Colesterol Practica

8/17/2019 Colesterol Practica

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PROCEDIMIENTOS BIOQUÍMICOS Y

FISIOLÓGICOS EN LAS ALTERACIONES DE LA

SALUD

CUADERNO DE PRÁCTICAS

CURSO ACADÉMICO 2006-2007

Alumno/a____________________________________________


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Practicas de Procedimientos Bioquímicos yFisiológicos en las alteraciones de la salud

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INTRODUCCIÓN

Un laborato rio clíni co es el lugar en el que se efectúan trabajos

experimentales y se realizan análisis y exámenes bioquímicos, serológicos,

histológicos citológicos, bacteriológicos...

En la actualidad, la mayoría de los diagnósticos pueden verse completados,

confirmados o sujetos a revisión gracias a las técnicas de laboratorio y, por ello,buena parte de la responsabilidad del mantenimiento de la salud recae sobre

ellos. En definitiva, las técnicas analíticas cumplen básicamente tres objetivos:

• Aportan información para que el médico diagnostique adecuadamente

• Permiten seguir la evolución de una enfermedad durante el tratamiento

• Pueden ser utilizadas como medida preventiva para conocer el estado de

salud de los individuos y detectar precozmente alguna alteración.

Cuatro son las condiciones de un buen profesional de laboratorio:

• Ciencia: es imprescindible una compresión adecuada

• Paciencia: meticulosidad y capacidad crítica

• Conciencia: de la responsabilidad del trabajo realizado

• Instrumentación: conocimiento básico de los aparatos e instrumentos

utilizados.

OBJETIVO

El objetivo de estas prácticas es familiarizar al alumno con las distintas técnicas

experimentales empleadas en el laboratorio de análisis clínicos, trasladando al

mismo los conocimientos adquiridos durante la docencia teórica.


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INSTRUCCIONES GENERALES

Material necesario

Cada alumno deberá venir provisto del siguiente material:

§ Bata de laboratorio

§ Cuaderno§ Rotulador de vidrio (si es posible)

§ Bolígrafo, papel milimetrado, regla y calculadora

Laboratorio

Sigue cuidadosamente las normas de seguridad. Trata el material con cuidado

y rotula adecuadamente todos los tubos y cualquier otro recipiente que utilices.

Limpieza

Al finalizar la práctica, todo el material de cada grupo, así como el material deuso general deberá quedar perfectamente limpio y sin rótulos, el últimoenjuague debe realizarse con agua destilada.

Asistencia

Es obligatorio asistir a todas las sesiones prácticas

Evaluación

Se evaluará de forma continuada en el laboratorio durante el desarrollo de las

sesiones prácticas tanto las aptitudes como las actitudes mostradas por elalumno.

Tras la finalización del periodo de prácticas se entregará, de forma voluntaria,un cuaderno en el que se incluirán: las respuestas a las cuestiones planteadas,

los cálculos realizados así como los resultados obtenidos en cadadeterminación, un comentario personal con la descripción de las técnicasempleadas, el material utilizado, las normas de manipulación de la muestra, los

posibles problemas acaecidos, etc. Si los resultados obtenidos fueran erróneos,el alumno deberá indicar las posibles causas que han originado el error así

como la forma de subsanarlas.


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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Es necesario, antes de comenzar cualquier prueba, saber la finalidad y

procedimiento experimental exacto con el objeto de tener preparado todo el

material y los reactivos necesarios. Aquellos materiales o reactivos que se

utilicen con más frecuencia se tendrán guardados en lugares fácilmente

accesibles. Es esencial la limpieza, tanto durante el trabajo como al final del

mismo.

En todo laboratorio existen riesgos potenciales que requieren una atención

especial. Como normas generales para prevenir los accidentes se pueden

considerar las siguientes:

1. Debe utilizarse bata mientras se permanece en el laboratorio

2. No se debe comer o beber dentro del laboratorio, ni utilizar recipientes para

beber o conservar alimentos

3. Antes de utilizar los reactivos, leer los rótulos

4. No dejar destapados los envases

5. Guardar las medidas de asepsia cuando ello sea necesario. En el

laboratorio clínico se debe trabajar con guantes en todo momento.

6. Mantener limpio el lugar de trabajo y lavar el material utilizado al finalizar el

análisis

7. No fumar

8. No succionar con la boca una pipeta. Utilizar peras de goma.

9. No abandonar una prueba que no está acabada, a no ser que se

especifique claramente que se puede hacer

10. El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes


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PRÁCTICA 1

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO.MÉTODO GOD-POD

Con esta práctica se pretende determinar la concentración de glucosa en unamuestra de suero, utilizando un kit comercial basado en el método GOD-POD.

La glucosa es el glúcido principal del cuerpo y todos los otros glúcidos seconvierten en glucosa después de su digestión y absorción.

Los niveles de glucosa en sangre se mantienen entre unos límites muyestrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la acción de dos

hormonas: insulina y glucagon. En general, dichos valores nunca debensobrepasar los 200 mg/dl, por grande que sea la ingestión de hidratos de

carbono, ni descender por debajo de 50 mg/dl en condiciones fisiológicas.

Interpretación de los datos de laboratorio

-Hiperglucemia: entre las alteraciones que cursan con hiperglucemia podemoscitar:

- Diabetes mellitus: síndrome caracterizado por un aumento en losniveles fisiológicos de la glucosa y que cursa de manera característica con

polifagia, poliuria y polidipsia. Durante las clases teóricas se explicará

detalladamente las pruebas de laboratorio que llevan a su diagnóstico.

