Clonación Electroforesis Pcr
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TCNICAS DE MANIPULACIN
GENTICA
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1. La clonacin molecular
2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento de ADN forneo.
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Obtencin de genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
-
1. Introduccin: la clonacin molecular
- Amplificacin de molculas de ADN por clonacin clular
-Amplificacin de molculas de ADN por clonacin acelular (PCR)
- Manipulacin gentica y clonacin de organismos pluricelulares (animales y plantas)
La clonacin consiste en la obtencin de un clon, entendido como un conjunto de elementos genticamente iguales entre si e iguales a su precursor.
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1. Introduccin: la clonacin molecular
... Dios mo, me han clonado... !!
-
1. Introduccin: la clonacin molecular
Estrategia general del proceso de clonacin
1. Aislamiento del ADN forneo
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-DNA forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
-
1. Introduccin: la clonacin molecular
Estrategia general del proceso de clonacin
Extraer el gen de inters
insulina
-
. Stanley Cohen , Boyer, Berg (Universidad de Stanford)
Plsmidos bacterianos
Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans 1979
Enzimas restriccin
Aislamiento y digestin del ADN
Insercin en molculas vectores
con capacidad autnoma de replicacin en la clula hospedadora
1. Introduccin: la clonacin molecular
-
Tipo I y Tipo III
Actividad restriccin y modificacin
Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina
Reconocen una secuencia especfica
Recorren un cierto nmero de bases y cortan
Cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)
Tipo II
Rompen por la secuencia de reconocimiento
Precisan Mg 2+, pero no ATP
Cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palndromes.
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas
Enzimas de restriccin -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el esqueleto azcar-fosfato (enlace fosfoester).
-
2. Las enzimas de restriccin
Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas
Ejemplos de endonucleasa
GA A T T C
C T T A AG
5
5
3
3
C C G G
G G C C
extremos romos
extremos cohesivos
-
EcoR 1 de E.coli
G A A T T C
C T T A A G
Secuencias Palindrmicas
A A G C T T Hind III de
T T C G A A Haemophilus influenza
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas
Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
-
EcoR 1 de E.coli
G A A T T C
C T T A A G
Secuencias Palindrmicas
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas
Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
Extremos cohesivos
-
EcoR 1 de E.coli G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
C T T A A
G
G
Extremos pegajosos
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas
-
EcoRI actuando sobre una
secuencia de ADN
2. Las enzimas de restriccin
-
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas
Extremos cohesivos
Extremos romos
-
3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN
Enzimas de restriccin
Vector ADN
-
Estrategia general del proceso de clonacin
1. Introduccin: la clonacin molecular
1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-ADN forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin
Vector de clonacin
-
Estrategia general del proceso de clonacin
1. Introduccin: la clonacin molecular
1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-ADN forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
-
Formacin de ADN recombinante: unin ADN forneo-vector
3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN
-
Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
-
Vectores de clonacin
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
Son vehculos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN forneo y replicarlo.
Caractersticas principales
Se replican de forma autnoma (origen de replicacin)
Contienen regiones no esenciales para su multiplicacin y estabilidad
-
Tipos de vectores: Plsmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son ms
eficaces con insertos ms pequeos (
-
Tipos de vectores de clonacin
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
Plsmidos
Virus
Csmidos (laboratorio)
YACs (levaduras)
-
Plsmidos
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
pBR322
-Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto N de sitios de restriccin -Bajo PM (4 363 bp) (transformacin con plsmidos 10000bp es poco eficiente
ADN Plasmdico
ADN
ADN Plasmdico
-
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV
Para mamferos: SV40
Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad
que poseen para introducir el ADN forneo en la
clula hospedadora
-
Virus
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cpsida puede hacerse in vitro. La cpsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). -Se introduce en la bacteria hospedadora por transduccin
Fago l
-
Adsorcin de partculas virales a una bacteria
-
SIDA
-
Tipos de vectores de clonacin
Plsmidos
Virus
Csmidos (laboratorio) Mezcla plsmido y virus
YACs (levaduras), contienes sitios caractersticos de la funcionalidad de los cromosomas
V
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
-
Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
-
Estrategia general del proceso de clonacin
1. Introduccin: la clonacin molecular
1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-ADN forneo en
la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
-
Estrategia general del proceso de clonacin
1. Introduccin: la clonacin molecular
1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-ADN forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
-
5. Mtodos de seleccin
MTODOS DE SELECCIN
Resistencia a antibiticos
Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
-
5. Mtodos de seleccin
Resistencia a antibiticos La resistencia la confieren genes que porta el vector,
en este caso a ampicilina y a tetraciclina
Plsmido pBR322
El ADN
forneo se
inserta en el
gen de
resistencia a
Ampicilina
-
Sin plsmido
Sin inserto
5. Mtodos de seleccin
Resistencia a antibiticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector
Con ampicilina
y tetraciclina
Con plsmido
Sin inserto
Con plsmido
Con inserto
Con
tetraciclina
-
5. Mtodos de seleccin
MTODOS DE SELECCIN
Resistencia a antibiticos
Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
-
5. Mtodos de seleccin
Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa)
5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactsido Br-Cl-indol + galactosa
(X-gal) (Azul)
Inactivacin insercional
(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)
Insercin gnica positiva
(Unir el gen marcador al DNA foraneo)
Amp
Gal
Ori
pUC19
-
5. Mtodos de seleccin
Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
