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Citometría de FlujoPrincipios y Aplicaciones

Prof. Edwin [email protected]

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina “José María Vargas”

Cátedra de Inmunología

2016

mailto:[email protected]

Esquema General

• Principios Generales de la Citometría de Flujo– Citómetro de Flujo

– Fluorescencia / Fluorocromos

– Anticuerpos Monoclonales

– Señales / Datos Generados

– Análisis

• Aplicaciones en Medicina– Inmunofenotipaje

– Sistema de Complemento

– Diagnóstico de Inmunodeficiencias

– Procesos Celulares Dinámicos

PRINCIPIOS GENERALESCitómetro de Flujo

CITOMETRÍA DE FLUJO

http://bcrf2.ucsd.edu

Citometría de Flujo• Metodología que permite analizar células (u otras

partículas: 0.2-50 µm) que se encuentran en un fluido, en base a sus características de dispersión de luz y fluorescencia, al interaccionar una a una con un rayo láser.

Enfoque Hidrodinámico

Fluido deArrastre

Flujo Laminar(Partículas avanzan una a una)

Canal Central(Muestra en Estudio)

http://www.abdserotec.com/flow-cytometry

Dispersión del Rayo de Luz

• Dispersión Frontal (FSC, forward scatter)

– Es una medida del tamaño de la célula o partícula evaluada

• Dispersión Lateral (SSC, side scatter)

– Es una medida de la granularidad y/o complejidad interna de la célula o partícula evaluada

SSC

FSC

http://www.bdbiosciences.com

Láser(Fuente de Luz) Dispersión Frontal

Dispersión Lateral

Célula

FSC

m

Población de LeucocitosSangre Periférica

Granulocitos

Linfocitos

Monocitos

Monocito

Laser(Fuente de

Luz)

SSC

FSC

Dispersión del Rayo de Luz

http://www.bdbiosciences.com

Dreamstime.com

PRINCIPIOS GENERALESFluorocromos y Fluorescencia



Eexcitación(Energía de Excitación)

Eemisión(Energía de Emisión)

Estado Basal

Absorción

de LuzEmisión

de Luz

Liberación

de CalorEstado de Singlete

Excitado

Estado de Singlete

Relajado

Excitación(Longitud de onda 1)

Emisión(Longitud de onda 2)

nm

Fluorocromos

• Moléculas capaces de absorber energía (excitarse) a una determinada longitud de onda y emitir esa energía, en forma de fotones, a una longitud de onda mayor

FITC (Isotiocianato de Fluoresceína)

Máxima

Emisión

525 nm

Emisión

FuerteVerde

Emisión

DébilAnaranjado

Espectro de Emisión

490 nm

Máxima

Absorción

Laser de Argón488 nm

Luz Azul

Longitud de

Onda (nm)

Espectro

Espectro de Absorción


FluorocromosEspectros de Absorción y Emisión de Fotones

Láser de Argón488 nm

Isotiocianato de Fluoresceína

FITC

Ficoeritrina

PE

Ficoeritrina-Cy5

PE-Cy5

Compensación


Longitud de Onda (nm)

La compensación se refiere a la

corrección matemática de la

señal de fluorescencia detectada

en un canal determinado,

“restando” el porcentaje de señal

introducido (solapado) por otro

fluorocromo

Longitud de Onda (nm)

12% 5%

PRINCIPIOS GENERALESAnticuerpos Monoclonales


Epitopos

Anticuerpos Monoclonales

CélulasPlasmáticas

CélulasEsplénicas

Células deMieloma

+Hibridación

Hibridomas

Separación de

Clones

AnticuerposMonoclones

Kohler & Milstein, 1975

Conjugar

Ac. Monoclonal+

Fluorocromo

PRINCIPIOS GENERALESAnálisis de Datos


Procesamiento de Señales


Pantallade

Computadora

Rayos Laser

Lentes

Sistema deFluidos

Detectores

Filtros

Detector

Filtros

Fluorescencia 1

Fluorescencia 2

Fluorescencia 3

Fluorescencia 4

Dispersión Lateral(Complejidad)

Dispersión Frontal(Tamaño)

Fluorescencia

FL1 – FL4

Dispersióndel Rayo de Luz

FSC / SSC

Análisis de DatosSelección de Regiones

Histograma

CD3Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)

Análisis de DatosIntensidad de Fluorescencia

72%

Células Positivas para FL-1 (CD3)

Linfocitos T

Análisis de DatosIntensidad de Fluorescencia

Histogramas de Dos Parámetros

CD4 Vs. CD3

CD8 Vs. CD3

Subpoblaciones de Linfocitos T

Porcentaje (%)

Recuento (Cél./µL)

