SEIMC cap3a

I

Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinadora: Elena Loza Fernández de Bobadilla Autoras: Elena Loza Fernández de Bobadilla

Ana Planes ReigMarta Rodríguez Creixems

ISBN: 84-609-2289-8

II

INDICE DEL DOCUMENTO CIENTIFICO

1. Introducción2. Bacteriemia3. Indicaciones de los hemocultivos4. Obtención de la muestra de sangre

4.1. Venopunción4.1.1. Asepsia de la piel4.1.2. Extracción de la muestra de sangre

4.2. Número e intervalo de las extracciones4.3. Volumen y dilución de la sangre

5. Transporte del hemocultivo al laboratorio6. Recepción y registro de los hemocultivos 6.1. Inspección inicial 6.2. Criterios de rechazo 6.3. Normas de seguridad7. Procesamiento de los hemocultivos

7.1. Métodos de hemocultivos 7.1.1. Manuales 7.1.1.1. Convencional 7.1.1.2. Bifásico

7.1.1.3. Lisis-filtración 7.1.1.4. Lisis-centrifugación 7.1.1.5. Manométrico 7.1.2. Sistemas automáticos 7.1.2.1. Radiométricos y no radiométricos 7.1.2.2. Sistemas automáticos de monitorización continua

7.2. Hemocultivos positivos7.2.1. Tinción de Gram y otras tinciones7.2.2. Subcultivos7.2.3. Identificación y antibiograma preliminares7.2.4. Informe preliminar7.2.5. Identificación e informe definitivo

7.3. Informe de los hemocultivos negativos8. Interpretación de los resultados9. Microorganismos y situaciones especiales

9.1. Brucelosis9.2. Tularemia9.3. Leptospirosis9.4. Bartonelosis9.5. Bacterias deficientes en pared9.6. Abiotrophia

9.7. Bacterias dependientes de antibióticos 9.8. Micoplasmas

9.9. Micobacterias9.10. Leishmaniasis9.11. Hongos9.12. Virus9.13. Endocarditis9.14. Bacteriemia asociada a catéter

10. Control de calidad10.1. Manuales y normas10.2. Análisis de los datos

11. Bibliografía

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INDICE DEL DOCUMENTO TÉCNICO 1. Propósito y alcance2. Fundamento3. Documentos de consulta4. Toma de la muestra

4.1. Preparación del material4.2. Obtención de la sangre

4.3. Envío de los hemocultivos al laboratorio4.4. Recepción y registro de los hemocultivos

5. Medios de cultivo, reactivos y productos5.1. Medios de cultivo5.2. Reactivos5.3. Otros

6. Aparatos y material7. Procesamiento

7.1. Introducción de los hemocultivos en el sistema7.2. Extracción de los frascos sospechosos de crecimiento7.3. Procesamiento de los frascos positivos7.4. Lectura de placas e identificación de los microorganismos

7.5. Procesamiento de los microorganismos significativos7.6. Procesamiento de los microorganismos contaminantes7.7. Procesamiento de los frascos negativos

8. Obtención y expresión de resultados8.1. Informe preliminar de los hemocultivos sospechosos de crecimiento8.2. Informe de resultados positivos definitivos8.3. Informe de resultados negativos

9. Responsabilidades10. Anotaciones al procedimiento11. Limitaciones del procedimiento12. Bibliografía

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

3a. HEMOCULTIVOS. 2003

Coordinador: Elena Loza Fernández de Bobadilla

Autores: Elena Loza Fernández de Bobadilla Ana Planes Reig

Marta Rodríguez Creixems

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1. INTRODUCCIÓNEn el año 1993 se publicó el número 3 de los

Procedimientos en Microbiología Clínica tituladoHemocultivos. Desde entonces se han producidoimportantes cambios en la incidencia y en la etiologíade la bacteriemia y la fungemia, así como en losmétodos para detectarlas, por lo que la SociedadEspañola de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica ha considerado imprescindiblerevisar y poner al día este procedimiento teniendo encuenta todos estos aspectos. Este documento seestructura en dos apartados: el primero constituyeuna guía práctica de recomendaciones para losmicrobiólogos clínicos basada en la informaciónpublicada y el segundo se justifica por la necesidadde disponer de protocolos de trabajo normalizados(PNT) para la certificación de los laboratorios segúnlas normas ISO, pudiendo posteriormente seradaptado a las particularidades de cada laboratorio.

2. BACTERIEMIALa detección de la bacteriemia y la fungemia

constituye una de las prioridades del Servicio deMicrobiología Clínica, dada su importancia diagnósticay pronóstica ya que se asocia con una elevadamortalidad que oscila entre el 20 y el 50%.

Se define como bacteriemia la presencia debacterias en la sangre que se pone de manifiesto porel aislamiento de éstas en los hemocultivos. Eltérmino fungemia se utiliza para designar lapresencia de hongos en la sangre. Septicemia ysepsis son expresiones que se emplean paradenominar el síndrome clínico con el quehabitualmente se manifiestan las bacteriemias o lasfungemias, independientemente del resultado de loshemocultivos, por lo que en numerosas ocasionesresultan confusas y no se utilizarán en estedocumento.

La bacteriemia y la fungemia son complicacionesgraves de las infecciones bacterianas y fúngicas,respectivamente, y tienen una metodologíadiagnóstica muy similar por lo que se describirán deforma conjunta. Ambas se producen cuando losmicroorganismos invaden el torrente sanguíneo y semultiplican a un ritmo que supera la capacidad delsistema reticuloendotelial para eliminarlos. Estainvasión puede producirse desde un foco infecciosoextravascular, a través de los capilares sanguíneos ode los vasos linfáticos, o desde un foco intravascular(endocarditis, infección de catéteres intravenosos oarteriales...).

Las bacteriemias pueden ser transitorias,continuas o intermitentes según la forma en queaparecen los microorganismos en la sangre, peroesta distinción es difícil de establecer y poco prácticadesde el punto de vista microbiológico. El términobacteriemia de “brecha” se emplea cuando ésta sepresenta en un paciente que está recibiendo terapiasistémica con antimicrobianos a los cuales essensible el microorganismo aislado. Su presencia

puede ser debida a una concentración inadecuadadel antimicrobiano en la sangre, a un incorrectodrenaje del foco de infección, a la presencia deendocarditis o infección endovasular, al deterioro delas defensas del huésped, al desarrollo deresistencia al tratamiento antimicrobiano, etc.

La incidencia de la bacteriemia depende del tipode población estudiada (5-30 casos por 1000pacientes hospitalizados) y puede presentarse acualquier edad, sobre todo en pacientes con gravesenfermedades de base y en los sometidos amaniobras que alteran los mecanismos locales ygenerales de defensa frente a la infección. Los focosmás frecuentes de bacteriemia son el tractogenitourinario, los abscesos, las heridas quirúrgicas,el tracto biliar y los catéteres intravasculares, aunquehasta en un 25% de los casos su foco originario esdesconocido.

La mayoría de los microorganismos son capacesde invadir el torrente circulatorio. En la actualidad losgrampositivos, especialmente estafilococos yenterococos, igualan o superan en frecuencia a losgramnegativos. Ello es debido a múltiples causas,entre las que destacan la utilización de antibióticosde amplio espectro, el uso generalizado de catéteresintravasculares y el empleo de métodos dediagnóstico invasores. Por otra parte, el aumento depacientes inmunodeprimidos con tratamientosantineoplásicos o con infección por el VIH hapropiciado la aparición de bacteriemias por agentesque en el pasado eran causa muy rara de infección.

El diagnóstico definitivo de la bacteriemia seestablece cuando se aísla el microorganismo causalen la sangre del enfermo mediante el cultivo de ésta.El aislamiento del agente responsable estrascendente, además, para conocer su sensibilidada los antimicrobianos e instaurar el tratamiento o lasmodificaciones necesarias a la terapia empírica yaestablecida. En ocasiones puede orientar eldiagnóstico de enfermedades como la neoplasia decolon (asociada a bacteremia por Streptococcusbovis), endocarditis (estreptococos del grupoviridans) e incluso infeción por el VIH (Salmonella,enterococo). Por otra parte, permite, en la mayoríade las ocasiones, la diferenciación de los casos deverdadera bacteriemia de aquellos en los que lapositividad es debida a un inadecuado procedimientode extracción y procesamiento.

3. INDICACIONES DE LOS HEMOCULTIVOSSería imposible detallar todas las situaciones en

las que se deben extraer hemocultivos, pero, deforma general, deben realizarse, antes de laadministración de la terapia antimicrobiana sistémica,siempre que exista sospecha clínica de sepsis,meningitis, osteomielitis, pielonefritis, infecciónintraabdominal, artritis, infecciones graves de la piel ytejidos blandos, neumonía, endocarditis y fiebre deorigen desconocido (absceso oculto, fiebre tifoidea,brucelosis, tularemia, etc.). Los signos que orientan

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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esta sospecha incluyen fiebre o hipotermia(neonatos, ancianos), escalofríos, leucocitosis ogranulocitopenia, deterioro uni o multiorgánico deetiología no aclarada, shock, compromisohemodinámico de causa desconocida ycombinaciones de algunos de ellos.

La extracción de hemocultivos está indicada,asimismo, en niños pequeños o ancianos condisminución súbita de la vitalidad, ya que en estaspoblaciones pueden no presentarse los signos ysíntomas típicos de la bacteriemia.

El cultivo de la sangre debe complementarse conel de otros fluidos como líquido cefalorraquídeo,orina, muestras del tracto respiratorio inferior olíquido sinovial en pacientes con sospecha demeningitis, pielonefritis, neumonía o artritis séptica,respectivamente.

4. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRELa probabilidad de que el resultado de los

hemocultivos positivos representen una bacteriemiaverdadera aumenta cuando la muestra se obtieneadecuadamente. Algunos estudios sugieren que elmomento óptimo para la extracción de hemocultivoses exactamente antes del inicio de los escalofríos.Como este hecho es imposible de predecir conexactitud, se recomienda que la sangre para cultivosea extraída lo antes posible después del comienzode la fiebre y los escalofríos, o siempre que sesospeche una infección grave. No obstante, elmomento de la extracción de la muestra de sangrees indiferente si la bacteriemia es continua como enla endocarditis u otras infecciones intravasculares yen las primeras semanas de la fiebre tifoidea o labrucelosis.

No ocurre lo mismo en la bacteriemiaintermitente, que se presenta en diferentesinfecciones, y en la bacteriemia transitoria,generalmente autolimitada y benigna, que sueleproducirse después de manipulaciones ensuperficies mucosas no estériles (procedimientosdentales o urológicos, endoscopias), en tejidosinfectados (abscesos, forúnculos, celulitis) o encirugía de áreas contaminadas. En ambos casos,que constituyen la mayoría de las bacteriemias, lamuestra de sangre debe extraerse lo más cercaposible del pico febril.

