UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CURSO: BIOLOGIA CELULAR

MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE

LA CÉLULA

Mg. Fanny Elizabeth Lazo Manrique

2012-II

• Lo que hemos visto es una célula animal típica. Hasta que no se dispuso de buenos M. ópticos a principios del siglo XIX, no se descubrió que todos los tejidos animales y vegetales son agregados de células (Descubrimiento propuestos por Schleiden y Schwann en 1838 como la TEORÍA CELULAR, que marca el nacimiento formal de la BIOLOGÍA CELULAR.

• ¿Cómo se estudian las células?

• Las células son pequeñas y complejas. Resulta difícil observar su estructura y descubrir su composición molecular, pero resulta más difícil dilucidar como funcionan sus componentes. Los que podemos aprender sobre ellas depende de las herramientas que tengamos a nuestra disposición.

• Los mayores avances de la ciencia son frecuentemente fruto de la introducción de nuevas técnicas de estudio y por eso para entender la biología celular es necesario conocer algo acerca de estos métodos de estudio.

• Empezaremos con las usadas para examinar la célula como un todo y después con las técnicas usadas para analizar sus constituyentes macromoleculares. Nuestro punto de partida será :

• LA MICROSCOPIA.- La Biología Celular empezó con la M. óptica, la cuál todavía es una herramienta esencial junto con la M. electrónica (1940)y otras formas de radiación.

• CULTIVOS CELULARES: CULTIVOS CELULARES: Desde la observación pasiva iremos hasta la intervención activa, considerando como las células de diferentes tipos pueden ser separadas de los tejidos y crecer fuera del cuerpo Líneas primarias, secundarias y establecidas Líneas primarias, secundarias y establecidas (células HeLa y L). (células HeLa y L).

FRACCIONAMIENTO CELULAR: Cómo se pueden romper las células y aislar de forma pura sus orgánulos y constituyentes macromoleculares. Se usan agentes químicos (sodio dodecil sulfato) y enzimas (lisozima). Además la centrifugación a diferentes velocidades.

COLORACIONES CITOLÓGICASCOLORACIONES CITOLÓGICAS: Generalmente en base a la : Generalmente en base a la carga eléctrica del colorante o del componente celular. Se carga eléctrica del colorante o del componente celular. Se usan colorantes para distintas partes de la células: usan colorantes para distintas partes de la células: Hematoxilina (núcleo), Eosina (citoplasma).Hematoxilina (núcleo), Eosina (citoplasma).

•

MARCADO ISOTÓPICO Y AUTORADIOGRAFÍA: Se utilizan átomos radioactivos como C14, N15, H3, P32, I125, Ca42 y se sigue su incorporación en las moléculas orgánicas por contadores de centelleo (Geiger-Muller). En autoradiografía los isótopos son detectados en una emulsión fotográfica.

DIFRACCIÓN DE RAYOS XDIFRACCIÓN DE RAYOS X

MÉTODOS INMUNOLÓGICOS MÉTODOS INMUNOLÓGICOS Se usan anticuerpos Se usan anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar principalmente marcados con fluorescencia para detectar principalmente proteínas.proteínas.

CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍACROMATOGRAFÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

Tinciones ó Coloraciones

Las células animales no sólo son diminutas, sino que también son incoloras y traslúcidas, por ello, el descubrimiento de las principales características internas de la célula, dependió del hallazgo a fines del siglo XIX de diversos colorantes que proporcionaron el contraste suficiente para hacerlas visibles.

Son técnicas que permiten observar células y microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

a) Organismos ó células vivas:

- Tinción vital ( colorantes inócuos)

-Tinción supravital: adición de colorante a células extirpadas de organismos (rojo neutro, verde de

Janus, azul de metileno)

b)Tejidos Muertos: Biopsias

Obtención, Fijación, Inclusión, Cortes, Tinción y Montaje

Tipo de Colorantes

1.- Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, Hematoxilina , Hematoxilina férrica; derivados de la anilina (metacromatica) Azul de toluidina, azul de metileno, rojo neutro, verde de Janus.

2. - Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina,ácido pícrico diazoico:azul de tripano, rojo de tripano

3- Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen (Negro sudán, Sudán III) 

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.

TIPO DE COLORACIONES

-Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un  colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) .

-- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Nielsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante

 

-- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes

- M. Campo oscuro

- M. Fluorescencia

La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista.

la microscopía generalmente implica la difracción, reflexión o refracción de radiación incidente en el objeto de estudio.

• El microscopio óptico, permite aumentar las imágenes de las células hasta 1500 veces y tener acceso a detalles hasta 0,25 µm. Se requiere de tres elementos para visualizar una

• célula:

• 1) debe proyectarse una luz brillante en la muestra por la lente del condensador.

• 2) La muestra tiene que ser cuidadosamente preparada para que la luz pueda atravesarla.

• Un sistema de lentes apropiados (objetivo y ocular) y debe estar alineado para enfocar una imagen de la muestra en el ojo.

    MICROSCOPIOMICROSCOPIO

DE LUZDE LUZMICROSCOPIOMICROSCOPIOELECTRONICOELECTRONICO

IluminaciónIluminación Haz de luzHaz de luz Haz de electronesHaz de electrones

Longitud de Longitud de ondaonda 2000 Å - 7500 Å2000 Å - 7500 Å 0.037 Å - 0.086 Å0.037 Å - 0.086 Å

LentesLentes VidrioVidrio ElectromagnéticasElectromagnéticas

MedioMedio AtmósferaAtmósfera VacíoVacío

ResoluciónResolución 2000 Å2000 Å 3 Å3 Å

MagnificaciónMagnificación 10 x  -  2000 x10 x  -  2000 x 100 x  -  450000 x100 x  -  450000 x

FocalizaciónFocalización MecánicaMecánica EléctricaEléctrica

ContrasteContraste Absorción - ReflexiónAbsorción - Reflexión ScatteringScattering

Poder de resolución: Tamaño de las células y de sus componentes, dibujado sobre una escala logarítmica, indicando el intervalo de resolución del M. óptico y el M. electrónico. µm = 10-

6m; nm= 10-9m

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

• Es una manera sencilla de observar algunas características de una célula viva, no teñida y consiste en usar luz dispersada por sus diversos componentes. Aquí los rayos luminosos del sistema de iluminación son dirigidos desde la parte lateral, por lo que sólo penetra en las lentes del microscopio la luz dispersada y la célula aparece como un objeto iluminado sobre un fondo negro.

Colorantes fluorescentes

Fluoresceína (verde) y tetrametilrodamina (roja)Emiten luz amarillo-verdosa y roja respectivamente cuando se activan con una luz de longitud de onda adecuada. La zona naranja indica la posición de un grupo químicamente reactivo, formandose un enlace covalente entre el colorante y una proteína (-NH2)u otra molécula –SH)

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

• Las moléculas fluorescentes absorben la luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permite pasar la longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color es una característica de la molécula fluorescente usada.

• La luz atravieza 2 sistemas de filtros:

• 1) El primero, filtra la luz antes de que llegue a la muestra y pasan solo las longitudes de onda que excitan al colorante fluorescente.

• 2) El segundo, bloquea esta luz, dejando pasar sólo las longitudes de onda emitidas por el colorante fluorescente. Los objetos coloreados muestran un color brillante sobre un fondo oscuro.

Microscopía de fluorescencia_

Método inmunológicos: Se usan anticuerpos marcados con usan anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar principalmente proteínas.fluorescencia para detectar principalmente proteínas.

Micrografía de una zona de la superficie de un embrión temprano de Drosophila, en el que se han marcado los microtúbulos con un anticuerpo acoplado a fluoresceína (micrografía de la izquierda) y los filamentos de actina con un anticuerpo acoplado a rodamina (micrografía central).

