CONTROLES DE CALIDAD Taller 3

Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca)María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca)María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca)Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)

Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD

Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidosnucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.

Dra. María Pérez Caro. Área de Control de CalidadBanco Nacional de ADN Carlos III‐ Universidad de Salamanca

12 de Noviembre de 2014

Cuando tratamos el control de calidad tenemos que distinguir entre:

PUREZA: ausencia de contaminantes

INTEGRIDAD:  banda única de gran tamaño (DNA) /relación 28S:18S 2:1 (RNA)

FUNCIONALIDAD: que la solución sea apta para realizar los ensayos que se propongan.

CONCENTRACIÓN

• El término calidad engloba concentración, pureza e integridad.

• En el DNA y RNA el análisis de la calidad, tradicionalmente, comprende electroforesis y análisis del ratio 260/280 

• En el RNA concretamente,  se determina la calidad del rRNA (>80% ribosómico y 1‐3% mRNA)

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‐D.O A260/230 ~2,0

< 1.5  (contaminación sales, comp. orgánicos)

PUREZA ÓPTIMA

‐CONCENTRACIÓN Y PUREZA: RELACIÓN ABSORBANCIAS

PUREZA ÓPTIMA‐D.O A260/280 2.0‐2.1

1.8 Pureza aceptable

< 1.8 Contaminación comp. aromáticos

‐INTEGRIDAD DNA RNA

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‐FUNCIONALIDAD

5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente

amplificación en 6 cromosomas diferentes

amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb

Long PCR Múltiple: DNA

M

RT‐PCR  oligos inter‐exónicos: RNA

Agilent 2100 bioanalyzer combina técnicas de electroforesis capilar y fluorescencia.

•Evalúa calidad e integridad.•Requiere de muy poca cantidad de muestra.•Da valores numéricos a las imágenes que se ven habitualmente‐RIN (RNA Integrity Number) 

RIN < 4  RNA baja calidad

RIN > 7  RNA alta calidad (arrays)

RIN 4‐7 RNA calidad media (qRT‐PCR)

Técnicas de microfluídos

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•Uso de geles multi‐línea y microfluidos que permiten un ensayo semi‐automático. •Simplifica el manejo de muestras y reduciendo los tiempos de ensayo. 

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Tapestation‐Agilent

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TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOSControl de calidad del RNA

OBJETIVO:Comprobar fiabilidad y repetitividad: RIN y concentración

• 5 muestras RNA (diluciones)• extraídas por métodos diferentes• analizadas por duplicado• y en días distintos

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Well RINe Conc. [ng/µl]

Sample Description Replicas Datos Bioanalyzer

A1 7,2 168 ladder [1]/[2] RIN []B1 6,1 114 28853 patol 0.9 7.5 95ng/ul

C1 6,1 123 28853 patol

D1 6,3 61,4 28853 patol 1/2 1.1 6.9 44ng/ul

E1 6,4 55,7 28853 patol 1/2

F1 6,4 31.0 28853 patol 1/4 1 7.1 27ng/ul

G1 6,4 31.0 28853 patol 1/4

H1 1,8 75,8 28854 patol 1 2.4 97 ng/ul

A2 2,1 79,2 28854 patol

B2 1,8 52,4 28854 patol 1/2 1.3 2 50 ng/ul

C2 1,7 41,4 28854 patol 1/2

D2 1,4 27,5 28854 patol 1/4 1 1.1 27 ng/ul

E2 1,7 28,5 28854 patol 1/4

F2 6,4 107 28855 norm 0.9 7.5 78ng/ul

G2 6,5 94,7 28855 norm

H2 6 56,3 28855 norm 1/2 0.9 N/A 14ng/ul

A3 6,3 61,4 28855 norm 1/2

B3 6,6 26.0 28855 norm 1/4 1 N/A 7ng/ul

C3 6,5 26,9 28855 norm 1/4

D3 7,9 250 28849 neutro 1.1 7 209ng/ul

E3 8 228 28849 neutro

F3 8,1 105 28849 neutro 1/2 1.1 7.8 58ng/ul

G3 8,1 97,9 28849 neutro 1/2

H3 7,8 55,5 28849 neutro 1/4 1.1 7.7 29ng/ul

A4 7,8 52.0 28849 neutro 1/4

B4 7,7 147 28849 mono 1.1 8.6 100ng/ul

C4 7,7 131 28849 mono

D4 8,2 61,5 28849 mono 1/2 1.1 8.1 55ng/ul

E4 8,2 58,2 28849 mono 1/2

F4 7,9 33.0 28849 mono 1/4 1 8.8 24ng/ul

G4 8 33,9 28849 mono 1/4

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El análisis de las medidas de concentraciónaportada por bioanalizador y tapestation de• lasmismas muestras,• por duplicado• y en días distintos,determinó la baja reproducibilidad entre ambastécnicas, resultando ser la medida más estable laaportada por el nanodrop.

