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LABORATORIOS BETERÁ

Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia

Dra.Hilda Marilín García Pérez1

RESUMEN

Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influenciade un campo eléctrico. Se dio una visión general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para proteínas en condicionesnativas o desnaturalizadas, se incorporaron nuevos conocimientos tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionalesde este método, como son la adición de compuestos de restricción de la difusión y que aumentan la estabilidad de los geles. Seejemplificó el comportamiento anómalo de algunas proteínas en la determinación del peso molecular por electroforesis en gelesde poliacrilamida en condiciones desnaturalizadas.

Palabras clave: electroforesis, poliacrilamida, geles.

UNIV DIAG 2000;1(2):31-41

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La electroforesis es un método analítico –semipreparativo, en el que se separan biomoléculaen dependencia entre otros factores de su cargabajo la acción de un campo eléctrico, fue empleadopor primera vez por Tiselius en el año 1937.Raymond y Weintraub en 1959 emplearon comosoporte para la electroforesis un gel depoliacrilamida (PAGE), posteriormente el métodofue perfeccionado por varios investigadores comoDavis y Ornstein. La popularidad de este creciórápidamente y se logró un aumento de la resoluciónEl dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce enesta técnica en 1970, y ya en 1972 se empleaagentes reductores y SDS en la determinación depeso molecular de proteínas en lo que se denominelectroforesis en geles de poliacrilamida con SDS(SDS-PAGE). En este trabajo se da un bosquejogeneral de la electroforesis, si se tiene en cuentel desarrollo desde su surgimiento hasta el present

DESARROLLO

1. Fundamentos de la electroforesis

La electroforesis es la migración de solutosiónicos bajo la influencia de un campo eléctrico;Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo(electrodos - y +), en dependencia de una

1 Master en Ciencias Bioquímicas. Investigadora Agregada.

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combinación de su carga, peso molecular yestructura tridimensional.

Es de destacar que a escala analítica, losmétodos electroforéticos son de alta sensibilidad,poder de resolución y versatilidad, y sirven comométodo de separación de mezclas complejas deácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas,donde aportan un potente criterio de pureza. Sepueden conocer también mediante estas técnicas,las características ácido-básicas de las proteínaspresentes en un extracto crudo, lo que da lainformación necesaria si se pretende realizar unaseparación cromatográfica basada en diferenciasde carga. Es útil además para determinar otrosparámetros como peso molecular, punto isoeléctricoy número de cadenas polipeptídicas de lasproteínas.

La velocidad de migración (v) de la partículaes directamente proporcional al producto de sucarga efectiva (q) y el gradiente de potencialeléctrico (E) e inversamente proporcional alcoeficiente de fricción (f) relativo a la talla y formade la molécula, o sea, a la resistencia que le ofreceel medio.

V = q E / f

La movilidad electroforética (Me) es un casoparticular de la velocidad de migración de un ión,

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cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm.Su signo es igual al de la carga de la partícula.

La velocidad de migración electroforéticadepende de la densidad de carga de la molécul(relación carga / peso), del voltaje aplicado y de laporosidad del gel de electroforesis. El voltaje no sepuede incrementar indiscriminadamente porque sgenera un excesivo calor. En contraste, al aplicabajo voltaje puede ocurrir una pobre separaciónpor causa de la difusión por tiempo muy prolongadode la corrida electroforética.1

La mayoría de las biomacromoléculas(proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseedeterminada carga eléctrica con grupos aniónicosy catiónicos capaces de disociarse. La carga netde la partícula está dada por el pH del medio ypuede ser modificada por la interacción conpequeñas moléculas de iones u otrasmacromoléculas. De lo anterior se deduce que epH influye sobre la velocidad de migración de lasmoléculas.2 En el punto isoeléctrico de labiomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta nmigra. Por debajo del punto isoeléctrico tiene carganeta positiva y migra hacia el cátodo, y por encimadel punto isoeléctrico tienen carga neta negativa ymigra hacia el ánodo.

2. Métodos electroforéticos zonales

Son útiles para lograr la separación decomponentes de mezclas complejas. Se aplicapequeñas cantidades de la disolución de proteínaa un soporte sólido, que se impregna con unasolución de tampón. Los soportes son en generapolímeros y forman un gel poroso que restringe emovimiento de las moléculas a través del mediodurante la electroforesis y disminuyen los flujos deconvección del solvente. Como soportes han sidoutilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida,agarosa, acetato de celulosa, etcétera.

Este método tiene gran poder resolutivo porquese aplica una cantidad pequeña de proteína a unzona estrecha, mientras que la longitud del trayectoes mucho mayor que la zona de aplicación. Elequipamiento requerido es simple (fuente de podey cubeta vertical u horizontal donde se coloca elsoporte y 2 electrodos). Con el desarrollo de laciencia se han diseñado equipos automatizados delectroforesis como el PhastSystem.

