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Instructor: James K. Otero: jotero.cimatec@gmail.com Nombre: Preguntas de Pre-Laboratorio l,Que es electroforesis? Fecha __ --_

Introducci6n La electroforesis es una herramienta comun en la biotecnologfa utilizada para analizar y separar macromoleculas como el ADN, ARN Y protefnas por medio de un campo electrico aplicado a una gelatina de agar. Durante el proceso la muestra de la macromolecula se carga en la gelatina hecha a base de polisacaridos en conjunto can un tinte para visualizar las moleculas, se aplica una corriente electrica y las moleculas se separan en base a su tamano y carga . Debido a esto, la tecnica nos permite separar por tamano una muestra mixta de moleculas, determinar el tamano molecular y purificar muestras de macromoleculas. EI equipo utilizado para electroforesis es simple. Esta compuesto de una camara can polos opuestos, una fuente de energfa (power supply) y soluci6n amortiguadora para conducir la electricidad y mantener el pH estable.

Terminos de Trasfondo Electroforesis de gelatina Macromolecula

ADN Protefna Masa Agar

Experimento Materiales para cad a persona 1 Jabonera 1 Cable de "stainless steel" (entre 18" y 24" de ancho) 1 Pinzas para cortar metal 5 baterfas de 9V 2 "alligator clips" Un pedazo de "styrofoam" (parecido al utilizado para empacar la carne) con dimensiones aproximadas de 4"x3" 1 Tijera 1 Balanza de cocina 1 Probeta0 0

cucharas de medida

instrumento de medici6n de volumen en mL

1 Microondas 1 Envase para hacer mezclas 2 g Baking Soda (Aprox. Y2 cucharadita) 200 mL de agua destilada 1 g Agar-Agar0

Agarosa (Aprox. % cucharadita)

3 Colores de tintes para cocinar 1 Gotero0

pipeta0

1 regia en em

mm

Construccion de la camara de electroforesis: 1. Corta dos pedazos de un poco mas largos que la jabonera del cable de "stainless steel" cobre con las pinzas.0

2.

Dobla ambos alambres en forma de gancho para ser puestos en el borde de la jabonera y el

ancho de la misma. Uno de los alambres debe de estar colocado en la parte superior de la jabonera (electrodo negativo) y el otro en la parte inferior (electrodo positivo). Ver Figura 1. EI alambre que vaya en el extremo superior de la jabonera debe ir un poco mas elevado que el de la parte inferior.

3.

Conecta las 5 baterfas de 9-voltios en serie conectando el polo positivo con el negativo hasta

conectar las 5 baterfas. Debe de quedar Iibre un polo positivo y uno negativo. Ver Figura 2.

4.

Cuando esten Iistos para comenzar el experimento, conecta el clip tipo cocodrilo a cada

terminal expuesto en el set de baterfas. Luego conecta el lade opuesto del clip a los electrodos de la jabonera. (Recuerda no conectar el circuito completamente hasta el momenta exacto de comenzar el experimento)

a. La peinilla debe de ser cortada mas ancha en la parte superior de for a que pueda ponerse sobre105

bordes de la jabonera. Los dientes de la misma deben de ser cortados

de igual forma y con al menos 2mm de separaci6n entre dientes. Ver Figura 4.

Experimento de Separaci6n de Tintes Una vez completada la camara de electroforesis, se preparan las soluciones y la gelatina. 1. EI primer paso consiste en hacer las soluciones a ser utilizadas para la gelatina y correr las muestras. La soluci6n amortiguadora debe de ser de 1% de baking soda. Para hacer la misma, combine 2 gramos de baking soda con 200m 1 de agua destilada y mezcle completamente. (De no tener balanza, 2g de baking soda es

aproximadamente ;Iz cucharadita.)

2. Para hacer la gelatina de 1% de Agar, mezcle 1 gramo de Agar con 100ml de la soluci6n de bakingc

soda

(paso ~). De no tener

balanza,

19 de Agar

es

aproximadamente % cucharadita.

a. Caliente la soluci6n de Agar en el microondas en incrementos de 15-20 segundos y mezcle hasta que la misma comience a hacer burbujas. La soluci6n debe de quedar de forma transpare?

,ie./, ./

/

3. RemuE?va105 alambres de la jabonera ..' "t'

.. f] ~

, 4. Insefte la peinilla de "styrofoam" perpendicularmente en la parte superior de la jabonera a , 0.5 cm del borde. Luego, poco a poco vierta la soluci6n de Agar en la jabonera. Anada.. ;:;;.....:.-.-, .

suficiente soluci6n hasta que 105 dientes esten sumergidos aproximadamente 0.5 cm. Ver Figura 5. (Si la gelatina es muy gruesa sera diffcil observar separaci6n de 105 tintes.)

Figura 5. Montaje para preparar gelatina.

4

6. Atiada 1ooml de soluci6n amortiguadora sobre la gelatina solidificada hasta que la cubra completamente.

8. Remueva la gelatina de la jabonera y corte los bordes para dejar espacio para los electrodos. Vuelva a poner los mismos en la jabonera.

Separaci6n

de

105

tintes

Una vez esten preparadas las soluciones y la camara de electroforesis podemos proceder a separar las muestras. 1. Utilizando un gotero por la peinilla.0

pipeta, anada una gota pequena del tinte en los pozos formados

2. Utilizando los clips de cocodrilo, conecte el set de baterias en los electrodos de la jabonera. EI electrodo positivo debe de conectarse al terminar positivo de la bateria. EI electrodo positivo debe de estar opuesto a los pozos formados por la peinilla. Una vez conectado ambos terminales de las baterias a los electrodos se deben de comenzar a formar burbujas. Esto es indicativo que la corriente esta pasando a traves de la soluci6n amortiguadora. Ver figura a continuaci6n.

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3. Verifique el progreso del movimiento de los tintes en la gelatina cada 10-15 minutos. Corra la gelatina hasta que yea buena separaci6n de los tintes y migraci6n.

4. Compare cada muestra de tinte. ("Cuantas bandas observa para cada color? ("Cual migro la mayor distancia? Utilizando una regia en cm/mm mida la distancia recorrida por cada banda. Luego haga una tabla para anotar sus observaciones como la que se presenta a continuaci6n.

Color del tinte

Numero de bandas

Migraei6n de eada banda (em)

Preguntas de diseusi6n 1. ("C6mo el proceso de electroforesis separa moleculas?

7.

RETO: Unos investigadores realizaron electroforesis para separar una mezcla de mohculas.0

En el ultimo carril, ~que molecula es mas grande, A

B? Explica.

Figura 7: Representacion de una Electroforesis