Además los cromosomas se han marcado con un tercer colorante que únicamente emite fluorescencia cuando se une a DNA (micrografía de la derecha) . En este estadio, todos los núcleos del embrión comparten un mismo citoplasma y están en el estadio de metafase de la mitosis. Las tres micrografías fueron tomadas en la misma región de un embrión fijado, utilizando tres juegos de filtros diferentes en el microscopio de fluorescencia.

Se pueden utilizar anticuerpos para detectar y aislar moléculas determinadas.

A pesar de que se puede unir directamente una molécula marcadora, como un cololrante fluorescente a un anticuerpo que será utilizado para el reconocimiento específico (anticuerpo primario), se consigue una señal mayor utilizando el anticuerpo primario y luego detectándolo con un grupo de anticuerpos secundarios que se unen a él.

MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO

• Los métodos de amplificación más sensibles utilizan una enzima como molécula marcadora, unida al anticuerpo secundario. Así se puede utilizar la peroxidasa o la fosfatasa alcalina , esta última es una enzima que en presencia de los reactivos adecuados produce fosfato inorgánico que genera un precipitado coloreado. Este precipitado revela la presencia del anticuerpo secundario que está acoplado a la enzima y por lo tanto la localización del complejo antígeno-anticuerpo al que se ha unido el anticuerpo secundario. Como cada molécula de enzima actúa catalíticamente generando varios cientos de moléculas de producto, este sistema permite la detección de diminutas cantidades de antígeno. Sobre este principio se han desarrollado inmunoensayos unidos a una enzima (ELISA de Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay))

Microscopia Electrónica

Permite la observación de la ultraestructura.

Los electrones emitidos dentro de un tubo al vació son acelerados y luego desviados a campos magnéticos que actúan como lentes ópticas . La imagen se visualiza sobre una pantalla fluorescente y es producida por la dispersión de los electrones al chocar con los núcleos atómicos presentes en el objeto. Se usan átomos pesados que actúan como colorantes electrónicos y aumentan el contraste.

Poder resolutivo 0,3 a 0,5 nm y aumento de un millón de veces a más.

Las macromoléculas, caso de la estructura de membrana se estudia mediante la técnica de fractura por congelación seguida o no de “grabado”

BARRIDO ( Scanning) permite obtener una vista de superficie del objeto utilizando los electrones secundarios emitidos ya que los electrones se reflejan en la superficie de la muestra y la imagen revela la morfología superficial. Se pueden obtener imágenes tridimensionales.

TRASMISION (STEM) se utiliza un fino haz de electrones para efectuar el barrido del corte (sección fina de la muestra y revela la estructura interna ); los electrones dispersados son analizados con detectores especiales . Se obtiene imágenes de macromoléculas sin colorear.

M. ELECTRONICA 1. FIJACION - GLUTARALDEHIDO2. POST-FIJACION - OSMIO3. DESHIDRATACION - ALCOHOLES4. DESECACION – DIOXIDO DE CARBON5. INFILTRACION E INCLUSION - EPON6. CORTE - ULTRAMICROTOMO7. MONTAJE - REJILLAS8. CONTRASTACION Y SOMBREADO- OSMIOY CARBON

Visualización de microtúbulos: comparación de métodos

Microscopio electrónico Inmunofluorescencia

• Otros dos métodos que utilizan réplicas metálicas son:

• 1) Microscopia electrónica de criofractura

• 2) Microscopia electrónica de grabado por congelación.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE CRIOFRACTURA: Para visualizar el interior de las membranas celulares. Las células se congelan a la temperatura del nitrógeno líquido (-196°C) en presencia de un crioprotector (anticongelante) para impedir la distorsión provocada por la formación de cristales de hielo y el bloque se fracciona con una cuchilla. A menudo el corte pasa a través del centro hidrofóbico de las bicapas lipídicas, exponiendo así el interior de las membranas celulares. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino y las réplicas se observan al microscopio electrónico.

