BUAPFacultad Ciencias Químicas

-Análisis Espectrofotométricos-TLQ Neftalí Pérez Pérez

Catedrático: Dr. Ulises Peña Rosas

Iniciada en los 60’s como importante avance (medir y contar partículas y células)

Citómetro de flujo (CMF): Mide partículas biológicas en suspensión celular.

Sorters: Mismas capacidades, solo que pueden separar partículas especificas.

Introducción

Moldavan (1937)

•Primer contador automático.

•Un microscopio con un capilar (problemas) y contador fotosensible.

Crosland & Taylor (1953)

•Cámara de flujo con inyección de muestra.

•Diámetro del capilar mayor enfoque (hoy en día).

1967-69 Van Dilla

•Mejora la cámara de Crosland/Taylor, pero aplica a procesos biomédicos.

•Demostró la cuantificación por fluorescencia de ADN.

Historia

Características estructurales y funcionales de células.

Sus aplicaciones son fundamentalmente científicas y de investigación clínica (biología y medicina).

Identifica antígenos celulares por inmunofluorescencia, contenido del ADN, y fases del ciclo celular.

Aplicaciones

Biomedicina

Hematología: Contaje celular, fórmula leucocitaria, análisis de medula ósea y conteo reticulocitario.

Farmacología: Estudios de cinética celular.

Inmunología: Subpoblaciones T, tipaje celular, estimulación linfocitaria.

Oncología: Diagnóstico/pronóstico, monitorear tratamientos.

Bacteriología: Diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.

Genética: Cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

CMF en el mundo

Sistema óptico

Fuentes de luz

Detectores

• Basados en una fuente de iluminación laser, perpendiculares al paso de la muestra (elimina ruido).

• La fluorescencia se recoge a 90º (espejo 90%)

• Sintonizables o de emisión fija (Argón o Kriptón).

• Lámparas de Hg o Xe (decrece con el tiempo)

• Fotomultiplicadores (PMT): Detectan la señal a 90º con buen ratio señal/ruido.

• Diodos: Detecta Dispersión frontal de la luz (señales fuertes).

Características generales de un CMF 1

Cámaras de flujo

•Laser: Cerradas flujos laminares lentos y menor ruido (coágulos) y abiertas o de chorro al aire.

•De arco: Hay varios tipos y cada uno tiene su complejidad.

Sistemas de inyección de muestra

•Por Presión: Mantiene una velocidad constante.

•Por inyección isovolumetrica: Con jeringa y mantiene velocidades bajas.

Componente electrónico

•Los pulsos de los fotodetectores van de un amplificador, a un conversor digital.

•Existe la posibilidad de un ‘’umbral de señal’’.

Características generales de un CMF 2

Configuración óptica de un Citómetro de flujo

Configuración óptica de un Sorter

Tinción

•Fluorocromos que se unen específicamente a un constituyente celular.

Inyección

•En un flujo laminar y pasan una por una a un punto iluminado por un laser.

Señal

•Dependiendo de su contenido de fluorocromo, emitirán una señal fluorescente (individuales).

Proceso de muestra

Sangre periférica, médula ósea y otros fluidos biológicos.

Tumores sólidos o muestras parafinadas, requieren de disgregación intensa (enzimas).

Soluciones con concentración bacteriana desconocida.

Que puedo meter ahí?

Estructura, función y vitalidad de las células.

Método sensible

Unión covalente del fluorocromo a componentes específicos celulares.

Uso I

Fluorocromos que varían sus características en función del microambiente que les rodea.

Uso II

Fluorocromos

Ejemplo

¿Que te hace fluorocromo?

Alto coeficiente de extinción a la λ de excitación (probabilidad de absorber luz).

Alto rendimiento cuántico (emisión de luz)

Elevada fotosensibilidad

Corto estado de excitación (si estará unido a algo, debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente).

Propiedades ideales de un fluorocromo

Uso:

•Reaccionan y marcan proteínas, lípidos u otras moléculas biológicas.

•Altamente selectivos y reactivos.

Se emplean:

•Cromóforos con grupos isotiocianato, clorotrizinil y esteres de succinimida.

•Fluoresceína y ficoeritrina (Gran absorción y rendimiento, puede excitarse a 488nm pero emite mas allá de ese espectro/doble análisis).

Detección:

•Anticuerpos conjugados (cada uno con diferente marcador).

•Tinción de células cancerígenas.

Marcadores fluorescentes de unión covalente

Debido a su especial composición, se unen a determinados componentes moleculares.

Marcadores ADN/ARN O Bases: Hoechst33342 (A-T), CromomicinaA3 ( G-C), mitramicina (G-

C) naranja de acridina (ADN y ARN dif. λ).

Marcadores de potencial de membrana: Cianinas y rodamina123, marcan mitocondrias debido a su alta interferencia en potencial de

membrana.

Fluorocromos de unión no covalente

Estiman las prioridades del ambiente (espectro de

absorción)

pH(6-carboxi-fluoresceina), potencial

redox(diclorofluoresceína)

Actividad enzimática(substratos),

polaridad (anilino-naftalina-sulfato)

Sensibles a su micro-entorno

Proceso de

diferenciación celular

Gen de desarrollo

Gen de función

Productos del gen

Superficie celular

Intracelulares (caracterizar

sub-poblaciones)

El inmunofenotipaje (perfil de alergias)

Antígeno entra al organismo

Linfocitos B segregan Ig (una

parte)

Neutralizan a una sustancia especifica

Anticuerpos

terminaciones

Fab (especificidad)Fc

(región constante)

Gran especificidad (pequeñas diferencias

estructurales)

Fluorocromo (se une con el anticuerpo),

puede marcar varios y no daña la célula..

Respuesta inmune

No sabía que era alérgico…

Procedimientos técnicos

Aumento de la señal fluorescente (lecturas precisas)

Antisueros: Mezcla de Ig después de coagular, fusionadas con marcador y antígenos puros.

Tinción inmunofluorescente: técnicas directas (poco background y baja fluorescencia) o directas (aumenta background, pero es mayor la fluorescencia

con unión).

Fluoresceína (FITC), para IgA.

Incremento de la señal/ruido

Resultados

Deben ser almacenadas, inmediatamente después del análisis inmunofenotípico.

• Se deben de guardar en condiciones criogénicas.

En medios de cultivo con 0.1% de NaH3

(amoniaco) en hielo a 4ºC.

• Se puede (no se precisa viabilidad celular), fijar con paraformaldheido y guardar a 4ºC en cámara oscura.

Almacenaje de muestras

http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/

imf.htm Responsable del artículo: SEDAI de Citometría. Rovira Roure 80.02198 Lleida +34973702208

Técnicas de fluorescencia en microscopía y citométrica Escrito por Andrés Sampedro,J. R. de Los Toyos,Ángel Martínez Nistal

Bioquímica clínica y patología molecular. I, Volumen 1 X. Fuentes Arderiu

Bibliografía