EXCLUSIN MOLECULAR - ELECTROFORESIS

fredy quispe jacoboLima, 29 de noviembre del 2013 UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA, FUNDADA EN 1551)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

EXCLUSIN MOLECULARCromatografa de permeacin en gelCromatografa de exclusin de tamao

Tcnica analtica de separacin de molculas sobre la base de su tamao y forma

TeoraLas molculas grandes son excluidas desde los poros y se mueven a travs de la columna de manera ms rpidaLas pequeas molculas son atrapadas pudiendo difundirse dentro de los poros y eluir lentamente

Perfil de elucinVe = Volumen de elucin. Depende de la proporcin de la matriz porosa disponible para el analito a separar.

Parameters de la ColumnaVs= volumen de solvente mantenido en los porosVt-Vo= volumen de soporteVo = Volumen vacoVt = Volumen total

Clculo del Volumen de elucin (Ve)Para una molcula que puede ingresar a los poros:

Ve = Vo + Kav (Vt-Vo)

Kav = Proporcin de poros disponibles a la molcula Totalmente Excluido Kav = 0 and Ve = Vo Totalmente Incluido Kav = 1 and Ve = Vt

Comportamiento de una molcula sobre una columna

Kav = Ve Vo Vt - Vo

ResolucinLa resolucin del analito es proporcional a la raz cuadrada de la longitud de la columna. Afectada por la velocidad de la fase mvil en la columna

Chart2

0.50.5

0.50.5

0.50.75

0.51.25

0.51.5

0.752

1.251.5

1.51.25

20.75

1.50.5

1.250.5

0.750.5

0.50.5

Fraction number

Amount

Resolution

Sheet1

10.5

20.5

30.75

41.25

51.5

62

71.5

81.25

90.75

100.5

0.110.75

121.25

131.5

142

151.5

161.25

170.75

180.5

190.75

201.25

211.5

222

231.5

241.25

250.75

260.5

10.50.5

20.50.5

30.50.75

40.51.25

50.51.5

60.752

71.251.5

81.51.25

920.75

101.50.5

111.250.5

120.750.5

130.50.5

Sheet1

Fraction number

Amount

Idealised Elution Profile

Sheet2

Fraction number

Amount

Resolution

Sheet3

Separacin en la columnaTamao de la ColumnaSolventeInerte al soporteMatriz/soporteConsideracion importanteDiferentes tiposMaterialTamao de poro

Tipos de matriz/soporteMaterialSephacryldextranSephadexdextranSepheroseagaroseSuperdexmixture

SephacrylProteina (kD)Dextranos(kD)S-1001-100NSS-2005-2501-80S-30010-15002-400S-40020-800010-2000S-500NS40-20,000

Aplicacin: Determinacin de la masa molecularCalibra la columna con estndares conocidosPlotear Kav against log Masa molar

Chart1

0.8

0.68

0.5

0.32

0.2

Lg Mol Wt

Kav

Calibration curve

Sheet1

10.5

20.5

30.75

41.25

51.5

62

71.5

81.25

90.75

100.5

0.110.75

121.25

131.5

142

151.5

161.25

170.75

180.5

190.75

201.25

211.5

222

231.5

241.25

250.75

260.5

10.50.5

20.50.5

30.50.75

40.51.25

50.51.5

60.752

71.251.5

81.51.25

920.75

101.50.5

111.250.5

120.750.5

130.50.5

40.8

4.50.68

50.5

5.50.32

60.2

Sheet1

Fraction number

Amount

Idealised Elution Profile

Sheet2

Fraction number

Amount

Resolution

Sheet3

Lg Mol Wt

Kav

Calibration curve

ELECTROFORESISTcnica que permite la separacin de molculas en medio acuoso por efecto de un campo elctrico aplicado.Cada molcula se desplaza por efecto del campo elctrico, alcanzando rpidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesto por el medio en el que se desplaza.

Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccinq x E = f x v

q= carga (C), E= intensidad del campo (V x m), f= coeficiente de friccin (C x V/s), v= velocidad de la molcula (m/s)

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada molcula, esencialmente la forma y tamao. As, por ejemplo, las molculas grandes y asimtricas poseen un mayor coeficiente de friccin que las pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica, u

v/ E= u= q/f =Ze/f(Z=nmero entero, e= carga del electrn)

A. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance, o frontera con el disolvente.B. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio soporte de ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que se aplica la tcnica con el nico objetivo de separar los componentes de la muestra.C. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso

TIPOS DE ELECTROFORESIS

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la magnitud de la carga. Otros medios (geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y el factor forma y tamao adquiere una alta relevancia en la separacin.

SOPORTE PARA ELECTROFORESIS

Papel: sencillo, pero elevada adsorcin de los grupos hidroxilo de la celulosa

Acetato de celulosa: Grupos OH acetilados, baja adsorcin, baja tincin de fondo, posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar.

Almidn: Pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: Polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60 C) y al enfriar solidifica formando un gel de alta porosidad.

Poliacrilamida: Gel resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bis acrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia

Poliacrilamida con SDS: El dodecil sulfato de sodio (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el TAMAO DE LA PROTENA ES DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A SU LONGITUD EN AMINOCIDOS y su CARGA QUEDA ENMASCARADA POR LA MAYOR CARGA DEL SDS QUE LA RECUBRE, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamente de su MASA MOLECULAR.