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2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida

La poliacrilamida es un soporte empleadofrecuentemente en electroforesis en gel, esquímicamente inerte, de propiedades uniformes,capaz de ser preparado de forma rápida yreproducible. Forma, además, geles transparentescon estabilidad mecánica, insolubles en agua,relativamente no iónicos y que permiten buenavisualización de las bandas durante tiempoprolongado. Además tiene la ventaja de quevariando la concentración de polímeros, se puedemodificar de manera controlada el tamaño delporo.3

2.2. Formación del gel de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se forman por lapolimerización vinílica del monómero acrilamidaCH2=CH-CO-NH2 y del monómero entrecruzador N,N´-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH - CH2

- NH - CO - CH = CH2. La polimerización se inicia conla formación de radicales libres del monómero, quese producen por radicales libres de oxígeno, porcausa de la acción de iones persulfato.1 Las aminasterciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-diamina(TEMED) se emplean como catalizadores de estareacción, porque causan la formación de radicaleslibres del persulfato.4 Esta reacción es fuertementeinhibida por altos niveles de oxígeno,5 por lo que lasolución debe ser desgasificada para lograr unaformación de gel reproducible. Hay muchosfactores que desempeñan una función importanteen la separación electroforética, como son pH,fuerza iónica, gradiente de potencial, tiempo decorrida, concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, etc. Las condiciones óptimas de unabuena separación, en la práctica se determinanexperimentalmente, con el análisis de cómoinfluyen los diferentes factores en la electroforesisen cuestión. La naturaleza de la muestra sirve deguía para alcanzar las condiciones en la que sedeben obtener los mejores resultados.6

Bambeck7 reporta que durante lapolimerización del gel a temperaturas inferiores a17 ºC, la iniciación del control catalítico y el tiempode elongación de la cadena comienzan a serdiferencialmente controlables.

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2.3. Significación de % T y % C

La concentración de acrilamida (% T)representa el porcentaje en peso del monómetotal empleado (acrilamida + entrecruzador engramos por 100 mL) y determina la longitudpromedio de la cadena del polímero. Laconcentración de bis-acrilamida (% C) representel porcentaje de este monómero en el gel determina el grado de entrecruzamiento.

La estructura del gel comienza a ser evidenta 4 % T; 0,2-5 % C.8 Los factores que gobiernanla talla del poro del gel son complicados, pero engeneral el tamaño del poro disminuye con eincremento del %T.9 Las proporciones en queambas se encuentran determinan las propiedadfísicas del gel como son densidad, elasticidadresistencia mecánica y el tamaño del poro. Egeneral se recomiendan valores de T de 5 a 15 y de C de 2 a 4 %.10 Para separar moléculas portamaño, es necesario tomar en cuenta la relacióentre el poro efectivo del medio y el tamaño de lamolécula que se pretende separar. Si el poro dmedio es significativamente mayor que la moléculala separación electroforética será sobre la base ddiferencias de carga y el tamizaje molecular sermínimo. Al aplicar muestras biológicas en un gecon gradiente de acrilamida, todas lasmacromoléculas comienzan su migración a bajporcentaje y en la medida en que avanzan sencuentran con poros más pequeños que retardsu movimiento. Las moléculas menores comienzaa tener alta fricción cuando los poros son mápequeños, mientras que las grandes comienzanfricción en los poros de mayor tamaño.

2.4. Tipos de monómeros

La bis-acrilamida es el agente entrecruzadomás comúnmente empleado en este tipo delectroforesis. O Gaal y otros en 1984,10 plantearonque la bis-acrilamida puede actuar comoterminador de la cadena en el proceso dpolimerización y concentraciones altas puedendisminuir el tamaño de poro máximo de gel.

Se han reportado otros agentesentrecruzadores como: la N, N´-diallitartar diamina(DATD) que da un tamaño de poro mayor que eobtenido con bis-acrilamida; la N, NC- bisacrililcistamina

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(BAC) cuyo gel resultante se une por los gruposbisulfuro, lo que hace que pueda disolverse ensoluciones de reactivos tiólicos y el N,N´-(1,2-dihidroxietileno) bis-acrilamida o DHEBA formageles de poros altamente hidrofílicos.8

2.5. Catalizadores empleados en la formacióndel gel de poliacrilamida

La polimerización se lleva a cabo con lautilización de sistemas catalíticos redox como porejemplo:

• Persulfato de amonio (agente oxidante) yTEMED como agente reductor.

• Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).

• Peróxido de hidrógeno, sulfato de hierro y ácidoascórbico.

La polimerización no ocurre a bajo pH, ya querequiere radicales de monómeros libres formadospor catálisis básica de radicales oxígeno delpersulfato.