- Disminución de la tolerancia a la glucosa: glucemia basal inferiora 140 mg/dl y, a las dos horas de sobrecarga oral de glucosa, valores

intermedios entre los fisiológicos y los típicos de la diabetes.

-Hipoglucemia: hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa ensangre se sitúan entre 40 y 45 mg/dl. La hipoglucemia puede presentarse en

ayunas, o bien ser reactiva a la ingestión de alimentos o a la toma demedicamentos

CUESTIONES

1. ¿Cuál es la finalidad del blanco? ¿Cómo se ajusta el espectrofotómetro con

el blanco? ¿Ha realizado un blanco de reactivos o de suero? por qué?2. Calcule la concentración de glucosa en el suero indicando los cálculosrealizados.

3. Si la concentración de glucosa hubiera sido superior a 500 mg/dL. ¿Cómohabría actuado?

4. Para la determinación ha utilizado un método enzimático. ¿Se trata de unmétodo cinético? Justifique su respuesta


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PRÁCTICA 2

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL

El objetivo de esta práctica es realizar la determinación del colesterol totalpresente en una muestra de suero, siguiendo para ello las instrucciones de unkit comercial.

El colesterol es un alcohol esteroide insaturado muy soluble en grasas peropoco hidrosoluble. El colesterol presente en el organismo tiene un doble origen:

§ El que procede de la dieta -exógeno- se encuentra en su mayor parte en

forma libre –no esterificado-. El colesterol esterificado es hidrolizado por lacolesterol esterasa pancreática dando colesterol libre y ácidos grasos.

§

El colesterol endógeno –aunque puede ser potencialmente sintetizado portodas las células- se forma fundamentalmente a nivel hepático e intestinal y

es eliminado por el hígado –con la bilis- o utilizado para la síntesis de ácidosbiliares.

El colesterol circula en sangre unido a las lipoproteínas:

§ Las LDL transportan el 70% del colesterol § Las HDL del 15 al 20% § El resto, circula unido a las VLDL y a los quiliomicrones.

El aumento de la concentración plasmática de colesterol, se asocia a unincremento del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, por lo que suregulación tiene un alto interés epidemiológico.


Niveles elevados de colesterol en sangre se van a encontrar en casos de:

1. Dietas ricas en colesterol y grasas saturadas; estas últimas pueden elevar

hasta en un 15-20% la cifra de colesterol sanguíneo.2. Hipotiroidismo, como consecuencia de la disminución del metabolismo

lipídico3. Diabetes mellitus: debido al incremento notable del metabolismo lipídico4. En enfermedades de retención renal: en estos casos se eleva tanto el

colesterol sanguíneo como los triglicéridos y los fosfolípidos. Se cree que esdebido a la inhibición de la lipoprotein lipasa, de manera que se elevan

considerablemente las grasas sanguíneas.5. En casos de ictericia obstructiva

Niveles bajos de colesterol en sangre suelen ser indicativos de hepatitis grave ycirrosis.


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CUESTIONES

1. Si tuviera que preparar un blanco de suero ¿cómo lo haría? Razone su

respuesta.2. ¿Por qué se incuban los tubos durante 5 min. a 37ºC o 10 min. a Tª

ambiente? ¿Por qué varía el tiempo en función de la temperatura?3. Si la muestra tuviera un valor de 700 mg/dl ¿podría aplicar el método

directamente?

4. Determine el valor de colesterol en la muestra problema, especificandolos valores experimentales de D.O. obtenido y el cálculo realizado.

5. Si el paciente cuyo suero ha analizado tuviera una concentración detriglicéridos de 200 mg/dl y un nivel de colesterol HDL de 60 mg/dl ¿Cuálsería su concentración de colesterol LDL?


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PRACTICA 3

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

PLASMÁTICAS

En esta práctica se realizará la cuantificación de las proteínas presentes en unamuestra de suero.

Las proteínas presentes en el plasma forman parte de un sistemametabólicamente "dinámico" con características y funciones muy diversas.

La suma de las concentraciones de todas y cada una de las proteínas

presentes en el plasma, se conoce como proteínas totales y en condiciones

normales oscila entre 66 y 83 g/L.

Fundamento

Existen diferentes métodos para determinar la concentración de proteínas deuna muestra. El método de Bradford se basa en el cambio de color que seproduce cuando el Azul Brillante de Coomasie se une a las proteínas

MATERIAL

-Reactivo de Bradford-Albúmina sérica bovina (BSA) (1 mg/ml).

-Muestras: Como es un método espectrofotométrico (Ley de Lambert-Beer), lasmuestras deben estar convenientemente diluidas para que sus absorbancias se

encuentren dentro de los valores de la recta de calibración. Así, la muestra

problema inicial (S1 ), se diluirá a la mitad 1/2 para obtener otra a la que

denominaremos S2.

PROCEDIMIENTO

1. Prepare 8 tubos, 6 para la recta patrón (B, 1 2, 3, 4 y 5) y 2 para cada una de

las muestras problema que haremos directamente en el tubo de análisis (S1,S2) según el protocolo esquematizado en la tabla siguiente:

Tras añadir estos reactivos habrá exactamente 0.1 mI en cada tubo de análisis.


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2. Añada 5 mI de reactivo Bradford a cada uno de los tubos. Agite sin que seforme espuma

3. Incube la mezcla durante 5 minutos.

4. Mida la absorbancia a 595 nm. Primero se mide el tubo blanco (B) que sirvepara ajustar el espectrofotómetro (autocero) y a continuación, el resto de los

tubos.

