Trabajo Práctico:

Análisis de poblaciones celulares

por citometría de flujo.

Objetivo:

• OBJETIVO: Identificación y enumeración de la subpoblación de

linfocitos T (CD3+), células NK (CD3- CD16+ CD56+) y linfocitos B

(CD19+) de una muestra de sangre periférica, utilizando un reactivo

de inmunofluorescencia directa de tres colores y posterior análisis

por citometría de flujo.

Citometría de Flujo: principios y aplicaciones

La citometría de flujo se basa en el hecho que partículas simples son conducidas por una corriente líquida de manera que puedan ser alineadas y que, en un breve período de tiempo, una a una pasen a través de una celda o cámara en la cual son analizadas.

En dicha celda las partículas son impactadas por una fuente luminosa, como consecuencia de dicha interacción se generan señales ópticas, bandas espectrales en el espectro visible los que pueden ser detectados, integrados y obtener datos correspondientes a sus características físicas (tamaño, granularidad) o bioquímicas.

Ventajas

• La CF permite analizar individualmente un gran número de partículas en tiempos brevísimos (10.000 cél/seg) generando información entre 10-20 parámetros diferentes de cada partícula.

• Usando análisis estadístico es posible separar electrónicamente diferentes poblaciones e identificarlas usando técnicas de análisis multivariado.

• Finalmente, la técnica de sorting permite separar físicamente las células para su posterior análisis.

• Sistema de fluídica

• Sistema de iluminación

• Sistema de detección

• Sistema de análisis

Componentes básicos de un citómetro:

Flujo laminar

CF permite realizar la medición de una variedad de características celulares:

Tamaño celular relativoGranularidad y complejidad

celular internaNiveles de autofluorescenciaPresencia o ausencia de una

marca fluorescente exógena

Determinación de parámetros celulares:

Tamaño relativo y complejidad

Fluorocromos

Los fluorocromos son

sustancias que al ser

estimulados por fotones con

una determinada longitud de

onda, comprendida entre

distintos rangos de excitación,

emiten fotones de mayor

longitud de onda (emisión).

Cada compuesto posee une

espectro de excitación y otro

de emisión.

Determinaciones fluorescentes

• Clínica médica, hematología, inmunología,

oncología

• Medicina reproductiva

• Biología celular

• Microbiología

• Veterinaria

• Industria farmacéutica

Áreas de competencia:

Principales usos:

• Inmunofenotipificación nos permite analizar:

• Linajes celulares

• Estado de activación celular

• Capacidad de Homing

• Ensayos de funcionalidad celular:

• Producción de citoquinas

• Eflujo de Ca++

• Fosforilación de proteínas

• ROI

• Proliferación celular

• Fagocitosis

• Despolarización mitocondrial

Inmunofenotipificación

El inmunofenotipo es la identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana

Otras aplicaciones:Ciclo celular Movilización de Calcio intracelular

Proliferación celular

MATERIALES

-Reactivo CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD19-PECy5 (Cytognos)

-Citómetro de Flujo equipado con láser de 488 nm y software asociado.

-Tubos eppendorf.

-Sangre obtenida por punción venosa, anticoagulada con EDTA.

-Buffer de lisis de glóbulos rojos

-Buffer salino (PBS)

Especificidad:

El antígeno CD3 se encuentra en la superficie celular de timocitos maduros y linfocitos T

en sangre periférica.

CD3 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como un

mediador de la transducción de la señal, a través de la asociación con el receptor de los

linfocitos T (TCR).

CD3 es una proteína multimérica compuesta de cuatro cadenas polipeptídicas distintas (ε,

γ, δ ζ,), que consta de dos heterodímeros (εγ, εδ) y un homodímero (ζζ). CD3 se expresa

por un alto porcentaje de células T periféricas circulantes y se considera un marcador de

linfocitos T.

Los anticuerpos anti-CD3 se utilizan para la identificación y cuantificación del % de

linfocitos T en muestras de sangre o preparaciones celulares. Se utilizan frecuentemente

para la clasificación clínica de muestras hematológicas en pacientes con leucemias,

linfomas o inmunodeficiencias.

El antígeno CD19 se encuentra en la superficie celular de los linfocitos B normales y

neoplásicos, está ausente en las LT, monocitos y granulocitos.

CD19 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como una

molécula de transducción de señales crítica y reguladora del desarrollo, diferenciación y

activación de linfocitos B.

CD19 se expresa en las células dendríticas foliculares y linfocitos B, desde los primeros

estadíos reconocibles de linaje B, su expresión se pierde en la maduración a plasmocitos.

CD19 es un marcador linfocitos B comúnmente utilizado.

El antígeno CD56 se encuentra en las células NK y en subpoblaciones de LT CD3+CD4+ y

CD3+CD8+. Los LB normales, monocitos y granulocitos no expresan el antígeno CD56 en

su superficie.

La combinación CD16 / CD56 facilita la identificación de células NK, como subpoblaciones

que expresan CD16 + / CD56 +, CD16 + / CD56- o CD16 / CD56 +, pero carecen de CD3 y

receptor de células T (TCR).

PROCEDIMIENTO

1- Mezclar 100μl de sangre periférica con 26μl del reactivo: CD3-FITC/CD16+CD56-

PE/CD19-PECy5.

2- Para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo puede prepararse un tubo control de

isotipo.

3- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.

4- Añadir 1 ml de buffer de lisis de glóbulos rojos e incubar la muestra durante 10 minutos

a temperatura ambiente en oscuridad.

5- Lavado: pasar la muestra a un tubo falcon de 15 ml conteniendo 10 ml de PBS frío.

Centrifugar a 400xg durante 5 min.

6- Descartar el sobrenadante por volcado y resuspender el pellet de células en 1 ml de

PBS. Mantener en hielo y al resgurado de la luz.

7- Analizar por citometría de flujo.

Análisis: Antes de adquirir las muestras, ajustar las condiciones de

adquisición para minimizar el debris y asegurarse de que la población celular

de interés se distingue apropiadamente. Verificar que el citómetro está

alineado correctamente y estandarizado para dispersión de la luz (FSC/SSC

en escala lineal) e intensidad de fluorescencia (FL1, FL2 y FL3 en escala

logarítmica).

Crear regiones:

R2: linfocitos: pequeños y de granularidad baja

R1: monocitos

R3: granulocitos

Stats:

Region X-Mean Y-Mean Events %Total %Gated

R0 2169.6 1648.4 21470 100.00 100.00

R2 1631.3 407.3 7234 33.69 33.69

R1 2260.5 1023.8 2548 11.87 11.87

R3 2558.6 2624.0 9280 43.22 43.22

En R2: linfocitos

FL1

FL1

controles de isotipo con marca

0,03%

0,07% 0,00%

99,9% 55,8%

13,1% 0,28%

30,8%

0,00%

0,00% 0,03%

99,9% 50,7%

22,8% 5,32%

21,1%

FL3

FL2

Los resultados se deberán informar como porcentaje de linfocitos T, células NK y

linfocitos B respecto al total de linfocitos o leucocitos presentes en la muestra que a

su vez puede determinarse por CF en base a su característico patrón de FSC/SSC

(tamaño/granularidad o complejidad interna).

Valores de referencia (adultos)

Linfocitos T: 61-85%

Células NK: 6-29%

Linfocitos B: 7-23%

(% obtenido por CF respecto del total de linfocitos presente en la muestra)