La fotopolimerización con riboflavina no esinhibida por el oxígeno, sin embargo, en amboscasos el TEMED actúa como agente reductorsuave y acelera la polimerización.1

2.6. Sistemas de tampón que se empleanen la electroforesis en geles de poliacrilamida

La fuerza iónica (m) determina el potencialelectrocinético ya que reduce la carga neta de losgrupos con cargas efectivas. Se ha determinadoque la movilidad de las partículas cargadas esinversamente proporcional a la raíz cuadrada de lafuerza iónica, a baja m se eleva la velocidad demigración y es menor la difusión, de manera que lazona de separación es más ancha y mayor laresolución.1 Con el aumento de la m, se incrementael desprendimiento de calor y la evaporación. Enla electroforesis, los efectos de absorción de aguano-homogeneidad del material, intercambio iónicocon grupos cargados del soporte yelectroendósmosis, pueden influir sobre lamovilidad y la calidad de la separación. Laelectroendósmosis generalmente ocurre porquegrupos cargados del soporte se ionizan en

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soluciones tampón neutras o ácidas y locontraiones libres hidratados (H3O

+) migran haciael cátodo, esto provoca un movimiento relativo desolvente respecto al soporte sólido y que lamoléculas no cargadas sean transportadas hael cátodo a pesar de no tener grupos ionizados.

La electroforesis en geles de poliacrilamidapuede realizarse en el rango de pH de 2 a 11, sembargo la desaminación de las proteínas o lreacciones hidrolíticas pueden ser severas a valode pH inferiores a 3 y superiores de 10. La mayorde las proteínas con puntos isoeléctricocomprendidos entre pH 4 y 7,5, son separadas geles con pH entre 8 y 9.

La fuerza iónica del sistema tampón debmantenerse a un nivel adecuado para garantizarsolubilidad de la muestra y suficiente capacidaamortiguadora. Es usual utilizar concentracionede tampón en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, peropueden emplearse concentraciones sobre 0,5 moen sistemas fuertemente ácidos, pues a bajosvalores de pH muchos ácidos débiles (que son lmás empleados) están débilmente ionizados y necesaria una alta concentración para obteneradecuada capacidad amortiguadora.1

2.6.1. Sistemas de electroforesis. Electroforesisde múltiples zonas (MZE)

El sistema de electroforesis a emplear depende los objetivos a alcanzar, los más empleados sgel uniforme y tampón homogéneo, y gel y tampóheterogéneo. La principal desventaja del primeroes que la resolución es menor que con los sistemheterogéneos, porque no hay efecto concentraden la primera parte de la corrida. En el sistemdiscontinuo o heterogéneo se varían el poro del gy los iones del tampón, por lo que se puedconcentrar la muestra.11 Cuando no es necesariauna gran resolución, los sistemas homogéneos tienla ventaja de ser rápidos, sencillos. Las bandaespecialmente de proteínas pequeñas, son manchas en el sistema homogéneo que en heterogéneo, efecto que se compensa con la mapendiente de este último.12

En la actualidad es común que la electroforesdiscontinua se realice con 2 tipos de geles, un gconcentrador (de poros grandes) y un gel separad(de poros pequeños).13, 14 Esto se fundamenta en

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que los constituyentes iónicos de las solucionestampones utilizadas en ambos geles son igualespero el pH de estas y el tampón de corridaempleado en los electrodos es diferente. Laseparación ocurre en el gel separador, donde lamigración está determinada por la carga y el tamañomolecular de las partículas. Encima de este gel sesitúa el gel concentrador, generalmente de unamenor altura (1/3 del gel separador), en el que lamuestra se concentra en una zona muy estrechalo que determina la separación en bandas finas enel gel separador y alto poder de resolución. Elproceso general en PAGE-SDS discontinuo constade 3 etapas: concentración, desconcentración yresolución.

La teoría de MZE fue formulada por Jovin.15

Al aplicar esta teoría a un sistema con tris-HCl enambos geles y tris-glicina como tampón de corrida,se observa que las 2 especies iónicas existenteCl- (iones conductores) y glicinato (ionesrezagados) migran en la misma dirección que lasmoléculas de la muestra. Al comenzar laelectroforesis, los iones Cl- tienden a moverserápidamente, separándose del resto de las especieiónicas y dejando tras de sí una zona de bajaconductividad. La conductividad específica esinversamente proporcional a la fuerza del campoeléctrico, se forma un gradiente de voltaje en estaregión que acelera el movimiento de los ionesrezagados, lo que hace que estos migren en seguiddetrás de los iones conductores y a la mismavelocidad; de esta manera se forma el denominadolímite de Kohlraush, entre los iones conductores ylos rezagados (entre las regiones de alto y bajogradiente de voltaje). Las movilidades de loscomponentes de la muestra son intermedias entrelas de los iones conductores y rezagados, por loque se encontrarán en la región límite, en capas desolo algunos micrones de grosor.1 Cuando lamuestra concentrada llega a la interfase entre egel concentrador y separador, ocurren cambios enla movilidad de los constituyentes por causa delpH, la fuerza iónica y el efecto de tamizaje del gel.Dependiendo de los componentes individuales dela muestra estos migran en bandas discretas.

