Reporte espectrofotometría y electroforesis

Objetivo

El objetivo fundamental de la practica es la comprobación de la migraciónelectroforética de los aminoácidos sometidos a un campo eléctrico en función de sucarga y PI asi como Adquirir los conocimientos básicos sobre espectrofotometría de absorción visible, conociendo la Ley de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Química. Para ello se realizará un experimento en el laboratorio que muestre cómo utilizar un espectrofotómetro para llevar a cabo la determinación cuantitativa de un compuesto de sulfato de cobre

intro

Por electroforesis se entiende el método basado en el movimiento de iones omoléculas cargadas por acción de un campo eléctrico. En la Bioquímica y BiologíaMolecular sirve para la separación e identificación de biomoléculas. La electroforesis seaplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen gruposionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que lacarga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren.Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología

Una partícula cargada en un campo eléctrico intenso esta sometida a dos fuerzasimportantes, la fuerza eléctrica proporcional a la carga y al campo eléctrico, y unafuerza hidrodinámica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante laley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este análisis otra fuerza debida a laagitación térmica llamada fuerza browniana y que causa la difusión de las partículas.

La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter lapartícula al campo eléctrico, ésta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que lasdos fuerzas queden iguales, la partícula ha alcanzado la velocidad límite.

De esta última, se deduce que la mobilidad electroforética es proporcionala la carga de la molécula, pero es inversamente proporcional a su tamaño (a) y a laviscosidad de la soluciónEntre los distintos métodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar:

La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel,acetato de celulosa, almidón, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altoscampos eléctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentesdesnaturalizantes.

Emigración Origen Origen Ánodo CátodoPredicción del comportamiento electroforético de los aminoácidosEn resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en uncampo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su cargaeléctrica, 2) su tamaño, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio.Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo; si tiene carga negativa,hacia el ánodo.

Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al pH de 6,1 al que se realiza laelectroforesis, los aminoácidos neutros se quedarán en el origen, los aminoácidos ácidosemigrarán al ánodo y los aminoácidos básicos emigrarán al cátodo.

Espectrofotometría ultravioleta visible. Ley de Lambert-Beer.

Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación electromagnética que es absorbida o emitida por una sustancia. En función de ello se clasifican fundamentalmente en:

Métodos de absorción: Se basan en la disminución de la potencia de un haz de radiación electromagnética al interaccionar con una sustancia.

Métodos de emisión: Se basan en la radiación que emite una sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo de energía (térmica, eléctrica…).

Métodos de fluorescencia: Se basan en la radiación que emite la sustancia cuando es excitada previamente por un haz de radiación electromagnética.

Otras clasificaciones de los métodos espectroscópicos se establecen en función de la región del espectro electromagnético que interviene en la técnica. Así, pueden utilizarse regiones como rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc.

Dado que los primeros métodos espectroscópicos desarrollados corresponden a la región del visible recibieron la denominación de métodos ópticos, la cual se utiliza todavía con frecuencia. A continuación, se ofrece una breve información sobre la ley de Lambert-Beer y la espectrofotometría de absorción en la región visible del espectro.

Si se considera que se dispone de una fuente de radiación que hace llegar a la muestra un haz de radiación, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P0, la muestra de

espesor b absorbe una parte de esa radiación incidente, de forma que la potencia del haz disminuye después de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. El cociente entre la potencia de la radiación que sale de la muestra y la de la que incidió sobre ella, se define como transmitancia:T=P/P0.

La transmitancia también puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100. Es más frecuente utilizar el concepto de absorbancia, o densidad óptica, que se define como el logaritmo de la transmitancia cambiado de signo:

A = log (P0/P) = - log T

De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiación, P y P0 coinciden, por lo

tanto A=0, y se transmite toda la radiación T=1 (100% de transmitancia). Si, en otro caso, se transmite solo un 1% de radiación (T=0.01), P=P0/100, la absorción de radiación que ha tenido

lugar corresponde a A=2.

Al incidir radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecerá de color negro y en el segundo

de color blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, éste absorberá ciertas longitudes de onda y reflejará otras, siendo éstas últimas las responsables del color. Se dice que este color (observado) es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta práctica las medidas van a realizarse con espectrofotometría visible, es conveniente conocer para qué longitud de onda tiene cada color su máxima absorción, lo que se muestra en la tabla siguiente: Colores de la luz visible

Longitud de onda de máxima absorción(nm)

Color absorbido Color observado

380-420 Violeta Amarillo-verde

420-440 Azul-violeta Amarillo

440-470 Azul Anaranjado

470-500 Verde-azul Rojo

500-520 Verde Púrpura

520-575 Amarillo-verde Violeta

Complicación de la ninhidrina

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con

fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido.

Esta prueba es positiva tanto para proteínas como para aminoácidos. en aquellos casos donde no da positiva la prueba de biuret y da positiva la de ninhidrina, indica que no hay proteínas, pero si hay aminoácidos libres

Es una de las reacciones mas sensibles para identificar aminoacidos en general, ya que detecta una parte de aminoacido en 1 500 000 partes de agua. Aminoacidos y muchas aminas primarias dan un color violeta caracteristico. La prolina da coloracion amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoracion cuantitativa de amonoacidos por colorimetria. La valoracion de aminoacidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatias, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presente hiperaminoacidemia, estas se ven acompañadas por aminoaciduria paralela. Algunas enfermedades metabolicas congenitas dan lugar a la eliminacion anormal de algunos aminoacidos en la orina (p ej fenilcetonuria).

Biblio

Armstrong, F Bioquímica. Editorial Reverte, S.A. Barcelona España. 1982