Citometríadeflujo en urología

JoséAntonioLÓPEZ GARCIA-ASENJODepartamentodeAnatomíaPatológica.

HospitalUniversitarioSanCarlos.Madrid

1. INTRODUCClON

La tecnologíade citometriade flujo resultade la aplicaciónconjuntadelos conocimientosdesarrolladosen diferentesáreascomo sonla tecnologíadel láser,producciónde anticuerposmonoclonales,fluorocromosy procesa-mientocomputerizadodedatos.

Aunquesusprincipios básicossonconocidosdesde1930,suaplicaciónclínica no ha entradoa formar partedelas prácticasrutinariasde laboratoriohastamuy recientemente(1), coincidiendoconla disponibilidadde aparatosrelativamentebaratosdotadosde sistemasinformáticoscapacesde manejarmuy rápidamentegrancantidaddedatos.

La primeramáquinadisponiblecomercialmentefue ideadaporun anato-mopatólogo,HerbertDerman,y un ingeniero,JohnHoffer, quienesbasándo-seen las observacionesde Casper-ssony colaboradoressobrela fluorescen-cia de los ácidos nucleicos, pensaronen crearun sistemaautomáticodeanálisiscelular. La construccióndel aparatofue encargadaaLouis Kaments-ki, un físico quetrabajabaen un centrode investigaciónde IBM (2) y cuyaaportaciónfundamentalfue la de incorporarun sistemadeflujo, en lugar delanálisisestáticoque se realizabapreviamente,mientrasque las propiedadesdefluorescenciadelosácidosnucleicoseranpotenciadasconfluorocromos.

De forma muy esquemática,se puedeafirmar queel objetivo de la cito-metríade flujo es la rápidacuantificaciónde uno o másparámetrosen cadapartículade unaampliapoblacióncelular.La cuantificaciónde ADN, ARNo de una determinadaactividad enzimáticase puederealizarmuy rápida-mentede la mismaformaquela determinaciónde poblacionescelularesconmarcadoresdesuperficie.

ClínicasUrológicasdela Complutense,3, 83-102,Editorial ComplutensedeMadrid, 1995

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La ventajafundamentaldel sistemadecitometríade flujo sobrela citofo-tometriao la citometria deimagenes la velocidaddel análisisde losparáme-tros de cadapartícula,lo quepermiteestudiarpoblacionescelularesmayores.Sus resultadossonfácilmentereproduciblesen diferentescentros,lo cual esfundamentalcuandoseanalizanparámetrospronósticos.Las técnicasestáti-casutilizan menos células para el análisis,por lo que son de elecciónenmuestraspococelulares.Además,las medicionesse realizanbajo control mi-croscópico,eligiendoel observadorel tipo celularobjetode estudio(2).

En el-campo-de-las-neoplasiasdeltractogenitourinario,la cuantificaciónde ADN medianteCitometriade Flujo ha resultadoespecialmentevaliosa,comodesarrollaremosenlaparteespecíficadeestarevíston.

II. METOLOGIA DE CITOMETRÍA DE FLUJO

Parapodermedir unosdeterminadosparámetros,se marcanlas partícu-lascon fluorocromos,quesonexcitadosal pasarpor delantedeunafuentedeluz de unadeterminadalongitudde onda.La captaciónde las característicasindividualesde cadapartículaes posible,graciasa la señallumínicarecogidapor fotodetectoresal pasoindividual de lasmismas,frentea la fuentedeexci-taciónenel senode un flujo laminaraunavelocidaddeterminada.

II.a) Componentesdeun citómetro deflujo (Fig. 1)

La suspensióncelular se sitúaenel colectorde muestras,que esun com-partimentopresurizadodesdeel quepasaa una cámaradeflujo en dondehade disponerseenel senode un flujo laminardeun liquido acelular.Las partí-culas sesitúanen el centrodel flujo, y pasaránunaa unay a unavelocidaddeterminaday constantequesueleserde 100-200partículaspor segundo,atravésde la fuentedeexcitación.Aunqueel sistemade lámparasdearco resul-ta másbarato,la mayorpartede los citofluorógrafosactualesestánprovistosde un LASER de Argón. Habitualmenteobtienenun rendimientode 488 a520 nm, longitud de ondaapropiadaparaexcitar fluorocromoscomoFluo-resceitialodurodePropidio.BromurodeEtidio, NaranjadcAcr~Th~~ Piro-ninaY, Rodaminaetc.El alineamientodel hazdeluz con el flujo de partícu-las esfundamentalparala correctaobtenciónde datos(1-3).

En la interacciónde las partículascon el haz luminosose produceunadispersiónde la luz dependiendodel tamañode las mismas,pero tambiéntienelugarlaexcitaciónde losfluorocromospresentesenla superficiee inte-rior de cadapartícula.Unosfiltros ópticospermitenel pasoúnicamentea de-terminadaslongitudesde onda,cuyasseñalesluminosasson recogidasporunosfotodetectorescolocadosen el eje de la luz y en posiciónortogonal,paramedirelánguloanteriordedispersióndela luz y la intensidaddefluorescen-cia a 90; lo quepermiteobtenerdatossobreel tamaño,estructurainternade

Citometríadeflujo enurología 85

Suspensióncelular

Fluido 7

Sensoróptico

Y

Ordenador ~-e

Al ordenador

Fig. 1.— Citómerrode Flujo.

la partícula,viabilidad, etc. Estasseñalesson amplificadasy convertidasenpulsos eléctricos paraposteriormenteser transformadasa forma digital enunacomputadora(1-3).

