 nm

• Aumenta el número defluorocromos utilizables,pero se rompen confacilidad.

Fluorocromos en tándem

0 horas0 horas

2 horas2 horas

22,5 horas22,5 horas

S.C Bendall et al.

22

ASPECTOS PRÁCTICOS

¿Qué fluorocromo uso?

• No todos los fluorocromos son igual de “buenos”

produciendo fluorescencia.

• Rendimiento cuántico: Cuantos fotones necesita recibir un

fluorocromo para emitir uno → Determina el llamado “indice

de marcado”

D = Diferencia entre la mediana de los picos

W = 2 x SD (Desviación estandar)

Indice de marcado = D / W

CD127 PE

300 400 500 600 7000

5

10

15

20

25

30

35

40

25 mW green laser (532 nm)

100 mW blue laser (488 nm)

25 mW blue laser (488 nm)

PMT voltage

Sta

in in

dex

• Hay que elegir la combinación “mas brillante” posible, en

cualquier caso, los fluorocromos más brillantes deben

reservarse para los marcajes más débiles y debe minimizarse la

compensación .

23

AUTOFLUORESCENCIA

Espectro de absorción y emisión de NAD(P)H

• Tambien FAD, AA aromáticos, Vit A….

• Sobre todo azul-verde (FITC).

• Granulocitos, monocitos, linfocitos activados

S.C Bendall et al.

Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF


24


• En teoría + de 100 marcajes simultáneos (contaminación y

oxidación bajan el número) sin necesidad de compensación

• Índice de Marcado peor que los fluorocromos más

brillantes pero muy parecido entre ellos.

• Vmax 1000 cels/seg. Además sólo aprovecha el 30% de

la muestra.

• No FSC/SSC, ni niveles de calcio, división celular………

¿ Que podemos medirpor citometría de flujo?

Metabolitos

Características de la citometría de flujo

-El análisis es multiparamétrico y simultáneo . - El análisis

se realiza sobre partículas individuales dentro de una

población compleja.

- El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000

partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad

estadística (permite analizar poblaciones representadas en

baja frecuencia).

- Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm

(bacterias, levaduras, células eucarióticas).

25

•El análisis no permite determinar la localización de la

fluorescencia.

• En el caso de células adherentes tenemos que

despegarlas del soporte de cultivo, lo que puede alterar

su fisiología.

• Se consume muestra. La citometría convencional no

permite re-análisis de la misma.

Características de la citometría de flujo


INMUNOFENOTIPADO

• ¿Qué es un anticuerpo?.

• Marcaje directo extracelular. Representación de la

información: Histogramas, gráficas de puntos y densidad,

escalas.

• Otras estrategias de marcado: Marcaje intracelular, marcaje

indirecto.

• Controles en inmunofenotipado: Isotipo, biológicos y FMO.

• Bloqueo de receptores Fc

• ¿Cuánto anticuerpo uso?

26

• Se basa en la unión específica de los anticuerpos con su

antígeno correspondiente.

• Se generan anticuerpos frente a las proteínas cuya

presencia en la célula queremos determinar y se les acopla

un fluorocromo.

• Si la célula expresa la proteína el anticuerpo se une y

veremos fluorescencia asociada a esa célula

Anticuerpos

• Son glicoproteínas producidas por linfocitos B. Reconocen

con alta afinidad sustancias extrañas y activan la posterior

respuesta inmune.

• Principal Característica: Enorme diversidad.

- Recombinación somática.

- Hipermutación

- Cambio de clase.

• En proteínas reconoce zonas pequeñas (± 7 aa). Se

pueden generar varios anticuerpos misma proteína

Región variable

Región variable

Estructura de las inmunoglobulinas

α, δ, ε, γ, µκ, λ

Anticuerpos

27

Anticuerpos monoclonales.

• Cuando inmunizamos un animal con un antígeno

obtenemos una mezcla de anticuerpos contra los diferentes

epítopos→ Anticuerpo policlonal.

- Producción limitada: Necesidad de sucesivas

inmunizaciones.

• Anticuerpos monoclonales. Son producidos por un único

clon específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y

subclase determinadas y tienen una especificidad única

frente a un antígeno determinado.

Anticuerpos

Anticuerpos

λλλλ=488 nm

Excitación

λλλλ=530 nm

Emisión

Marcaje superficial

28

Marcaje superficial

• La intensidad del marcaje es proporcional al número de

moléculas diana que hay en la superficie

Estudio monoparamétrico

Triplesnegativos

Simplespositivos

Doblespositivos

Triplespositivos

Estudio multiparamétrico

29

Representación de la información

• Gráficas bidimensionales

S.C Bendall et al. Trens in Immunology


Gráficas tridimensionales Gráficas n-dimensionales

30


• Diagrama de puntos • Diagrama de densidad o de contorno.



