Modelización del crecimiento de una población microbiana en medio líquido

y su implicación en el estudio de la morfología

celular a través del análisis digital de imágenes

Ángel Viteri 1, Mónica Blanco 2, Rosa Carbó 3, Marta Ginovart 2

1 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona

2 Departament de Matemàtiques 3 Departament d'Enginyeria Agroalimentària i Biotecnologia

Universitat Politècnica de Catalunya

ÍNDICE

1. Introducción

2. Objetivos

3. Materiales y métodos

4. Resultados y discusión

Introducción

Aplicación de matemáticas en microbiología

Atractivo y gratificante

Visión más profunda del proceso de

crecimiento microbiano

Sistemas microbianos como ejemplos dónde aplicar conceptos y herramientas desarrolladas en

clase de matemáticas

Buenas oportunidades para evaluar y comparar

metodologías diferentes de modelización

Introducción

Jacques Monod (1910-1976),

biólogo francés, escribió, hace

65 años, una interesante

revisión sobre el crecimiento de

cultivos bacterianos, mostrando

algunas ideas en un intento de

caracterizar,

por medio de parámetros y

funciones continuas,

poblaciones microbianas

"viviendo" en un medio líquido.

J. Monod, Recherches sur la croissance des

cultures bactériennes. Hermann, Paris, 1958.

Monod (1910-1976) definió la naturaleza del crecimiento bacteriano limitado por la cantidad de nutrientes con diversos experimentos en

medios líquidos.

Introducción

Cambios en las tasas de crecimiento en función del

tiempo (encima)

y curvas de crecimiento

típicas (debajo)

En el crecimiento de una población de microorganismos en un cultivo cerrado en medio líquido

(sin entradas ni salidas) se puede distinguir

una sucesión de fases caracterizada por

las variaciones en la velocidad de crecimiento.

Fases o etapas en la evolución temporal del crecimiento poblacional microbiano

Adapted from ustration by : Michał Komorniczak (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth)

i)   Fase de latencia o adaptación, “lag phase”, con tasa de crecimiento nula.

ii)  Fase de aceleración con aumento progresivo de esta tasa de crecimiento.

iii)  Fase exponencial, “log phase”, con tasa de crecimiento positiva, constante y máxima.

iv)  Fase de retraso con la disminución progresiva de la tasa de crecimiento.

v)  Fase estacionaria con una tasa de crecimiento (aproximadamente) nula.

vi)  Fase de declive o muerte con una tasa de crecimiento negativa.

MICROORGANISMO: La levadura Saccharomyces cerevisiae

§  Hongo unicelular §  Facilidad de crecimiento y buen manejo en el laboratorio §  Interviene en fermentaciones industriales diversas (vino,

cerveza, pan…) §  La propia célula y los componentes o material que la

constituyen son utilizados para propósitos diversos en biotecnología

Capaz de crecer en

condiciones aerobias,

microaerófilas y

anaeróbicas

La levadura Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae var. bayanus (x500)

La levadura Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae var. bayanus (x500)

Proliferación vegetativa con reproducción asimétrica (no bipartición)

Reproducción por gemación

Célula madre

Célula hija

La gema crece en la superficie de la célula madre y deja una cicatriz en la separación física.

Vida replicativa limitada. Edad genealógica asociada al número de gemas producidas.

La media de los tamaños de las células crece con la edad.

Morfometría

}  Estudio cuantitativo del tamaño y forma, y su variación

}  Conjunto de variables cuantitativas (directas o indirectas)

para analizar

Etapas

Procesamiento de imágenes Obtención de variables Análisis estadístico

𝐶𝑖𝑟𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑=4  𝜋∗( Á𝑟𝑒𝑎⁄𝑃𝑒𝑟í𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↑2 ) 

𝐸𝑙𝑜𝑛𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛= 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↓𝑚á𝑥 ⁄𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↓𝑚í𝑛  

Proceso digital de imágenes

ÍNDICE

1. Introducción

2. Objetivos

3. Materiales y métodos

4. Resultados y discusión

El objetivo fundamental de este trabajo es

la modelización de la población de células de levadura Saccharomyces cerevisiae

que se encuentran creciendo en dos condiciones,

aerobia y microaerófila, que corresponden a dos concentraciones de

oxígeno diferentes

desde dos perspectivas distintas: a nivel poblacional y a nivel individual.

Objetivos específicos ü  Caracterizar las evoluciones temporales de

los tamaños de las poblaciones de levaduras (numero de células) correspondientes a las dos condiciones de crecimiento establecidas.

ü  Obtener y analizar los resultados de diversos

parámetros morfométricos directos y sus derivados de las células de levadura para poder comparar entre las distintas fases de crecimiento y entre las dos condiciones (aerobia y microaerófila).

