MEJORA DE LA CAPACIDAD DE UNIN DE LOS ESPERMATOZOIDES-ZONA PELCIDA (ZP) POR LA ACTIVACIN DE VAS DE LA PROTENA QUINASA A Y C EN DETERMINADAS HOMBRES INFRTILES CON ESPERMATOZOIDES DEFECTUOS DE UNION -ZP ANTECEDENTES: Defecto de unin de esperma-zona pelcida (ZP) (DSZPB) es una causa frecuente de fracaso de la fertilizacin in vitro. Este estudio fue determinar si DSZPB es causada por vas defectuosos casacada arriba de la protena quinasa A (PKA) y C (PKC), o fosforilacin de la tirosina protena reducida (TP).MTODOS: fueron estudiados hombres infrtiles con DSZPB y, tambien con morfologa normal de espermatozoides (NSM) > 14% (n=15) o < 5% (n=15). Ensayo de unin de esperma-ZP se realiz por incubacin de espermatozoides mviles con ovocitos durante 2 h con o sin dibutiril AMP cclico (dbcAMP, PKA activador) o acetato de forbol miristato (PMA, PKC activador). TP de espermatozoides capacitados en medio se evalu por inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina.RESULTADOS: Para los espermatozoides normales con unin normal de espermatozoides -ZP, tanto PMA y dbcAMP mejor significativamente la unin de espermatozoide-ZP de una manera dosis-respuesta. Slo dbcAMP, pero no PMA, aument significativamente TP de espermatozoides capacitados. En los hombres DSZPB con teratozoospermia severa (NSM14%, el PMA causo un aumento significativo de unin de espermatozoides hasta niveles normales > 40 espermatozoides union/ ZP) de cinco hombres y dbcAMP tubo un resultado similar en dos hombres. De nuevo TP se mejor significativamente slo por dbcAMP, pero no por PMA.CONCLUSIONES: Existe sealizacin defectuosa en las vas de aguas arriba de la PKC y PKA en algunos hombres con semen normal DSZPB y anlisis. La estimulacin de TP por dbcAMP no mejora la capacidad de unin de espermatozoides en los hombres-ZP DSZPB con baja TP, independientemente de la morfologa de los espermatozoides.La capacidad de los espermatozoides para unirse a la zona pelcida del humano (ZP) es uno de los indicadores ms importantes para la capacidad de fertilizacin del espermatozoide (Liu y Baker, 1992; Franken et al., 1993; Oehninger et al., 1997; Barratt y Publicover, 2001;. Liu et al (2004) y defecto de la unin y la penetracin del espermatozoide-ZP (DSZPB) son las causas ms frecuentes de fracaso total de la fertilizacin en la fecundacin in vitro convencional (FIV, Liu y Baker, 2000). Aunque la mayora de los hombres infrtiles con DSZPB tienen resultados anormales de anlisis de semen, particularmente teratozoospermia severa [estricta morfologa normal de espermatozoides (NSM)30%, 15 tenan estricta NSM>14% y el 15 tuvo teratozoospermia severa (NSM 40 esperma unido / ZP se utiliza como el umbral para el unin normal esperma-ZP desde el esperma de hombres frtiles tendra >100 espermatozoides unidos por ZP (Liu et al., 2004,2007).Los espermatozoides en el medio se lavaron con 10 ml de solucin salina normal y se centrifug. El pellet de esperma se resuspendi en~20 ml de solucin salina y luego 3 ml de este se unta en un portaobjetos de vidrio para la evaluacin de TP por IF como se describe a continuacin.EVALUACIN DE LA FOSFORILACIN DE LA TIROSINA DE ESPERMAFrotis de esperma se prepararon como se ha descrito anteriormente, se sec al aire y se fijaron en etanol al 90% durante 30 min para permeabilizar la membrana plasmtica. TP de los espermatozoides fue evaluada por IF directa con el PY20 anticuerpo monoclonal marcado con FITC (Liu et al., 2006). El anticuerpo se diluy 1: 300 en PBS que contena 10 mg / ml de BSA. Cada frotis (~10x10 mm) se cubri con 50 ml de PY20 diluido y se incub durante 4 h en una caja humidificada a 378c. Despus de la incubacin, el portaobjetos se lav y se monta con agua destilada y se cubre con un cubreobjetos (22x22 mm). Esperma reaccionar con el anticuerpo PY20 tena fluorescencia brillante en la pieza principio