Valores de Referencia

Leucocitos 7.400 4.100 – 10.900

Linfocitos Totales 25 1.850 2.200 – 4.200

Linfocitos T Totales 72 1.332 1.500 – 3.000

Linfocitos T CD4+ 12 222 800 – 1.900

Linfocitos T CD8+ 57 1.055 500 – 1.000

Relación CD4/CD8 0.21 1.5 – 2.4

IL-2

IFN

-γ

Vírgenes Memoria

CD45RO

CD

8

Linfocitos T CD8+Histograma

CD3Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)

Análisis de Datos

Selección de Regiones (“Gating”)

Linfocitos

Linfocitos T(CD3+)

CD4

CD

8CD45RO

CD

4

Linfocitos T CD4+

IL-2

Vírgenes Memoria

APLICACIONESInmunofenotipos


Hematopoyesis

Célula Madre

Hematopoyética

Progenitor Mieloide Común Progenitor Linfoide Común

GM-CFU

Linfocito

Pre-BLinfocito

Pre-T

Linfocito

Pre-NK

Granulocitos

Monocitos

Eosinófilos

Neutrófilos

Basófilos

Monocitos

Glóbulos Blancos

Células HematopoyéticasMarcadores de Linaje

CD19 ++

CD20 ++

CD22 ++

HLA-Dr ++

CD79 α, β ++

CD2 ++

CD3 ++

CD7 ++

CD4 +++

CD8 +++

CD16 ++

CD56 ++

CD3 –

CD4 +

CD11b +

CD11c +

CD14 ++

HLA-Dr ++

CD41 ++

CD61 ++

Glicoforina A ++

CD36 ++

CD45 – (ó Débil)

CD45

Débil

CD34 ++

CD13 +++

CD15 +++

CD33 +++

MPO +++

Linfocitos B

Linfocitos T Células Citotóxicas Naturales

(NK)

Células Madre

(Stem Cells)

Granulocitos

Monocitos

Plaquetas

Eritrocitos

Célula

Madre

Gen de Ig

Sin Reordenar

Pre-BCRµ+

Cadena

Liviana

Sustituta

Linfocito

Pre-B

Cad. Pesada µPre-BCR

IgM

Linfocito B

Inmaduro

IgM

IgM

IgD

Linfocito B

Maduro

IgM e IgD

Linfocito B

Activado

Expansión Clonal

Cambio de Isotipo

Mad. de Afinidad

Célula

Plasmática

Ig Secretadas

Gran Producción

CD45 Débil

CD34

CD45

CD34 Débil

CD10

CD19

Igα-Igβ

TdT

RAG1, RAG2

CD45

CD10 Débil

CD19

CD20 Débil

Igα-Igβ

CD45

CD19

CD20

Igα-Igβ

CD45

CD19

CD20

CD38

Igα-Igβ

CD45 Débil

CD38

CD56

CD138

Citometría de Flujo

Inmunofenotipo

Ontogenia del Linfocito B

InmunofenotiposDiagnóstico de Neoplasias Hematológicas

Célula

Madre

Pre-BCRµ+

Cadena

Liviana

Sustituta

Linfocito

Pre-B

IgM

Linfocito B

Inmaduro

IgM

IgD

Linfocito B

Maduro

Linfocito B

ActivadoCélula

Plasmática

Leucemias Linfomas Mieloma

Dependiendo del estadío de maduración ontogénica en que se encuentre una célula que

sufra una transformación neoplásica, el cuadro resultante será distinto

Diagnóstico Hemato-oncológico

LLA Común

SS

C

HL

A-D

R-F

ITC

CD

10

-FIT

C

CD

79

α-P

E

FSC CD19-PerCPCD22-PE

SS

C

CD34-PE TdT-FITC

Blood 2008;111(8):3941-3967

Linfoma del Manto

APLICACIONESSistema del Complemento


Proteínas Reguladoras del Complemento

C3bBb

Convertasa

de C5

CAMComplejo de Ataque a

Membrana

CD55 (DAF)

C4bBP, CR2, Factor H

Disociación de

Convertasa de C3

C4b2a

Vía Clásica

Vía de lasLectinas

VíaAlterna

Convertasas

de C3

C5b67

C8

C5b678

C5b678

C9

Poli-C9

CAMComplejo de Ataque a Membrana

C59 (MIRL)

HRF

X

X

Regulación: Convertasa de C3

Regulación:

Complejo de Ataque a Membrana

III

III

CD59-FITC

8%54% 38%

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

Blood 2005;106:3699-3709

Defecto en la expresión de CD55 y CD59 (dos proteínas reguladoras del

Complemento), asociado con hemolisis importante y trombosis

Evaluación de Eritrocitos

FSC FSC CD59-FITC

I

II

III

Paciente (HPN)