Con los 6 primeros valores obtenidos (tubos B, 1 2, 3, 4, 5) podremos construir,en un papel milimetrado, la recta patrón apareando los valores de absorbancia(eje Y) con los de concentración de glucosa (eje X). Esta recta representa larelación que existe entre absorbancia y la concentración de proteínas, y portanto nos permitirá calcular la concentración de proteínas de las muestrasproblemas leyendo en dicha recta los valores de absorbancia obtenidos paracada muestra problema (si entran dentro del intervalo de concentracionescomprendido por la recta patrón). Así se calcula la concentración de proteínapara cada uno de los tubos de análisis.

La concentración de proteínas en cada uno de los tubos de la recta patrón secalcula a partir de la concentración de la solución de albúmina (1 mg/ml)mediante la fórmula C·V = C’·V´ donde C = concentración de albúminaestándar (1 mg/ml); V = volumen de albúmina estándar añadido a cada tubo; C'= concentración de albúmina en ese tubo; V´ = volumen total en el tubo (0,1 mlen todos los tubos). El ajuste de la recta a los puntos se puede hacergráficamente o por mínimos cuadrados (opcional).

En el primer tubo problema (S1) la muestra no está diludida (dilución 1 :1 ) porlo que la concentración de proteínas será la calculada directamente por

interpolación en la recta patrón sin necesidad de multiplicar por ningún factorde dilución (el factor sería 1 ). En el segundo tubo problema (S2) la muestraestá diluida dos veces (1/2; factor de dilución 2) por lo que la concentración deproteínas en el suero original será 2 veces mayor, así multiplicamos elresultado de concentración obtenido por 2.

Para calcular la concentración de proteínas en el suero original (sin diluir),como hemos realizado dos medidas a diferentes diluciones, una veznormalizadas (es decir, multiplicadas por 1 o por 2, según el caso) podremoscalcular la media aritmética entre ellas, y esta será el resultado del análisis (sílos resultados obtenidos entre ambas diluciones son coherentes ).


El aumento en la cifra de proteínas plasmáticas totales, suele deberse a unadisminución relativa del volumen de líquido plasmático debido a hipovolemia oa una deshidratación (en realidad lo que varía no es la cantidad total deproteínas sino la proporción entre éstas y el nivel hídrico del organismo).


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La disminución en la cantidad de proteínas totales, puede tener causas tan

variadas como:

El aumento del volumen plasmático, como consecuencia de una retención de

líquidos.

La disminución en la síntesis de albúmina debido a alteración hepática odesnutrición graves .

El descenso en la producción (hipogammaglobulinemia) o aumento de las

pérdidas (quemaduras intensas, síndrome nefrótico) de la fracción de las

globulinas.

CUESTIONES

1. ¿Qué es y para que sirve una recta patrón? Calcule la concentración de

albúmina de los distintos puntos de la recta patrón.2. ¿Qué interferencias está eliminando el blanco utilizado? Razone larespuesta.

3. Dibuje la recta de calibración enfrentando los valores de absorbancia (eje Y)

obtenidos para cada concentración de albúmina (eje X). Calcule la ecuaciónde la recta por el método de los mínimos cuadrados (opcional).

4. Calcule la concentración de proteínas de S2.5. Calcule la concentración de la muestra S1 utilizando el resultado de la

concentración de proteínas obtenida para S2 y el valor obtenido en el tubo

S1.6. Si suponemos que el suero del enfermo se diluyó 200 veces (1/200) para

obtener S1 ¿Cuál será la concentración de proteínas del suero delenfermo?


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PRACTICA 4

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

El objetivo de esta práctica es separar mediante electroforesis las proteínasdel plasma sanguíneo identificando tras tinción las distintas fraccionesobtenidas.

Fundamento

Las proteínas poseen carga eléctrica en función de sus gruposionizables y del pH y, por tanto, son capaces de migrar al ser sometidas a un

campo eléctrico (Electroforesis). Normalmente se utiliza un tampón a pH > 8.0. A estos valores de pH, la mayoría de las proteínas están cargadas

negativamente, por lo que se desplazan hacia el polo positivo (ánodo). La

velocidad de desplazamiento de cada proteína estará determinada por su cargay su tamaño (relación carga/masa). La electroforesis de las proteínas

plasmáticas nos permite separar 5 fracciones con cargas negativasdecrecientes, que son: Albúmina (la más negativa); α1-globulinas; α2-globuli-

nas; ß-globulinas; (fibrinógeno en el caso de utilizar plasma), y γ -globulinas (las

menos negativas).

Material

- Cubeta de electroforesis

-

Alimentador para electroforesis- Aplicador semi-micro- Tiras de acetato de celulosa

- Tampón veronal sódico 0,04 M: Dietilbarbiturato sódico 8,24 g/l (preparadocomercial, pH >9)

- Colorante: Negro amido, 0,5 g; Metanol, 45 ml; Ac. acético 10 ml; Aguadestilada 45 ml

- Decolorante: Metanol 47,5 ml; Ac. Acético 5 ml; Agua destilada 47,5 ml

- Plasma o suero sanguíneo humano

Procedimiento experimental

- Sumerja previamente las tiras de acetato de celulosa en el tampón durante15 min. como mínimo, y absorber el exceso de tampón de las tiras entre doshojas de papel de filtro.