4.1. VENOPUNCIÓNLa muestra de sangre para hemocultivo debe

extraerse de una vena, utilizándose generalmente lasdel antebrazo. La utilización de sangre arterial no hademostrado ventajas sobre la venosa. La extracciónno debe realizarse a través de catéteresintravenosos o intaarteriales, salvo en los casos desospecha de bacteriemia asociada a catéter(apartado 9.14). Cada muestra de sangre seobtendrá de lugares de venopunción diferentes.4.1.1. Asepsia de la piel.El principal problema para la interpretación correcta

de los hemocultivos es su contaminación con lamicrobiota cutánea durante la extracción. Paraevitarla debe prepararse antes meticulosamente lapiel de la zona de extracción. Después de lapalpación de la vena elegida para la punción selimpiará la zona con alcohol isopropílico o etílico de70º durante 30 segundos. Se aplicará a continuaciónuna solución yodada (tintura de yodo al 1-2% durante30 segundos o povidona yodada al 10% durante 1minuto) cubriendo un área circular de 2-4 cm dediámetro. Es importante dejar secar el compuestoyodado para que ejerza su acción oxidante y evitartocar con los dedos el lugar de la venopunción, asícomo hablar o toser mientras se realiza la extracción.En pacientes alérgicos a los compuestos yodados sedeben realizar dos limpiezas con alcohol isopropílico.

Con una técnica aséptica correcta, el número dehemocultivos contaminados no debe exceder del 3%.En general, se consideran microorganismoscontaminantes Staphylococcus coagulasa negativa,Bacillus spp., Propionibacterium acnes,Corynebacterium spp. y otros que forman parte de lamicrobiota de la piel, siempre que su presencia no serepita en más de una muestra por paciente.4.1.2. Extracción de la muestra de sangre.Antes de proceder a la extracción se limpiarán lostapones de los frascos de hemocultivo con unantiséptico que se dejará secar para evitar suentrada en el interior del frasco al inocular la sangre.Se ha demostrado que la introducción de pequeñascantidades de antiséptico en el frasco puede inhibirel crecimiento bacteriano. A continuación se insertarála aguja en la vena elegida y se extraerá el volumende sangre sin utilizar anticoagulante. No debeponerse algodón u otro material no estéril sobre laaguja en el momento de sacarla de la vena. Losfrascos de hemocultivo deben inocularserápidamente para evitar la coagulación de la sangreen la jeringa, atravesándolos con la aguja enposición vertical. Diferentes estudios demuestran queel cambio de agujas no disminuye la tasa decontaminación y aumenta el riesgo de pinchazoaccidental y otros sugieren lo contrario. Se inocularáen primer lugar el frasco anaerobio, evitando laentrada de aire, seguido del aerobio, invirtiéndolosvarias veces para mezclar la sangre y el medio decultivo.

4.2. NÚMERO E INTERVALO DE LASEXTRACCIONESSe considera una extracción para hemocultivo a lasangre extraída de una única venopunción,independientemente de los frascos en los que seainoculada, habitualmente dos (aerobio y anaerobio).El número de extracciones considerado óptimo parala documentación de un episodio de bacteriemia esde 2 a 3, utilizando siempre lugares diferentes devenopunción. De este manera logran detectarse másdel 95% de las bacteriemias. Un mayor número deextracciones es desaconsejable desde el punto de

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vista coste/beneficio e incrementa innecesariamenteel trabajo del laboratorio. No obstante, en lospacientes con sospecha de endocarditis sobreprótesis, donde puede ser difícil interpretar elaislamiento repetido de estfilococos coagulasanegativa, o en casos de endocarditis conhemocultivos inicialmente negativos que pueden serdebidos a microorganismos de difícil crecimiento,puede ser útil la disponibilidad de un número mayorde extracciones.

La extracción debe realizarse lo antesposible después de la aparición de los síntomas(fiebre, escalofríos...) teniendo en cuenta que lasbacterias son eliminadas rápidamente de la sangrepor las células del sistema reticuloendotelial. Poresta misma razón no se recomiendan extraccionesseparadas por periodos de tiempo concretos, alcontrario, un estudio ha demostrado que se obtienensimilares resultados cuando se extraen loshemocultivos simultáneamente que cuando seextraen separados por periodos de tiempo arbitrariosdurante 24 horas.

Aunque la bacteriemia asociada a la endocarditisse suele acompañar de una baja cantidad demicroorganismos en la sangre, diversos estudiosdemuestran que no es necesario un número mayorde hemocultivos que el recomendado paradiagnosticarla.

Siempre que sea posible, las extraccionesdeben realizarse antes de la administración deantimicrobianos.

4.3. VOLUMEN Y DILUCIÓN DE LA SANGREDe todas las variables que influyen en el

aislamiento de una bacteria u hongo en unhemocultivo, el volumen de sangre cultivada es lamás importante debido al bajo número demicroorganismos presentes en la mayoría de lasbacteriemias. La mayor parte de los escasosrecuentos realizados muestran cifras próximas a 10UFC/ml de sangre o inferiores y muy rara vez sesuperan 100 UFC/ml. En niños las cifras son muyvariables. Se han descrito recuentos superiores a1.000 UFC/ml en bacteriemias por Haemophilusinfluenzae o Neisseria meningitidis y por el contrariobacteriemias con escasísimo número demicroorganismos.

El volumen recomendado por cada venopunciónen adultos es de 10 ml, ya que con volúmenesmenores se ha demostrado una disminución delíndice de positividad. Se considera que el índice depositividad aumenta entre el 3-5% por cada mililitroadicional de sangre cultivada. Sin embargo, larecomendación de elevar el volumen de sangre porextracción no se aplica, en cierta medida por laanemia que se puede provocar al paciente y paramantener la proporción de volumen sangre/medio decultivo.

En neonatos y niños, se ha preconizado que lamayor cantidad de bacterias presentes en sangre

permite que con volúmenes considerablementemenores, incluso inferiores a 1 ml, se obtenganresultados aceptables y comparables a los de losadultos. Sin embargo, algunos trabajos handemostrado que la bacteriemia de bajo nivel es muycomún en la población pediátrica y que el volumende sangre para detectarla debe ser proporcional alpeso (al volumen de sangre total) y a la edad. Serecomienda cultivar un volumen de sangreaproximadamente del 4,5% del volumen total desangre del paciente.

La dilución de la sangre en el medio de cultivo esnecesaria para neutralizar sus propiedadesbactericidas. En los pacientes en tratamiento conantimicrobianos esta dilución permite, además,conseguir que la presencia de éstos se reduzcahasta alcanzar concentraciones subinhibitorias. Ladilución final recomendada es de 1/5 a 1/10(volumen/volumen) ya que diluciones <1/5 reducen lapositividad.

5. TRANSPORTE DEL HEMOCULTIVO ALLABORATORIO

Cada hemocultivo o extracción (dos frascos) conla sangre inoculada debe ser debidamenteidentificado con los datos del paciente (número dehistoria clínica, nombre y apellidos, servicio, planta,número de cama), así como el nombre del médicoque lo solicita, el diagnóstico del paciente, eltratamiento antimicrobiano que está recibiendo y eltipo de análisis que se requiere (hemocultivoconvencional o para microorganismos de crecimientolento). También se hará constar el número deteléfono del control de enfermería en el que seencuentre ingresado para poder informar losresultados preliminares de los hemocultivos en casode positividad. Si los hemocultivos se extraen en elServicio de Urgencias y el paciente es dado de alta,se anotará el número de teléfono donde pueda serlocalizado en caso de positividad del hemocultivo.

Los frascos, con su debida identificación, debentransportarse al laboratorio inmediatamente. Sólodeben mantenerse a temperatura ambiente durantecortos periodos de tiempo para no afectar la posteriorrecuperación de los microorganismos. Si no puedenser enviados inmediatamente al laboratorio seincubarán en una estufa a 35-37ºC hasta esemomento. Los hemocultivos que van a serprocesados en sistemas automáticos puedenmantenerse a temperatura ambiente o a 35-37ºC. Eltiempo máximo que pueden permanecer atemperatura ambiente antes de ser introducirlos en elsistema no ha sido definido con exactitud, peronunca debe superar las 18 h. Si han sido incubadosa 35-37ºC, deben ser introducidos en los aparatosautomáticos antes de que transcurran 12 h. En loscasos en que la introducción de un hemocultivo enun sistema automático se demore más de 18 h,sobre todo si ha estado incubado a 35-37ºC, deberealizarse un subcultivo ciego para evitar un posible

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resultado falso negativo. Ello es debido a que losmicroorganismos pueden haber crecido hasta llegara la fase de meseta y no ser detectados por elsistema. Los hemocultivos nunca deben serrefrigerados.

6. RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LOSHEMOCULTIVOS6.1. INSPECCIÓN INICIALEn cuanto se reciben los hemocultivos en ellaboratorio, y antes de ser introducidos en losaparatos automáticos, los hemocultivos deben serexaminados cuidadosamente para comprobar quepueden ser manejados con seguridad, que esténíntegros, sin roturas o fisuras, que su identificaciónes correcta, que el volumen de sangre es adecuadoy para detectar macroscópicamente signos decrecimiento. Si éstos últimos no existen, los frascosse introducirán rápidamente en los aparatosautomáticos para evitar el retraso en el crecimientode los microorganismos.

6.2. CRITERIOS DE RECHAZOEn general, no se rechazará nunca un hemocultivodada la importancia del diagnóstico de labacteriemia, salvo en el caso en que haya seriasdudas en cuanto a la identificación de la muestra olos frascos estén dañados y contaminados. En elcaso de graves deficiencias en el envío de lamuestra se contactará con el servicio que la remitepara solucionarlas y después se procesará. Loshemocultivos aceptados para ser procesados seregistrarán en el sistema informático utilizado por ellaboratorio.

6.3. NORMAS DE SEGURIDADExiste un significativo riesgo biológico para elpersonal sanitario derivado de la extracción,transporte, manejo y eliminación de los hemocultivos,sobre todo por la manipulación de las agujas. Elpersonal por lo tanto deberá seguir de maneraestricta las normas contenidas en el Manual deSeguridad del Laboratorio de Microbiología Clínica(ver Procedimientos en Microbiología Clínica.Recomendaciones de la Sociedad Española deEnfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.Nº 10: Seguridad en el Laboratorio de MicrobiologíaClínica).