II.b) PreparacióndeMuestras

Prácticamentecualquiertipo demuestrapuedeserutilizadaparaunanálisisdecitometríadeflujo. El materialaanalizarpuedeserobtenidodepiezasquirúr-gicas,punciónaspiración,líquidosorgánicoscomoderramescavitariosu orina.

Existenvariastécnicasde preparacióndel material,perotodasellas tie-nenobejtivoscomunes.

— Preparacióndesuspensionescelulares.— Aislamientodenúcleos.— TincióndelADN

Preparación de suspensionescelulares: Una de las mayoresdificultadescuandose tratacon tumoressólidos,esla obtenciónde unabuenasuspensióncelular. Lascélulasquecarecende unionesintercelulares(hematolinfoides)son idealesparaestetipo deanálisis.Es fácil obtenerigualmenteel material

Rayo láser

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de cultivo de tejidos.Sin embargo,es mucho más difícil obtenerunabuenasuspensióncelulardetumoressólidos.Lascélulasepitelialesconsusunionesde membranason las másdifíciles de separar.Paraello, se utilizan varios«de-tergentes’>y enzimascomo EDTA, pepsina,tripsina, colagenasaetc.,asocia-dosa ladisgregaciónmecánica(4).

La aplicaciónde estastécnicasa tejidosincluidosenparafina permiteel ac-ceso a estudiosretrospectivos,con la ventajade trabajarcon pacientescuyocursoclínico es ya conocido.Estosmétodosrequierenla realizaciónde gruesoscortesdel materialincluido enparafina(3O-SOii)desparafinización,rehidrata-ción y tratamientoenzimáticoantesdeprocedera la tinción conel fluorocromo(5). La correlaciónde resultadosobtenidosde materialenfrescoe incluido enparafinaesbuena,en general,aunqueen el último caso,loshistogramasmues-tran mayorescoeficientesdevariacióny másdetrituscelulares(5-7).

Aislamientonuclear. La primeratécnicade aislamientonuclearestababa-sadaenla utilizaciónde Buifer Citrato, quea pesarde queproducealteracio-nesenlas membranascitoplásmicas,complejosde unión y citoplasmascelu-lares,permeabilizael núcleo a la acción de fluorocromos.Actualmente,elsistemamásutilizado esel propuestopor Vindelov (4).

Tinción.El procedimientodetinción variarásegúnlosparámetrosquesequierananalizar.Aunquelas posibilidadesson muy ampliasutilizandoanti-cuerposfluoresceinados,laaplicaciónmásinmediataen tumoressólidosy enlaboratoriosde diagnósticoes la cuantificacióndeADN. Los fluorocromosmayoritariamenteutilizados(JodurodePropidio,BromurodeEtidio, DAPI)tienenavidez,tantopor elARN, como porelADN, por lo queparaalcanzarunacorrectacuantificacióndel ADN, esnecesarioeliminar de los núcleos,las cadenasde ARN. Estose consigueincubandola suspensióncelular conRNAasaantesdela tincióncon el fluorocromo.

En nuestrolaboratorio,utilizamosel loduro dePropidioquese uneeste-quiométricamentea la cadenade ADN, de formaquela cantidadde fluoro-cromounido al ADN, y por tanto, la emisiónde fluorescenciaesdirectamenteproporcionala la cantidaddeADN contenidaen el núcleo.

Algunoscolorantescomo Naranjade Acridina se une simultáneamenteal ARN y al ADN, emitiendoen cadacasofluorescenciade distintalongitudde onda,por lo quepuedeser usadopara el análisis simultáneode amboscomponentes.Algunasvariantesde la técnicabásicaasocianalgún anticuer-po fluoresceinado(dobleo triple tinción) paraanálisismultivariante.

III. CUANTIFICACIÓN DE ADN MEDIANTE CITOMETRÍADE FLUJO

III.a) Obtención y procesamientode datos

La formamássimpley habitualde demostraciónde resultadoses el “dotplot<>. Cadapunto representaunapartícula(célula)quesesitúa,de acuerdoasu tamaño,enunasdeterminadascoordenadas(Fig. 2).

1

Citometríadeflujo enurología 87

FL

~ 1’ P3

______________ 4 3<O

NlT

3

FL3 FL3M N MAX 00857 PE8CENT MEAN SO MPCV MIS MAO COUNT PEOCENT MEAN SO % MPCV

1 330 381 <173 73 355.7 12.4 3.00 1 12.21 18.1< 1118 08.0 11.16 0.1 0832 380 1023 070 137 547.3 1134 0.83 2 25.17 37.36 756 84 2032 0.11 1313 558 779 23< 3.3 601.4 235 0.08

Fig. 2.—Obtenciónde losresultados.(Explicaciónenel texto.)

De acuerdoalas característicasdetamañoy complejidadcelular,se aco-tan laspoblacionesqueinteresanparael estudiopormediode “gates” y «bitmaps«(Fig. 2). Las primerassondivisionesrectilíneasy las segundasovoides,peroambastienenel mismo fin, queesdelimitar las poblacionescelularesso-bre lasquesequiererealizarel estudio.