- Monte las tiras sobre el puente de la cubeta de electrofo resis, previamentellena de tampón, con la cara absorbente hacia arriba.

- Con el aplicador, tome el plasma sanguíneo problema y póngalo sobre latira a un centímetro del borde del cátodo (polo negativo) de color negro. Alos valores de pH determinados por el tampón, las proteínas plasmáticasmuestran carga negativa, por lo que migrarán hacia el ánodo (polo positivo)


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PRACTICA 5

ANÁLISIS DE ORINA MEDIANTE EL EMPLEO DE TIRAS

REACTIVAS

La finalidad de esta práctica es realizar el análisis de anormales en una

muestra de orina.

La tira reactiva diagnóstica de inmersión es una tira de plástico a la que se fijauna o más almohadillas de celulosa que está químicamente impregnada detampón y varios indicadores químicos. Cuando se humedece en orina, cada

almohadilla se convierte en un medio químico en miniatura que responde a lapresencia de compuestos químicos específicos presentes en la muestra.

Para obtener resultados semicuantitativos, es importante observar los tiemposque se especifican para la realización de cada lectura.

Las zonas reactivas, una vez impregnadas de orina se comparan con las

escalas colorimétricas del envase.

Se debe considerar la tira reactiva como un dispositivo de selección primariaque junto con el examen visual, permite separar las muestras anormales de lasnormales. Las anomalías deben dilucidarse usando pruebas de seguimiento yconfirmación.

Las tiras reactivas disponibles en el mercado tienen tests para: glucosa,

bilirrubina, cuerpos cetónicos, densidad, sangre, pH, proteínas, urobilinógeno,nitritos y leucocitos.

Composición de las almohadillas

Glucosa: 16,3% p/p glucosa oxidasa (1,3UI); 0,6% p/p peroxidasa (3300UI); 7% p/p Yoduropotásico; 60,7% p/p tampón; 15,4% p/p ingredientes no reactivos. Bilirrubina: 0,4% p/p sal de diazonio de 2,4-dicloroanilina; 37,3% p/p tampón; 62,3% p/p

ingredientes no reactivos. Cetonas: 7,1% p/p nitroprusiato sódico; 92,9% p/p tampón.

Densidad: 2,8% p/p azul bromotimol; 97,2% p/p. Poli(metil vinil éter ácidomaleico sal sódica).Sangre: 6,8% p/p diisopropilbenceno dihidroperóxido; 4% p/p 3,3´,5,5´tetrametilbencidina; 48%p/p tampón; 41,2% p/p ingredientes no reactivos.

pH: 0,2% p/p rojo metilo; 2,8% p/p azul de bromotimol; 97% p/p ingredientes noreactivos.

Proteínas: 0,3% p/p azul de tetrabromofenol; 97,3% p/p tampón; 2,4% p/p.Ingredientes no reactivos.Urobilinógeno: 0,2% p/p p-dietilaminobenzaldehido; 99,8% p/p ingredientes no

reactivos.Nitritos: 1,4% p/p p-ácido arsanílico; 1,3% p/p 1,2,3,4-tetrahidrobenzoquinolin-

3-ol; 10,8% p/p tampón; 86,5% p/p ingredientes no reactivos.Leucocitos: 0,4% p/p éster de pirrol aminoacídico derivatizado; 0,2% p/p sal de diazonio; 40,9%p/p tampón; 58,5% p/p ingredientes no reactivos.


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Recogida y preparación de muestras

No deben utilizarse conservantes de orina porque pueden interferir en losresultados de las cetonas, bilirrubina o urobilinógeno. El crecimiento bacterianotambién puede afectar a los resultados de glucosa, pH y sangre. Manejar

siempre las muestras bajo condiciones sanitarias estrictas.

Técnica

Las instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente para obtener resultados

fiables. 1. Utilizar orina fresca recogida en un recipiente limpio y seco 2. Sacar una sola tira del frasco y utilizarla inmediatamente. Sumergir

brevemente la tira en la muestra y sacarla con rapidez 3. Escurrir el exceso de orina con el borde del frasco. Mantenerla en

posición horizontal 4. Si estamos leyendo visualmente comparar los colores con la carta de

colores del frasco –mantener la tira cerca de la tabla de colores yescoger cuidadosamente-. La mayor precisión se obtendrá ajustándola alos tiempos de lectura correctos. Algunos colores toman mayorintensidad con el tiempo y después decrecen, por lo cual colores queaparezcan transcurridos 2 minutos carecen de significado. Si el color deuna zona reactiva no es uniforme debemos fijarnos en la zona más

oscura. Todas las zonas, excepto los leucocitos, se pueden leer entre 1

y 2 minutos como “screening” de positivo o negativo. Leer los test deleucocitos a los 2 minutos.

5. Si se lee instrumentalmente, seguir las instrucciones de manejo delaparato.

6. Como todos los tests de laboratorio, el diagnóstico definitivo o ladecisión terapéutica no debe basarse en un solo resultado o test.

Instrucciones de almacenaje y cuidado

Almacenar las tiras en su propio frasco. No extraer el desecante. No sacar latira hasta el momento de su uso. No tocar las áreas reactivas de la tira.

Almacenar a temperaturas inferiores a 30ºC, pero no en refrigerador. Noalmacenar bajo luz directa.

Información sobre las áreas reactivas

Glucosa. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Este test es específico de glucosa; no hay otrasustancia que se conozca presente en orina que dé resultados positivos. En orinas diluidas ocon glucosa en pequeña cantidad, concentraciones de ácido ascórbico superiores a 2,2 mmol/l

pueden dar falsos positivos. Sensibilidad del test: 4-7 mmol/l.