Escala lineal.

Escala logarítmica

31

Escala Logicle-biexponencial: Nos muestra los valoresnegativos: Los software realizan una corrección del ruido defondo (baseline) que puede hacer que ciertas partículas muypoco fluorescentes nos den un valor negativo


Escala Logicle-biexponencial


Estrategia de análisis

32

Estrategia de análisis

CD 95

CD

28

HY Maecker Cytometry Part A 62A:169–173 (2004)

Fluorocromosen Tándem.Falsospositivos

33

• El marcaje pude ser superficial o intracelular.

• En el caso del marcaje intracelular hay que.

- Permeabilizar la célula. Los anticuerpos no difunden

a través de la membrana celular → Detergentes

(Saponina, Tween).

- Fijar la célula para evitar que el contenido intracelular

salga al exterior → paraformaldehido, etanol.

• Comprobar que el tratamiento no afecte al marcaje.

Marcaje intracelular

Marcaje

superficial Fijación

Marcaje

intracelular

Permeabilización

Primario conjugado(directo)

Primario sin conjugar(indirecto)

Primario conjugadocon biotina

Complejo avidina-fluorocromo

Secundario conjugado(indirecto)

Estrategias de marcado

Directo Indirecto Avidina-Biotina

34

• Para realizar el marcaje simplemente se añade el anticuerpo

a la suspensión celular, se deja incubar 15-30 min. A 4º C, se

lava para eliminar el exceso de anticuerpo, se resuspende y

se lleva al citómetro

• En el caso de marcaje indirecto se hacen 2 incubaciones

consecutivas con un paso de lavado intermedio.

• Si trabajamos directamente con sangre debemos realizar un

paso final de lisis de eritrocitos sin afectar a los leucocitos.

• Si no podemos analizarlas en el momento se puede fijar las

células

Controles de isotipo.

• El anticuerpo puede unirse inespecíficamente a la

superficie celular o a las proteínas citoplasmáticas →

Falso positivo.

• Para controlar este problema se usan los controles de

isotipo: Anticuerpos de la misma clase del que usamos y

con el mismo fluorocromo pero diseñados para reconocer

moléculas que nunca están presentes en las células → el

marcaje que aparezca sólo será por uniones

inespecíficas.

Primario conjugado(directo)

Control de isotipo

Controles de isotipo

Unión específica Unión inespecífica Control de isotipo

35

Representación de la información: Controles de isotipo

CONTROLES BIOLÓGICOS

• Para que los controles de isotipo sean adecuados es

necesario que se comporten igual que los anticuerpos que

vamos a usar → Difícil de asegurar (¿concentración?

¿moléculas de fluorocromo por anticuerpo?)

• El mejor control es usar nuestro anticuerpo en unas células lo

mas parecidas posibles a las que queremos estudiar pero que

no expresen el marcador de interés→ Control biológico.

CONTROLES BIOLÓGICOS

CD8

36

Perfetto et al. Nature Review Immunology (4) 648-655, 2004

Controles FMO

• No corrigen la unión inespecífica sino la interferencia entre

fluorocromos que no elimina la compensación

•Se añaden en un tubo todos los fluorocromos menos el

“controlado”→ Fluorescence Minus One

H.T MAECKER BD Biosciences

Controles

Comparación de controles

Bloqueo de receptores Fc

• Diversos tipos de leucocitos poseen receptores que se unen a

la zona constante de los anticuerpos.

• Unen por lo tanto inespecíficamente cualquier anticuerpo que

se les añada

Receptor FcReceptor Fc

AntígenoAntígeno

Anticuerpo Anticuerpo conjugadoconjugado

37


• Para solucionar este problema, antes de añadir el

anticuerpo específico, se incuba la suspensión celular con

un gran exceso de anticuerpo sin marcar

• Especialmente importante si la señal fluorescente es

débil, en el caso de marcajes intensos aunque disminuye la

relación señal/ruido no es imprescindible

Receptor Fc

Antígeno

Anticuerpo conjugado

IgG (ratón)


ASPECTOS PRÁCTICOS

¿Cuánto anticuerpo añado?

• Si añadimos más anticuerpo tenemos más unión a la

proteína problema, pero también más unión inespecífica.

Concentración de anticuerpo

Señ

al/ r

uido

Titulación del anticuerpo:

Probar diferentes cantidades

hasta encontrar la que da la

relación señal/ruido óptima

38

Concentración de anticuerpo

Señ

al

Unión específica

Unión inespecífica.

ASPECTOS PRÁCTICOS

¿Cuánto anticuerpo añado?

