Electroforesis de proteínasElectroforesis de proteínas

Claudio Jara CarrilloClaudio Jara Carrillo

BI-3BI-3

19 octubre 201019 octubre 2010

Introducción:Introducción:

• ElectroforesisElectroforesis::

- - Transporte de moléculas cargadasTransporte de moléculas cargadas

- Dirigido por campo eléctrico aplicado - Dirigido por campo eléctrico aplicado desde el exteriordesde el exterior

• La separación depende de:La separación depende de:• MoléculaMolécula

– CargaCarga– TamañoTamaño– FormaForma

• SoporteSoporte– NaturalezaNaturaleza– PorosidadPorosidad

• Condiciones externasCondiciones externas– pH (uso de tampones)pH (uso de tampones)– Uso de detergentesUso de detergentes– Tiempo de corridaTiempo de corrida– Potencial administrado, etc.Potencial administrado, etc.

Introducción:Introducción:

PAGEPAGE• PoliacrilamidaPoliacrilamida::

– Acrilamida (CH2=CHCO-NH2)Acrilamida (CH2=CHCO-NH2)– Entrecruzador de N,N’-metilendisacrilamidaEntrecruzador de N,N’-metilendisacrilamida

(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2)(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2)

Determinan porosidad del soporteDeterminan porosidad del soporte

PoliacrilamidaPoliacrilamida

• Características:Características:– Químicamente inerteQuímicamente inerte– Gel transparenteGel transparente– Insoluble en aguaInsoluble en agua– Rango pequeño de separaciónRango pequeño de separación– NEUROTÓXICO (acrilamida)NEUROTÓXICO (acrilamida)

Tipos de PAGE

• En condiciones nativas– CN-PAGE– BN-PAGE– Isoelectroenfoque

• En condiciones denaturantes– SDS-PAGE

En condiciones nativasEn condiciones nativas

• No utiliza detergentesNo utiliza detergentes

• Las proteínas no se denaturanLas proteínas no se denaturan

• Se conservan complejosSe conservan complejos

• Migran por:Migran por:– Carga intrínseca (carga total)Carga intrínseca (carga total)– TamañoTamaño– FormaForma

En condiciones nativasEn condiciones nativas

• CN-PAGECN-PAGE::– Separación proteínas solubles y de membranaSeparación proteínas solubles y de membrana– Gel de acrilamida en gradienteGel de acrilamida en gradiente– Usado para ver interacciones entre proteínasUsado para ver interacciones entre proteínas– No sirve para determinar correctamente el peso No sirve para determinar correctamente el peso

molecular de la proteínamolecular de la proteína

En condiciones nativas

• BN-PAGEBN-PAGE::– Utiliza Azul de Coomasie en el buffer catódicoUtiliza Azul de Coomasie en el buffer catódico– A. de C. otorga carga a la moléculaA. de C. otorga carga a la molécula– Migración por peso molecularMigración por peso molecular– No denatura los complejos(en la mayoría de No denatura los complejos(en la mayoría de

los casos)los casos)– Desventaja: Complejos con enlaces débiles.Desventaja: Complejos con enlaces débiles.

• IsoelectroenfoqueIsoelectroenfoque::

- Se utiliza el pI de cada proteína- Se utiliza el pI de cada proteína

- Gradiente de pH (a=a; c=k)- Gradiente de pH (a=a; c=k)

- Al llegar una proteína a su pI, - Al llegar una proteína a su pI,

deja de migrardeja de migrar

En condiciones nativas

En condiciones denaturantesEn condiciones denaturantes

• SDS-PAGESDS-PAGE::– Se utiliza un detergente aniónico (SDS)Se utiliza un detergente aniónico (SDS)– SDS denatura los complejos y carga SDS denatura los complejos y carga

totalmente a las proteínastotalmente a las proteínas– B-mercaptoetanol rompe enlaces S-SB-mercaptoetanol rompe enlaces S-S– Proteínas migran por tamaño molecularProteínas migran por tamaño molecular– Se utiliza en la determinación de peso Se utiliza en la determinación de peso

molecularmolecular