Bilirrubina. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Normalmente la bilirrubina no es detectable en

orina incluso por los métodos más sensibles. Incluso resultados traza de bilirrubina sonsuficientes para iniciar una investigación. Colores atípicos (no comparables al bloque positivo onegativo) indican que se deben continuar la investigaciones en esta muestra. Metabolitos de


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drogas que dan color a pH bajo pueden causar falsos positivos. Sensibilidad del test: 7-14

µmol/l.

Cetonas. Tiempo de lectura visual: 40 seg. El test reacciona con el ácido acetoacético en orina.

No reacciona con acetona ni con ácido betahidroxibutírico. Ciertas orinas de pH bajo y/odensidad alta pueden dar falsos positivos. Las muestras de orina no patológicas suelen darnegativo con este reactivo. Niveles detectables de acetona puden aparecer en caso de dieta,

embarazo o ejercicio extremo frecuente. En cetoacidosis o ayuno prolongado junto con otrasalteraciones del metabolismo lipídico o de carbohidratos, las cetonas pueden aparecer engrandes cantidades en la orina antes de que se manifiesten en el suero. Sensibilidad del test:0,5-1 mmol/l.

Densidad. Tiempo de lectura visual: 45 seg. Este test permite la determinación de densidades

entre 1-1,03. No se afecta por constituyentes no iónicos como la glucosa o colorantes. Orinasalcalinas altamente tamponadas pueden causar lecturas relativamente bajas en comparacióncon otros métodos. Pueden salir resultados falsamente altos en presencia de concentraciones

moderadas de proteínas (1-7,5 g).

Sangre. Tiempo de lectura visual: 60 seg. La interpretación del resultado “trazas” puede variar

ampliamente entre distintos pacientes y se requiere valorar cada paciente individualmente. Eldesarrollo de unos puntos verdes (eritrocitos intactos) o de color verde difuminado(hemoglobina/mioglobina libre) en el área reactiva de la tira indican la necesidad de una

investigación más profunda. La sangre se suele encontrar en los periodos menstruales de lamujer. Este test es muy sensible a la hemoglobina libre y algo menos a los eritrocitos intactos yasí se complementa con la investigación microscópica. La sensibilidad de este test puededisminuir algo en las orinas de alta densidad. Este test es igualmente sensible a hemoglobina

como a mioglobina. Alta densidad o proteinuria pueden disminuir la sensibilidad del test. Falsospositivos pueden aparecer por ciertos contaminantes oxidantes o por la peroxidasa microbiana

asociada a una infección. Sensibilidad del test: 150-620 µg/l (equivale aproximadamente a 5-20

células intactas por microlitro).

pH. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El área de pH mide de una en una unidad en el rango de

5 a 8,5 en lectura visual y de 5 a 9 en lectura instrumental. Si no sigue el procedimientocorrecto y permanece un exceso de orina en la tira, se puede producir un fenómeno conocidocomo “runover”, en el cual el tampón del reactivo de proteína contamina la prueba de pH dando

un resultado anormalmente bajo.

Proteínas. Tiempo de lectura visual: 60 seg. (o inmediatamente, o hasta 2 minutos después de

la inmersión de la tira). El área reactiva de la tira es más sensible a las albúminas que a lasglobulinas, hemoglobinas, proteínas de Vence-Jones y mucoproteínas. Un resultado negativono puede descartar por lo tanto la presencia de estas últimas. Generalmente no se suele

detectar proteínas por este método en orina a pesar de que normalmente se excreta unapequeña cantidad. Cualquier color por encima de trazas es indicador de proteinuria. Para

orinas de alta densidad suele aparecer el resultado de trazas en orinas normales. Se precisauna evaluación clínica para valorar el resultado de trazas. Se pueden encontrar falsos positivosen orinas alcalinas o altamente tamponadas y por contaminación con compuestos cuaternariosamoniacales y detergentes. Sensibilidad del test: 0,15-0,30 g/l.

Urobilinógeno. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El área reactiva puede detectar

concentraciones tan bajas como 3 µmol/l (aproximadamente 0,2 unidades Ehrlich). El rango

normal es de 3-16µmol/l. Un resultado de 33µmol/l significa el tránsito entre normal y anormal,y el paciente o la orina deben ser examinados con más cuidado. El área reactiva puede tenerinterferencias con sustancias que interfieran con la reacción de Ehrlich. Reacciones de color

atípicas se pueden presentar en caso de presencia de ácido p-aminobenzoico o formalinas.Sustancias altamente coloreadas como riboflavinas pueden enmascarar el desarrollo del color.Con este test no se puede determinar la ausencia de urobilinógeno.


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Nitritos. Tiempo de lectura visual: 60 seg. Este test depende de la conversión de los nitratos en

nitritos a través de las bacterias presentes en la orina, generalmente Gram negativas. Este testes específico para nitritos y no reacciona con otras sustancias presentes en la orina. Puntos obordes rosados no deben confundirse con un resultado positivo. Cualquier desarrollo de color

rosa suave uniforme debe interpretarse como un resultado positivo e indicador de al menos 10microrganismos/ml, pero el desarrollo del color no es proporcional al número demicroorganismos presentes. Un resultado negativo no puede probar la ausencia de

microorganismos. Pueden aparecer falsos negativos debido a la presencia de microorganismosque no contengan la reductasa para el paso de nitratos a nitritos o cuando la orina no hapasado tiempo suficiente en la vejiga (4 horas o más) para el proceso de reducción o cuando

no haya habido ingesta de nitratos en la dieta. La sensibilidad está reducida en las orinas de

alta densidad. Sensibilidad del test: 13-22 µmol/l.