ÍNDICE

1. Introducción

2. Objetivos

3. Materiales y métodos

4. Resultados y discusión

Datos experimentales Ø  Para cada una de las dos condiciones de crecimiento (aerobio y

microaerófilo), 4 réplicas (ensayos) de cultivos en medio liquido

Ø  Muestreos a lo largo del tiempo y recuento del número de células

Ø  Fotos de células tomadas de los ensayos en distintos tiempos

Parámetros cinéticos útiles

en microbiología

Maxima velocidad de crecimiento

µ (fase exponential)

Tiempo de

latencia λ

(duración fase de adaptación)

Fase Lag

Fase Estationaria

Evolución temporal del número de células

Modelo BUCHANAN: Modelo pseudo-mecanicista y lineal a trozos, describe de forma aproximada las tres fases principales de una curva de crecimiento poblacional

t Lag-Exp

µ máx

log10 (N0)

log10 (Nmáx)

Fase de adaptación (fase lag) Fase exponencial (fase log) Fase estacionaria

Buchannan et al. (1997)

“When is simple good enough: a comparison of the Gompertz,

Baranyi, and three-phase linear models for fitting bacterial growth

curves”

t Exp-Est

nlsMicrobio: Nonlinear

regression in predictive

microbiology

Tratamiento de imágenes

Programa libre (Fiji is just) Image J.

Establecer escala

Duplicación de imagen y resta de ruido

Pasar la imagen a 8 bits

Mejorar el contraste

Ajuste del umbral

Pasar la imagen a binario

Cerrar células

Llenar agujeros

Separar células

Cerrar células manualmente

ÍNDICE

1. Introducción

2. Objetivos

3. Materiales y métodos

4. Resultados y discusión

Parámetros cinéticos de crecimiento microbiano a partir del modelo Buchanan obtenidos con el programa R

Ejemplo de la curva de crecimiento ajustada para los datos de la réplica 1 en condiciones aerobias

Parameters: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)

lag 6.3120 1.3827 4.565 0.000441 *** mumáx 0.7995 0.1261 6.342 1.82e-05 *** LOG10N0 4.6236 0.2661 17.373 7.18e-11 *** LOG10Nmáx 8.9698 0.2173 41.279 5.02e-16 ***

Modelo de Buchanan

Tabla resumen de parámetros cinéticos para las 4 réplicas

en las dos condiciones de crecimiento t Lag-Exp - Tiempo de duración de la fase lag, tiempo de fase lag a fase log (h) µ máx - Tasa máxima de crecimiento (log ufc/mL h -1) log10 (N0) - Logaritmo de la población inicial (log ufc/mL) log10 (Nmáx) - Logaritmo de la población máxima (log ufc/mL) t Exp-Est - Tiempo del cambio de fase de log a fase estacionaria

Medio Aerobio Medio Microaerófilo

Réplica 1 2 3 4 1 2 3 4

t Lag-Exp 6,31 8,63 7,51 7,37 6,79 7,95 7,22 7,14

µ máx 0,80 0,95 1,01 0,74 0,54 0,60 0,52 0,55

log10 (N0) 4,62 4,90 4,45 4,70 4,48 4,60 4,53 4,59

log10 (Nmáx)

8,97 9,14 9,03 8,86 9,16 9,19 9,09 9,57

t Exp-Est 18,83 18,89 18,00 20,34 26,58 25,61 27,25 28,03

Comparación entre medios de crecimiento

Influencia del medio sobre los parámetro cinéticos Variabilidad y tendencia central (valores p de los test estadísticos)

log10  (N0)   t  Lag-­‐Exp   µ  máx   log10  (Nmáx)   t  Exp-­‐Est  

F  de  Fisher   0,086   0,296   0,017   0,353   0,916  

t  de  Student   0,259   0,747   0,016   0,086   <  0,001  

MicroaerófiloAerobio

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

Medio

µ  máx

 (1/h)

MicroaerófiloAerobio

5,0

4,8

4,6

4,4

4,2

4,0

Medio

No  (Lo

g  ufc/m

L)

Medio aerobio }  Área

20 25 30 35 40 45 50 55 60

0 10 20 30 40 50

Áre

a (µ

m2 )

Tiempo (h)

Réplica 3

Área (µm2)  

Medio aerobio }  Perímetro

17 19 21 23 25 27 29 31 33

0 10 20 30 40 50

Perí

met

ro (µm

)

Tiempo (h)

Réplica 3

Comparación entre medios }  Medio aerobio

}  Medio microaerófilo

0

20

40

60

80

100

Adaptación Logarítmica Estacionaria Po

rcen

taje

(%

)

0

20

40

60

80

100

Adaptación Logarítmica Estacionaria

Porc

enta

je (

%)

Gemación

Gemación

Comparación entre medios }  Estudio de la variable área según gemación

Área (µm2)  

Área (µm2)  

Medio aerobio }  Circularidad

SON MUCHOS Y DIVERSOS LOS DATOS QUE SE HAN ANALIZADO…. … Y SEGUIREMOS ANALIZANDO PARA MODELIZAR ESTAS POBLACIONES DE LEVADURAS a dos niveles diferentes: -  A nivel poblacional con parámetros cinéticos involucrados en

modelos continuos para describir evoluciones temporales de numero de individuos.

-  A nivel individual con distribuciones de variables morfométricas de las células que se encuentran relacionadas con su estado reproductivo y son reflejo de su vitalidad y actividad.

CON EL FIN DE PODER INTEGRAR TODA ESTA INFORMACION

Y CONSEGUIR REPRESENTACIONES APROXIMADAS MÁS COMPLETAS DE ESTAS POBLACIONES MICROBIANAS.

Muchas gracias por su atención!