CUANTIFICACIN DE ADN DEALTO PESO MOLECULARCATEDRA : BIOLOGA MOLECULARDOCENTE: M.Sc. ELMER REN CHAVEZ ARAUJO

MTODOSPara la cuantificacin del ADN, existen dos mtodos indirectos que permiten estimar la concentracin del ADN en las muestrasPor visualizaciny mediante espectrofotmetro.

Estimacin de la concentracin de ADN por visualizacin.El mtodo indirecto ms recomendable para la determinacin de la concentracin de ADN en una muestra es mediante la visualizacin de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas.

PROCEDIMIENTOEl procedimiento requiere la preparacin de una cmara de electroforesis (se recomienda la cmara mediana para 22 o 40 muestras), colocando cada una de las muestras que se desea evaluar en pozos individuales y dejando al menos 10 pozos libres.

ELECTROFORESISPosteriormente se inicia la electroforesis con 6 v/cm y diez minutos antes de que concluya la corrida, se detiene la fuente de poder, se destapa la cmara de electroforesis, sembrando las muestras de concentraciones conocidas.

FASE FINALFinalmente se cierra la cmara de electroforesis, se enciende nuevamente la fuente de poder, dejando que corra durante 10 minutos, se visualiza el producto con U.V. y se toma una fotografa.En este mtodo la estimacin se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algn programa computacional que contraste intensidades de color.

EspectrofotometraLa Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos.

La absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325-420 nm) y en el visible (420-900 nm).

A. Esquema de un espectrofotmetro de un solo hazB. Esquema de un espectrofotmetro de doble haz.

Estimacin mediante espectrofotmetro.En este mtodo se utiliza un espectrofotmetro que mida la absorvancia a 260 nm y 280 nm. En un equipo automatizado se sigue el siguiente protocolo.Encienda el espectrofotmetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.

Muestras con suficiente pureza

Mide cantidad de irradiacin UV absorbida por las bases

Preparacin del blanco.Agregue 10 ml de TE-RNasa (o la solucin que utiliz para resuspender el ADN de la muestra problema) y 990 m l de Agua dd, en una celda, asegurndose de la perfecta homogeneizacin.Coloque la celda en la posicin 1 del espectrofotmetro.

Preparacin de las muestras.Agregue 10 m l de la muestra problema y 990 m l de Agua .dd, en otra celda, asegurndose de la perfecta homogeneizacin.

Lectura. Para la lectura solo se tiene que responder con el teclado del equipo las preguntas que aparecen en pantalla. El equipo permite evaluar la concentracin de protenas (limpieza de la muestra), presencia de ARN y concentracin de oligos (ADN degradado).Es importante aclarar que la relacin A260/A280nm no es lineal, por lo que puede llevar a lecturas errneas, recomendndose solo como mtodo complementario de evaluacin.

Lectura a 260 nmMide concentracin ADN muestra50 ug/ml--------------1 O.DConc.ADN (ug /ml) = valor O.D x factor dilucin x 50

Lectura a 280 nm:Mide contaminacin (pureza muestra)Tasa absorbancia: 260/280Ej. 1.8- 2.0 (ADN puro)< 1.8 o > 1.8 (muestra contaminada, Ej: protenas, ARN)