Leucocitos. Tiempo de lectura visual: 2 min. Las muestras de orina normales deberían dar engeneral resultados negativos. Resultados positivos tienen significado clínico. Los resultados detraza deben ser interpretados cuidadosamente aunque, si son repetitivos, se deben considerar

positivos. Falsos positivos pueden deberse a descargas vaginales o a drogas. Concentraciones

de glucosa elevadas (160mmol/l), alta densidad o la tetraciclina pueden disminuir lasensibilidad. Cualquier sustancia que de color a la orina puede enmascarar la interpretación del

test. Sensibilidad del test: 5-15 células/c.a.p.

Cuestiones

1. ¿Qué es el análisis de anormales?

2. Describa el procedimiento utilizado para su realización. ¿Ha tenido algunaprecaución con la posición de la tira?

3. ¿Por qué deben mantenerse las tiras dentro del frasco evitando al máximomantenerlo abierto?

4. Describa el resultado obtenido en su muestra de orina. ¿Se trata de un

análisis cuantitativo? Justifique su respuesta


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PRÁCTICA 6

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEL ENZIMA

FOSFATASA ALCALINA EN SUERO La actividad enzimática puede determinarse mediante métodos cinéticos ométodos a punto final. Con esta práctica se pretende determinar de laactividad de la enzima fosfatasa alcalina, utilizando para ello un kit comercial

basado en un método cinético.

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la descomposición de los ésteres de

fosfato con poca especicidad para un substrato determinado.

Existen dos tipos de fosfatasas: la fosfatasa alcalina, que tienen un pH deactividad óptima de 9 y la fosfatasa ácida, que tienen un pH de actividadóptima de 5. Pueden separarse, alterando el pH al cual se realiza la prueba,

siendo los métodos de determinación en esencia similares para ambas.


La determinación de fosfatasa alcalina se utiliza principalmente para eldiagnóstico de las ictericias obstructivas post-hepáticas. Cuando la obstrucciónes completa los valores aumentan de 3 a 8 veces sobre los valores normalesen suero. Se ha observado que, cuando la enfermedad está producida por un

carcinoma pancreático, los niveles de fosfatasa son más elevados que enprocesos benignos. Igualmente, se encuentran aumentados en casos de

hepatitis vírica, ictericia hepatocelular tóxica, ictericia hepatocanalicular, etc.Se producen elevaciones de esta enzima en procesos hepáticos no ictéricos,

como en la enfermedad hepatobiliar, carcinoma hepático y abcesos hepáticos.Otras enfermedades con aumento de los niveles de fosfatasa alcalina son lasenfermedades óseas, caracterizadas por un aumento de la actividad

osteoblástica, como la enfermedad de Paget, raquitismo, fracturas, tumoresóseos, hiperparatiroidismo... Cifras fisiológicamente elevadas pueden

producirse en mujeres embarazadas y en niños en crecimiento.La determinación de fosfatasa ácida se utiliza para el diagnóstico de los

pacientes con carcinoma prostático, observándose niveles elevados.

CUESTIONES

1. En la derminación de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina se hautilizado un método cinético. Comente sus ventajas

2. ¿Ha preparado algún tubo blanco? ¿Por qué?3. Dibuje una gráfica en la que enfrente la D.O. obtenida en cada minuto?

Calcule el ∆E/min medio.

4. Determine la actividad enzimática explicando el significado del factor 3300

empleado en el cálculo.

5. Si la actividad obtenida fuera demasiado alta ¿Cómo afectaría a la forma dela gráfica? ¿Cómo actuaría para obtener un resultado fiable?


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PRÁCTICA 7

TINCIÓN DIFERENCIAL DE EXTENSIONES HEMATOLÓGICAS

El objetivo de esta práctica es la realización de una extensión y tinción

sanguínea, así como la posterior identificación al microscopio cada una de lascélulas observadas.

Los métodos que se pueden seguir utilizar para hacer un análisis de lamorfología de las células de la sangre son varios. Se puede hacer un examen

en fresco sin coloración, una coloración vital u observar las células fijadas yteñidas.

El examen de la sangre teñida es lo más habitual. Para ello se hace unaextensión de sangre en un porta, se fija y se tiñe observando por último al

microscopio. La extensión de sangre también se denomina frotis.Principalmente se utiliza para hacer recuento de los distintos tipos de

leucocitos.

Puede obtenerse mucha información del estudio de una extensión de sangre.Nos puede servir tanto para realizar un diagnóstico como para seguir el cursode una enfermedad o indicarnos los efectos nocivos de algún tratamiento.

Para que los resultados sean fiables es fundamental que la extensión esté bienhecha.

Preparación de la extens ión

Son varios los métodos a seguir:

a) Método del cubreobjetos

§ Tomar un cubre y depositar en su centro una gota pequeña de sangre§ Colocarlo con la gota de sangre mirando hacia abajo§ Aproximar desde abajo otro cubre de manera que las esquinas de los

mismos queden alternadas. La sangre entonces se extiende entre los doscubres de forma rápida y uniforme.