• Lavar después de añadir el anticuerpo disminuye mucho la

unión inespecífica


ESTUDIO DE CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN

• Estudio de ácidos nucleicos.

- Fluorocromos usados.

- Aplicaciones:

+ Detección de células nucleadas.

+ Discriminación de células muertas.

+ Estudio de ciclo celular. Fundamento, adquisición yeliminación de dobletes.

- Ciclo celular y BrdU

- Ciclo celular e inmunofenotipado.

• Estudios de proliferación. Número de divisiones celulares

39

• Se usan fluorocromos con las siguientes características.

- Unión estequiométrica a los ácidos nucleicos.

- Fijación estable a los mismos.

- La fluorescencia aumenta al unirse.

• Diversas especificidades: Unión a ADN y ARN, pares A-T,pares G-C.

• 2 tipos.

- Impermeables. No atraviesan la membrana plasmáticaintacta.

- Permeables. Atraviesan la membrana plasmática.

Detección de células nucleadas

Stuart T.F et al Blood 2006

• Incubamos con una sonda permeable de unión al ADN.

Entra en todas las células y tiñe aquellas que tienen

núcleo

• Interesante si trabajamos en

sangre con poblaciones

minoritarias: Elimina hematíes

y agregados plaquetarios

40

Viabilidad celular.

• Cuando la célula muere se abren poros en la membrana lo

que permite la entrada de colorantes que se unen al ADN

incapaces de atravesar la membrana intacta

Importante eliminar del

análisis las células muertas

→ Más autofluorescentes y

más unión inespecífica del

anticuerpo.

Viabilidad celular.

Vivas/muertas Marcaje inespecífico

Ciclo celular y

contenido de ADN.

G0/G1→ 2n.

S → 2n/4n.

G2/M → 4n

Ciclo Celular

41

• La cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la

cantidad de ADN.

• El colorante más usado es el yoduro de propidio.

• El PI tiene una elevada eficiencia cuántica y es barato, pero

se une también a RNA bicatenario (hay que tratar con RNAsa)

y tiene un espectro de emisión ancho (dificulta la posibilidad

de otros marcajes).

Ciclo Celular

PIFijación

Permeabilización

G0/G1

SG2/M

Ciclo Celular

Ciclo Celular.

Adquisición en el citómetro.

• Siempre en escala lineal: Mayor separación de los picos.

• Muy importante conseguir la mayor resolución de los picos

(bajo CV).

- Adquirir a la menor presión y velocidad de inyección

posibles.

- Adquirir el máximo número de células posible (> 10.000)

42

Yellow-W0 30 60 90 120

Yel

low

-A0

3060

9012

0

R1

PI Anchura

PI A

rea

Ciclo Celular

2n2n 4n4n 2n+2n2n+2n

Igual área pero diferente anchura del pulso.

Contenido de DNA

Tiempo

Láser

Discriminación de dobletes.

Ciclo Celular

Discriminación de dobletes

Ciclo Celular

CARIOTIPO DE FLUJO

43

G0/G1

SG2/M

G0/G1

SG2/M

• No es posible la

delimitación exacta de

las fases del ciclo

Ciclo Celular

Channels (Yellow-A)0 30 60 90 120 150

Num

ber

070

140

210

280

G0/G1

S

G2/M

• Se puede recurrir a

programas informáticos

que utilizan modelos

matemáticos para delimitar

las fases

Ciclo Celular


Num

ber

040

080

012

0016

00

• Mezcla de 2 poblaciones

celulares con diferente

contenido de ADN

Ciclo Celular

44


Num

ber

020

040

060

080

0 • Mezcla de poblaciones 2n y 4n

Ciclo Celular

Ciclo Celular

• Controles en ciclo celular.

Timocitos de ternera

Eritrocitos de pollo 35% delADN humano

Ciclo Celular. BrdU

• La BromodeoxiUridina es un análogo de la Timidina. Se

incorpora al ADN de aquellas células que están duplicando el

ADN.

• Añadiendo posteriormente un anticuerpo anti BrdU y un

fluorocromo que se una al ADN podemos determinar que

células están en la fase S del ciclo.

• Problema. Para que el anticuerpo llegue hasta la BrdU es

necesario desnaturalizar el ADN (Calor, DNAsas, ácidos).

Existen otros análogos de la T que no requieren este paso.