Microscopía de grabado por congelación

La muestra es rápidamente congelada y el bloque de hielo es fracturado con una cuchilla.

El nivel de hielo se reduce por sublimación del agua en el vacío, de forma que las estructuras de la célula que se encuentran cerca del plano de fractura quedan al descubierto.

A continuación, se prepara una réplica de la superficie todavía congelada, pues las zonas de la célula expuestas a este proceso de grabado son sombreadas para conseguir una réplica de platino. Esta técnica expones estructuras del interior de la cálula y puede revelar su organización tridimensional con claridad al examinar con el microscopio electrónico de transmisión.

El sombreado metálico permite el examen a alta resolución de detalles superficiales mediante el M. electrónico de transmisión.

Se usa con el M. electrónico de transmisión, con mayor resolución para estudiar la superficie de una muestra que el M. de barrido, de modo que pueden verse macromoléculas individuales. Sobre la muestra seca se evapora una fina película de un metal pesado como el platino. El metal se vaporiza desde un ángulo oblicuo, de manera que se forma una capa que en algunos lugares es más gruesa que en otros “SOMBREADO”, porque se crea un efecto de sombras que da una imagen de apariencia tridimensional. El material orgánico es eliminado por disolución después del sombreado de modo que tan sólo quede la fina réplica matálica de la superficie de la muestra. La réplica se refuerza con una película de carbono para que pueda ser colocada en una rejilla y examinada al M. electrónico .

Electromicrografia de una criofactura de la membrana del tilacoide de un cloroplasto de una célula vegetal

Las membranas del tilacoide se encuentran apiladas en múltiples capas. El plano de fractura se ha desplazado de capa a capa, pasando a través de cada bicapa lipídica y exponiendo la proteínas transmembrana que tienen un tamaño en el interior de la bicapa suficiente para hacer sombra y aparecer como partículas intramembrana en esta réplica de platino. Las partículas mayores que se aprecian en la membrana son el fotosistema II completo-un complejo de múltiples proteínas.

HERRAMIENTAS DE LA NANOTECNOLOGIA

Los microscopios ven cosas a través de lo que sienten con una punta muy afilada que está puesta en algo que parece

un alfiler.

Microscopia de Barrido de Efecto Tunel

Microscopio de efecto túnel podríamos definirlo como una máquina capaz de revelar la estructura atómica de las partículas. La técnicas aplicadas se conocen también como "de barrido de túnel" y están asociadas a la mecánica cuántica. Se basan en la capacidad de atrapar a los electrones que escapan en ese efecto túnel, para lograr una imagen de la estructura atómica de la materia con una alta resolución, en la que cada átomo se puede distinguir de otro. así también las propiedades electrónicas

Átomos del

Hierro sobre e

el Cobre

Microscopio de Fuerza Atómica

Los microscopios de fuerza atómica también son capaces de reconstruir tal relieve pero no hacen acopio del efecto túnel sino de la fuerza electromagnética entre la sonda y los electrones de la muestra a analizar: la sonda entra en contacto con la muestra y detecta los efectos atractivos o repulsivos de las fuerzas atómicas. La resolución es similar al del efecto túnel pero se utiliza para materiales no conductores, como la mayoría de muestras biológicas ( cadena de ADN y hasta átomos individuales).

En los microscopios, pasan una punta afilada sobre la superficie de objetos diminutos como transistores de silicona o moléculas de ADN. La punta, que mide tan solo unos átomos, se mueve con mucha lentitud. Los mejores microscopios atómicos necesitan hasta diez segundos para captar una imagen, así que no pueden ser utilizados para el estudio de procesos rápidos.

Bacteria E. coliEstudio de antibióticos sobre la superficie de células sanguíneas

CULTIVOS CELULARES

Principal método para estudiar a la célula viviente.