§ Una vez extendida la sangre se separan los dos cubreobjetos mediantedeslizamiento de uno sobre otro. El movimiento ha de ser firme y rápido, nolevantándolos ni apretando uno sobre otro.

§ Colocarlos sobre papel de filtro y dejar secar al aire. La parte donde no estála sangre será la que esté en contacto con el papel.

b) Método del portaobjetos

Es el método más utilizado en la práctica, ya que es mucho más cómodo de

realizar.


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Se utilizan dos portas, en uno de ellos se pone la gota de sangre y con el otro

se realiza la extensión.

Los pasos a seguir son:

§ Colocar una gota de sangre pequeña aproximadamente a 1 cm del borde

del portaobjetos. Este puede estar sujeto con la mano izquierda por elextremo opuesto a donde está la gota, o bien puede estar colocado sobre

una mesa. Es preferible lo segundo, ya que así tiene un lugar de apoyo.§ Coger con la mano derecha (con los dedos índice y pulgar) el otro

portaobjetos y apoyarlo sobre el que tiene la gota de sangre por delante de

ella. El ángulo que forman ambos portaobjetos ha de ser de 30º a 40º.§ Hacer retroceder el portaobjetos hacia el extremo donde no estaba la gota

de manera rápida y uniforme hasta que la sangre quede totalmente

extendida.

Observaciones

En una extensión de sangre realizada correctamente se observará una parte

más gruesa en donde estaba la gota de sangre, después una uniforme y al finaluna zona de menor espesor deshilachada. Cada una de esas partescorresponde a lo que se denomina cabeza, cuerpo y cola de la extensión.

La extensión de sangre no ha de llegar a los bordes del portaobjetos ni tener

estrías o vacuolas.

El espesor de la extensión depende del ángulo entre los dos portaobjetos,

tamaño de la gota, rapidez y presión con que se realiza la extensión. A mayorrapidez se consigue un mayor espesor. A mayor ángulo también el espesor es

mayor.

Si el espesor es muy grueso las células aparecen sobrepuestas, con lo que los

leucocitos no se identifican con facilidad. Si es demasiado fino las células estánmuy separadas y hay que recorrer muchos campos para hacer el recuento.


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Una buena preparación para contar leucocitos es aquella en la que los glóbulosrojos aparecen algo amontonados, ya que así los leucocitos se encuentran

también más juntos (pero no superpuestos) y su recuento se hace más rápido.

A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuentaque la distribución de las células no es uniforme. Las células grandes(monocitos y neutrófilos) se sitúan en los bordes, mientras que las células

pequeñas (linfocitos) se sitúan en el centro de la extensión. Por esta razón nose cuenta sólo en el centro o en los bordes, sino que se siguen unas

trayectorias a modo de grecas.

CUESTIONES 1. ¿Cuál es la finalidad del fijador? 2. Comente los colorantes utilizados

3. Haga un dibujo de las células observadas.


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Basófil

CCéélluullaass ssaanngguuíínneeaass

Plaquetas,Monocit

Neutrófil

Eosinófil

Neutrófilos: 3.500-7.000/mm , 60-70%Eosinófilos: 150-400/ mm3, 2-4%Basófilos: 50-100/ mm3,


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APENDICE

1. PREPARACIÓN DE DILUCIONES

En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o losreactivos para obtener concentraciones adecuadas a las técnicas. La perfecta

preparación de estas diluciones es imprescindible para la obtención de unosresultados correctos.

La dilución realizada se expresa generalmente como una unidad de la solucióninicial por unidades de la solución final. Por ejemplo, una dilución al 1/10

requiere que una unidad de la solución inicial sea o haya sido diluida hasta unvolumen final de 10 unidades (un volumen de 1 solución inicial más 9volúmenes de disolvente).

Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como

cantidad de soluto en un volumen fijo de disolución, como es el caso de laNormalidad, Molaridad o % p/v, se denominan escalas volumétricas deconcentración.

Cuando la concentración se expresa sobre una de estas escalas volumétricas,la cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solución es igual alproducto del volumen por la concentración:

Cantidad de soluto = volumen·concentración

Si diluimos una solución, el volumen de la misma aumentará a la par quedisminuye su concentración, mientras que la cantidad de soluto presentepermanecerá constante. Por ello, dos soluciones con distintas concentraciones,

pero que contienen las mismas cantidades de soluto, están relacionadas de lasiguiente forma:

V1 · C1 =V2 · C2

Apl icacion es de esta fórmu la:

a) Si se conocen tres de los términos de esta ecuación, se puede calcular elcuarto. Las cantidades a los dos lados de la ecuación deben expresarse en lasmismas unidades.

Ejemplo 1

Preparar 50 mI de HNO3 0,1 M a partir de una solución concentrada de HNO3 1 M. Aplicando la fórmula V1 · C1 =V2 · C2 donde:

C1 = 1 mol/l

C2 = 0, 1 mol/l

V2 = 50 m IV1 = desconocido


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Sustituyendo:

V 1 · 1 mol/l = 50 ml · 0, 1 mol/l Despejando V1= 5 ml

Para preparar 50 m I de HNO3 0, 1 M, mediremos 5 m I de HNO3 1 M y

completaremos hasta 50 m I con agua destilada.

b) Despejando C2 de la ecuación [1] obtenemos:

C2 = (V1 · C1) / V2 = C1 · V1 / V2

El cociente de volúmenes se denomina cociente de dilución y se representa1/d. Por tanto:

C2 = C1 · 1/d

Es decir, para calcular la concentración de la nueva solución diluida, hay quemultiplicar la concentración inicial por el cociente de dilución.