HORIZONTALEn papel, para aminocidos u otras molculas pequeas, y en soportes similares especialmente, acetato de celulosa para protenas.En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente cidos nucleicos. Casi siempre el tampn cubre el gel (para evitar que se seque por el calentamiento al paso de la corriente), denominndose electroforesis submarina. El soporte impregnado de disolucin tampn por capilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contacto elctrico Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador especfico) como una gota SOBRE el soporte (papel, acetato de celulosa) o DENTRO de un pocillo creado en el gel.

DISPOSICIN DEL SOPORTE PARA ELECTROFORESIS

VERTICAL

Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao. El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre 2 placas rectangulares, contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o compartimientos del nodo y ctodo. La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua cuando existen 2 tramos del gel de composicin ligeramente diferente.

EJEMPLOS DE SEPARACIN ELECTROFORTICA

SEPARACIN DE PROTENAS POR SDS-PAGE discontinua verticalSDS-PAGE= SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electrophoresis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio.Gel de poliacrilamida, en placa, verticalSeparacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente de acuerdo con la longitud de la cadena polipeptdica).La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la composicin del gel) y se calienta brevemente a 90 100 C, para provocar la desnaturalizacin. Se suele aadir tambin -mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando as las subunidades de la protena y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.

En la preparacin se mezclan:

Un tampn de pH (comnmente Tris-HCl)Acrilamida y bisacrilamidaAgente iniciador de la polimerizacin, como el persulfato amnico (genera radicales libres)Un agente catalizador de la polimerizacin, como el TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina)SDS

Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin de mxima movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador tracking dye, molcula cargada y de tamao pequeo que avanza ms que cualquier componente de la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol.Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se emplea electroforesis discontinua:En la parte superior, un gel acumulador, concentrador o espaciador - apilador (stacking gel) que tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene lugar la separacin de los componentes.El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador, combinada con una diferente composicin de tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH para ambos geles.Tris= Tris(hidroximetil)aminometano, sustancia habitual para preparer disoluciones tampon de pH prximo a 7.

Separacin de DNA en geles de agarosaEs una modalidad de electroforesis horizontal submarina. Las molculas de DNA de las clulas son excesivamente grandes para avanzar a travs de un gel de electroforesis normal, pero pueden analizarse si previamente se han fragmentado de forma controlada. Se suelen emplear geles de agarosa de concentracin entre 0,3 y 2%, ms porosos que los de poliacrilamida. Las caractersticas mecnicas de estos geles hacen aconsejable la realizacin de la electroforesis en horizontal, habitualmente submarina. Las muestras se aplican en pocillos practicados dentro del gel.

La carga elctrica de una molcula de DNA depende sus grupos fosfato y el nmero de estos es igual al doble del nmero de pares de bases. La forma de todas las molculas de DNA es esencialmente la misma, en consecuencia resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud de la molcula (medida habitualmente como un nmero de pares de bases, pb): la electroforesis separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de protenas en SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los pocillos para hacer la curva de calibrado de tamaos.

TCNICAS ESPECIALESIsolectroenfoqueConocido tambin como enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing. Tcnica que se presenta como una variante de electroforesis donde el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran medios de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico del analito evaluado, y como consecuencia este detiene su avance. De este modo se alcanza un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo al punto isoelctrico, que adems se puede caracterizar porque se conoce el gradiente de pH del gel (soporte).

Electroforesis bidimensionalPara lograr separaciones de mezclas complejas, la electroforesis se realiza de 2 direcciones. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se sita como muestra en una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, caractersticos de cada muestra que luego se comparan con muestras similares.

Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kpb no se pueden resolver (separar) empleando electroforesis convencional en gel de agarosa. Que se debe a la dificultad de manejo de los geles preparados a bajas concentraciones de agarosa, inferiores al 0,4%, la conformacin ms o menos globular que adoptan las molculas del DNA, y el tamao relativamente grande para atravesar los poros del gel que imposibilitan su separacin. Para solucionar el problema se propone una modificacin de la tcnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis, PFGE).

Se emplean geles de agarosa al 1% donde se altera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue que las molculas se desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin extendida. Las molculas de mayor tamao, se reorientan con ms dificultad, por lo que su avance relativamente ser lento

RESUMEN DE TCNICAS INSTRUMENTALESSegn interaccin de la radiacin electromagntica con la materia:

Espectroscopia de emisin atmica: LlamaEspectroscopia de absorcin atmicaEspectroscopia de fluorescencia Espectroscopia infrarrojaEspectrofotometra UV-VisDispersin de luz: turbidimetraEspectroscopia fotoacsticaEspectroscopia de RMNMicroscopia electrnica Emisin, absorcin, fluorescencia y difraccin de rayos X

2. Mtodos electroqumicos:

PotenciometraConductimetraVoltametra

3. Mtodos de separacin:

Cromatografa lquidaCromatografa en gel e intercambioCromatografa de exclusin molecularCromatografa planarCromatografa de gasesEspectrometra de masasElectroforesis

4. Mtodos trmicos:

Anlisis trmico diferencialTermogravimetraCalorimetra de barrido diferencial

5. Mtodos radioqumicos:

Anlisis por dilucin isotpicaRadioinmunoanlisis

GRACIAS POR SU ATENCIN