La principal ventaja de la teoría de MZE es laflexibilidad con que puede ser aplicada en elfraccionamiento analítico o preparativo.

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2.7. Formatos de la PAGE

Existen 3 formas diferentes de realizaelectroforesis en geles de poliacrilamida: láminvertical, varilla cilíndrica y lámina horizontal.

Los geles más finos son más económicoporque emplean menos reactivos y pueden seficientemente refrigerados durante la corrida, plo tanto pueden ser corridos a mayor voltajelográndose así una alta resolución en corto tiempLos tiempos de tinción y destinción son menoretambién porque la difusión es muy rápida; siembargo como el gel es tan fino es más propena perturbaciones y problemas en la polimerización8

Se ha planteado que la resolución de las molécugeneralmente aumenta con la disminución dgrosor del gel.16

2.8. Comportamiento de las proteínas en lelectroforesis en geles de poliacrilamida condodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS)

La electroforesis con SDS es un excelenmétodo para identificar y monitorear las proteínadurante un proceso de purificación; también semplea para la determinación del peso molecude las subunidades de proteínas.4

La estructura del detergente SDS empleaden esta variación de la electroforesis en gel poliacrilamida es CH3 (CH2) 10 CH2 = SO3 - Na+.El anión se une a las proteínas por absorción específica (aproximadamente una molécula de SDpor cada dos residuos de aminoácidos, con urelación SDS/proteína máximo de 1,4 g/g). El SDdesnaturaliza por completo las proteínas y romlas interacciones no covalentes que determinanestructura terciaria y cuaternaria. Los grupoalifáticos dodecil se colocan en el interior, mientraque los grupos sulfato en la superficie y todos locomplejos SDS-proteína toman carga neta negat(que excede la carga intrínseca de las cadenasaminoácidos). Las proteínas reaccionan con SDa relativamente alta concentración, pero se demostrado que 0,4 % de SDS es el nivel mínimnecesario para saturar los sitios de unión deproteína, sin embargo, se emplea 1 % para logun margen de seguridad.8

El Rf es una medida convencional de lmovilidad de la proteína relativa al frente d

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migración4 y se define como la distancia desde elinicio del gel separador hasta el centro de cadabanda dividida entre la distancia a la que hamigrado el ión líder.

La concentración apropiada de SDS en eltampón superior, se determina incrementando lacantidad de SDS hasta que no exista variación enel Rf. Se ha demostrado que concentraciones enel rango de 0,02 a 0,025 % de SDS en el tampónsuperior es suficiente, sin embargo se utiliza 0,03 %para obtener un margen de seguridad.

El complejo SDS-proteína tiene forma devarilla con un diámetro aproximado de 18 Å y unalongitud proporcional al peso molecular de la cadenapolipeptídica. El tratamiento concomitante con unagente reductor de puentes bisulfuro, como el betamercaptoetanol ( βME) o el DTT desnaturalizalas proteínas y las rompe en las subunidades que lcomponen. Por lo que el complejo SDS-proteínatiene generalmente mayor densidad de carga ymenor tamaño que las proteínas nativas. Se hadeterminado que con 5 min a 95-100 ºC essuficiente para la formación de enlaces establesSDS-proteína a una concentración de 1 % de SDSen presencia de EDTA y condiciones reductoras.El complejo SDS-proteína es estable durante 3 mesesa 4 ºC. El SDS migra más rápido que el complejoproteína-SDS en un gel restrictivo, por lo que elSDS no es necesario adicionarlo en los geles seste está presente en la muestra y en el tampósuperior, lo que da la ventaja de asegurar lascondiciones y la eficiencia de polimerización delos geles sin SDS.8

La migración de los derivados proteína - SDShacia al ánodo es inversamente proporcional allogaritmo de su peso molecular (log PM).17 Larelación carga/masa es aproximadamente igual paratodas las proteínas de la muestra por lo que la tallade esta deviene en el factor determinante de laseparación. El SDS-PAGE se emplea para estimael peso molecular de las proteínas y se comparacon un patrón. No obstante Bjellqvist18 hareportado que diferentes proteínas de igual tallapueden migrar como una banda única.