CD235a es una molécula expresada en eritrocitos

CD24-PE

Paciente 3HPN Clásica

98.8%

Evaluación de Granulocitos

FSCSSC

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

Blood 2005;106:3699-3709

La causa es un defecto genético que afecta a las proteínas que se unen a la

membrana celular a través de puentes con GPI (Glucofosfatidilinositol)

CD24-PE

Paciente 2Anemia Aplásica

8.7%

CD24-PE

Paciente 1Anemia Aplásica

0.18%

Granulocitos

Normales

Defectos en

la expresión

Eosinófilos

CD16 y CD24 se anclan a la membrana de PMN por puentes de GPI

CD15 se expresa en Granulocitos

APLICACIONESDiagnóstico de Inmunodeficiencias



Diagnóstico de Inmunodeficiencias Primarias

Célula

Madre

Pre-BCRµ+

Cadena

Liviana

Sustituta

Linfocito

Pre-B

IgM

Linfocito B

Inmaduro

IgM

IgD

Linfocito B

Maduro

Linfocito B

ActivadoCélula

Plasmática

Tirosinquinasa

de Bruton (Btk)

Requerida para reordenamiento

genético y expresión de

cadenas ligeras

Defectos

en Btk Agammaglobulinemia

Ligada a X (XLA)

Inmunodeficiencia Primaria

Ontogenia del Linfocito B

CD20

Control Paciente (XLA)

Determinar Subtipos Celulares:

–XLA (Agammaglobulinemia Ligada a X)

Citometría de Flujo: Usos Clínicos


Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:499-509.

Linfocitos T (CD3+)

Linfocitos T (CD3+)

15.8%

Linfocitos B (CD20+)

0.39%

Linfocitos B (CD20+)

Ausencia de

Linfocitos B

Activación del Linfocitos BInteracción CD40/CD40L

Antígeno

MHC-II TCR

CD4

Ausencia de CD40L

XSíndrome de

Hiper-IgMLigado a X

Inmunodeficiencia

Síndrome de Hiper-IgM Ligado a X

Citometría de Flujo: Usos Clínicos


Oliveira J et al; Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008; 8:499-509.

OTRAS APLICACIONESCITOMETRÍA DE FLUJO

Parámetros Evaluables por Citometría de Flujo

Estructurales Funcionales

•Tamaño Celular•Granularidad Citoplasma

•Antígenosmembrana, intracelular

•Contenido de ADN, ARN

•Apoptosis•Endocitosis•Produccion de Citoquinas

•Proliferación•Calcio movilización

Aplicaciones

Procesos Celulares Dinámicos• Proliferación Celular

•Incorporación de Fluorocromos en Fosfolípidos de Membrana

•Detección de Disminución de Fluorescencia en Progenie Celular

• Apoptosis•Disminución del contenido de ADN

•Disminución de tamaño y aumento de Complejidad Interna

•Pérdida de Asimetría de Fosfolípidos de Membrana

•Reducción del Potencial de Membrana Mitocondrial

• Fagocitosis•Ingestión de Bacterias marcadas con FITC

• Estallido Oxidativo•Transformación de Fluorocromos por Metabolitos del Oxígeno

• Producción de Citoquinas•Inhibición de la secresión

•Detección Citoplasmática de Citoquinas

Ensayos de ProliferaciónCFSE

(pigmento de membrana)

Determinación de ApoptosisTUNEL

Apoptosis:

•Fragmentación de ADN

•Extremos OH 3’ disponibles

•TdT añade BrdU

•Detección con anti-BrdU


Cuantificación de CitoquinasEn Sobrenadantes de Cultivos

(CBA-BD)

MuestraSobrenadantes de Cultivos

Perlas de CapturaPoblaciones con Fluorescencia discreta (FL3)

Anticuerpos DetectoresMarcados con Fluorescencia (FL2)

Sándwich InmunitarioPerlas + Citoquinas + Anticuerpos Detectores

Varias Citoquinas SimultáneamenteCombinando Diferentes Poblaciones de Perlas de Captura

Flexibilidad y EficienciaEnsayos “Personalizados”, Ahorro de Tiempo y Muestra


Cuantificación de CitoquinasEn Sobrenadantes de Cultivos

(CBA-BD)

Perlas de Captura: Poblaciones con Fluorescencia discreta (FL3)

Determinación de Citoquinas: análisis de las señales de fluorescencia FL3 (Perlas) y FL2 (Anticuerpos Detectores)

¡GRACIAS!

Espectro Electromagnético

Espectro Visible

500 nm 600 nm400 nm 700 nm

MayorEnergía

MenorEnergía


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