DIA 1 DIA 2Tape 1 Tape 2 Tape 1 Tape 2 Agilent Agilent

muestras concentración concentración concentración concentración concentración concentración28853 patol 114 123 91 129 95 12228853 patol 1/2 61,4 55,7 46,4 68 44 6128853 patol 1/4 31 31 19,7 38,2 27 4528854 patol 75,8 79,2 50,5 78,2 9728854 patol 1/2 52,4 41,4 48,2 50,1 5028854 patol 1/4 27,5 28,5 16,8 31,2 2728855 norm 107 94,7 55,2 42,6 78 8728855 norm 1/2 56,3 61,4 62,6 31,5 14 6028855 norml 1/4 26 26,9 16,9 32,7 7 3328849 neutro 250 228 156 249 209 30828849 neutro 1/2 105 97,9 104 69,1 58 14628849 neutro 1/4 55,5 52 18,1 29,7 29 7328849 mono 147 131 58,1 51 100 8028849 mono 1/2 61,5 58,2 34,6 28,1 55 3128849 mono 1/4 33 33,9 19,3 12,2 24 40

DIA 1 DIA 2

Well RINe Conc. [ng/µl]

Sample Description RINe/RIN Observations

A1 7,2 168 ladder RIN []B1 6,1 114 28853 patol 0,84 7.5 95ng/ul

C1 6,1 123 28853 patol

D1 6,3 61,4 28853 patol 1/2 0,89 6.9 44ng/ul

E1 6,4 55,7 28853 patol 1/2

F1 6,4 31.0 28853 patol 1/4 0,93 7.1 27ng/ul

G1 6,4 31.0 28853 patol 1/4

H1 1,8 75,8 28854 patol 2.4 97 ng/ul

A2 2,1 79,2 28854 patol

B2 1,8 52,4 28854 patol 1/2 2 50 ng/ul

C2 1,7 41,4 28854 patol 1/2

D2 1,4 27,5 28854 patol 1/4 1.1 27 ng/ul

E2 1,7 28,5 28854 patol 1/4

F2 6,4 107 28855 norm 0.82 7.5 78ng/ul

G2 6,5 94,7 28855 norm

H2 6,0 56,3 28855 norm 1/2 0.87 N/A 14ng/ul

A3 6,3 61,4 28855 norm 1/2

B3 6,6 26.0 28855 norm 1/4 0.88 N/A 7ng/ul

C3 6,5 26,9 28855 norm 1/4

D3 7,9 250 28849 neutro 1.16 7 209ng/ul

E3 8,0 228 28849 neutro

F3 8,1 105 28849 neutro 1/2 1.07 7.8 58ng/ul

G3 8,1 97,9 28849 neutro 1/2

H3 7,8 55,5 28849 neutro 1/4 0.94 7.7 29ng/ul

A4 7,8 52.0 28849 neutro 1/4

B4 7,7 147 28849 mono 0.89 8.6 100ng/ul

C4 7,7 131 28849 mono

D4 8,2 61,5 28849 mono 1/2 0.93 8.1 55ng/ul

E4 8,2 58,2 28849 mono 1/2

F4 7,9 33.0 28849 mono 1/4 0.87 8.8 24ng/ul

G4 8,0 33,9 28849 mono 1/4

Taller 3: CONTROLES DE CALIDADEvaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.

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CONCLUSIONES:

Resultados obtenidos en el BNADN muestran cómo las mismas  muestras de RNA analizadas en días diferentes, en ambas plataformas, NO reproducen la  concentración entre réplicas (a pesar del que cumplen con las especificaciones del aparato)…

… pero SÍ reproduce los valores de RIN/ RINe en el RNA, siendo la diferencia entre ambos ~1

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOSControl de calidad del DNA

TAPESTAT

ION‐AGILEN

T

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Sample Description

Ratio Picogreen/ TapeStation

Ratio Nanodrop/ TapeStation

RatioPicogreen/ Nanodrop

1 1,1 1,2 0,912 1,2 1,2 0,943 1,3 1,3 0,974 1,2 1,2 0,985 1,1 1,1 0,966 1,2 1,4 0,877 1,3 1,3 18 1,3 1,4 0,939 1,2 1,4 0,85

10 1,5 1,7 0,89

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CONCLUSIÓN:

Cada sistema de análisis aporta resultados diferentes, NO COMPARABLES,de ahí la importancia de utilizar siempre la misma plataforma, conociendo 

sus ventajas e inconvenientes.

DIRECCIÓN:Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos

PERSONAL DE LABORATORIO:Javier García Palomo

Teresa Malvar Ferreras

Mª Teresa Márquez de Sousa

Sheila Mateos Domínguez 

Mª Isabel Morante Arroyo

COORDINACIÓN TÉCNICA:Dr. Andrés García MonteroDra. María Almeida Parra

CONTROL DE CALIDAD:Dra. Rosa Pinto LabajoDra. María Pérez Caro

SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN:Elena Chamorro Castro

GESTIÓN DE CALIDAD:

Ana Regalado Mayordomo

www.bancoadn.org

¡GRACIAS!