7. PROCESAMIENTO DE LOS HEMOCULTIVOS EINTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS7.1. MÉTODOS DE HEMOCULTIVOSEn el procedimiento número 3 referido anteriormentese describía exhaustivamente el métodoconvencional (manual) de procesamiento dehemocultivos basado en el sistema de dos frascosdescrito a mediados del siglo pasado. En laactualidad, aunque el concepto básico sigue siendoel mismo, se han desarrollado nuevos métodos cuyadescripción es el objetivo de este nuevo

procedimiento. Por todo ello, se reseñarásomeramente el método manual para detallar másampliamente los nuevos sistemas automáticos.7.1.1. Métodos manuales7.1.1.1. Convencional. Es un método técnicamentemuy simple que se basa en la observaciónmacroscópica de los signos de crecimiento de unapareja de frascos con medio de cultivo líquido en losque se ha inoculado la sangre del paciente. Existeuna amplia variedad de medios de cultivo. Los másfrecuentemente utilizados son caldo triptosa soja,Columbia, infusión cerebro corazón, Brucella,tioglicolato y caldo de peptona suplementado y enocasiones medios con resinas para neutralizar losantimicrobianos cuando el paciente está recibiendotratamiento antibiótico previo. Estudios comparativoshan demostrado que no existe un medio de cultivoque pueda considerarse superior a todos los demás.

Los frascos de hemocultivo llevan incorporado unanticoagulante, la mayoría SPS (polianetol sulfonatosódico) a una concentración del 0,006 al 0,050%,que inhibe la actividad bactericida del suero humanoy puede dificultar el crecimiento de algunosmicroorganismos como Neisseria spp.

El medio de cultivo se embotella al vacío con unaatmósfera que contiene cantidades variables de CO

2.

El potencial de óxido-reducción del medio, si no seventila, es lo suficientemente bajo como para permitirel crecimiento de bacterias anaerobias. Uno de losdos frascos, después de la inoculación, se ventila pormedio de una aguja, permitiendo la entrada deoxígeno atmosférico en su interior y la creación deuna atmósfera aerobia. La temperatura deincubación oscila entre los 35º y los 37ºC, la quemás se aproxima a la temperatura corporal y la quedemuestra un mayor aislamiento demicroorganismos durante un período más corto.

La mayoría de los potenciales patógenosresponsables de bacteriemia se aísla en loshemocultivos entre las 18 y 72 horas siguientes delinicio de su incubación. Más del 95% de losmicroorganismos se aíslan durante la primerasemana, lo que motiva que se mantenga laincubación durante 7 días. Existen, no obstante,algunos patógenos y situaciones en los que seprecisa más tiempo para su crecimiento como loshongos, microorganismos del género Brucella yalgunos microorganismos causantes de endocarditis(Cardiobacterium, Eikenella...) por lo que, ante lasospecha de cualquiera de estas circunstancias, seprolonga la incubación hasta 4 semanas.

Los frascos se observan diariamente paradetectar signos visibles de crecimiento bacterianocomo el enturbiamiento del medio, la hemólisis de loshematíes, la producción de gas o la formación decolonias en el fondo del frasco. No obstante, sólo sedetecta crecimiento macroscópico a partir de 10

7

UFC/ml.El problema de la detección macroscópica,

6

además del retraso, estriba en la presencia de falsospositivos y falsos negativos. Hay causas ajenas alcrecimiento bacteriano que pueden enturbiar elmedio o hemolizar los hematíes y, por el contrario,hay microorganismos que pueden crecer sin producirningún signo macroscópico de crecimiento. Elloobliga a complementar la visualización macroscópicacon el examen microscópico.

La técnica microscópica más utilizada es latinción de Gram. Con ella pueden visualizarsemicroorganismos cuando su concentración seaproxima a los 10

5 UFC/ml. Debido a que consume

una importante cantidad de tiempo, puede sersustituida por la tinción con naranja de acridina, conla que contrastan mejor las bacterias con el fondo yse visualizan los microorganismos conconcentraciones bacterianas de 10

4 UFC/ml. La

detección del crecimiento con naranja de acridina esmás rápida y permite obviar el subcultivo ciegorutinario tras las primeras 18-24 horas de incubación.A los 7 días de incubación, justo antes de desecharlos frascos como negativos, se realizará unsubcultivo ciego. El examen microscópico de loshemocultivos sin signos de crecimiento hademostrado ser de poco valor.7.1.1.2. Bifásico. Castañeda, en los años 40,introdujo un frasco con un medio bifásico compuestode una fase sólida y otra líquida. Al inclinar el frasco,el medio líquido cubre totalmente el medio sólido,realizando un subcultivo en el mismo cuantas vecesse desee, sin necesidad de abrir la botella. Estemedio supuso un significativo avance en el ren-dimiento de los aislamientos de Brucella spp.Posteriormente se han introducido variaciones deeste sistema como el Septi-Check (Hoffman-LaRoche) y el Opticult (Becton-Dickinson). Losfrascos se inoculan con la sangre y a su llegada allaboratorio se abre el tapón y se sustituye éste porun cilindro roscado que contiene distintas superficiescon diferentes tipos de agar. Cada día, alinspeccionar el frasco, se invierte éste para hacerque la sangre y el caldo bañen el agar y realizar asíun subcultivo.

Con este procedimiento la detección de bacteriasy hongos es tan buena o mejor que con el métodoconvencional y más rápida. Por el contrario, tiene elinconveniente de no permitir un adecuadoaislamiento de anaerobios, ya que ha de abrirse labotella para la colocación del mencionado cilindro.Necesita, por tanto, ser complementado con unfrasco con atmósfera anaerobia que garantice elaislamiento de anaerobios.7.1.1.3. Lisis-filtración. En este método, tras la lisisde las células sanguíneas, se procede a filtrar lasangre para retener las bacterias. El filtro utilizado, ofragmentos del mismo, se siembra en distintosmedios de cultivo.

Las técnicas de lisis-filtración han sido utilizadasdesde hace muchos años y el mejor resumen de susituación actual lo representa el hecho de que

todavía no han llegado a ser introducidas en elmercado. Ello es debido a que, junto a un indudablerendimiento, requieren un elevadísimo tiempo demanejo en el laboratorio, lo que las hace irrealizablescon carácter rutinario.7.1.1.4. Lisis-centrifugación. El método delisis-centrifugación es la base del sistema Isolator(DuPont). Consiste en un tubo que contienesaponina como agente lisante, polipropilenglicolcomo agente antiespumante, SPS y EDTA comoanticoagulantes y un líquido fluoroquímico inerte.Tras la inoculación de la sangre, ésta se mezcla conel contenido del tubo para conseguir la lisis de lascélulas. A continuación, para separar losmicroorganismos y los elementos sanguíneos, secentrifuga el tubo a 3.000xg durante 30 minutos.Después se desecha el sobrenadante y se siembrael sedimento en distintos medios de cultivo.

Con el sistema Isolator se consigue una mayorrecuperación de microorganismos y más rapidez quecon los métodos convencionales. Detecta más y conmayor rapidez la presencia de levaduras quecualquier otro sistema. Sus mayores inconvenientesderivan de la necesidad de procesar cada muestraindividualmente y dentro de los 30 minutosposteriores a su extracción, de su laborioso manejo yde la alta incidencia de contaminaciones que genera.El sistema es caro y por todo ello no es unaalternativa a otros métodos, pero es complementariode ellos, por las ventajas apuntadas y por la facilidadcon la que el sistema permite hacer recuentos delnúmero de colonias presentes en sangre, dato quese utiliza cada vez más en el diagnóstico de lasbacteriemias relacionadas con catéteresintravasculares.7.1.1.5. Manométrico. El método manométrico es elempleado por el sistema Signal (Oxoid). Consta deuna botella con caldo de cultivo a la que, una vezinoculada, se le acopla una pequeña cámara con unaaguja que llega hasta el fondo del medio líquido. Laproducción de gas durante el crecimiento bacterianoprovoca un aumento de la presión dentro de labotella que desplaza el medio de cultivo líquido através de la aguja introduciéndose dentro de lamencionada cámara. La presencia de medio decultivo en la cámara, por tanto, indica crecimientobacteriano de manera rápida y sencilla. Surendimiento es variable según los estudios, pero suprincipal inconveniente son los falsos positivos, quese pueden reducir calentando los frascospreviamente. Agitando los frascos los 2 primerosdías se aumenta la tasa de recuperación demicroorganismos.

7.1.2. Sistemas automáticos7.1.2.1. Radiométrico y no radiométricos. El Bactec460 (Becton Dickinson) radiométrico fue el primersistema comercial de hemocultivos automático.Utiliza substratos marcados con 14C que al sermetabolizado por los microrganismos libera 14CO

2 al

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medio, que difunde a la atmósfera del frasco. En estaatmósfera se mide periódicamenrte el nivel de 14CO

2y se expresa como un índice de crecimiento cuandose compara con los niveles de CO2 en frascos decontrol. La lectura está totalmente automatizada y serealiza por medio de una cabeza móvil provista dedos agujas que perforan los tapones de goma de losfrascos. Su principal inconveniente es el manejo yposterior eliminación de los residuos radiactivos. Enla actualidad ha sido superado por otros sistemas ysólo se utiliza para el cultivo de micobacterias.

Los sistemas Bactec NR-660 y NR-730 noradiométricos, muy parecidos al anterior, detectan elCO2 por espectrometría de infrarrojos. Utilizan unagitador para los frascos aerobios en las primeras24-48 h. Se recomiendan dos lecturas diarias losprimeros 3 días y una lectura diaria hasta que secumplan 5-7 días. Estos sistemas han sidodesplazados por los de monitorización continua.7.1.2.2. Sistemas automáticos de monitorizacióncontinua. En los últimos años se han introducidovarios sistemas comerciales que, eliminando todamanipulación, realizan agitación contínua de losfrascos, monitorización contínua con notificacióninmediata de los resultados positivos y utilizantécnicas no invasoras para la lectura. Los que sedescriben a continuación son los más ampliamenteutilizados. Se basan en la detección de la producciónde CO2 por los microorganismos y difieren en elmétodo de detección de éste, en la capacidad de losfrascos, en el tipo de medio de cultivo utilizado, en lafrecuencia de lectura y en la capacidad máxima delos incubadores (ver detalles en las tablas 1, 2 y 3).Los datos obtenidos en cada lectura se transmiten aun ordenador donde se almacenan y se analizansegún sofisticados algoritmos que determinancuándo se produce crecimiento bacteriano, a la vezque minimizan el número de falsos positivos y falsosnegativos. Todos los sistemas han demostrado suutilidad en la detección de la bacteriemia.

El Bactec-9240 (Becton Dickinson) es unsistema totalmente automático, no invasor, deagitación continua, que se compone de un incubador,un detector y un ordenador. El CO2 producido por elmetabolismo bacteriano reacciona con un materialfluorescente situado en el fondo del frasco delhemocultivo, lo que modula la cantidad de luz que esabsorbida por un sensor. Los fotosensores miden elnivel de fluorescencia, que se corresponde con lacantidad de CO2 producida por el microorganismo.Esta medida es interpretada por el sistema deacuerdo con unos parámetros programados. Estesistema realiza una lectura de todos los frascos cada10 minutos y mediante un sistema luminoso dealarma indica los frascos positivos detectados encada lectura.