Tras el análisisde las señalesfluorescentes,se obtienenunosdatosquesonexpresadosmediantehistogramas.Estospuedenserunivariables,en losquese analizanivel de fluorescenciao tamañode las partículasy el númerototal delasmismas,o bienbivariables,quesonaquellosenlos quecadacanalrecogelas partículasquerecogendoscondicionesdelimitadaspor medio delos <‘bit maps«.

1II.b) Cantidad deADN y cinéticacelular

Mediantetécnicasde citometríaestáticay autorradiografía,ya se habíacomprobadoque frecuentementelas célulastumoralesposeíanunacantidadanormalde ADN, en comparacióncon las célulasnormales.La aportaciónde

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la citometríadeflujo a estetipo de análisisconsisteen la rapidezy facilidadconquese puedenestudiargrandespoblacionescelulares.

La resolucióndel análisisde ADN mediantecitometriade flujo entumo-ressólidosdepende,en primerlugar, de la conservacióny manipulacióndeltejido, elprocedimientodetinción y dela calidaddelcitómetro.En un análi-sis convencional,hande poderdiscriminarsecontenidosde ADN diferentesen un 4% que correspondeaproximadamentea un cromosoma.La resolu-ción del sistemade análisis mediantecoeficientede variaciónde unapobla-ción no tumoral enfaseGO/GI. En condicionesóptimas,éstehadeserinfe-rior a 2% (1-3,8).

Como se hacitadoanteriormente,parala determinaciónde la cantidadde ADN presenteen el núcleo, se utilizan fluorocromosque se uneneste-quiométricamentea las cadenasdeácidosnucleicos,y por tanto, la intensidadde fluorescenciaserádirectamenteproporcionala la cantidadde ácido nu-cleico.De la cuantificaciónde laemisióndefluorescenciadecadacélula,ob-tenemossimultáneamentedatossobrelaploidiaysobreel ciclo celular.

La forma más usualde expresarel contenidode ADN es medianteel in-dice deADN. Esteíndicese calculadividiendoel númerodecanalmediodefluorescenciade la poblaciónproblemaen faseGO/Gí entreel númerodelcanal medio de la faseGO/Gí de la poblaciónnormal. De estaforma, pordefinición, el indice de ADN deunapoblacióndiploide normalesde 1. Lasneoplasiasmalignas,frecuentementeson ANEUPLOIDES, es decir, tienenun índice distinto de 1. Cuandoel índice es 1 se denominaadichapobla-ción HIPERDIPLODE, cuandoesde 2 sedenominaTETRAPLOIDE, si es1 HIPODIPLOIDE, y si existenvarios picos aneuploides,se conocecomoMULTIPLOIDIA. Estaterminologíaha sido cuestionadapor comitésde ex-pertos(AmericanSociety for Histocompatibility andImmunogenetics),quelimitan el términode aneuploidíaa lasalteracionescromosómicasy propug-nanla denominaciónde «cantidadanormaldeADN<~ parareferirsea las ano-malíasdetectadasconcitometríadeflujo.

Normalmente,el 90-95%de lascélulasseencuentranenfaseGO/GI conun contenidodiplode de ADN. Las célulasquese encuentransintetizandoactivamenteADN, muestranun mayorcontenidodel mismo reflejadoen unaumentode la intensidadde fluorescencia.Las célulasen mitosis o en fasepremitótica(G2/M) contienenunadoblecantidaddeADN (4n).

El análisisdel ciclo celular se realizaa travésde modelosmatemáticosbasadosen el estudiode áreasde unacurva de Gaussparala faseGO/GI yG2/M y dela sumadeáreasderectángulos.

Los modeloscitadosevitanla superposiciónde célulasde los picos2n y 4nconla mesetade fase5 y permitendiscriminarel fondo atribuiblea detritus,etc.,peroparaestimarla fase5 real y eliminar célulasfuerade ciclo, el métodomáscorrecto es el tratamientoprevio de las muestrasconanálogosde laTimidina(ej: BromoDeoxiUridina),quepermite,mediantela aplicaciónde un anticuerpofrentea BrdU conocerla fracciónrealde célulasen fasede síntesisactivadeADN (Fase5). Su aplicaciónpuederealizarse<‘in vivo>’ o encultivo detejidos.

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III.c) Control de calidad

Paragarantizarla homogeneidadde resultadosen diferentesinstitucio-nes, es necesariocumplir unaserie de requisitos.Paracomprobarel buenfuncionamientodel sistema(alineamientodel Láser,voltajes,etc),utilizamospartículasplásticasfluorescentes,quehande serhomogéneasy muy estables.Antesde cadasesiónde trabajo,fijamos las condicionesdel análisisajustan-do losvoltajesparaobtenerel canal de fluorescenciadeseadocon las partí-culasdecontrol.

Utilizamosademáscontrolesbiológicosconstituidospor núcleoscelula-res con una cantidadconocidade ADN. Los hematíesde poíío contienenunacantidadde ADN de 35% respectoa la especiehumanay los hematíesde carnerode un 80%.Los picos obtenidoscon estascélulasdebenser muyfácilmentedistinguiblesde los obtenidosconla muestracontrol y semezclancon la mismacomo control interno (8). Cuandose trabajacon tumoressóli-dos,y más aún,conmaterialquehasido incluido enparafina,es imprescindi-ble añadirun nuevocontrol,que idealmenteseráunamuestrasanadel mismopacientey del mismo órgano,procesadaen las mismascondicionesque lamuestraproblema.