Plasmido pUC19
Amp
Gal
Ori
Plasmido pUC19
Amp
Gal + inserto
Ori
-
5. Mtodos de seleccin
b-galactosidasa b-galactosidasa
+ ADN forneo
pUC19 = plsmido
X
-
5. Mtodos de seleccin
GFP (green fluorescent protein)
-
5. Mtodos de seleccin
510 488 Tubulina GFP-TUB
530 515 Retculo endoplsmico
YFP-ER
510 488 Peroxisomas GFP-PEROXI
530 515 Ncleo YFP-NUC
475 420 Mitocondria CFP-MITO
600 550 Mitocondria RFP-MITO
510 488 Membrana M-GFP
510 488 Endosomas GFP-ENDO
475 420 Ap. De Golgi CFP-GOLGI
510 488 Actina GFP-ACTIN
Emisin (nm)
Excitacin (nm)
Localizacin Vector
GFP (green fluorescent protein)
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Estrategia general del proceso de clonacin
1. Introduccin: la clonacin molecular
1. Aislamiento del ADN forneo y del ADN vector
2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vector-ADN forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin de los transformantes
5. Estabilidad de la informacin gentica
-
Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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Genotecas
Genoteca: coleccin de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genmicas Parciales ADNc. Coleccin de ARNm Tipos de vectores: Plsmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genmicas pequeas y de ADNc) Csmidos, BAC (genotecas genmicas complejas)
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6. Obtencin de genotecas
Utilizando un virus
Utilizando un plsmido
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5. Mtodos de seleccin
Hibridacin de colonias
Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridacin in situ con sondas marcadas Obtencin de la sonda marcada:
marcaje radioactivo: (32P) marcaje desoxinucletidos fluorescentes
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Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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7. Electroforesis en geles de agarosa
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TCNICAS ELECTROFORTICAS
Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en un campo elctrico.
En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migracin de las molculas es el campo electrico, pero el gel acta como filtro molecular, relentizando la migracin su migracin en funcin de su tamao
Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)
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7. Electroforesis en geles de agarosa
-
ELECTROFORESIS. SOPORTES
CH2CH
O
CNHCH2NH
O
CCH2 CH
NH2
O
C
CH2 CH
Acrilamida N,N`-Metilenbisacrilamida
- Geles de acrilamida (protenas, geles de secuenciacin de ADN)
- Geles de agarosa (los ms usuales para ADN)
Gelificacin
qumica
Gelificacin
trmica
-
ELECTROFORESIS DE ADN
Disolver la agarosa a la concentracin deseada en una solucin
salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento
Dejar enfriar hasta unos 50C y aadir Bromuro de Etidio
N+
C2H5
Bromuro de Etidio
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7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa es el polmero usado para la separacin.
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7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa se mezcla con un tampn.
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7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa se disuelve en el microondas.
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7. Electroforesis en geles de agarosa
Se preparan la cubeta y el peine.
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7. Electroforesis en geles de agarosa
Se aade el polmero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificacin.
-
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin TAE
Se procede a cargar los pocillos con las muestras
Se procede a conectar a una fuente de electroforesis
7. Electroforesis en geles de agarosa
-
7. Electroforesis en geles de agarosa
Formados los pocillos, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.
-
7. Electroforesis en geles de agarosa
Cada muestra forma una banda azul que correr en la agarosa dependiendo de su tamao.
-
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin TAE
7. Electroforesis en geles de agarosa
-
7. Electroforesis en geles de agarosa
El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes.
Se coloca el gel en un
transiluminador de luz UV
Se visualizan las bandas de ADN
teidas con el bromuro de etidio.
-
La movilidad electrofortica del ADN en los geles de agarosa es
inversa a su tamao
2.02.01.61.6
1Kb1Kb AA
3.03.0
BB
1.01.0
0.50.5
BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis2.02.01.61.6
1Kb1Kb AA
3.03.0
BB
1.01.0
0.50.5
BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis
7. Electroforesis en geles de agarosa
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Indice
1. Introduccin: la clonacin molecular
2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo
5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
-
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary Mullis. Premio Nobel de Qumica en 1993
Descrubri la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp.
Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an
afternoon
-
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.
PCR
amplificacin
DNA
(molcula sencilla)
Muchas moleculas
del mismo ADN
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.
DNA
(doble hlice)
Controlando la temperatura
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Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G -T
Primers cortos de DNA especficos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
5 3
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
-
Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T 5 3
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
A C G T A
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Despus del primer periodo de sntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensin de la cadena
Cadena original de DNA
Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Primero, la desnaturalizacin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Primero, desnaturalizacin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa
Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
2
1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Desnaturalizacin 95C
Hibridizacin 50-60C
Extensin de La cadena
75C
Primer Ciclo
2do Ciclo 95C
50 - 60C 75C
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial de copias
-
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polimerasa)
Hey, Boo Boo pescamos lasTap para amplificar los
sandwiches?
Ok Yogy
Parque Nacional de Yellowstone
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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
-
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pelo humano
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TCNICAS DE MANIPULACIN
GENTICA
-
GRACIAS!!!!!!!!!!!