“Técnica de crecimiento de células in vitro,  que permite reproducir las condiciones existentes in vivo. “

•Burrows (1910) uso plasma de pollo para nutrir explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio reveló ser mucho mejor que los anteriormente probados, permitiendo observar crecimiento de tejido nervioso, corazón y piel.

•Burrows y Carrel (1912) realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, consiguiendo mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias

R.G. Harrison (1907), padre de los cultivos de R.G. Harrison (1907), padre de los cultivos de tejidos animales, fue el primero en emplear técnicas tejidos animales, fue el primero en emplear técnicas in vitroin vitro para el estudio de fenómenos para el estudio de fenómenos in vivoin vivo, , realizando cultivos embrión de anfibios. Observo el realizando cultivos embrión de anfibios. Observo el crecimiento de axones de neuroblastos en una gota crecimiento de axones de neuroblastos en una gota de linfa de Rana que colgaba de un cubreobjetos en de linfa de Rana que colgaba de un cubreobjetos en una cámara sellada.una cámara sellada.

•Rous y Jones (1916) emplearon por primera vez extractos de tripsina para disociar células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular.

Células disociadas mediante el uso de Células disociadas mediante el uso de TripsinaTripsina

Grey, Coffman y Kubicek (1952) establecen la Grey, Coffman y Kubicek (1952) establecen la primera línea celular continúa, las actualmente bien primera línea celular continúa, las actualmente bien conocidas células HeLaconocidas células HeLa obtenidas de carcinoma obtenidas de carcinoma humano, L y 3T3 de embrión de ratónhumano, L y 3T3 de embrión de ratón

•Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estériles, pero sin grandes avances.

•1961 se usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos, pudiendo mantenerlos durante 12 meses.

•Kohler y Milstein (1975) establecen la primera línea celular productora de anticuerpos monoclonales.

CONDICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR CONDICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR ((MICROAMBIENTE)MICROAMBIENTE)

Medio de cultivoMedio de cultivo. Debe contener los nutrientes básicos . Debe contener los nutrientes básicos para la supervivencia de las células como y estimuladores para la supervivencia de las células como y estimuladores (hormonas) que promuevan su diferenciación y viabilidad.(hormonas) que promuevan su diferenciación y viabilidad.

Gases (OGases (O2 2 y COy CO22) y pH.) y pH. Debe garantizarse un 20% de O Debe garantizarse un 20% de O2 2

(atmosféricos) y un 5% de CO(atmosféricos) y un 5% de CO22 (tisular) en el sistema los (tisular) en el sistema los cuales deben ser administrados con una adecuado sistema cuales deben ser administrados con una adecuado sistema de ventilación y filtros que garanticen la eliminación de de ventilación y filtros que garanticen la eliminación de contaminantes.contaminantes.

Osmolaridad-humedad.Osmolaridad-humedad. Debe garantizarse una Debe garantizarse una ambiente húmedo, que evite la evaporación del agua del ambiente húmedo, que evite la evaporación del agua del medio de cultivo lo que incrementará lo osmolaridad del medio de cultivo lo que incrementará lo osmolaridad del mismo.mismo.

Temperatura.Temperatura. El estricto control de la temperatura es muy El estricto control de la temperatura es muy importante al tratarse de un factor crítico en la mayoría de importante al tratarse de un factor crítico en la mayoría de los experimentos con células de mamíferos cuyo los experimentos con células de mamíferos cuyo metabolismo óptimo es a 37º . Cuando en un experimento metabolismo óptimo es a 37º . Cuando en un experimento aparecen problemas y datos no explicables, la causa suele aparecen problemas y datos no explicables, la causa suele ser un deficiente ajuste de la temperatura.ser un deficiente ajuste de la temperatura.