45

BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)

Br

Br

Incubación

Desnaturalización

Ciclo Celular. BrdU

EdU (5-ethynyl-2 '-deoxyuridine)

Incubación

Ciclo Celular. EdU

Ormerod M. Basic flow cytometry

Ciclo Celular. BrdU

46

Gary Warnes. University of London

• Si añadimos BrdU al

cultivo, incubamos,

lavamos y vamos

recogiendo células a

diversos intervalos tenemos

una imagen dinámica del

ciclo

Ciclo Celular. BrdU

Ciclo Celular

• No se puede distinguir la fase G0 de la G1 (ambas 2n) y la

fase G2 de la M (ambas 4n)

• Si medimos el contenido en ARN podemos separa G0 de

G1

• Mediante inmunofenotipado de proteínas cuya expresión

cambia durante las fases del ciclo podemos discriminar G0

de G1 y G2 de M

Ciclo Celular.

Contenido de ARN

� Pyronina. Intercalante en dsNA.

- Más especificidad por dsRNA, aunque no exclusivo.

- Marca rRNA y tRNA no RNA total.

- Exc 547-560nm, emi 565-574nm.

� Naranga de acridinio.

- Mide el RNA total.

- Se excita a 488nm y emite en rojo unido al RNA y verdeunido al DNA

- Muy dependiente de las condiciones: concentración,fuerza iónica, detergentes.

47

WOODWARD et al. PNAS 2007

Ciclo Celular.

Contenido de ARN


Ciclo Celular. Inmunofenotipado

• Diferenciación de fase G2- M

Ciclo Celular. Inmunofenotipado

Expresión de ciclinas y ciclo celular

Ormerod M. Basic flow cytometry.

48

CFSE

XX

Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula

X / 2X / 2 X / 4X / 4

Sin dividir

Tras una división

Tras dos divisiones

Estudio del número de divisiones celulares

• Se usa una sonda que difunde a través de la membrana y

una vez en el interior de la célula se modifica, se vuelve

fluorescente y no pueda salir.

No proliferantesProliferantes


• El número de ciclos distinguibles es limitado: Dilución

excesiva de la sonda.

• La fluorescencia depende del tamaño, poblaciones con

mucha dispersión del mismo dan resultados pobres.


• Combinación con marcajede membrana

• Combinación con estudio de viabilidad

49


ESTUDIO APOPTOSIS Y MUERTE CELULAR

Apoptosis

• La apoptosis es un modo de muerte celular activo y

fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su

propia muerte. Regulado por Caspasas

• La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés:

choque térmico, hipotónico, pH..

• Los métodos deben distinguirlas

Apoptosis

50

Apoptosis

Apoptosis

Apoptosis Necrosis

Grupos de células

Núcleo Condensación densade la cromatina

Agrupación irregular de la cromatina

Organelascitoplásmicas

Intactas morfológicamente

Anormales

Membrana celular Cuerpos apoptóticos Blebbing

Blebbing y pérdida de la integridad

Volumen celular Se incrementaSe reduce

En tejidos Células aisladas

Respuesta tisular Ninguna Inflamación

Diferencias entre apoptosis y necrosis

51

Apoptosis y patología.

• Aumentada:

- SIDA

-Enfermedades neurodegenerativas:

Alzeheimer, Parkinson, ELA, Retinitis

pigmentosa

- Anemia aplásica.

- Isquemia: Infarto, Accidente cerebro

vascular

- Cirrosis alcohólica

• Disminuida:

- Cancer: Linfomas foliculares, tumores

con mutación en p53, tumores

hormonodependientes (mama, próstata,

ovario)

- Enfermedades autoinmunes: LES,

Glomerulonefritis

- Virus: Herpesvirus, poxvirus,

adenovirus

Apoptosis Métodos De Análisis por

citometría

• Exposición fosfatidilserina

• Fragmentación de ADN

• Detección de caspasas activadas.

• Función mitocondrial.

• Otros: Radicales de oxígeno, cambios en la permeabilidad

de membrana, niveles de iones, Familia Bcl2, cambios en

tamaño y complejidad

PS: Fosfatidil serina

Estudio de apoptosis.Anexina V/PI

52

Anexina V

Yodu

ro d

e P

ropi

dio

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14%

37%

1010

1010

100

12

34

Control Fármaco

10 10 10 10 100 1 2 3 4

6%

5%

1010

1010

100

12

34

15%

5%

Células vivas

Apoptosis tardía Necrosis

Apoptosis temprana


• Método sencillo, rápido y relativamente barato.

• Fácil de combinar con inmunofenotipado de membrana: La

anexina se puede marcar con el fluorocromo que queramos y

el PI se puede sustituir por otra sonda similar (7-AAD).

• Limitaciones:

- Apoptosis sin exposición de PS.

- En la necrosis puede haber marcaje de Anexina V.



VIVAS

APOPTOSIS TEMPRANA

APOPTOSIS TARDIA + ¿NECROSIS?

