Introducción a la Citometría de Flujo

12/3/2015

Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la dispersión de luz (light scatter) de células

o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente líquida laminar, cuando son

presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles de células/segundo) frente a un haz de luz láser de longitud

de onda adecuada

Qué se puede medir con un Citometro ?

Parámetros Biológicos en Citometría de Flujo

Cómo funciona un Citometro ?

La muestra es inyectada a presión en el centro de un fluido envolvente laminar estable que se mueve a gran velocidad ordenando a las células que circulan una a una frente a la fuente de excitación

Flujo de muestra: Enfoque hidrodinámico

Sistema de iluminación: Láser

Sistema de iluminación: Filtros ópticos

Forward Scatter Detector• Es un fotodiodo de sílice• La luz dispersada frontalmente es muy intensa, por lo cual no se requiere

un PMT• Un fotodiodo produce corriente cuando es expuesto a la luz

•Los detectores para Side Scatter y para fluorescencia son Fotomultiplicadores PMTs: fotocatodo, dinodo y anodo•El fotocatodo es de un material fotosensible que emite electrones cuando es expuesto a la luz•Un foton incide sobre el fotocatodo, los electrones del fotocatodo son acelerados en un campo eléctrico hasta el primer dinodo. El dinodo emite más electrones que son acelerados hasta el segundo dinodo, el cual emite incluso más electrones para pasar por la cadena de dinodos hasta el anodo (etapas fotomultiplicadoras).

Fotomultiplicadores

•La cantidad de electrones que cada dinodo emite está determinada por el potencial entre los dinodos. El potencial aplicado al conjunto del PMT es el Voltaje del PMT•A mayor voltaje del PMT mayor es la sensibilidad del detector•Ajustamos el voltaje en función de la necesidad de sensibilidad de la muestra

Procesamiento de la señal

Procesamiento de la señal

•Cada señal (pico o área) se integra •Se amplifica: lineal o logarítmicamente •Los citómetros de flujo amplifican las señales en un rango de valores entre 0 y 10 voltios antes de la conversión analógica-digital

t

v

Integración de la señal

Conversor analógico/digital

•Debido a que las señales analógicas sólo duran unos milisegundos, han de ser convertidas en digitales para su almacenamiento y posterior análisis en ordenadores. Esto se consigue gracias a los conversores analógico-digital.

•Un conversor analógico-digital (o también ADC del inglés "Analog-to-Digital Converter") es un dispositivo electrónico capaz de convertir una señal analógica de voltaje en un valor de salida binario.• El ADC establece una relación entre su valor de entrada (señal analógica, en voltios) y su valor de salida (señal digital, en 2n bits), es decir: voltios/ 2n bits.

Conversor analógico/digital•En un ADC de 8 bits tenemos un valor de salida (canales) de 2n bits, es decir 28 = 256 canales. •Supongamos que queremos convertir en digital una señal analógica amplificada linealmente usando un ADC de 8 bits. •En este caso tendríamos 256 canales para un rango de señal de 0 a 10 voltios.•Por lo tanto la señal correspondiente a cada canal vendría definida por el ratio a 10V/256 canales, es decir 0,04 V (40 mV) por canal.

0 50 100 150 200 250

10 V1 mV

Channels

Log

1 V100 mV10 mV

0 50 100 150 200 250

10V1V

100mV

Channels

Linear

Qué parámetros puedo medir con un Citometro?

• Luz dispersada frontalmente cuando el haz de un láser impacta en una partícula.

• La señal de Forward Scatter es una estimación del tamaño de una partícula

Forward Scatter

Forward Scatter

Side Scatter

• Luz dispersada en todas direcciones cuando el haz de un láser impacta en una partícula.

• La señal de Side Scatter es una estimación de la complejidad interna de una partícula.

Side Scatter

Fluorescencia

Trigger Chanel

Análisis de Resultados

Representación Monoparamétrica: histograma de Frecuencias

Fluo

resc

enci

a N

aran

ja

Fluorescencia Verde

Representación Biparamétrica

Representación Lineal o Logarítmica

Compensación

Compensación

Compensación

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