Bajo iguales condiciones de pH y temperatura,el SDS y las proteínas se concentran en la mismazona, pero como la cantidad de SDS es muy grandecomparada con la de proteínas y su concentraciónen el gel concentrador se puede regular, se formauna zona de concentración amplia caracterizada

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fundamentalmente por ser estable con el frentecorrida y que continuamente aumenta duranteelectroforesis dependiendo de la cantidad de Sintroducido en el tampón. Se aprecia una progresdifusión del borde de migración en la medida eque aumenta la concentración de T.8 Estos autoresdemostraron que el ión glicinato no se concentcon el gel concentrador, lo que puede estprovocado por una interacción entre la glicina y SDS. La concentración de pequeñas proteínasdifícil en estas condiciones, porque se formacomplejos de proteínas y detergentes de igual tay carga que las micelas de SDS solas, por lo qrecomienda el empleo de una mínima cantidad SDS.

Las condiciones pueden ajustarse dependiende como se necesite separar las proteínas estado completamente desnaturalizadparcialmente desnaturalizada o nativa). Laasociaciones covalentes entre las unidades proteínas pueden mantenerse omitiendo el βMEdel tampón de muestras. En ausencia de este agreductor los puentes bisulfuro intracatenariosintercatenarios de la muestra de proteínpermanecen intactos; la movilidad electroforéticdel complejo SDS proteína se altera bajo escondiciones de disociación y durante lelectroforesis la movilidad de los oligómeros SDproteínas es menor que con los componentes Spolipéptidos completamente desnaturalizados. Lproteínas pueden mostrar una respuesta individcaracterística a la reducción, lo que se determal comparar los geles corridos con βME o sin este.Adicionalmente las proteínas no reducidas, puedno estar del todo saturadas con SDS por lo qpuede variar su relación peso/peso en interacción con el detergente. Esto hace que determinaciones de peso molecular con escaracterísticas no tengan la misma confiabilidaque el análisis hecho con polipéptidos del toddesnaturalizados. Es necesario la existencia patrones y proteínas conocidas de iguconfiguración para una comparación válida. ESDS-PAGE bajo condiciones reducidas y nreducidas es un método muy útil para el análisislos puentes bisulfuro que contienen las proteínaSchuhmacher M y otros19 en estudios con lalisozima de huevo durante la electroforesdemostraron que el βME y del DTT forman

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aductos bisulfuro con las proteínas. Jeannot MAy Zheng J20 reportaron un método de preparaciónde la muestra en el que se elimina el SDS del gel.

2.9. Determinación de peso molecular deproteínas. Comportamiento anómalo dediferentes proteínas en electroforesis

El peso molecular (PM) de las proteínas puededeterminarse en electroforesis al comparar lasmovilidades electroforéticas de varios marcadoresde peso molecular conocido. Existen patrones(mezclas de proteínas de peso molecular conocidoy que se tiñen uniformemente) de varios rangos depeso molecular, se debe aplicar el que abarque elpeso molecular esperado para la proteína que sequiere determinar. Estos patrones deben sertratados de manera similar a la muestra. En general,cuando las proteínas tienen gran cantidad decarbohidratos en su composición o cuando estánunidas a complejos de membrana migran de maneraaberrante,8 por lo que no son recomendadas comomarcadores de peso molecular.

Al realizar un ploteo del log PM de la proteínapatrón como función del valor de Rf, se obtiene ungráfico ligeramente sigmoideo. El peso moleculardesconocido puede estimarse por el análisis deregresión lineal o por interpolación en la curva dellog de PM contra Rf.4

El ploteo de Ferguson del log de Rf contra el% T del gel separador para varias proteínaspatrones chequea el error sistemático del método,para lo que es importante que estas proteínasmuestren uniformidad en su densidad de carga, loque se determina por la intercepción de sus líneasa 0 % T. Se obtiene un ploteo de Ferguson nolineal en el fraccionamiento de pequeñas proteínasa una alta concentración de gel o de proteínasmuy grandes que dan valores de Rf muy pequeños.8

El coeficiente de retardación (Kr) da unamedida de la influencia del tamizaje sobre lamovilidad de las biomoléculas, se ha reportado quees función del peso molecular y existe inclusivepara moléculas pequeñas. Los valores de Krpodrían minimizarse para todas las proteínaspatrones por selección de valores bajos de C. Conel empleo del ploteo de Ferguson se puedendiscriminar las diferencias de carga, el pesomolecular y las formas de diferentes isómeros,8

así como determinar el peso molecular de estosin embargo se pueden encontrar dificultadtécnicas cuando varios multímeros de proteínse analizan.