NECROSIS

53

Estudio de apoptosis.Fragmentación del ADN

Rotura internucleosomal

T – Tdt mediatedU – dUTP-biotinN – nickE – endL – labelling

3’-OH-ADN

TdtPoli-BrdU

Anti-BrdU-FITC

3’-OH-ADN-UTP-Brd

3’-OH-ADN

3’-OH-ADNADN3’-OH-ADN


• Técnica relativamente sencilla.

• Implica fijar las células.

• Existen procesos apoptoticos sin rotura internucleosomal


• Se puede combinar con inmunofenotipado y con estudio

del ciclo celular.


54

0 40 80 120 160 200

G1

S

G2/M

Channels (FL2-A-PI CONTROL 24H)

3%

Con

trol

G1

S

G2/M

Channels (FL2-A-PI MITO 24H)

0 40 80 120 160 200

21%

Mito

xant

rona

0.25

µg/

mL


• Pico sub-diploide

Estudio de apoptosis.Activación de caspasas

• El método más directo

es usar anticuerpos

marcados contra la

forma activada de las

caspasas


• Detección de rotura de sustratos.

- Anticuerpos anti-proteínas rotas por caspasas (PARP).

- Rotura de sustratos con cambio de fluorescencia.

SUSTRATO- SUSTRATO +

• Inhibidores fluorescentes (FLICA)

CASPASA

55

Ormerod. Basic flow Cytometry


• Rotura de sustrato fluorescente

Control Estaurosporina

Estudio de apoptosis.Función mitocondrial

• La mitocondria es el mediador clave en la apoptosis

inducida por estrés celular.

• Uno de los primeros cambios que ocurre al iniciarse la

apoptosis es una pérdida del potencial de membrana

mitocondrial (Ψm).

• Existen fluorocromos cuya fluorescencia varia con Ψm


• Moléculas fluorescentes que se acumulan en la mitocondria

si Ψm está conservado, sino, salen de la mitocondria y de la

célula.

DiOC6(3)

Control KCN


N: Vivas; D: muertas; A: apoptóticas

56


• Moléculas que cambian su fluorescencia en función de su

estado de agregación: Si Ψ2 está intacto se acumulan en la

mitocondria (alta concentración, agregados) si no salen al

citoplasma (baja concentración monómeros)

JC-1.

• Agregados: rojos.

• Monómeros: Verdes

A: Control; B: Apoptosis

• Existen otros parámetros mitocondriales que se afectan

en la apoptosis y que podemos estudiar por citometría

• Liberación cit c.

• Producción de ROS: Disfunción de la cadena respiratorio

• Apo 2.7: Anticuerpo que reacciona con una proteína

mitocondrial que aparece en membrana en la apoptosis.

muy temprano


Estudio de apoptosis.Proteínas de la familia Bcl2

• Familia de proteínas que controla la formación de poros en

la membrana mitocondrial y regula la apoptosis.- Pro apoptóticas: Bax, Bak, Bid, Bik, Bcl-Xs, Bad

- Anti apoptóticas : Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Brag-1, Bfl-1

Neutralidad

Supervivencia Muerte

Ratio Bcl2/Bax

57

APOPTOSIS VOLUMEN COMPLEJIDAD

inicial Disminución Aumento

tardía Disminución Disminución

NECROSIS

inicial Aumento Disminución

tardía Disminución Disminución

Cambios en el volumen yla complejidad celular

Poco específico y poco sensible: células muertas, debris,

núcleos aislados, cuerpos apoptóticos

Cambios en volumen y complejidad celular

0 64 128 192 256

064

128

192

256

SS

C

FSC

Control Fármaco

0 64 128 192 256

064

128

192

256

Cambios en la permeabilidad de la

membrana


• A medida que aumenta la

apoptosis la membrana va

siendo mas permeable a

fluorocromos con carga como

PI, aunque no pierde totalmente

su funcionalidad.

• La cantidad de fluorocromo que entra es demasiado

pequeña para dar el máximo de fluorescencia posible

58

Formación apoptosoma

Disminución ∆ψm

Activación caspasa

Proteólisis PARP

Externalización FS

Fragmentación ADN

Cambios morfológicos

Membrana permeable

Horas aproximadas después de la inducción por anti-FAS

2 4 6 8 10

Estudio de apoptosis.Secuencia de acontecimientos.


ANÁLISIS FUNCIONAL.

• Producción de ROS.

• Medida de pH

• Medida de concentración intracelular de Ca2+ libre

• Potencial de membrana

• Actividad enzimática.

• Estudio de genes reporteros: Proteínas fluorescentes.

• Estudio de la “side population”.

• Estudio de componentes celulares.

• Otras aplicaciones.

59

• Se acopla un cambio de emisión a un proceso biológico:

Moléculas cuya fluorescencia cambia con pH, nivel de iones,

procesamiento por una enzima, potencial de membrana celular

o mitocondrial ….. y que se retiene en la célula.