Tipos de Cultivos

CULTIVOS PRIMARIOS:Se obtienen a partir de muestras de tejido que son

tomadas directamente a partir de organismos vivos, los cuales son tratados mediante enzimas proteolíticas a fin de disgregar las células inmediatamente son cultivadas en un medio apropiado por periodos cortos de tiempo dentro de los cuales se da el análisis.

CULTIVOS SECUNDARIO: una o varios tipos célulares de un cultivo primario se re-siembran (sub cultivo)

LINEAS CELULARES: Estos son cultivos que se establecen a partir de la selección de un clon especifico proveniente de un cultivo primario tripsinado. De uso mas corriente son las líneas establecidas las cuales se han adaptado a un crecimiento prolongado in vitro por transformación cancerosa. * Cultivos celulares obtenidos a partir de líneas celulares primarias, que hayan sufrido un fenómeno de transformación (natural o no). Importante : por el poder ilimitado de proliferación celular; Poder ilimitado de expansión (número ilimitado de generaciones).- Inmortalización celular.-

• Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,...

• Investigación del Cáncer

• Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática.

• Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento.• Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal.• Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad.• Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante.• Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial..

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Los anticuerpos monoclonales son glucoproteínas especializadas que hacen parte del sistema inmune, producidas por las células B, con la capacidad de reconocer moléculas específicas (antígenos). Los anticuerpos monoclonales son herramientas esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico, y han probado ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunológicas y neoplásicas, así como también en el estudio de las interacciones patógeno-hospedero y la marcación, detección y cuantificación de diversas moléculas.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

FRACCIONAMIENTO CELULARFRACCIONAMIENTO CELULAR

El fraccionamiento celular es un conjunto de El fraccionamiento celular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen por objetivo obtener métodos y técnicas que tienen por objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana plamática, membrana total, fracción de membrana plamática, membrana total, complejos multiproteicos, citoesqueleto, poros complejos multiproteicos, citoesqueleto, poros

nucleares, etcnucleares, etc..

Etapas del fraccionamiento célularEtapas del fraccionamiento célular Todo proceso de fraccionamiento subcelular Todo proceso de fraccionamiento subcelular

tiene dos etapas : tiene dos etapas :

Rotura de células o tejidosRotura de células o tejidos para obtener para obtener un un lisado celularlisado celular (o tisular) en el que la (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación. condiciones adecuadas para su purificación.

Separación de la fracción deseadaSeparación de la fracción deseada mediante algún criterio como diferencia de mediante algún criterio como diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o densidad (centrifugación en gradientes o diferencial), presencia de antígenos diferencial), presencia de antígenos (cromatografía de inmunoafinidad, (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.), etc.inmunoprecipitación, etc.), etc.

SonicaciónSonicación en la cual se aplica en la cual se aplica ultrasonidos a la suspensión celular, ultrasonidos a la suspensión celular, produciéndose una intensa agitación que produciéndose una intensa agitación que destruye las membranas. Dependiendo de destruye las membranas. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía se la frecuencia, intensidad y energía se puede destruir estructuras subcelulares e puede destruir estructuras subcelulares e incluso complejos proteicos.incluso complejos proteicos.

Detergentes no ionicosDetergentes no ionicos que solubilizan que solubilizan la membrana celular. la membrana celular.

HomogenizadoresHomogenizadores. . Los que rompen las Los que rompen las células con la ayuda de un émbolo células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a rotatorio que se ajusta perfectamente a las paredes de un tubo de cristal especial, las paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. el homogenizador.