IV. CITOMETRIA DE FLUJO EN UROLOGÍA

IV.1. Carcinomade vejiga

El carcinomade célulastransicionalesde vejigaurinariahasido y es unode lostumoressólidosmás ampliamenteestudiadosmediantecitometriadeflujo. Tanto las muestrasdeorina, lavadosvesicaleso las obtenidaspor técni-cas endoscópicaspoco agresivas,son utilizadas para la cuantificacióndeADN.

Se handescritomúltiples nivelesde utilidad, quevandesdeel diagnósticoinicial al establecimientode parámetrospronósticos,conimplicacionesenelseguimientodelos pacientes.

IV. 1 .a) Diagnóstico

En primer lugar, y desdeel punto de vistadel diagnósticoinicial, se hacomparadosusensibilidadconotrastécnicascomola citologíaconvencionalen diferentestipos de muestra(9). La sensibilidaddela citometríadeflujo seha mostrado,al menos,igual quela dela citología.Algunosautores(Badala-ment, 1987) reconoceninclusounamayorsensibilidada la citometriadeflu-jo. En el citadotrabajo,se obtieneunasensibilidaddel 83% encitometria deflujo de lavadosvesicales,61% con citología de lavado vesicaly 60 con elexamencitológico de tresmuestrasde orina. Colístey cols (10)demostraron

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queutilizandocomofluorocromoNaranjade Acridina,se incrementala sen-sibilidadde la técnica.

Los criterios del Memorial Sloan-KeíteringCenter,paraconsiderarunamuestrapositiva, son la demostraciónde unapoblacióncelularaneuploide,incluyendoen estacategoríala demostraciónde másde un 16% de célulasconcontenidohiperdiploidede ADN (9). Con estoscriterios,aunquese lo-gra unabuenasensibilidad,se produceunapérdidade especificidadpor laapariciónde falsospositivosque puedealcanzartasasde 28-38%.La apari-ción de un importante componenteinflamatorio, fundamentalmenteenlesionesulceradas,contribuyea la apariciónde célulascon contenidoanor-mal deADN.

Parapoderaceptarestatécnicacomosistemade rastreode carcinomasvesicalesen poblaciónde riesgo,ademásdecumplir requisitosde sensibili-dady especificidad,debede poderrealizarseen muestrasobtenidasdefor-ma no invasiva,económicay rápida.Las muestrasde orina seríanlas ópti-mascon estepropósito.El problema del análisis de muestrade orina es laausenciade celularidadsuficiente(11,12), quehaceque en las seriescita-das sólo se obtenganhistogramasvalorablesen el 47% de los casos.Enestepunto,convienerecordarqueunabuenaalternativaa la citometríadeflujo paracuantificaciónde ADN en muestraspococelulares,es la citome-tría estáticao de imagencon la queseestánobteniendomuybuenosresul-tados(13).

En cuantoa sucapacidadparadetectartumoresno visiblesmacroscópi-camente,cabereseñarel estudiorealizadoporNorming et al. (14). Observa-ron la presenciadepoblacionescelularesconcontenidoanormalde ADN enmucosamacroscópicamentenormal,de pacientesportadoresde carcinomavesical,fundamentalmenteenaquelloscon tumoresaneuploidesno tetraploi-des.Comprobaronigualmente,que estehechoguardabarelacióncon el gradohistológico,de forma que los tumores con grado2 aneuploidesmostraronmuchamenortendenciaa presentaraneuploidíasen mucosanormalquelostumoresaneuploidesdegrado3.

La deteccióndecarcinomain situ, cistoscópicamentepuedepresentardi-ficultades.Desdeel punto de vistahistopatológico,se catalogancomo neo-plasiasde alto grado, no infiltrantes.Con citometria deflujo, se hanencon-trado unaalta incidenciade aneuploidíasen este tipo de neoplasia.En larevisiónde Normingy cols, encuentranun 76%de aneuploidíasen carcino-ma in situ, 41% en zonasde displasiaepitelial moderaday 10% en mucosahistológicamentenormal adyacenteal carcinomain situ (15). En estudiosprevios(16), sehabíademostradounaclararelaciónentreaneuploidíasmúl-tiplese incrementode la fracción proliferativay laprogresióndel tumor coninvasióndela capamuscular.

La significación de la apariciónde poblacionesaneuploidesen mucosamacro y microscópicamentenormales,no esta muy aclarada,pero en cual-quier casoparecennecesariosfactorescoadyuvantesparael cambio de ex-presiónmorfológicay progresióndela enfermedad(15,16).

Citometríadeflujo en urología 91

IV. 1 .b) Pronóstico

La heterogeneidaden el cursoclínico del carcinomavesical,ha impulsa-do la búsquedadenuevosparámetrospronósticosqueañadiral clásicoesta-diaje clínico y gradaciónmorfológica.

La estrechacorrelaciónentrecontenidoanormaldeADN y crtteríoshís-topatológicoscomogradoy estadio,ha sidoampliamenterecogidaennume-rosasreferenciasbibliográficas (12,13,16,17,18,19,20).Como resumendelas mismaspodemosconcluir, quela inmensamayoríade tumoresde alto gra-do e invasivosson aneuploides,mientrasquelos debajo grado,por el contra-rio, sondiploides. Mayorvariabilidadencontramosen loscasosde gradoin-termedio(Tabla1).