APLICACIONESEstudios funcionales

Producción de especies reactivas de oxígeno

Dihidrorodamina 123

RODAMINA 123RODAMINA 123

HH22OO22

• Fluorocromos cuya

fluorescencia cambia

con su estado redox

Ormerod M. Basic Flow Cytometry

Producción de especies reactivas de oxígeno

• Estallido respiratorio en

neutrófilos estudiado con

dihidroetidina

60

Structure Reactive Oxygen Species Detection Reagents

H2O2 Hydrogen peroxideCarboxy-H2DCFDA ,CM-H2DCFDA ,Dihydrocalcein AMDihydrorhodamine 123 , Dihydrorhodamine 6G , H2DCFDA ,Lucigenin Luminol , RedoxSensor Red CC-1

HO• Hydroxyl radical3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)fluorescein (HPF), CM-H2DCFDA Proxyl fluorescamine ,TEMPO-9-AC

HOCl Hypochlorous acid Aminophenyl fluorescein (APF) , Dihydrorhodamine 123 ,Luminol

NO Nitric oxide DAF-FM , DAF-FM diacetate, DAA , 2,3-Diaminonaphthalene ,Luminol

ROO•Peroxyl radical, including bothalkylperoxyl and hydroperoxylradicals (wherein R = H)

BODIPY FL EDA, BODIPY 665/676, H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA,CM-H2DCFDA, DPPP, Luminol, cis-Parinaric acid, RedoxSensor RedCC-1

ONOO– Peroxynitrite anion

3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)fluorescein (HPF), H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA,Coelenterazine Dihydrorhodamine 123, Dihydrorhodamine 6G,Luminol

1O2 Singlet oxygenSinglet Oxygen Sensor Green reagent, trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyrene

•O2– Superoxide anion

Coelenterazine, Dihydroethidium, Fc OxyBURST Green assayreagent OxyBURST Green H2DCFDA SE, OxyBURST Green H2HFFBSA, Lucigenin Luminol, MCLA, MTT, NBT, RedoxSensor Red CC-1,TEMPO-9-AC, XTT

Medida del pH

• Generalmente ácidos débiles con un pKa cercano a 7 y

con un fluorescencia diferente en las formas

desprotonadas y protonadas.

Cambio en la intensidad de

fluorescencia de la fluoresceina

con el pH

Medida del pH

• Generalmente se usan

fluorocromos con distintos

picos de emisión entre la forma

protonada y desprotonada →

Medidas ratiométricas

Espectro de emisión de SNARF-1 en función del pH

61

O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001

Medida del pH

• Medidas cinéticas de cambio de pH intracelular en leucocitos

tras acidificación del medio con BCEF (ratio amarillo/verde)

Medida del pH

• Método cuantitativo → Crear

curvas de calibración

6.5 7 7.5

MUESTRA

Medida del pH

62

Concentración de Ca 2+

libre intracelular

• Moléculas cuya fluorescencia varía con los niveles de Ca2+

intracelular

Cambio en la intensidad

Espectros de emisión fluo-3 yfura red en función de laconcentración de Ca 2+

Cambio en la λ de emisión

Espectro de emisión Indo-1 enfunción de la concentración deCa2+


libre intracelular

Medidas directas

Cambios en laconcentración de Ca 2+

intracelular en linfocitos,monocitos y macrófagosmedidos con Fluo 3

Medidas ratiométricas

Medida de Ca 2+ intracelular en célulasJurkatJ6 después de añadir un anticuerpoanti-CD3 con una mezcla de Fluo3 y Fura Red(ratio 525/675)


libre intracelular

63

Medida del potencial de membrana

Despolarización de Staphylococcusaureus inducida por CCCP medidacon DiOC2(3).

Polarizada

Despolarizada

Medida del potencial de membrana

• Se añade un sustrato que difunde en la célula y al ser

procesado por la enzima se vuelve fluorescente (sustrato

fluorogénico).

• Podemos medir la actividad de proteasas (caspasas),

esterasas (CFSE), oxidasas, dehidrogenasas, transferasas,

fosforilasas…….

Medida de la actividad enzimática

64

ACTIVIDAD DE ALDOLASAEstudio de la actividad de aldolasa

Con actividad enzimática Sin actividad enzimática

A

Genes reporteros, proteínas fluorescentes

Control sin transfectar Células transfectadas con GFP

Chudakov D M et al. Physiol Rev 2010;90:1103-1163

©2010 by American Physiological Society

65

Estudio de la “side population”

• Las células progenitoras presenta gran actividad de

transportadores de la familia ABC que expulsan fuera de la célula

el Hoechst 33342

Bone Marrow


Hoechst Far Red

Hoe

chst

Blu

e

+ verapamil

A B


• Se excita con laser UV y se mide emisión a 420 y 670 nm

66

Detección de componentes celulares

• Marcaje con rojo nilo y Syto

62 para estudiar células

nucleadas con depósitos de

lípidos neutros

Otras aplicaciones

O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001


SEPARACIÓN CELULAR.