1000G 10000G 105,000G

20min

RERibosomas

• VELOCIDAD DE SEDIMENTACION

• La muestra se coloca sobre una solución diluída de sacarosa y los componentes subcelulares sedimentan a diferentes velocidades de acuerdo con su tamaño. Para estabilizar las bandas que sedimentan y evitar que se mezclen por fenómenos de convección originados cuando una solución densa (una que contenga orgánulos), se halla en la parte superior de otra de menor densidad, el tubo contiene un gradiente continuo de sacarosa que aumenta de concentración hacia el fondo del tubo (5 a 20% de sacarosa). El fondo del tubo tiene mayor densidad y se consigue que cada una de las regiones de la solución de sacarosa sea más densa que cualquier solución superior. Después de la centrifugación, los diferentes componentes pueden recogerse por separado, el sistema más sencillo consiste en perforar el tubo de centrifuga y recoger el medio gota a gota.

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACION

• La ultracentrifuga también puede utilizarse para separar componentes celulares sobre la base de su densidad de flotación, independientemente de su tamaño o forma. La muestra se coloca en una capa en la parte superior o dispersa dentro de un pronunciado gradiente de densidad que contiene concentraciones muy altas de sacarosa o de cloruro de cesio. Cada componente subcelular se desplaza hacia arriba o hacia abajo cuando se centrifugan hasta que alcanzan una posición donde su densidad coincide con la que le rodea y no se moverá más. Finalmente se producirá una serie de bandas en la que las más próximas al fondo del tubo contienen los componentes de densidad de flotación más elevados. El método también se conoce como “Centrifugación por gradiente de densidad”

DIFRACCION DE RAYOS X

Hace algo más de un siglo, en 1895 W. K. Röntgen, científico alemán, descubrió una radiación, desconocida hasta entonces y que denominó rayos X, capaz de penetrar en los cuerpos opacos.Las aplicaciones de los rayos X en el campo de la Medicina son de todos conocidas, radiografías, tomografías, etc., pero su uso también se haextendido a otras áreas como la detección de microfracturas en metales o en el análisis de obras de arte.El descubrimiento de los rayos X, y su aplicación al estudio de materiales, revolucionó a lo largo de los años los campos de la Física, la Química y la Biología.Los rayos X son radiaciones electromagnéticas, como lo es la luz visible, y lo único que los distingue de las demás radiaciones es su longitudde onda, del orden de 10-10 metros, que equivale a un Ángstrom.

Definición: Fenómeno óptico producido por la luz por la cual los rayos al atravesar una rejilla o cristal se separa en zonas claras y oscuras, es decir el cristal hace que algunos rayos se superpongan y se intersecten.

Esta propiedad de la luz utilizada también con los rayos X por su alta frecuencia , se emplea para analizar moléculas biológicas, de modo que se obtienen imágenes las cuales aplicando ecuaciones matemáticas, computarizadas (como ley de Bragg o Series de Furrier)

se logra la figura tridimensional de dicha muestra.

Esta técnica permitió descubrir la estructura de la doble hélice del ADN en 1953 y actualmente se utiliza para determinar la estructura de las proteínas.Los rayos X, como la luz son una forma de radiación electromagnética pero de una longitud de onda mucho menor (alrededor de 0,1 nm) Si se dirige un haz estrecho y paralelo de rayos X a una muestra de proteína pura, la mayoría de rayos X pasaran a su través. Sin embargo una pequeña fracción de ellos serán dispersados por los átomos de la muestra. Si la muestra es un cristal bien ordenado, los haces dispersados se reforzarán unos a otros en ciertos puntos y aparecerán como manchas de difracción, cuando los rayos X sean recogidos sobre un detector.

Conjunto de objetos y susCorrespondientes diagramas de dispersión / difracción:(a) una molécula,(b) una repetición en línea de puntos(c) una repetición en línea de moléculasen línea de moléculas. (d) una red puntual, y por fin (e) una red bidimensional de moléculas.

La cruz formada por los puntos oscuros es característico de moléculas helicoidales como el ADN, Las mediciones de diversos aspectos del patrón señalan las dimensiones de la hélice del ADN. Por ejemplo la distancia entre los puntos en cruz corresponde a la distancia entre las vueltas de la hélice.

Separación de proteínas por cromatogtafía

MUCHAS GRACIAS