El BacT/Alert (Organon Teknica) fue el primersistema comercial no invasor de agitación ymonitorización contínua de cada frasco. Detecta elaumento y/o nivel total de CO2 producido por el

crecimiento microbiano utilizando un sensorcolorimétrico interno pegado al fondo de los frascos.A medida que cambia el color del sensor, la cantidadde luz reflejada se incrementa y es cuantificadacomo un aumento del voltaje. Las señales seanalizan en un ordenador por medio de un algoritmoque utiliza tres criterios como evidencia decrecimiento. La lectura se realiza cada 10 minutos.

El sitema Vital (bioMerieux) difiere de losanteriores en que incorpora un indicador fluorescenteen el medio de cultivo. Como consecuencia delmetabolismo microbiano se producen cambios en elpH, en el potencial redox o en el nivel de CO2 queprovocan una disminución de la fluorescencia delindicador. Esta fluorescencia se lee cada 15 minutospor medio de un detector diodo/fotón luminescenteno invasor. Algunos trabajos han demostrado unacierta dificultad de este sistema en la detección delas levaduras.

El ESP (Difco Laboratories) es un sistemaautomático no invasor en el que los frascos secolocan en cajones y los de anaerobios no se agitan.Monitoriza cada frasco cada 12 minutos y elcrecimiento se mide por un método manométrico quedetecta el consumo y/o la producción de gas.

7.2. HEMOCULTIVOS POSITIVOS7.2.1. Tinción de Gram y otras tinciones

Cuando, por el método convencional, en unhemocultivo se observan signos de crecimiento, o lossistemas automáticos lo señalan como positivo,inmediatamente deben aspirarse asépticamente de 3a 5 ml de caldo del frasco, introducirlos en un tuboestéril y depositar una gota en un portaobjetos pararealizar una tinción con la técnica de Gram (ver tabla4). Si no se observan microorganismos puede ser útilrealizar una segunda tinción con naranja de acridinaque es capaz de detectar un número menor debacterias. Esta técnica ha demostrado su utilidad enbacteriemias por Brucella y Campylobacter.7.2.2. Subcultivos

El material aspirado, independientemente delresultado obtenido en la tinción de Gram, debe sersubcultivado en distintos medios (agar sangre, agarchocolate y agar sangre enriquecido) que seincubarán a 35-37ºC en diferentes atmósferas(aerobia, con 5% de CO

2 y anaerobia,

respectivamente) y períodos de tiempo (24 h el agarsangre y el agar chocolate, y 48-72 h el agar sangreenriquecido en anaerobiosis). En ocasiones puedeser necesaria la incubación del agar chocolate 48 h.Teniendo en cuenta la morfología de losmicroorganismos observada en la tinción de Gram sedeben realizar, además, subcultivos en mediosespecíficos, por ejemplo, en agar Sabouraud si seobservan levaduras, e incubar a diferentestemperaturas, 30ºC en caso de sospecha de hongos.7.2.3. Identificación y antibiograma preliminaresCon objeto de obtener resultados lo antes posible, sedeben realizar pruebas de identificación

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Tabla 1. Sistemas comerciales automáticos de hemocultivos

Sistema Indicador del crecimiento Mecanismo dedetección

Monitorizacióncontínua

Bactec 460 Producción de CO2 Radiométrico No

Bactec 660 Producción de CO2 Infrarrojos No

Bactec-9240 Producción de CO2 Fluorescencia Sí

BacT/Alert Producción de CO2 Colorimétrico Sí

Vital Producción de CO2, cambio de pH o potencial redox Fluorescencia Sí

ESP Producción y/o consumo de gas Manométrico Sí

Tabla 2. Características de los sistemas automáticos de monitorización contínua de hemocultivos

Sistema Nº de frascospor unidad

Máximo unidades(frascos)

Frecuencia lectura(minutos)

Tipo de agitación/velocidad

Bactec-9240 240 5 (1200) 10 Balanceo/30a

BacT/Alert 120-240 6 (1440) 10 Balanceo/34a

Vital 200-400 3 (1200) 15 Sinusoidal/150a

ESP 128-384 5 (1920) 12 (aerobios) Rotación/160b

24 (anaerobios)

a: Ciclos/minuto.b: Revoluciones/minuto.

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Tabla 3. Características de los frascos utilizados por los sistemas automáticos de hemocultivos

Sistema Caldo de cultivoa

Volumende caldo (ml)

Volumen de sangrerecomendado (ml)

Dilución Atmósfera Ventilaciónrequerida

Concentración/anticoagulanteb

Bactec-9240 Aerobio/F SCD 40 5 1:8 CO2 + aire No 0,025%/SPS Anaerobio/F SCD 40 5 1:8 CO2 + N2 No 0,025%/SPS Plus Aerobio/F SCD 25 10 1:2,5 CO2 + aire No 0,050%/SPS Plus Anaerobio/F SCD 25 10 1:2,5 CO2 + N2 No 0,050%/SPS PEDS Plus/F SCD 40 0,5-3 1:80-1:13,3 CO2 + aire No 0,020%/SPS Litic/10 Anaerobio/F SCD 40 10 1:4 CO2 + N2 No 0,035%/SPS

BacT/Alert Aerobio SCD 40 10 1:4 CO2 + aire Sí 0,035%/SPS Anaerobio SCD 40 10 1:4 CO2 + N2 No 0,035%/SPS Pedi-BacT BHI 20 4 1:5 CO2 + N2 Sí 0,020%/SPS FAN Aerobio BHI 40 10 1:4 CO2 + aire Sí 0,050%/SPS FAN Anaerobio BHI 40 10 1:4 CO2 + N2 No 0,050%/SPS

Vital Aerobio SCP 40 10 1:4 CO2 + mezcla O2 No 0,025%/SPS Anaerobio SCP 40 10 1:4 CO2 + mezcla N2 No 0,025%/SPS

ESP Aerobio 80A SCP 80 10 1:8 CO2 No 0,006%/SPS Anaerobio 80N PP 80 10 1:8 CO2 + N2 No 0,070%/TSC EZ DRAW 40A SCP 40 5 1:8 CO2 No 0,006%/SPS EZ DRAW 40N PP 40 5 1:8 CO2 No 0,070%/TSCa: SCD: Caldo soja-caseína; BHI: Caldo cerebro-corazón; SCP: Caldo peptona soja-caseína; PP: Proteosa-peptona.b: SPS: Polianetol sulfonato sódico; TSC: Citrato trisódico.

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Tabla 4. Identificación preliminar de microorganismos de hemocultivos basada en la tinción de Gram

Tinción de Gram Identificación preliminar

Gram (+) en racimos TSI, DNAsa o coagulasa, novobiocina, antibiograma enagar Mueller Hinton

Gram (+) en diplos o cadenas Optoquina, bacitracina, bilis-esculina, antibiograma enagar sangre

Cocos

Gram (-) Antibiograma en agar chocolate incubado en CO2(Neisseria)

Bacilos Gram (+) y corineformes Esculina, antibiograma en agar sangreGram (-) Pruebas bioquímicas de identificación, antibiograma en

agar Mueller Hinton

Cocobacilos Gram (-) Antibiograma en agar chocolate incubado en CO2(Haemophilus)

Levaduras Agar Saboureaud+cloranfenicol, agarSaboureaud+cloranfenicol+cicloheximida

Flora mixta Gram (+) y Gram (-) Agar sangre+ácido nalidíxico, agar MacConkey

presuntiva partiendo del caldo aspirado. Cuandose trata de bacteriemias monomicrobianas (lamayoría de las veces), dichas pruebas rápidas suelendar resultados comparables con los que aporta laidentificación definitiva en más del 90% de losestudios y en un tiempo incluso de 4 horas. En elcaso de que la tinción de Gram demuestre lapresencia de bacterias grampositivas la morfología delas mismas tiene un alto valor predictivo.

Al tiempo que se procede a la identificación, apartir del caldo de cultivo también debe realizarse unantibiograma preliminar, que permita disponer lo másrápido posible la sensibilidad del microorganismo.Estos resultados tienen un gran valor en el manejoinicial del paciente con bacteriemia. La correlación deeste procedimiento con los resultados delantibiograma definitivo realizados a partir de coloniasaisladas oscila entre 87 y 99,3% en diversos estudios.En cualquier caso, las discrepancias existentesinteresan sólo en la medida en que puedan interferirlesivamente en la adecuada terapéutica del paciente.

Es posible también inocular el caldo de cultivodirectamente en sistemas automáticos de identificacióny estudio de sensibilidad. Algunos permiten la lecturade los resultados a las tres horas de incubación.7.2.4. Informe preliminar

El hallazgo de un hemocultivo positivo puede sercrítico por lo que el resultado obtenido de la tinción deGram debe informarse inmediatamente por víatelefónica al médico responsable del enfermo y dejarregistrado el día, la hora y el nombre de la personaque recibe el informe. En dicho informe seespecificará la morfología de los microorganismos, elresultado de la tinción de Gram, el número dehemocultivos en los que se observan con referenciaal total de los extraídos y la fecha de obtención de los

mismos. Debe informarse, en cuanto se disponga deella, la sensibilidad del microorganismo a losantimicrobianos según el antibiograma inicial. Elinforme verbal debe ir seguido de uno escritoinformando en los mismos términos y advirtiendo deque será seguido del informe definitivo.7.2.5. Identificación e informe definitivoTras el crecimiento de los microorganismos en losmedios de cultivo se identificarán y se realizaránpruebas de sensibilidad por los métodos estándar.Los microorganismos considerados comocontaminantes se identificarán sólo al nivel de genero.Obtenida la información definitiva, se emitirá uninforme escrito. Se informará también verbalmente enel caso de que los resultados sean discrepantes conlos proporcionados previamente.

7.3. INFORME DE LOS HEMOCULTIVOSNEGATIVOSLos hemocultivos en los que no se aíslanmicroorganismos, transcurrido el período deincubación establecido, se informarán por escritocomo estériles o negativos. Se puede añadir unafrase en la que consten los días de incubación, porejemplo: “Estéril a los 5 días de incubación”.

8. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSUn hemocultivo puede ser positivo sin que ello

represente un episodio verdadero de bacteriemia. Esfrecuente que la propia microbiota cutánea delenfermo o del personal que realice la toma delhemocultivo pueda contaminar la sangre en elmomento de la extracción. También el laboratorio,durante la manipulación de los hemocultivos, puedeinocular de forma accidental los microorganismos. Sila técnica de extracción, transporte y procesamientoes correcta, no debe contaminarse más de un 3% de

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todas las extracciones.Denominamos bacteriemia verdadera a aquella

producida por microorganismos realmente presentesen la sangre de los pacientes y falsas bacteriemias alas causadas por una contaminación accidental de losmedios de cultivo.