Existen casos de migraciones anómalas proteínas como por ejemplo la ferritina y apoferritinde bazo de caballo,8 en que se recomienda suempleo para calibrar SDS-PAGE solo bajadecuadas condiciones de desnaturalización (2SDS, agente reductor de bisulfato y 5 min a 100 ó 5 h a 37 ºC), ya que la apoferritina es inusualmenresistente a la desnaturalización y disociación subunidades. Puede observarse que en un tamcontinuo a pH 7 da una banda con peso molecude 20 000 y en SDS -PAGE con sistema de tampdiscontinuo se aprecian 2 bandas de PM 19 88922 200, lo que puede no ser por causa de aumento de la resolución en la técnica, sino pdiferencias en la concentración de SDS, por lo tanel fenómeno puede ser explicado por diferenciocasionales en la estimación del peso molecude los 2 tipos de SDS-PAGE. Cuando estproteínas se separan por filtración en gel, spropiedades geométricas e hidrodinámicas hacque su talla y características superficiales sediferentes de otras proteínas globulares típicas, plo que es necesario tener en cuenta comportamiento característico.

Zhang J y otros,21 hacen un interesante análisis decomportamiento anómalo en cuanto a la determinacde peso molecular, de una proteína recombinainhibidora de la proteína fosfatasa-1(denominadinhibidor-3), que es extremadamente hidrofílica yestable al calor. Esta proteína tiene un pemolecular aparente de 23 kD en SDS-PAGE, pgel de filtración, un peso molecular relativo de55 000 y su peso molecular calculado es de 14 kDEsta característica se ha descrito también paraproteínas inhibidor-1 e inhibidor-2, que actúasobre la proteína fosfatasa-1.

Para completar el estudio de peso moleculde proteínas, se ha reportado19 el análisis porespectrometría de masa por ionización eelectroatomización (ESI-MS) para proveer de undeterminación exacta del peso molecular dproteínas aisladas y no resueltas por SDS-PAGA pesar de que existen otros métodos mrecientes para la determinación del peso molecude proteínas, la electroforesis en geles dpoliacrilamida no ha perdido su utilidad.

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2.10. Estabilidad de los geles de electroforesis

El principal problema que afecta la estabilidady la resolución en todos los medios de electroforesises la absorción y desorción. Las características detamizaje del gel están fundamentalmente dirigidaspor el tamaño del poro y cuando el medio absorbeagua, el tamaño medio del poro se incrementa, estohace que las moléculas puedan migrar más rápidoa lo largo del gel y disminuye la resolución. Perocomo la absorción de agua no es uniforme encada porción del gel, casi siempre es mayor en laregión central que en los extremos, por lo que lasmoléculas localizadas en esta migran a través delgel más rapido que las que están en los extremos,lo que deforma y afecta la reproducibilidad de laelectroforesis.

Todos los geles de poliacrilamida absorben aguadurante el proceso de polimerización y durante laconservación, pero la tendencia se incrementa conel aumento del porcentaje de acrilamida.

En el sistema de electroforesis con tampón ygel heterogéneos, la diferencia de concentraciónentre los geles concentrador y separador crea unpotencial osmótico entre los 2 geles, lo que provocaque el agua pase del gel concentrador (región debajo % acrilamida) hacia el separador (región dealto % de acrilamida). Este proceso es muy rápidoy continúa hasta que se establezca un equilibrioentre ambos geles como resultado de la difusióndel agua al gel separador, por lo que el porcentajede acrilamida no es estable en el gel separador yes necesario emplear los geles en el día de supreparación.

Cuando se mantiene en tampón, el gel absorberápidamente agua de este hasta llegar al equilibrio,lo que provoca inestabilidad en este y dificulta sucomercialización. Un gel no tiene una calidadaceptable si presenta poros no uniformes comoresultado de la difusión de agua entre el gel dealto porcentaje y la atmósfera.16 Por todo loanterior se ha planteado la utilización decompuestos que restringen la difusión, los quepueden ser polioles, polisacáridos, alcoholespoliméricos, etc. Estos compuestos se adicionanen la parte del medio de electroforesis en que sequiere inmovilizar el agua, en el caso de laelectroforesis en poliacrilamida cuando estásintetizando el gel concentrador, lo que no afecta

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el proceso electroforético que se puede segusegún el método convencional. Si se desea prevela difusión de agua desde el tampón hasta el gel,necesario añadir estos compuestos al tampón.

Los compuestos de restricción de la difusióreportados por CM Starr16 son moléculas nocargadas hidrofílicas que contrarrestan el potencosmótico entre 2 geles de electroforesis codiferente potencial osmótico o entre el tampón y egel. Sin embargo como el potencial osmóticodepende de la hidrofilicidad de los compuestos de la concentración molar, la concentración de ucompuesto particular de restricción de la difusiódependerá del desbalance de potencial osmótique se desee contrarrestar; se necesita una meconcentración para un gel uniforme que la necesapara un gel discontinuo. El polietilenglicol es eagente hidrofílico de restricción de la difusión máempleado en el gel concentrador en electroforesde poliacrilamida. El proceso de difusión de agues dependiente de la temperatura, por lo que reducción de la difusión en el medio aumenttambién la estabilidad térmica de este. Lviscosidad del gel puede controlarse con la adicióde polímeros, además se le puede añadir agaroen concentración de 0,2 a 2 % p/v, dependiendo la cantidad de monómero y agente entrecruzadque contenga el gel.