de la cola, y no se observ tincin fluorescente en la cabeza del espermatozoide (Liu et al., 2006). El porcentaje de esperma manchado (equivalente a tirosina fosforilada esperma) se determin anotando 200 esperma para cada muestra usando un microscopio de fluorescencia (Liu et al., 2006).EL ANLISIS ESTADSTICOLas diferencias en los resultados de los anlisis de semen entre los dos grupos de hombres con NSM? 14% y? 5% se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. La significacin de las diferencias en el nmero de espermatozoides con destino y el porcentaje de espermatozoides con TP a diversas concentraciones de dbcAMP y PMA se examinaron mediante la prueba no paramtrica de ANOVA de dos vas (Friedman). Pruebas t pareadas se utilizaron para la comparacin de varias variables entre la prueba (PKA y PKC activadores tratamientos) y las muestras de control. Las correlaciones entre mejorada espermatozoide-ZP vinculantes y una mayor TP de espermatozoides capacitados por dbcAMP se examinaron mediante la prueba de Spearman.RESULTADOSLos resultados del anlisis de semenResultados de las pruebas de esperma de 30 hombres infrtiles con DSZPB se resumen en la Tabla I. De acuerdo con el diseo del estudio, todos los hombres tenan concentraciones de espermatozoides>20x106 / ml con la motilidad razonable. Los hombres fueron divididos en dos grupos subjetivamente sobre la base de resultados de NSM en el semen. Quince hombres tenan anlisis de semen normal (NSM>14%) y otros 15 hombres tenan teratozoospermia severa (NSM40 espermatozoides unidos por ZP) en cinco hombres (Tabla II, Fig. 3). En dos de estos cinco hombres, los espermatozoides-ZP unin fue tambin aument a niveles normales por dbcAMP. La prueba se repiti en dos de los cinco hombres con mayor espermatozoides-ZP de unin utilizando el esperma de una eyaculacin diferente, y se obtuvieron resultados similares. Sin embargo, en todos los dems casos, PMA y dbcAMP no tuvo ningn efecto significativo sobre el esperma-ZP vinculante.En los 15 pacientes DSZPB con anlisis de semen normal dbcAMP mejorado significativamente TP mientras que el PMA no lo hizo. Esta mejora inducida por dbcAMP de TP pareca no tener correlacin con la mejora de la unin espermatozoide-ZP (r Spearman 0,069,. P 0,05).En los 15 pacientes con DSZPB teratozoospermia severa, la incubacin de los espermatozoides con 2 mM dbcAMP o 15 mM de PMA no aument significativamente el nmero de espermatozoides unidos a la ZP en cualquier individuo.Una vez ms, dbcAMP mejorado significativamente TP de manera uniforme para todas las muestras, pero PMA no tuvo efecto sobre TP (Tabla II, Fig. 4).Ni dbcAMP ni PMA tenan ningn efecto significativo sobre el estado acrosomal de espermatozoides capacitados. Esto era cierto tanto para los hombres con anlisis de semen normal y aquellos con teratozoospermia severa (Tabla II).DiscusinEste estudio muestra que la activacin de PKA y PKC vas de transduccin de seal por dbcAMP y PMA mejora significativamente la capacidad de unin del esperma-ZP en algunos hombres infrtiles DSZPB con anlisis de semen normal. Capacidad de unin del espermatozoide con ZP se increment a niveles normales en 5 de 15 hombres por PMA y en dos de estos cinco hombres por dbcAMP (Fig. 3). Este resultado sugiere que la causa de DSZPB en los cinco hombres puede incluir defectos especficos en las vas de aguas arriba de PKA o PKC. Sin embargo, la mayora de los hombres infrtiles normosprmicos con DSZPB no respondi, lo que indica que pueden tener defectos aguas abajo de PKA o PKC vas, o diferentes defectos no relacionados con estas vas tales como la ausencia de receptores para la ZP en la membrana plasmtica. Esto requiere una mayor investigacin. En cambio, ni dbcAMP ni PMA fueron capaces de mejorar la unin de esperma-ZP en cualquiera de los 15 pacientes con DSZPB teratozoospermia severa (NSM