La distinción entre la verdadera bacteriemia y laque no lo es constituye un asunto de la máximaimportancia y trascendencia para el paciente. Uno delos datos orientativos más importante lo constituye lapropia identidad de los microorganismos aislados.Microorganismos patógenos como Staphylococcusaureus, Escherichia coli y otras enterobacterias,Pseudomonas aeruginosa y Streptococcuspneumoniae son responsables de bacteriemiasverdaderas en más del 90% de los casos. Por elcontrario, es dudoso el papel que representan losmicroorganismos que forman parte de la microbiotadel paciente como los estafilococos coagulasanegativa, Streptococcus del grupo viridans,Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes,Bacillus spp. y algunas especies de Clostridium que,en conjunto, suponen menos del 5% de lasbacteriemias verdaderas. Sin embargo, algunos deestos microorganismos pueden ser responsables deauténticas bacteriemias en algunas situaciones y portanto, su identidad no es un dato suficiente paraestablecer el criterio de significación clínica. Espreciso recurrir al número de hemocultivos en que serepite el aislado y en este sentido, sin que el dato seadefinitivo, es indudable que la repetición de la mismabacteria en más de una extracción (suponiendo quetodas las extracciones no se han realizado desde unamisma vía contaminada), aumenta la probabilidad deque se trate de una bacteriemia verdadera. Por elcontrario, la presencia de un solo hemocultivo positivode extracciones seriadas en un corto período detiempo sugiere una contaminación.

El valor de los hemocultivos cuantitativospara predecir la bacteriemia verdadera también hasido cuestionado, así como los hemocultivosobtenidos secuencialmente. En el caso de laendocarditis la bacteriemia es continua y si un cultivoes positivo todos deberían serlo también. Sinembargo, la mayor parte de las bacteriemias sontransitorias y por lo tanto no es de extrañar que sóloen el 70-80% de los casos los hemocultivos seanpositivos. En general es de ayuda también para lainterpretación la existencia de cuerpos extraños ofocos infecciosos de los que se haya aislado el mismomicroorganismo que en la sangre.

En la mayoría de las ocasiones, sin embargo,el laboratorio no dispone de elementos suficientespara establecer con seguridad la significación de labacteriemia. El microbiólogo debe compartir lainformación que posee con el clínico responsable delpaciente para, junto con los datos clínicos de éste,valorar conjuntamente los resultados obtenidos.

9. MICROORGANISMOS Y SITUACIONESESPECIALES

Si la colaboración entre el clínico y el microbiólogoes siempre necesaria, mucho más ante la sospecha de

una infección cuyo agente etiológico es infrecuente y,además, de difícil aislamiento y crecimiento. La mayoríanecesitan medios de cultivos especiales por susrequerimientos nutritivos y su incubación debe serprolongada debido a su lento crecimiento. En alguno deestos procesos infecciosos el estudio serológico esindispensable para el diagnóstico; en otros esimprescindible aplicar técnicas de biología molecularque proporcionan información con más celeridad que elcultivo. Estos microrganismos, a veces responsables delas llamadas endocarditis con hemocultivo negativo,incluyen Brucella, Haemophilus, Cardiobacterium,Eikenella, Kingella, Bartonella, Abiotrophia, etc.

9.1. BRUCELOSISAunque ha disminuído, en España la brucelosis es

todavía una enfermedad que se debe tener presente.Para el aislamiento de Brucella se ha utilizadoclásicamente el medio de cultivo de Castañeda ocualquier frasco de hemocultivo con medio bifásico. Laventaja es que permiten resembrar el medio líquidosobre la fase sólida sin necesidad de abrir o pinchar elfrasco. La lectura se realiza diariamente y la bacteria sedetecta generalmente entre 4 y 7 días. Las coloniastienen un aspecto característico, translúcidas yagrupadas de forma arrosariada, también llamada decielo estrellado. Actualmente, con los sistemasautomáticos el microorganismo se detecta en losfrascos aerobios más rápidamente. Es recomendable,sin embargo, prolongar el período de incubación hasta21 días, realizar un subcultivo en agar sangre y/o agarchocolate, independientemente de la técnica utilizada, eincubar la placa 3 ó 4 días antes de descartar elhemocultivo como negativo. Debido al riesgo querepresenta para el personal del laboratorio, se exige unnivel 2 de seguridad para procesar muestrassospechosas de contener Brucella y un nivel deseguridad 3 para manipular los cultivos de estemicroorganismo.

9.2. TULAREMIALa tularemia es una infección poco frecuente y el

aislamiento de Francisella tularensis, su agente causal,en un hemocultivo es extremadamente raro ya que labacteria sólo está en la sangre en la fase aguda de laenfermedad. Los frascos deben incubarse 14 díassubcultivándolos, cada 4 días y al final del período deincubación, en agar sangre suplementada con glucosay cisteína. También se pueden utilizar agar chocolateenriquecido con IsoVitalex o agar charcoal con extractode levadura. Los niveles de seguridad requeridos sonlos mismos que los descritos para Brucella.Habitualmente, el diagnóstico de tularemia se realiza através del estudio serológico.

9.3. LEPTOSPIROSISLa leptospirosis es una infección aguda producida

por espiroquetas del género Leptospira que se presentacon un amplio espectro de manifestaciones clínicas. Elmicroorganismo suele estar presente en la sangre en lafase aguda, la primera semana de la enfermedad.

El cultivo se realiza añadiendo de 1 a 3 gotas desangre fresca del paciente a 5 ml de medio de Stuart o

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a los medios semisólidos de Fletcher o Ellinghausen.Previamente a la inoculación de la sangre se añadesuero fresco de conejo a una concentración del 14%.La incubación se lleva a cabo en ausencia de luz a30ºC durante 28 días. Se realiza el examenmicroscópico de una parte del cultivo en campo oscurouna vez a la semana con el fin de observar las formasespiroquetales, así como su movilidad. El examendirecto de la sangre en campo oscuro no esrecomendable ya que es fácil confundir Leptospira conrestos de hematíes. La técnica descrita no es sencilla,por lo que se aconseja determinar la presencia deanticuerpos específicos siempre que se sospeche esteproceso infeccioso.

9.4. BARTONELOSISBarton, en 1909, describió el género Bartonella

como bacterias de crecimiento intraeritrocítico. Sonbacilos gramnegativos muy pequeños, ligeramentecurvados y de difícil aislamiento. B. henselae y B.quintana se han descrito como agentes responsablesde endocarditis infecciosa en vagabundos, enfermedadgranulomatosa, peliosis, enfermedad por arañazo degato... También se han asociado a síndromesneurológicos en pacientes portadores del VIH. Existenzonas endémicas que constituyen una amenaza paralos viajeros.

Se ha obtenido crecimiento de Bartonella en líneasde cultivo celular HeLa, células endoteliades y/o encultivo primario de monocitos humanos. Aunque no esfácil, el mejor sistema para aislar Bartonella es latécnica de lisis-centrifugación: el subcultivo debehacerse en medio fresco de agar sangre o chocolate,sellar las placas pasadas las primeras 24 h e incubar a35-37ºC en 5-10% de CO2 con 40% de humedaddurante 30-40 días. Bartonella no enturbia los mediosliquidos y los sistemas automáticos no detectan laproducción de CO2 por lo que hay que realizarsubcultivos ciegos a partir del séptimo día. Algunosautores recomiendan combinar el subcultivo con latinción de naranja de acridina o de Jiménez. El estudiode PCR a partir de muestras clínicas, así como elestudio serológico, es muy útil para el diagnóstico.

9.5. BACTERIAS DEFICIENTES EN PAREDLas llamadas formas L o bacterias deficitarias en

pared raramente se aíslan de hemocultivos. Paraconseguirlo hay que estabilizar osmóticamente el mediocon sacarosa o manitol al 10% en el laboratorio, lo queprovoca un importante riesgo de contaminación, o bienemplear medios específicos comerciales. A veces, enpacientes tratados con antibióticos betalactámicos, seobservan en la tinción de Gram formas bacilaresgramnegativas alargadas por alteración de la pared quese recuperan en el subcultivo.

9.6. ABIOTROPHIAEran conocidas con anterioridad como bacterias con

requerimientos nutricionales especiales. Crecen bien enlos frascos de hemocultivo ya que contienen sangrefresca del paciente. En la tinción de Gram se observancocos grampositivos con tendencia a agruparse encadenas, aunque a menudo su morfología es deforme

mostrando un aspecto cocobacilar incluso gramvariable. La dificultad de su aislamiento estriba en queno crecen en agar sangre ni en chocolate, siendonecesario realizar el subcultivo en placas de agarsangre enriquecida con vitamina B 6 (en forma depiridoxal, no como piridoxina ni piridoxamina) o concisteína. Una forma sencilla de demostrar su deficiencianutricional es realizando una estría de S. aureushemolítico en una placa de agar sangre. A las 24-48 hse puede observar el crecimiento de microcoloniashaciendo satelitismo alrededor de la estría deestafilococo. Estas bacterias suelen desarrollarsetambién en las placas empleadas para el crecimientode anaerobios, las cuales suelen contener cisteína.Para no confundirlas con Peptostreptococcus es útilhacer un subcultivo en dos placas enriquecidas deanaerobios e incubar una en CO2 y otra en atmósferaanaerobia.

9.7. BACTERIAS DEPENDIENTES DE ANTIBIÓTICOSEl uso prolongado de antimicrobianos de amplio

espectro es uno de los factores que ha contribuido a laaparición de enterococos resistentes a la vancomicina(EVR). En los últimos años se han descrito casos depacientes sometidos a tratamiento con vancomicina enlos que se han aislado enterococos dependientes devancomicina (EVD), mutantes de EVR que sólo crecenen presencia de glicopéptidos y que pierden estadependencia en los subcultivos sucesivos. Se hadetectado un brote de infección nosocomial causadapor EVD en pacientes trasplantados de médula óseasometidos a profilaxis con vancomicina. Su significadoclínico aún no ha sido aclarado.

Se puede sospechar la presencia de estosmicroorganismos en pacientes con múltiplestratamientos antimicrobianos y de larga duración,especialmente si en el entorno existen EVR y si seobservan en la tinción de Gram formas semejantes alas descritas como Abiotrophia.

9.8. MICOPLASMASAunque no es frecuente, se han aislado

Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum enhemocultivos de mujeres con fiebre postparto opostaborto o cirugía ginecológica. Suelen serbacteriemias transitorias autolimitadas que evolucionanbien, incluso sin tratamiento específico. Se han descritotambién bacteriemias por M. hominis en quemados,leucémicos, politraumatizados, trasplantados renales,etc. Los sistemas automáticos permiten el crecimientode estos microorganismos aunque el SPS los inhibe yraramente serán detectados, por lo que es convenienterealizar un subcultivo en medios específicos paramicoplasmas genitales al finalizar el período deincubación.

Crecen bien en el medio Plus Anaerobio/F deBactec 9240, aunque el sistema no los detecta. Enmujeres con infección pélvica o postparto y sospechade bacteriemia con hemocultivos negativos esaconsejable realizar un subcultivo en mediosespecíficos a los 7 días. En el agar sangre incubado 72ó 96 horas en 5-10% de CO2 se puede advertir lapresencia de microcolonias y no observar

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microorganismos en la tinción de Gram. Este hechodebe hacer sospechar la posibilidad de la presencia demicoplasma. También se puede realizar una tinción deDienes de las microcolonias.