TABLA 1

Incidenciade aneuploidiasencarcinomasdevejiga

Grado Diploide % FaseS Aneuploide % FaseS Número

1 8(89%) 35±/—1,7 1(11%) — 92 28 (67 %) 5,4+/—1,6 14 (33 %) 10,7+/—4,6 423 2 (4 %) 5,0 47 (96%) 19,0+/—5,8 49

Total 38 (38 %) 62 (62%) 100

FuENTE: TomadodeTribukaitB et al.: Br.]. Urol., 1982; 52:t30-135.

La buenacorrelacióncitadasemantienetambiénconestadiosdeinfiltra-ción, de formaquesólo un 2,5%de tumorescon invasióndela capamuscu-lar, conservaun contenidonormal de ADN (18). Lo mismo ocurrecon elcomportamientoclínico. Tribukait y cols (19).demostraronunaestrechaco-rrelación entreaneuploidia,progresióntumoral y muertepor la enfermedad.Sin embargo,no quedaclaramenteestablecidosuvalor comoparámetropro-nósticoindependiente.

En unaampliaserie(203 casosde carcinomasdevejiga no tratados)Ta-chibanay cols. (21), realizanun análisismultivarianteentreparámetrosclási-cosclínico-histopatológicosy los obtenidospor citometríade flujo. Conside-radosde forma individual los datoscon mayorvalor en ordendecrecienteresultaronserla presenciade hipertetraploidía,gradohistológico,tetraploi-díay estadiodeltumor.

Blomjousy cols.(22)establecieronunaasociaciónestadísticamentesigni-ficativa entrecantidadde ADN y supervivenciaa los 5 años,encontrandoquelos tumoresdegrado2 concontenidonormalde ADN teníanunasuper-vivencia mayor queaquelloscon contenidoanormalde ADN. Estoshallaz-

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gosson de especialrelevanciaal plantearla posibleseparaciónde entrelospacientescontumoresdebajo gradoo intermedioy bajo estadio,un grupode alto riesgo cuandoseobservanpoblacionescelularescon contenidoanor-mal deADN (23, 24).

La predicciónde recurrenciaesun datode importanciaen el manejote-rapéuticodel paciente.En el trabajoya citadode Blomjous(22), se reconocea la determinaciónde la ploidía con citometria de flujo como el parámetrode mayorcapacidadpredictivade recidivasfrentedatoscomo tamañofumo-ral, multiplicidad delas lesiones,morfometríanuclear,grado,estadio.

De Vere White y cols.(25)demostraronla utilidad del estudiosecuencialde lacantidadde ADN enlamonitorizacióndepacientesconcarcinomaurote-lial superficial.Todos lostumoresde estaserieconcontenidoanormaldeADNrecidivarony en un alto porcentajedecasos(20 de 28), se produjo un cambioen el patrónde ploidia de ADN. Concluyenestosautores,quede acuerdoalcontenidode ADN, sepuedenestablecergrupos,queprobablementevan asu-frir recidiva tumoral, y gruposde riesgoparael desarrollode carcinomasinva-sivos, enaquellosconrepeticióndeaneuploidiasen sucesivasrecidivas.

En la experienciaqueestamosdesarrollandoy como partede un estudiomás amplio, hemosanalizadohastael momento80 carcinomasuroteliales,utilizandomuestrasincluidasen parafina.Desdeel puntode vistahistopato-lógico, se ha utilizado un sistemade 4 grados(Broders)y el estadiajede Je-wett. Se hanpodido analizarde forma satisfactoria75 de los tumores,si-guiendo la metodologíade Hedley (5). La lectura se ha realizadoen uncitofluorógrafoEpicsProfile II deCoulter.

A pesarde utilizar un sistemade 4 grados,distinto al de la mayorpartede las seriespublicadas,semantienenunaasociaciónestadísticamentesigni-ficaliiva entregradoy ploidia (Fig 3). La relación entreinfiltración y ploidiatambiénse mantieneen nuestraserie(Fig 4). En los tumores,en los que yatenemosconstanciade recidivas,existe asociaciónentrerecidivay ploidia(Fig 5). Entrelos tumoresdiploidesquerecidivaron,encontramosdoscasosenlos queel gradohistológicoaumentaenla recidivade1 a II y coincidecon laapariciónde poblacionesaneuploides.Porotraparte,uno de los casosde al-fo grado(gradoIII), que mostróun patrón diploide,permanecesinrecidivasdesdehaceS años.

En relaciónconla fracciónprohferativatumoral,referidaaporcentaje-decélulasen fase5, no hemosencontradocorrelaciónsignificativaentrela mis-may el gradohistológico.Sin embargo,estacorrelaciónsí seproduceal com-pararlas mediasde porcentajede célulasen fase5 entretumoresdiploidesqueno hanrecidivadoy losquesilohanhecho(Fig. 6).

IV. 1 .c) Seguimiento

En el seguimientode pacientestratadoscon terapiaintravesical,uno delos métodosconvencionalmenteutilizados es el de los lavadosvesicales.

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30

25

20

15

10

5

OGRADO1,11 GRADO111,1V

DIPLOIDE AN EU PLO IDE

Fig. 3.—Relaciónentregradohistológicoyploidia en elcarcinomaurotelial.