Ejemplo

Calcular la concentración de una disolución obtenida a partir de una inicial al 10por 100 que se ha diluido al 1/10.

C 2 = C1 · 1/d

C2 = 10 .1/10 = 1 por 100

c) Si se realizan sucesivas diluciones, para conocer la concentración de ladilución final, basta multiplicar la concentración inicial por todos los cocientes

de dilución.

C2 = C1 .1/d [1] .1/d [2]...

Ejemplo:

Se ha partido de una solución al 10 por 100 p/v; ésta se ha diluido inicialmente

al 1/10, y la solución obtenida al 1/2. Calcular la concentración de la soluciónfinal.

C2 = C1 .1/d (1) .1/d (2) ...C2 = 10 .1/10 .1/2 = 0,5 por 100

d) Forma práctica de realizar una dilución.

1 /d significa 1 unidad de la solución inicial + (d -1) unidades de disolvente.

Ejemplo:

Diluir una solución al 1/5.

Para hacer esta dilución, por cada unidad que tomemos de la solución inicialtomaremos 5 -1 = 4 unidades de disolvente. Ej. 1 ml de solución inicial y 4 ml

de disolvente.

Ejemplo:


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Diluir con agua destilada 10 mI de una solución al 1/10.

Para hacer esta dilución, por cada unidad que tomemos de la solución inicial

tomaremos 10 -1 = 9 unidades de disolvente.

Como tenemos 10 unidades de solución inicial, tendremos que tomar 9 x 10 =

90 unidades de agua destilada. En resumen, para hacer esta dilucióncogeremos los 10 mI de solución inicial y los completaremos con 90 mI de

agua.

e) En el laboratorio de Análisis Clínicos, principalmente en Inmunología, esfrecuente la utilización de diluciones seriadas, que se llaman así porquedespués de la primera son todas iguales.

Ejemplo : Diluir un suero al 1/2 (1:2) por adición de 1 mililitro de suero a 1mililitro de solución salina. Tubo (1). A partir del tubo (1) preparamos cuatro tubos (tubos 2, 3, 4, 5) que contienen

cada uno 1 mililitro de solución salina como diluyente. Realizamos la diluciónseriada por transferencia de 1 mililitro del tubo (1) al tubo (2), mezclamos y

transferimos 1 mililitro del tubo (2) al tubo (3), y así sucesivamente hasta eltubo (5).

La concentración del suero decrece según un factor 2 en cada dilución: tubo (1)1/2; tubo (2) 1/4; tubo (3) 1/8; tubo (4) 1/16; tubo (5) 1/32.


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2. CROMATOGRAFíA

La cromatografía agrupa un importante grupo de técnicas que permiten separar

componentes de mezclas complejas.

En todas las separaciones cromatográficas la muestra que se desea separar se

disuelve en la "fase móvil" que normalmente está formada por un gas o unlíquido. La fase móvil se hace pasar a través de una "una fase estacionaria", la

cual se mantiene fija en una columna o en una superficie sólida que actúacomo soporte.

NOTA:

Fase móvil: en la cual están los solutos que se van a separarFase estacionaria: lecho a través del que fluye la fase móvil

Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se muevenlentamente con el flujo de la fase móvil. Los componentes con baja afinidad por

la fase estacionaria se desplazan con más rapidez al ser arrastrados por la fasemóvil.

Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria, salenseparados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en procesos de

identificación o cuantificación .

FASES DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO

1. Preparación de la fase estacionaria

2. Introducción de la muestra vehiculada por una fase móvil3. Paso a través de una fase estacionaria donde se producen las interaccionesque más tarde llevarán a su separación4. Elución (según en que técnica)

5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma

MECANISMOS IMPLICADOS

1. Adsorción

2. Reparto

3. Intercambio iónico

4. Exclusión molecular5. Afinidad

Cromatografía de adsorción: poco usada en clínica

Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las

distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografía en capa fina(ver figura 1):

• sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensión uniforme de

partículas (ej gel de sílice) que más tarde se seca y activa. En dichaplaca se aplica la muestra y se deja secar.


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• Se introduce la placa en una cámara en cuyo fondo hay un disolventeque va subiendo por capilaridad y arrastrará a los componentes de lamezcla en función de la solubilidad de los mismos en la fase móvil.

• Se deja hasta que el frente llegue al final

• Los resultados se visualizan por ejemplo por tinción con colorantes.

Aparecerán unas manchas que se pueden identificar mediante el uso depatrones o cuantificar mediante densitometría o raspado de las

manchas, disolución y determinación espectrofotométrica.

Cromatografia de intercambio iónico: basada en un mecanismo electrostáticopor atracción entre iones de distinta carga. En el laboratorio clínico se utiliza en

analizadores de aminoácidos, separación de Hb, isoenzimas y esteroides (Verfigura 2)

Cromatografia de exclusión molecular : basadas en la diferencia de tamaño delas distintas sustancias a separar. En clínica se utiliza para purificaciones ej de

hormonas (Ver figura 2)

Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican interaccionesespecíficas entre dos moléculas como uniones enzima-sustrato, hormona-

receptor, antígeno-anticuerpo... (Ver figura 2)

NOTA: HPLC ó cromatografía líquida de alta presión (resolución): es un

sistema de cromatografía en columna (la fase estacionaria se deposita en unacolumna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la fase móvil

que acelera el proceso

Figura 1


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Figura 2

Colesterol Practica

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