9.9. MICOBACTERIASLa sangre no era la muestra más adecuada para

diagnosticar una micobacteriosis y constituía un hechoanecdótico el aislamiento de Mycobacteriumtuberculosis y otras micobacterias a partir de la misma.Sin embargo, la aparición del VIH puso de relieve laexistencia de nuevas formas de enfermedadtuberculosa y paralelamente la presencia demicobacterias en sangre se hizo cada vez másfrecuente, por lo que está indicada su investigación. Elprimer sistema utilizado para este fin fue el Bactec 460radiométrico, sustituido en la actualidad por lossistemas de monitorización continua que utilizanfrascos específicos para micobacterias. Aun no siendolos medios apropiados, la incubación prolongada hasta6 semanas de los frascos aerobios de los diferentessistemas permite también detectar la presencia de M.tuberculosis y Mycobacterium avium. Otro método muyútil es el de lisis-centrifugación. Puede ser eficazrealizar una combinación de dos métodos: en primerlugar procesar la sangre por la técnica de lisis-centrifugación y sembrar el sedimento después en unfrasco de los sistemas automáticos con el fin de acortarel período de incubación.

Actualmente, con el tratamiento antiretroviral, handisminuido las infecciones oportunistas en los pacientescon sida, por lo que también ha descendido el númerode micobacteriemias en estos pacientes.

9.10. LEISHMANIASISEn los países mediterráneos es frecuente la

leishmaniasis, parasitosis del sistema mononuclearfagocítico causada por Leishmania donovani. Es otrade las infecciones que se incrementaron con laaparición del SIDA y que ha vuelto a disminuir con losactuales tratamientos antivirales. El diagnósticorequiere la visualización de Leishmania en una tinciónde Giemsa a partir de muestras obtenidas de médulaósea, biopsia de bazo o adenopatía, o bien el cultivo dela misma.

El medio clásico utilizado es el NNN, al cual hay queañadir una tercera parte de su volumen de sangredesfibrinada de conejo. Es algo laborioso de preparar yfácil la contaminación del mismo. Otros medios útilesson el medio Drosophila de Schneider, al que se añadesuero fetal bovino a una concentración del 30%, y elmedio MEM (Eagle minimal essential medium) al quetambién se le adiciona suero fetal bovino. Se inoculandos o tres gotas de la muestra por tubo de mediopreparado y se dejan a temperatura ambiente durante 1mes. Se realiza un examen microscópico del medio decultivo a 400 aumentos, colocando una gota entre portay cubreobjetos el tercer día de incubación y despuésuna vez a la semana.

9.11. HONGOSClásicamente se ha recomendado el medio bifásico

o Castañeda para la recuperación de hongos. En los

últimos 20 años los múltiples avances en las técnicasde hemocultivo, entre ellos, la mejor calidad de losmedios empleados, tanto en la técnica convencionalcomo en los sistemas automáticos, la ventilación de losfrascos aerobios, el desarrollo de medios de cultivo conresinas, así como los de alto volumen, y la agitacióncontinua de los frascos, han permitido diagnosticar unmayor número de fungemias. Un método muy útil es elde lisis-centrifugación, que ha demostrado una granefectividad para recuperar hongos, especialmenteHistoplasma capsulatum, ya que permite seleccionarlos medios de subcultivo.

Las levaduras son responsables de la mayoría delas fungemias, siendo el género Candida el másfrecuente. En ocasiones y dependiendo del medio decultivo empleado debe ventilarse el frasco aerobio. Loshongos levaduriformes se aíslan en los frascosaerobios de hemocultivo con relativa rapidez, nodespués de 5-7 días de incubación. No obstante, si sesospecha que el agente causal es un hongo dimórfico ofilamentoso es recomendable prolongar su incubaciónhasta 30 días a 22-30ºC con un subcultivo final antesde descartar como negativo. Para recuperar Malasseziafurfur el medio debe ser suplementado con sustanciasque aporten ácidos grasos de cadena larga como elaceite de oliva.

Los pacientes con mayor riesgo de fungemia son losinmunodeprimidos, especialmenten hematológicos ytrasplantados. En los portadores del VIH debesospecharse la posibilidad de que el causante de lafungemia sea Cryptococcus neoformans.

9.12. VIRUSEl hemocultivo para detectar virus se realiza

habitualmente en pacientes trasplantados de órganosólido o de médula ósea para el control decitomegalovirus (CMV). A partir de monocitos ypolimorfonucleares del paciente se inoculan frascos dehemocultivo convencionales y los denominados “shellvials”. La alternativa al cultivo es la detección directa deCMV (antigenemia) en leucocitos, no aconsejable enneutropénicos, y la detección del ADN de CMV porPCR en leucocitos o plasma. Se realizan tambiénhemocultivos para detectar viremias causadas porHerpes simplex, VIH y virus de la hepatitis C y conmenor frecuencia para otros virus. No está bien definidoel volumen de sangre por hemocultivo ni el número delos mismos. En general se extraen entre 2 y 5 ml desangre con EDTA que se transportan de inmediato allaboratorio de Microbiología (ver procedimientosespecíficos de virología).

9.13. ENDOCARDITISCuando se sospecha una endocarditis infecciosa es

aconsejable realizar tres hemocultivos con un volumende sangre por extracción no inferior a 10 ml. Sufinalidad es detectar la bacteriemia continua y descartaragentes etiológicos contaminantes como estafilocococoagulasa negativa o corinebacterias, que al mismotiempo suelen ser los microorganismos responsablesde la endocarditis protésica. Aunque todos losmicroorganismos pueden causar endocarditisinfecciosa, los más habituales (estreptococos,

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estafilococos) suelen crecer en las primeras 48 horas.Pasado este tiempo, si el paciente no ha recibidotratamiento antimicrobiano se sospechará la, malllamada en algunos casos, endocarditis conhemocultivo negativo, como la causada pormicroorganismos del grupo HACEK, Brucella,Abiotrophia... Los frascos deberán incubarse entre 2 y 4semanas, subcultivando en medios específicos al finalde la incubación. En pacientes con hemocultivonegativo debe realizarse al mismo tiempo un estudioserológico frente a Coxiella burnetii, Legionella,Brucella, Bartonella y Chlamydia, particularmente si hanrecibido tratamiento antimicrobiano previo. En estecaso, si el paciente mantiene un buen estadohemodinámico, lo indicado es interrumpir el tratamientoantimicrobiano y repetir los hemocultivos como mínimo48 h después de la suspensión.

9.14. BACTERIEMIA ASOCIADA A CATÉTEREl 100% de los pacientes ingresados en áreas de

vigilancia intensiva son portadores de catéteresintravasculares (CIV) y la mayoría de ellos estánpluricateterizados. No sólo son portadores de CIV lospacientes ingresados, sino también pacientes enrégimen ambulatorio sometidos a hemodiálisis oquimioterapia. Los datos clínicos son poco útiles parael diagnóstico de la bacteriemia asociada a catéterpor su baja sensibilidad y especificidad, por lo que serequiere la confirmación microbiológica para tener undiagnóstico de certeza.

En breve va a ser publicado un procedimientoespecífico titulado “Infección asociada a catéter”, que ellector interesado en el tema puede revisar. No obstante,a continuación se resumen las técnicas microbiológicasempleadas para el diagnóstico de las bacteriemiasasociadas a catéter.

Procedimientos diagnósticos sobre catéteresretirados

Cultivo cualitativo de la punta del catéter. Estatécnica consiste en cortar asépticamente el extremodistal del catéter e introducirlo en un tubo con mediolíquido. Es sencilla y sensible, aunque no permitecuantificar el número de UFC, por lo que no serecomienda en la actualidad.

Cultivo semicuantitativo de la punta del catéter.Descrita por Maki, se cultiva la superficie externa de lapunta del catéter. Para ello se rueda la punta distal delCIV en una placa de agar sangre con la ayuda depinzas estériles. Es la técnica de referencia.

Cultivo cuantitativo de la punta del catéter. Técnicasmás complejas descritas por Cleri, Brun-Buisson,Sheretz y Liñares.

Procedimientos diagnósticos manteniendo elcatéter. Más del 70% de los catéteres retirados porsospecha de infección son estériles, por lo que sonnecesarios procedimientos diagnósticos que noobliguen a disponer del catéter. Los cultivos de la pielen el punto de inserción y de la conexión, el cepilladoendoluminal del catéter y los métodos que comparanlos resultados obtenidos de los hemocultivos de sangreextraída de una vena periférica y los realizados a travésdel catéter son los procedimientos más utilizados. Encuanto a estos últimos, concretamente, se ha propuesto

comparar el tiempo de crecimiento de los hemocultivosextraidos de una vena periférica y de los extraídos através del catéter.

10. CONTROL DE CALIDAD10.1. MANUALES Y NORMASEl laboratorio de Microbiología debe poseer,debidamente actualizado, un manual deprocedimientos o guía en la que se describaexhaustivamente la metodología de los hemocultivos.Además, deberá dictar normas específicas para elpersonal sanitario en relación con la asepsia de lapiel, la venopunción y la inoculación de los frascos dehemocultivo, así como recomendaciones sobre elnúmero e intervalo de extracción de los hemocultivos,el volumen de sangre para cultivar y la selección deltipo de frasco o medio de cultivo.

10.2. ANÁLISIS DE LOS DATOSPeriódicamente, y al menos una vez al año, deberánevaluarse los resultados obtenidos del procesamientode los hemocultivos. El análisis de estos datosproporciona una valiosa información sobre el controlde calidad interno del laboratorio. Se evaluará la tasade positividad, la de falsos positivos y la cifra total y eltipo de microorganismos aislados.La tasa de contaminación, si los hemocultivos sonobtenidos y procesados correctamente, no debesuperar el 3% del total de hemocultivos. Si es mayordeberán establecerse medidas como informarperiódicamente al personal sanitario de la importanciade una técnica aséptica de extracción de la sangre,utilizar la misma aguja para la extracción de la sangrey la inoculación del frasco, y controlar y cambiar, si esnecesario, los antisépticos empleados. Una tasa depositividad muy baja puede reflejar una excesivautilización de los hemocultivos.

El número de bacteriemias, así como su origen,comunitario o intrahospitalario, y su localización porservicios proporciona datos esenciales para elconocimiento, vigilancia y control de la infección.

11. BIBLIOGRAFÍA1. Bouza E, Loza E, Planes, A, Rodríguez Cobacho A.

Procedimientos en Microbiología Clínica, Hemocultivos.1993. Coordinador, J Romero Vivas, Ed JJ Picazo.Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica, Madrid.

2. Bouza E, Burillo A, Muñoz P. Catheter-relatedinfections: diagnosis and intravascular treatment. ClinMicrobiol Infect 2002; 8: 265-274.

3. Brouqui P; Raoult D. Endocarditis due to rare andfastidious bacteria. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 177-207.