67

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

• Separación individualizada de células en función de

parámetros definidos por citometría de flujo.

• Posteriores estudios de biología molecular (RT-PCR,

FISH), clonación de líneas celulares, estudios

funcionales, etc.

Sorting Electroestático

Punto de incidencia del láser y de decisión

oooo oooo ooooIzq basura der

Transductor Vibra a una frecuencia determinada para producir separación del chorro en gotas.

o o o o oo o o o oo o o oo o o

oooooooo

Carga de la gota + Azul - rojo.

-+ Gotas cargadas son separadas en un campo electroestático ± 3000 V

o-o+

oo+

o-oo

+-

++

Drop delay

Recogida

Nozzle

68

Gota satélite

Amplitud

Frecuencia

• Se generan hasta100.000 cels/seg.

• Lo ideal es quehaya un máximo de1 célula cada 3gotas

Separación de dos poblaciones celulares


69


Separación de cuatro poblaciones celulares

Separación de cuatro poblaciones celulares

70

• Se pueden separar células individuales directamente en

placas de 96 pocillos.

• Se puede separar directamente en placas de 6, 12, 24

pocillos o en un porta de microscopia.

• Se puede mantener la muestra a

4 o 37º C.

• Se puede recoger la muestra a 4

o 37º C.

• El parámetro crítico es el drop delay: Tiempo que transcurre

desde que seleccionamos la célula hasta que se carga la gota

que la contiene.

• Depende de cómo se

forman las gotas → Ajustar

cada vez que hacemos una

separación.

• Separación de esferas

fluorescentes sobre un porta

• Accudrop. Sistema automatizado basado en esferas

fluorescentes. Un láser en la parte inferior del sorter nos

permite ver donde están.

71

• Recuperación-eficiencia : % de partículas sorteadas

recogidas del total de partículas que nos interesan.

• Pureza : % de partículas sorteadas recogidas que

cumplen los criterios seleccionados en función del total

sorteado.

• Si aumentamos la pureza disminuimos la

recuperación y viceversa

pureza

rendimiento

Nº deseado de células

1.00010.000

Concentración de células en la muestra

0,1%8 min1,4 h

1,0%48 sg8 min

5,0%10 sg

1,7 min

50,0%1 sg

10 sg100.000

1.000.00010.000.000

100.000.000

14 h5,8 d1,9 m1,6 a

1,4 h14 h5,8 d1,9 m

17 min2,8 h1,2 d12 d

1,7 min17 min2,8 h1,2 d

Velocidad lectura 2.000 cels/sg

¿ Y esto cuanto tarda?

72

• Sistemas de cámara abierta→ RIESGO BIOLÓGICO .

• Sistemas Caros. Tanto equipamiento como consumibles.

• Sistemas lentos. Pureza depende de cuantas

células/segundo analicemos y la resolución de la citometría

es mejor si el número de células por segundo es bajo.

• Viabilidad celular variable: Tipo celular, tiempo y presión

de sorting, medio de recogida.

Sorters hidraúlicos

� Cámara cerrada: no contaminación

� Poco complicados, baratos y adaptables

� Sistemas sin necesidad ajuste

� Facilidad de uso (similar a analizador)

� Baja velocidad de separación

� Baja viabilidad del producto

� Baja concentración celular

Emplean jeringas, energía acústica, etc.. para desviar el flujo

líquido durante algunos milisegundos y con él la célula

seleccionada.

Sorters hidraúlicos

73

Sorting de partículas grandes. BIOSORT

Nanopartículasunidas a la célula

MACS

• Magnetic activated cell sorting. Utiliza partículas

magnéticas unidas a anticuerpos

ELECTROIMÁN N S

MATRIZ

FERROMAGNÉTICA

Anticuerpo unido a nanopartícula magnética

MACS

74

FACS vs MACS: Uno o los dos?

Son dos sistemas compatibles

FACS MACSSeparación multiparamétrica

Separación por un soloparámetro

No permitenseparaciones masivas

Separan un número elevadode células.

Equipos caros, peroamortizables a medioplazo

Muy caros

Indicado para separarpoblaciones pocofrecuentes

Rápidos


ANÁLISIS MULTIPLEX.

• Estudio de moléculas solubles por citometría de flujo.