2.11. Phastsystem

El equipo PhastSystem consiste en un sistemade electroforesis computarizado, en el cual spuede ejecutar focalización isoeléctricaelectroforesis y revelar estas automatizadamenLos geles de electroforesis denominados PhastGel,empleados en el equipo PhastSystem, tanto parasistema nativo como desnaturalizado emplean comtampón acetato 0,112 mol/L y tris 0,112 mol/L apH 6,4 en ambas zonas. Las longitudes de los geconcentrador y separador son de 13 y 32 mrespectivamente y su grosor de 0,45 mm.

El tampón de electrodo se suministra en formde tiras de 2 tipos, uno para electroforesis nativaotro para desnaturalizada, hechos con reactivosalta calidad y agarosa de baja electroendósmosEstas crean durante la corrida un sistema dtampón discontinuo o continuo según se dese

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En las tiras para SDS-PAGE se emplea tricina0,2 mol/L, tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 % pH 8,1,agarosa 2 %. Esta alta concentración de SDS enlas tiras permite eliminar el SDS del gel.

El PAGE-nativo en equipo PhastSystememplea los mismos geles que el desnaturalizado,solo cambia el sistema de tampón en las tiras, quees en este caso de L-alanina 0,88 mol/L y tris 0,25mol/L pH 8,8 en agarosa 2 % (acetato como ioneslíderes y L alanina como rezagados). Como el pHdel gel toma un valor de 8,8, las proteínas conpunto isoeléctrico menor que 8,3 se cargannegativamente y migran a través de la zona deconcentración.8

3. Fuentes de error en la electroforesis

La electroforesis es una técnica muy sensibley puede ser afectada por muchos erroresexperimentales, estos se reflejan a continuación.

3.1. Temperatura durante la polimerizacióny la corrida del gel

La movilidad de las proteínas varía entre otrascausas porque la viscosidad del agua aumenta abajas temperaturas (la distancia recorrida esaproximadamente 20 % mayor en la región centralque es más caliente). Este efecto puede atenuarsecon el empleo de un tampón más diluido omanteniendo temperaturas bajas durante eldesarrollo de la electroforesis.

En geles vertidos a 25 ºC ocurre mayorvariabilidad de los Rf si se comparan con losvertidos a bajas temperaturas. La eficiencia depolimerización incrementa comparativamente a0 ºC por lo que sus propiedades físicas sonsuperiores (para SDS-PAGE) a las de gelespolimerizados a 25 ºC, posiblemente por unadisminución del promedio de la longitud de lacadena de estos últimos.8

Un promedio de la desviación estándar de losRf determinados por geles hechos con la mismamezcla de polimerización es de 0,01, mientras queentre geles hechos de diferentes lotes depolimerización, aunque preparados con idénticacantidad de catalizadores es de 0,13. Esto estádado porque no es igual el porcentaje de conversiónde monómero en polímero.

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La uniformidad de la temperatura a través dgel mientras ocurre la corrida electroforéticgeneralmente elimina el efecto de la deformacide las bandas en forma de “sonrisa”.22

3.2. Velocidad de la polimerización. Nivelesde catalizador

Una polimerización muy rápida puede deformlas bandas, porque ocurre una contracción uniforme del gel, en este caso debe reducirseTEMED y el persulfato de amonio o adicionaferricianuro de potasio, con el objetivo de hacmás lenta esta.

El empleo de niveles bajos de catalizadprovoca que la superficie del gel se torne desigy tienda a romperse con facilidad, pero el emplde altas concentraciones provoca que los getiendan a cuartearse. Este problema puesolucionarse en geles de altas concentracionesponer una capa de alcohol isobutílico en lugar agua (en geles de bajas concentraciones deemplearse alcoholes de altas densidades).

3.3. Pureza de los reactivos

El empleo de reactivos de alta calidad y agdesionizada es un prerrequisito para hacer gereproducibles y de alta resolución, en particular ees muy importante para la acrilamida, ya que esconstituyente más abundante del gel y sprincipales impurezas son ácido acrílico residu(que puede retardar la movilidad electroforéticade algunas proteínas), poliacrilamida linealiones.4

O Gaal y otros10 plantearon que el ácidoacrílico y otras impurezas pueden ser eliminadpor diferentes métodos, entre ellos la recristalizacde la acrilamida.