4. Capdevila JA, Planes AM, Palomar M, Gasser I,Almirante B, Pahissa A, Crespo E, Martínez-VázquezJM. Value of differential quantitative blood cultures in thediagnosis of catheter related sepsis. Eur J Clin Infect Dis1999; 29: 403-407.

5. Creixems MR, Fron C, Muñoz P, Sánchez C, Peláez T,Bouza E. Use of anaerobically incubated media toincrease yield of positive blood cultures in children.Pediatr Infect Dis J 2002; 21: 443-446.

6. Dune WM Jr, Nolte FS, Wilson ML. Cumitech 1B, Bloodcultures III. 1997. Coordinating ed, JA Hindler.American Society for Microbioogy, Washington DC.

15

7. Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update ondetection of bacteremia and fungemia. Clin MicrobiolRev 1997; 10: 444-465.

8. Richter SS, Beekmann SE, Croco JL, Diekema DJ,Koontz FP, Pfaller MA, Doern GV. Minimizing theworkup of blood culture contaminants: implementationand evaluation of a laboratory-based algorithm. J ClinMicrobiol 2002; 40: 2437-2444.

9. Weinstein MP, Towns ML, Quartey SM, Mirrett S,Reimer LG, Parmigiani G, Reller LB. The clinicalsignificance of positive blood cultures in the 1990s: aprospective comprehensive evaluation of themicrobiology, epidemiology, and outcome of bacteremiaand fungemia in adults. Clin Infect Dis 1997; 24: 584-602.

10. Wilson ML, Weinstein MP. General principles in thelaboratory detection of bacteremia and fungemia. ClinLab Med 1994; 14: 69-82.

PNT-HC-01

HEMOCULTIVOSPNT-HC-01

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

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EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº. ...........ASIGNADA A.................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital .......................... La información enél contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Lascopias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-HC-01

Servicio de Microbiología

Hospital...........................Hemocultivos

Edición Nº 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es normalizar larealización de los hemocultivos. Su aplicación seextiende desde la extracción de los mismos por elequipo de enfermería que atiende al paciente, cuyoprocedimiento debe vigilar y dirigir el responsable dellaboratorio de Hemocultivos, hasta la emisión de losresultados.

2. FUNDAMENTOEl procesamiento de los hemocultivos constituye unade las prioridades del Servicio de Microbiología Clínica.Las siguientes normas e instrucciones no se concibencomo el "estándar de oro" de un laboratorio dehemocultivos, sino que pretenden ser un fiel reflejo delprocesamiento de los hemocultivos.Indicaciones

- Pacientes con fiebre ≥ 38ºC o cuya temperaturasea inferior a 36ºC.- Pacientes con leucocitosis o leucopenia.- Pacientes con trombopenia o alteraciones de lacoagulación de causa no filiada.- Pacientes con infección focal de etiología noaclarada.- Pacientes con deterioro uni o multiorgánico, shocko inestabilidad hemodinámica.- Neonatos ante la mínima sospecha de infección.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTANormas o libro de hemocultivos.Manuales de instrucciones de las técnicas aplicadas.Normas NCCLS de las pruebas de sensibilidad a losantibióticos.Normas de bioseguridad.

4. TOMA DE LA MUESTRA4.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL

En una bandeja se preparará:1.- Un compresor elástico.2.- Un paquete de gasas estériles.3.- Un frasco preferiblemente con solución yodada o

povidona yodada y una gasa impregnada en alcohol de70°.

4.- Una jeringuilla desechable de 10 ml decapacidad con su correspondiente aguja I.V.

5.- Un juego de dos frascos de hemocultivo (aerobioy anerobio) por cada extracción

4.2. OBTENCIÓN DE LA SANGREMomento y lugar de la extracción.- Se extraerán 2-3hemocultivos con el menor intervalo de tiempo posibledespués de la aparición de los síntomas utilizandolugares de venopunción diferentes. Cada hemocultivo oextracción consta de dos frascos con tapones dediferente color.Método de la extracción:

1- Levantar la lengüeta plástica de los frascos ylimpiar los tapones con una gasa impregnada ensolución yodada o povidona yodada.

2- Colocar el compresor al paciente tras elegir lavena a pinchar. Tras ello se limpia con una gasa

impregnada en alcohol de 70° una zona de la piel de undiámetro de 3-5 cm en el lugar elegido para lapalpación y los dedos del explorador. Dejar actuar almenos 1 minuto.

3- Pintar ampliamente con povidona la piel de lazona a pinchar (al menos en un diámetro de 10 cm). Acontinuación se pintarán las yemas de los dedos índice,medio y pulgar de la mano utilizada para la palpaciónde la vena. El efecto de la povidona no se ejerce demodo total hasta que transcurre el tiempo suficientepara su oxidación (secado).

4- Extraer un mínimo de 10 ml de sangre (5 ml porfrasco) en los adultos y la mayor cantidad posible en losniños, a ser posible una cantidad mínima de 2 ml (1 mlpor frasco).

5- Introducir 5 ml de sangre en cada uno de los dosfrascos correspondientes a esa extracción (aerobio yanaerobio), evitando la entrada de aire, pinchando através del tapón de goma. Nunca se destapará el tapónde goma que viene sellado con una arandela metálica.Se tendrá la precaución de sujetar bien el émbolo de lajeringa para que la presión del vacío que existe en elfrasco no aspire rápidamente más cantidad de sangreque la adecuada ni el aire que pudiera quedar en elfondo de la jeringuilla. Es correcta la utilización delsistema Vacutainer para la extracción de loshemocultivos, teniendo la precaución de extraer losfrascos de hemocultivos antes que cualquier tubo paraotros fines, ya que se puede contaminar la aguja delsistema Vacutainer y por consiguiente los hemocultivosextraídos con posterioridad.

6- Se rotulará cada frasco con una etiquetaadhesiva en la que figuren el nº de historia, nombre delenfermo y el número de extracción realizada (1º, 2ª ó3ª), teniendo la precaución de no tapar la etiqueta decódigo de barras del frasco.

4.3. ENVÍO DE LOS HEMOCULTIVOS ALLABORATORIO1- Se rellenará un volante para cada extracción (dosfrascos). Es absolutamente necesario indicar en losvolantes el nombre del paciente, el servicio donde seencuentra ingresado, el número de cama y el númerode teléfono del control de enfermería con objeto deinformar los resultados preliminares en caso depositividad. Si los hemocultivos son extraídos en elServicio de Urgencias y el paciente es dado de alta, seanotará en los volantes el número de teléfono deldomicilio del paciente o donde pueda ser localizado encaso de positividad.

Sería deseable añadir en los volantes otrainformación que ayudara a la valoración de labacteriemia en el laboratorio como si está recibiendotratamiento antibiótico, la enfermedad de base delpaciente, el síndrome clínico que padece en elmomento actual y si la infección es de adquisiciónnosocomial o comunitaria.

2.- Los 4-6 frascos de cada paciente con los 2-3volantes se introducirán en una bolsa de plástico y seenviarán inmediatamente al Servicio de Microbiología,

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donde se introducirán en una estufa a 35-37ºC. Nuncadeben dejarse en nevera.4.4. RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LOSHEMOCULTIVOS

Los técnicos del laboratorio sacarán de la estufalos hemocultivos llegados durante la noche yprocederán de la siguiente forma:

1- Sacar los 4-6 frascos y los volantes de la bolsa deplástico y colocarlos por parejas en el orden deextracción (1ª, 2ª y 3ª).

2- Comprobar que cada pareja de frascos llegaacompañada de su volante correspondiente y quecoinciden los datos que figuran en los volantes y en losfrascos.

3- Asignar a cada extracción, bien sea de dos o unsolo frasco, un número correlativo del registro general.Dicho número se anotará en el volante y en el frasco ofrascos de cada extracción.

4- Si la petición es de cultivo para micobacterias,existe un frasco especial para tal fin. Sólo es necesarioun frasco y por tanto una sola extracción.

5- Colocar todas las parejas de frascos por ordennumérico y llevarlos al laboratorio de hemocultivos.Los volantes pasarán a Secretaria para su registro enel sistema de gestión del laboratorio.

6- Aunque existan graves deficiencias en el envíode la muestra, dada la importancia del diagnóstico debacteriemia, nunca será rechazada. Sin embargo,constará en la información de los volantes:"Interpretar resultados con precaución...", anotándoseel tipo de deficiencia encontrado.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS

5.1. MEDIOS DE CULTIVO:Frascos de hemocultivos. Cada control de enfermeríadel hospital solicitará los frascos al Almacén General.Deben almacenarse a temperatura ambiente. El tipo defrascos que deben utilizarse y la empresa que lossuministra será decisión del Servicio de Microbiología.Medios de cultivo para subcultivos e identificación:

Agar sangre (Nevera a 4ºC)Agar chocolate (Nevera a 4ºC)Agar Brucella (Nevera a 4ºC) Agar Mueller Hinton (Nevera a 4ºC)Agar MacConkey (Nevera a 4ºC)Agar CNA (Nevera a 4ºC)Medios específicos para hongos (Nevera a 4ºC)Medios específicos para anaerobios (Nevera a 4ºC)Otros medios (Nevera a 4ºC)

5.2. REACTIVOS:Tubos de agua destilada estéril (Temperaturaambiente)Sistemas de identificación:

- Discos de optoquina (Nevera a 4ºC)- Discos de bacitracina (Nevera a 4ºC)- Discos de novobiocina- TSI- Coagulasa- DNasa- Bilis-esculina

- Tubos para pruebas bioquímicas- Tiras para la determinación de oxidasa (Nevera

a 4ºC)- Equipo de determinación grupos antigénicos

Streptococcus (Nevera a 4ºC)- Equipo de identificación por aglutinación de S.

aureus (Nevera a 4ºC)- Indicadores de anaerobiosis (resazurina)- Antisueros Brucella (B. abortus y B. melitensis)

(Nevera a 4ºC)- Antisueros Listeria (Nevera a 4ºC)

- Aceite de inmersión (Temperatura ambiente)- Otros

Reactivos para tinciones (Temperaturaambiente)

Discos de antibióticos para determinación desensibilidad (Nevera 4ºC)

5.3. OTROS

6. APARATOS Y MATERIALDescripción del sistema de hemocultivos

utilizado por el laboratorio.Otro aparataje:Neveras (control diario de temperatura).Estufa de cultivo a 35ºC (control diario de

temperatura).Cabina de seguridad biológica (limpieza diaria

después de su utilización).Microscopio óptico (limpieza después de su

utilización).Microscopio de fluorescencia.Otros.Otro material necesario:

- Asas desechables- Agujas y jeringas para subcultivos- Torundas- Portas- Cubres- Tubos pequeños estériles- Guantes- Papel de filtro- Clorogel y lejía- Papel de manos- Otros

Al finalizar cada jornada de trabajo se revisarán yrepondrán los productos y material necesario para eltrabajo del día siguiente. Semanalmente, por escrito, sesolicitará al supervisor el material fungible que preciseser repuesto.