20

15

10

5

0

r~u n~ClDIVA

DIPLOIDE m ANEUPLOIDE

Fig 5 — Correlacion entreploidíayrecidivoen carcinomaurotelial.

~SIADlOA ~IAUlOB

DIPLOIDE ANEUPLOIDE

Fig 4 —Relaciónentreploidíayestadiodeinfiltración.

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<6,5% >10,8%

Fig. 6.—Relaciónentre%decélulasenfáse 5 y recidivotomoral.

Ademásdel estudiocitológico, estasmuestrasson susceptiblesde procesa-miento paraanálisisde ADN con buenosresultados,como seha expresadoanteriormente~La utilizáción rútinariadeestametodologíahasido propuestapor algunosautores(26).

La desapariciónde unalíneacelularaneuploideen un pacientecuyo tu-mor original la tenía,permiteasumirqueel tratamientoes efectivo.De espe-cial utilidad se muestraestatecnologíaen la monitorizacióndel tratamientode pacientescon carcinomain situ, o entumoresdealto gradoenfaseno in-vasiva(24,26).

Comoresumen,y haciendoreferenciaa la última reuniónde consensode citometriade ADN en cáncerde vejiga (27), podemosconcluirque lacitometríano se debe utilizar como método de rastreo en hematurias,niutilizando muestrasde orina espontánea,ni las procedentesde lavadosve-sicales.Debe reservarseestatécnicapara aquellospacientescon antece-dentesde carcinomavesical o con fuerte sospechade tenerlo. Hay unabuenacorrelaciónentrela ploidia de ADN y el gradohistológicoy estadio,residiendosu mayor utilidad en aquelloscasosde gradoshistológicosin-termediosy estadiosde infiltración superficialsin afectaciónmuscular.Enestoscasos,la presenciade poblacionescelularesaneuploidespermitees-tratificar los pacientessegúnel riesgode recidiva y pronóstico.La utilidadpronósticade la determinaciónde la fracciónde célulasenfase5 no es tanclara.

En estareunión, seha reconocidola importanciadela ploidia de ADNenel seguimientodelos pacientes.En loscasosde carcinomasuperficialtra-tadosde formaconservadora,la apariciónde un histogramaaneuploidenotetraploideen el lavadovesical, indicarecidiva.La obtencióndeun histogra-madiploide conun histogramatumoral previo aneuploide,significa unabue-narespuestaal tratamientointravesical.

9SCitometríadeflujo en urología

IV.2. Carcinomade Próstata

Clásicamente,se ha consideradoqueel parámetropronósticomásvalio-soes el estadiajeclínico. Desdeel puntode vistahistopatológico,existeunaclaraasociaciónentretumoresde bajo gradoy buenpronóstico,y entreneo-plasiasde alto gradoy mayor agresividadclínica. Sin embargo,los tumoreslocalizadosy de gradosintermediosde malignidad,tienenunarespuestairre-gularal tratamientoy unaevoluciónmuyvariable.Poresarazón,sehanbus-cadonuevosparámetrosclínicos ehistológicosqueaportenunamayor infor-maciónpronóstica.Algunos estudios,hansugeridoque la cuantificacióndeADN concitometríadeflujo aportadichainformación(28,29).

La realizaciónde estetipo de análisis seha llevado a cabocon materialprocedentede PunciónAspiración con Aguja Fina (PAAF), muestrasenfrescoy tejido incluido enparafina(29). Comoocurreenotros tumoressóli-dos, seha observadounamenorcalidaden los histogramasprocedentesdebloquesde parafina,sin embargo,numerososautoresy nosotrosmismoshe-mosencontradounabuenacorrelaciónentremuestrasen fresco e incluidasen parafina,por lo que se demuestra,que estetipo de muestraes válido yaportala ventajade poderrealizarun análisisretrospectivocon especialva-lor en el carcinomade próstata,que puedepresentarun cursoclínico muyprolongado.

Se haencontradoen lasneoplasiasprostáticasunabuenaasociaciónentregradoy ploidia. Conpocasexcepciones,lostumoreslocalizadosy debajogra-do sondiploides. Los de alto gradoson, en un alto porcentaje,aneuploides.En los de gradosintermedios,los patronesde ADN sonmásvariablesy exis-ten con frecuenciaformastetraploides(4n)(29).Aunqueno todoslosautoreshacendiferenciasentreaneuploidíay tetraploidia,en el carcinomade prósta-ta, estadistinciónesútil, ya quelaaneuploidiano tetraploide,pareceasociadaa un mayorgradodeagresividadenel comportamientotumoral (29).

En pacientescon enfermedad localizada, la cuantificaciónde ADN per-mite estratificar,segúnalgunosautores,engruposdealto y bajo riesgo,mien-trasotros no reconocena éstamayorvalor que el gradohistológico.La con-troversiaen losresultadosse explica,en parte,por las diferentesmodalidadesterapéuticasutilizadasy distintasmetodologíasde análisis(29-31).Entrepa-cientestratadosconprostatectomiaradical y linfadenectomíapélvica, la pre-senciade aneuploidíasno empeorasignificativamentela supervivencia(32).Montgomerydemuestra,sin embargo,unaasociaciónestadisticamentesigni-ficativaentreprogresióndela enfermedady aneuploidía(30).