En SDS-PAGE la calidad del SDS eimportante, porque las proteínas pueden unirsimpurezas como alkil sulfato C10, C14 y C16, yprovocar que una simple proteína forme múltiplbandas en el gel. Con SDS puro ocurre umigración anómala en proteínas muy básicas o mácidas, en varias glicoproteínas y lipoproteínas pcausa de su composición inusual.4

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3.4. Tiempo de corrida

La determinación del tiempo adecuado decorrida es muy importante, pues corridas muycortas impiden que las muestras avancen el espacionecesario para su correcta separación, perotambién se ha probado que tiempos de corridacortos minimizan la dispersión de la muestra y elensanchamiento de la banda.

3.5. Preparación de las muestras

En el caso de la SDS-PAGE es necesariolograr una completa desnaturalización de lasproteínas, para evitar la aparición de bandasfantasmas en la electroforesis (bandas dobles porla concentración de βME o por el tiempo deincubación).12

Seichi y Chait23 reportaron que la alquilaciónde la cisteína antes de la electroforesis evita laformación accidental de aductos de acrilamidadurante la electroforesis.

4.Tinción

Las proteínas coloreadas naturales como lamioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C,pueden ser observadas directamente en los geles,sin embargo la visualización de la mayoría de lasproteínas requiere el uso de colorantes.

Los colorantes orgánicos fueron los que seemplearon primero para teñir proteínas en los geles(ejemplo de estos bromofenol azul, azul deCoomassie, etc.).

Una rápida tinción, destinción y fijación sonesenciales en el caso de las proteínas pequeñaspara evitar su elusión; la omisión del metanol de lasolución de tinción es beneficiosa ya que se reduceel tiempo de tinción y disminuye el hinchamientode los geles.12

Existen diferentes tipos de tinción, entre ellosla plata que es muy sensible y tiene la característicade producir generalmente coloraciones carmelitao negro, sin embargo algunas proteínas tienencolores característicos como las lipoproteínas quetienden a colorearse de azul y algunas glicoproteínasque aparecen amarillas, carmelitas o rojas.24 Esteefecto cromático se ha demostrado que está dadopor la difracción de la luz en la plata. Se han

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desarrollado algunos procedimientos de tinción cplata para identificar ciertas proteínas, conempleo de combinaciones de tinción.

La tinción con Coomassie puede empleapara la determinación de proteínas cuando eson abundantes, pero no para la determinaciópureza de proteínas trazas. Esta tinción requun medio ácido para la generación de la atraccelectrostática entre las moléculas del colorantlos grupos amino de las proteínas. La atracciónica es a través de las fuerzas de Van Der Waque une a las proteínas y al colorante formandocomplejo. Esta unión es totalmente reversiblecondiciones apropiadas.

Se ha reportado la tinción de proteínas por otmétodos entre los que se encuentran: eriocronegro, compuestos fluorogénicos, modificaciónlos aminoácidos de las proteínas.8

5. Conservación de los geles de electrofore

Notsu K y Shiratori M25 reportaron sumergirel gel después de electroforesis en una soluciósacáridos, azúcares, alcoholes de más dcarbonos y polímeros solubles en agua; despse introduce este entre 2 filmes de celoftransparentes y semipermeables colocado en fode sandwich a ambos lados del gel o en uno y el otro una lámina plástica. De esta forma lcomponentes acuosos del gel son reemplazapor los de la solución. Esto permite que el gelseque, sin causar su ruptura, deformación, pérdde la transparencia y sin necesidad de empcalor o presión reducida ni ningún aparato especNo se han reportado variaciones en geles tratacon este método después de 2 años.

Se recomienda el empleo de un poliol comoglicerol como un agente «húmedo» cuya funces además de actuar como un agente de restricde la difusión, impedir que el gel se seque poevaporación durante la conservación, lo que ela ruptura de este.

AGRADECIMIENTOS

A Gretter Armas García por su colaboracióen la realización de este trabajo.

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SUMMARY

Electrophoresis makes possible to separate biological moleculesdepending mainly upon their charge under the influence of anelectric field. A general and updated outlook on electrophoresisin polyacrylamide gels for proteins is given. Some traditionalconcepts about this methods such as the addition of compoundslimiting diffusion and that increase the gel stability are analyzed.Examples are given about the abnormal behavior of some proteinsin the determination of the molecular weight by electrophoresisin polyacrylamide gels under disnatured conditions.

Keywords: electrophoresis, polyacrylamide, gels.

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Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrero del 2001.

Dra. Hilda Marilín García Pérez. Laboratorios BETERÁ. Calle102 e/ 31 y 31-B. Marianao. Ciudad de La Habana.Correoelectrónico: beterá@infomed.sld.cu