7. PROCESAMIENTO7.1. INTRODUCCIÓN DE LOS HEMOCULTIVOS ENEL SISTEMA (descripción específica del sistemautilizado por el laboratorio)

7.2. EXTRACCIÓN DE LOS FRASCOSSOSPECHOSOS DE CRECIMIENTO (descripciónespecífica del sistema utilizado por el laboratorio)

7.3. PROCESAMIENTO DE LOS FRASCOSPOSITIVOS

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En la cabina de seguridad biológica, donde seencuentran todos los frascos que el sistema hadetectado como sospechosos de crecimiento colocadospor orden numérico, se introduce en cada uno de lostapones de goma de los frascos una aguja con sujeringa. Tras invertir los frascos con una ligeraagitación, se extraen de los mismos 2 ml de caldo quese introducen en un tubo estéril rotulado con el númerodel frasco. A continuación se realizará:1.- Tinción de Gram

a - Colocar en el interior de la cabina portaobjetosrotulados con el número de registro de cada frasco yuna "V" si se trata de un frasco aerobio o una "N" si esuno anaerobio.

b - Colocar sobre el correspondiente porta 1 ó 2gotas del contenido del tubo, comprobando lacoincidencia del número del tubo y del rotulado en elporta.

c - Extender la gota ligeramente con el asa.d - Realizar la tinción de Gram.

e - Observar al microscopio la presencia demicroorganismos. El resultado de la tinción se anotaráen la hoja de trabajo por orden numérico. Si seobserva la presencia de levaduras se realizará unatinción de tinta china con el objeto de descartar deforma precoz Cryptococcus neoformans.2.- Subcultivos

A todos los frascos sospechosos de crecimientose les realizarán subcultivos en agar sangre, agarchocolate con IsoVitalex y agar Brucella.

Si en la tinción de Gram se observansimultáneamente microorganismos grampositivos ygramnegativos se realizará, además, un subcultivoadicional en placas de agar CNA (colistina + ácidonalidíxico) y agar MacConkey. Si en la tinción de Gramse observan levaduras se hará un subcultivo adicionalen medios para hongos.

Las placas de agar sangre, las de MacConkey y lasde hongos se colocarán por orden numérico y seincubarán a 35ºC en atmósfera aerobia. Las placas deagar chocolate, CNA y anaerobias, también en ordennumérico, se colocarán en campanas de CO2 yanaerobiosis, respectivamente, y se incubarán a 35ºC.3.- Identificación y antibiograma preliminares

Dependiendo del resultado de la tinción de Gram serealizarán pruebas específicas de identificación yantibiograma preliminares utilizando como inóculo unasgotas del caldo de cultivo de los frascos de hemocultivosiguiendo el siguiente esquema:

a) Cocos grampositivos en racimos: TSI, DNAsa ocoagulasa, novobiocina, antibiograma en agar MuellerHinton con discos de antibióticos para grampositivos.

b) Cocos grampositivos en cadenas o diplococos:bilis-esculina y antibiograma en agar sangre condiscos para grampositivos, añadiendo un disco deoptoquina y otro de bacitracina.

c) Cocos gramnegativos: antibiograma en agarchocolate con discos para Neisseria e incubación enCO2.

d) Bacilos gramnegativos: pruebas bioquímicas deidentificación y antibiograma en agar Mueller Hintoncon discos para gramnegativos.

e) Cocobacilos gramnegativos: antibiograma enagar chocolate incubado en CO2 (Haemophilus) condiscos para gramnegativos.

e) Bacilos grampositivos: esculina, antibiogramaagar sangre con discos para grampositivos.

f) Flora mixta: Se esperará al crecimiento delsubcultivo al día siguiente.

Otra alternativa es la inoculación del caldo de cultivodirectamente en sistemas automáticos de identificacióny estudio de la CMI, algunos de los cuales, además,permiten la lectura de los resultados en tres horas.

El antibiograma preliminar se realizará a todos losfrascos de hemocultivo siguiendo el esquema indicado,con independencia de que se trate de hemocultivos delmismo paciente y de que la tinción de Gram muestre elmismo tipo de microorganismos.

7.4. LECTURA DE PLACAS E IDENTIFICACIÓN DELOS MICROORGANISMOS

Las placas de agar sangre de los subcultivos, asícomo los antibiogramas, se leerán tras 18-24 h deincubación, mientras que las de agar chocolate y lasplacas de anaerobios se leerán a las 48 h, siguiendo elsiguiente esquema:

1.- Colocar las placas de agar sangre de loshemocultivos de sospecha del día anterior en ordennumérico junto con las pruebas y los antibiogramascorrespondientes y proceder a su lectura.

2.- Colocar las placas de agar chocolate yanaerobios de los hemocultivos de sospecha de dosdías anteriores (48 horas de incubación) en ordennumérico.

3.- Preparar los “protocolos de trabajo” donde sehabrán anotado los resultados de la tinción de Gram delos frascos positivos, que estarán en una carpeta enorden numérico, y anotar los resultados de las pruebasy de los antibiogramas.

4.- Preparar las “hojas de trabajo" donde seanotarán todas las pruebas que deben ser realizadasde cada placa.

7.5. PROCESAMIENTO DE LOSMICROORGANISMOS SIGNIFICATIVOS

Los microorganismos aislados que se considerenproductores de bacteriemia significativa se identificaránde forma definitiva y se les realizarán, en casonecesario, las pruebas de sensibilidadcorrespondientes.

Los microorganismos anaerobios y los hongospasarán a los laboratorios específicos para suidentificación. Todos irán acompañados de un protocolode trabajo con toda la información necesaria.

Todos los microorganismos significativos seconservarán en el archivo de cepas.

7.6. PROCESAMIENTO DE LOSMICROORGANISMOS CONTAMINANTES

Los microorganismos considerados contaminantesse identifican sólo a nivel de género. En general seconsideran contaminantes los siguientesmicroorganismos, siempre que crezcan en un solohemocultivo o extracción:

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Bacillus spp.Corynebacterium spp. (excepto C. jeikeium)Lactobacillus spp.Propionibacterium acnes.Staphylococcus coagulasa negativa.Streptococcus del grupo viridans.Clostridium perfringens.

Para considerar que alguno de losmicroorganismos descritos anteriormente, causanbacteriemia significativa deben estar presentes conidéntico biotipo y antibiotipo (en su caso) en 2 o máshemocultivos o extracciones del mismo paciente.

7.7. PROCESAMIENTO DE LOS FRASCOSNEGATIVOS

Transcurrido el tiempo de incubaciónpreestablecido, los frascos donde no se ha detectadocrecimiento serán desechados.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS8.1. INFORME PRELIMINAR DE LOSHEMOCULTIVOS SOSPECHOSOS DECRECIMIENTO

A última hora de la mañana se informará, de formapreliminar mediante llamada telefónica a los controlesde enfermería, de los resultados de la tinción de Gramde los hemocultivos sospechosos en los siguientescasos:

Pacientes con 2 o más extracciones con cocosgrampositivos en racimos

Pacientes con 1 o más extracciones con cocosgrampositivos en cadenas o diplococos

Pacientes con 1 o más extracciones con bacilosgramnegativos

Pacientes con 1 o más extracciones con flora mixtaPacientes con 1 o más extracciones con cocos

gramnegativos en diplos.Pacientes con 1 o más extracciones con levadurasLos datos de todos los frascos sospechosos de

crecimiento (número de registro, nombre del paciente,servicio y cama, fecha de la extracción, tipo de muestra,número de hemocultivos positivos/número dehemocultivos extraídos y resultado de la tinción deGram) serán diariamente registrados. Cuando elpaciente haya sido avisado telefónicamente se colocaráun asterisco junto al nombre del paciente y el nombrede la persona a la que se ha comunicado lainformación.

Asimismo, se informarán los resultados delantibiograma preliminar al médico responsable delpaciente que lo solicite.

8.2. INFORME DE RESULTADOS POSITIVOSDEFINITIVOS

Una vez terminado el procesamiento de loshemocultivos, se registrarán los resultados en elprograma de gestión del laboratorio y se imprimirá elinforme definitivo. Una vez impresos todos los informespositivos, el facultativo encargado los revisará y firmará.Los informes de las extracciones del mismo pacientey de la misma tanda de hemocultivos se envíanjuntos, grapados.

A los microorganismos considerados contaminantesno se les informa el antibiograma, aunque susensibilidad quedará registrada por si se requiere conposterioridad.

Después de enviar la información hacia las áreas dehospitalización correspondientes, todos los resultadosse anotarán en el Libro de Registro de Hemocultivos yen la hoja diaria y se desecharán los frascos crecidosque ya han sido informados. Todos los protocolos detrabajo de los hemocultivos significativos se guardaránen archivadores, ordenados por orden alfabético.

8.3. INFORME DE RESULTADOS NEGATIVOSLos hemocultivos negativos permanecerán en

incubación durante 5 o 21 días según su caso ytranscurrido ese tiempo se informarán como estérileso negativos.

9. RESPONSABILIDADESLos técnicos de laboratorio serán los responsables de

la realización de la técnica, de realizar el informepreliminar verbal de los hemocultivos con sospecha decrecimiento y de emitir el informe escrito preliminar y eldefinitivo siempre bajo la supervisión del facultativoresponsable.

El facultativo de hemocultivos también tendrá bajosu responsabilidad la interpretación de los resultadosy la validación de todos los informes emitidos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOLos sistemas automáticos de monitorización

continua de hemocultivos permiten determinar elmomento en el que se produce el crecimiento de lamayor parte de las bacterias y los hongos derelevancia clínica.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOEstos sistemas automáticos no permiten detectar

el crecimiento de algunas bacterias como Francisellaspp., Leptospira spp., Bartonella spp. y Mycoplasmaspp., parásitos ni virus.

12. BIBLIOGRAFÍA1.- Bouza E, Loza E, Planes, A, Rodríguez Cobacho A.

Procedimientos en Microbiología Clínica, Hemocultivos.1993. Coordinador, J Romero Vivas, Ed J Picazo.Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica, Madrid.

2.- Dune WM Jr, Nolte FS, Wilson ML. Cumitech 1B, Bloodcultures III. 1997. Coordinating ed, JA Hindler. AmericanSociety for Microbioogy, Washington DC.

3.- Loza E, Alomar P, Bernal A, Pérez JL, Picazo JJ,Sarazá ML. Procedimientos en Microbiología Clínica,Seguridad en el Laboratorio de Microbiología Clínica.2000. Coordinadora, E Loza, Ed JJ Picazo. SociedadEspañola de Enfermedades Infecciosas y MicrobiologíaClínica, Madrid.

4.- Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update ondetection of bacteremia and fungemia. Clin MicrobiolRev 1997; 10: 444-465.

5.- Wilson ML, Weinstein MP. General principles in thelaboratory detection of bacteremia and fungemia. ClinLab Med 1994; 14: 69-82.

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