La aportaciónde la citometria de flujo en estetipo de pacientesno es,por tanto,muy claraen cuantoa suvalor como factor pronósticoindepen-dientey debemoscitar quela mayoríade los autoresreconocenla vigenciadela gradaciónhistológica.

En los pacientescon neoplasialocalizaday que sonsometidosa radia-ción, seha intentado,sin éxito, predecir,de acuerdoa los histogramasobte-nidos, la respuestaa la radioterapia(32,33).Se ha constatadoenestoscasos,

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la mayor incidenciade poblacionesaneuploidesdespuésde la radiación,sinquesehayaofrecidounaexplicacióna estehecho.En los quehanseguidote-rapiaendocrina,el patróndiploide esmucho másfrecuenteenpacientesconsupervivenciasuperiora S años.

En los enfermosen estadioC, sí se ha encontradounaclaraasociaciónentreaneuploidiay recidivay supervivencia.En estegrupo,tantolostumoresaneuploidescomo los tetraploidesmostraronpeor pronóstico.Los mismosresultadossehanobtenidoenpacientesconmetástasisenestadioDl (29).

Tribukait y cols, en su trabajosobrepacientesinicialmenteno tratados,recogedatossimilaresen las correlacionesestadísticas,peroademás,muestraunaalta tasade transformacionesdel patrónde ploidía, que sigue,habitual-mente,el patrón diploide-tetraploide-aneuploide,y también,habitualmente,conprogresiónenelgradohistológico(19,34).

En resumen,la aportaciónde la citometriade flujo en el manejode lospacientescon cáncerde próstata,no seencuentratotalmenteaclarada,aun-quesi existendatosdebuenacorrelaciónentrela ploidia, el gradohistopato-lógico y el estadiajeclínico. En la actualidad,creemosqueno sepuedeconsi-derarel análisisdeADN comoun factorpronósticoindependiente.

IV.3. Carcinomade célulasrenales

El primerhallazgorelevanteenla cuantificacióndel ADN concitometriadeflujo es la granheterogeneidadendiferentesáreasdel tumor,lo queobligaaun amplio muestreodel mismo (3S).

La incidenciade tumoresaneuploidesen las diferentesseriesoscilaentreel 45% y el 74% (35,36,37).Segúnlos resultadospublicadosen la literatura,no estáclaroqueexistaunacorrelaciónentrecitometriade flujo y paráme-tros clásicoscomo grado de Furhman,estadio de Robsony clasificaciónTNM (38,39).Sin embargo,sí existecorrelaciónestadisticamentesignificati-vaentreploidiay supervivencia(40).

Ljunbergy cols. (36), realizaronun análisisde tumorescon metástasis,estudiandomuestrasdel tumororiginal y delas metástasis.El S3%delos tu-moresprimarios mostraronalgunapoblacióncelularaneuploide.En las me-tástasisobservaronun 69% de aneuploidías.Entre los tumoresprimariosque resultarondiploides, seencontraronun 60% de aneuploidíasen las me-tástasis.Porel contrario,enlos tumoresaneuploides,el 23%de susmetásta-sis, mostraronun patróndiploide. Estosdatos,ademásde confirmarla granheterogeneidadquemuestrael carcinomade célulasrenales,permitehaceralgunasobservacionesen relacióncon el pronóstico.En el estudioestadísti-co llevadoa c&oo en estetrabajo,secompruebaqueel parámetrocón mayorvalor es laploidia dela lesiónmetastásica.Los pacientesconhistogramasdi-ploidesen las metástasis,lograronunasupervivenciade 31 meses,mientrasaquellosconaneuploidiassólo alcanzabanunasupervivenciamediade 11,5meses.

Citometríadeflu/oenurología 97

Lasconclusionesanteriormentecitadasno soncompartidaspor otrosau-tores(37), queno reconocenasociaciónentrela ploidiay supervivencia.Re-cientemente,se hapublicadoun estudio(41) en elquese realizabaun análisisbivariante,considerandocantidaddeADN y capacidaddeincorporacióndebromodeoxiuridina(BrDU). La BrDU es un análogode la timidina, y portanto,escaptadaporaquellascélulasquese encuentranenfasede síntesisac-tiva de ADN. La cuantificaciónde estascélulasinforma sobrela verdaderacapacidadproliferativa de la neoplasia.Los resultadosdel citado estudio,muestranunamejor correlaciónde los nivelesde BrDU con los parámetrospronósticosclásicosqueel estudioaisladode la ploidia. Curiosamente,no seencontrarondiferenciassignificativasentretumoresdiploidesy aneuploidesen la incorporaciónde BrDU. El corto períodode seguimientode los pa-cientesde esteestudio,no permiteasegurarsi el modelode análisisbivariantepropuestoaportaefectivamenteunainformaciónpronósticaadecuada.

Un temacontrovertidoen la patologíarenalneoplásicaes la existenciaono de los adenomas.Convencionalmente,se consideraadenomaaaqueltu-mor de célulasrenalesmenorde 3 crus.,basándoseenel hechodequelostu-moresdeestetamaño,excepcionalmente,metastatizan.Con el desarrollodelas técnicasde imagen,cadavez más sofisticadas,se descubrenfrecuente-mentetumoresde estacategoría,en los que es deseableconocersu posiblecomportamientobiológico.