• El límite de detección en citometría de flujo es de 0.5 µ,

para poder estudiarlas necesitamos retenerlas en esferas

fluorescentes que se pueden detectar por el citómetro.

• La citometría nos permite estudiar diversas moléculas

simultáneamente asociando cada una a una esfera

diferente que puede distinguirse por citometría.

75

• Método realizable en cualquier citómetro aunque existen

equipos especialmente diseñados para el análisis

multiplex.

• Mezcla de beads de diferentes tamaños y con diferente

concentración de un fluorocromo que se excita con un láser rojo.

Diferenciación de las esferas


• Esferas del mismo tamaño

(5,6-6,5 µ) con una diferente

mezcla de 2 colorantes

excitados por el láser rojo

76

Matriz de microesferas coloreadas

Color 1

Color 2



Discriminador de dobletes

Elimina por tamaño restos y agregados de esferas

77


• Esferas del mismo tamaño con una

diferente mezcla de 3 colorantes

excitados por el láser rojo → Genera

500 esferas diferentes

• Las esferas se funcionalizan con diferentes moléculas

en función de lo que queramos estudiar

Multiplex

ILIL--22

ILIL--44 ILIL--1010

IFNIFN--gg

TNFTNF--alfaalfa

ILIL--55

ELISAELISA

PE

PE PE

PE

PE

PE

análisis de concentración de proteínas solubles

78

The Microsphere is a 5.6mM polystyrene bead with two fluorescent dyes incorporated into it in different ratios.

A primary antibody specific for the analyte isconjugated to the bead surface by an amine coupling reaction

The primary antibody binds to the specific analyte – no crossreactivity with other analytes occurs.

A biotinylated, analyte specific reporter antibody is added to the assay after another wash step.

After another wash step Streptavidin PE is added to the assay. The biotinylated reporter antibody binds to one of the four available sites.

In assays with high analyte numbers excess biotinylated reporter antibodies bind to the Strep-PE in a non-specific manner.

Free excess streptavidin-PE binds to the non-specifically bound biotinylated reporter antibody leading to a signal amplification.

The phycoerythrin is excited by the reporter laser and emits a fluorescence which is quantified by the Luminex reader.

The immune-complex/ microsphere is then excited by the ****** laser. The bead specific emmission is quantified by the luminex and the bead identified.

tomado de UPSTATE. Serological corporation


Laser A

Laser B


0102030405060708090

1er trim. 2do trim . 3er trim. 4to trim. Este

Oeste

Norte

Col

or a

naliz

ador

Color clasificador 1

Una vez clasificada la esfera con el primer láser, el segundo

mide la fluorescencia del fluorocromo asociado al segundo

anticuerpo que es proporcional a la cantidad de proteína en la

muestra


79


• Generando una curva de calibración podemos cuantificar la

concentración

5000 pg/ml625 pg/ml

156 pg/ml40 pg/ml0 pg/ml

312.5 pg/ml

Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónSe genera una curva de calibración asociando la

fluorescencia medida a unas concentraciones de analito

conocidas

Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibración

80

Control negativoControl negativo

Por último los valores de fluorescencia obtenidos para cada

muestra se interpolan en la curva de calibración y se

calcula la concentración

MuestraMuestra

• Permite determinar hasta 500 proteínas en un solo ensayo.

• Gran ahorro:

- Económico: Equipamiento más caro que un ELISA pero se

compensa con el menor coste de los reactivos

- Tiempo

- Muestra: Con sólo 25 µl podemos determinar las 500

proteínas.

81

Aplicaciones en biología molecular

• En lugar de anticuerpo funcionalizamos las esferas con

sondas de ácidos nucleicos.

• Se puede aplicar a múltiples aplicaciones: Genotipado

(estudios de SNPs), expresión génica, concentración de

micro RNAs, reordenamientos génicos.

• Funcionalizando con sondas de ácidos nucleicos también

podemos estudiar expresión de factores de trascripción

82

Genotipado Genotipado Genotipado Genotipado

Genotipado

Genotipado

83

Genotipado

Ding C, Jin S. Methods Mol Biol. 2009

Comparación de métodos

MULTIPLEX

Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAs

• No necesita amplificación por PCR

Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de Cuantificación de microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAs

84

• No es necesarioconvertirlo en cDNA.

Expresión génicaExpresión génicaExpresión génicaExpresión génica

Grandes reordenamientos

Factores de Trascripción

85

Factores de Trascripción

• Sistema no basado en citometría de flujo.

• Requiere el uso de beads magnéticas.

• Equipo mas barato que los citómetros pero menos sensible

• Las partículas magnéticas

se retienen sobre un imán y

se iluminan con 2 LEDs:

Rojo y verde.

• La fluorescencia se lee con

una cámara CCD.

Curso básico de citometría de flujo

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