Ellis y cols. (42), hanpublicadorecientementeun estudiorealizadosobre26 tumoresde menos de 3 cms procedentesde extirpacionesquirúrgicas,constituyendola seriemásamplia recogidaenla bibliografía.En susresulta-dos,apareceunaincidenciade aneuploidiasde 32%muypróxima a la descri-ta enlos tumoresde másde 3 cms.La fase5 delostumoresaneuploidestam-bién se encuentraanormalmente elevaday muy próxima a la de losconsideradoscarcinomas.Estosautoresconcluyenqueseha deabandonareltérmino de adenomay considerara estostumorespotencialmentemalignos.No se hacereferenciaen el citado trabajoal comportamientobiológico delos tumoressujetosde estudio,quefueron sometidosaun seguimientocorto,conlo que,no pareceposible,en el momentoactual,adoptaractitudestera-péuticasdiferentesenlostumoresde menosde 3 cmsdediámetrobasándoseenelpatróndeploidia.

En los oncocitomasconsideradostradicionalmentebenignos,los estu-dios publicadosno aclarantampocoel valor de la citometria de flujo comoparámetropredictivode evolución,habiéndoseencontradoun 10% de aneu-ploidíasen tumoresconseguimientolargo y quese hancomportadode for-mabenigna(43).

En resumen,sepuedeconcluir queen el carcinomade célulasrenales,el estadiajeen el momentodel diagnóstico,siguesiendo el datomásvalio-so, desdeel puntode vistapronóstico.Sin embargo,sepuedeafirmar quelaploidiadel tumorprimariose correlacionaconel desarrollodeenfermedadmetastásicay la ploidía de las metástasisse correlacionancon la supervi-vencía.

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IV.4. Tumorestesticulares

Existenpocosestudiosde tumorestesticularescon citometríade flujo.En los tumoresde célulasgerminales,los resultadospublicadoscoincidenenuna incidencia muy elevadade aneuploidias,que oscila entreel 70% y el9S%. (44-46).Estaproporcióndetumores,con cantidadanormaldeADN,hacequeno puedaserconsideradoesteparámetrocomode interéspronósti-Co (45). Algunosautoresconsideranla fracciónproliferativa (porcentajedecélulasen fase 5) como datodiscriminatorio,ya queaquellospacientesconfase5 elevadamostraronunasupervivenciasignificativamentemenor.

La citometriade flujo se muestrapotencialmenteeficazen la detecciónde carcinoma<‘in situ” de célulasgerminales.Nagler y cols. (47) en unasertede 25 pacientes,a los quese realizabiopsiapor aspiracióndel testiculoparaestudiode infertilidad mediantecuantificaciónde ADN, detectanun casodecarcinoma«in situ’> por la presenciade picosanómalosen el histograma.An-teriormente,sehabíaintentadola detecciónprecozdecarcinoma“in situ<> enpacientesde alto riesgo(esterilidad,tumorcontralateral,etc)aplicandola ci-tometriade flujo al análisis desemen(48). Demostraronaneuploidíaen 50%de los pacientescon carcinoma“in situ”. La posibilidad de falsos negativoscon estatécnica,haceque no seaun buen sistemade rastreo de carcinoma‘<in situ>< de célulasgerminales,si biense tratade unaseriemuy corta,cuyosresultadosdeberíansercomprobados.

JV.S. Tumoressuprarrenales

Comoen otros órganosendocrinos,la clasificaciónde los tumoresde lacortezasuprarrenalenbenignosy malignos,puedeser difícil basándoseúni-camenteencriteriosde atipiacitológica.Porello, seha intentadola cataloga-ción delos mismosutilizando la citometríadeflujo, tantoparael diagnóstico,como paraintentarpredecirel comportamientobiológico.

Comoenel carcinomade célulasrenales,se hademostradounagranhe-terogeneidaden lacargade ADN en poblacionescelularestumorales.Prácti-camente,todos los carcinomasmostraronunao más poblacionesaneuploi-des.En losadenomassedescribenpoblacionestetraploides,sinevidenciadeaneuploidesno tetraploides,por lo que algunosautoresreconocenun valordiagnósticoa la citometriadeflujo (49). Estasconclusionesno soncompleta-mentecompartidasporotros autores,quedemuestranhastaun 15% de aneu-ploidías en adenomas(50). Los carcinomascon poblacionesaneuploidesmostraronen diferentesestudiosun comportamientomásagresivo(49-Sl).

Recientemente,se ha publicadounaseriemuy ampliade feocromocito-masestudiadoscon citometríade flujo. En 184 casosde estaneoplasia,y ana-lizandomaterial incluidoen parafina,los autoresconcluyenquelos tumoresaneuploides(incluyendoen estacategoría,los tetraploides)sonmásfrecuen-tes enlos casosfamiliareso asociadosa otrasneoplasiasendocrinas.El 32%

Citometríadeflujo enurología 99

de estospacientesmostraronprogresiónde la enfermedado muertepor eltumor. Todoslos tumoresconrecurrenciao queocasionaronla muertedelpacienteerananeuploides.Porel contrario, los tumoresdiploides, siguieronun cursoclínico excelentetras la cirugía. Basándoseen estosresultados,seproponeincorporarla cuantificaciónde ADN por citometríade flujo alestu-dio rutinariodeestospacientes(52).

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