Rocio Inga Peña Dpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS.
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Rocio Inga PeñaDpto. Bioquímica, Biol Mol
& Farmacología
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
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Modificaciones:
Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…
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Extracto crudo(mezcla de proteínas)
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Gel de apilamiento (menor concentración)
Gel de separación (la concentración depende de la resolución que se busque )
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Marcadores de Peso Molecular
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Inicio de corrida(donde inicia el gel separador)
Frente de corrida (línea donde termina el colorante)
DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
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DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
RF = distancia recorrida por la banda distancia total al frente de la corrida
(RF)
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• Acrilamida (C3H5NO) – formación de polímeros
• Bisacrilamida (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas de polímeros
• SDS : saturación con cargas negativas
• APS y TEMED : catalizadores de la reacción de polimerización
• DTT o βME : agentes denaturantes
• Azul de Bromofenol: Permite la visualización de la corrida electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.
REACTIVOS:
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• La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta 50 ng
• La tinción con plata incrementa la sensibilidad de detección ( 50 veces aprox)
Tinción del Gel SDS-PAGE
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ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Separación por:
• Punto isoeléctrico
• Tamaño
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Separación por Punto Isoeléctrico
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Punto isoelectrico diferentepero del mismo tamaño
Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño
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Análisis de Proteínas Multiméricas
- Se puede determinar el número y tamaño de subunidades mediante la electroforesis bajo condiciones denaturantes
Agentes denaturantes frecuentemente usados:
- Dithiotreitol (DTT)- β-mercaptoetanol (βME)
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El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante
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ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA DIMENSION
CONDICIONES:
• DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)
PRACTICA A REALIZAR
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Las muestras para analizar serán diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa:
• Extracto crudo
• Fracción con proteìna, sin actividad
• Fracción con proteìna, con actividad
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Dos tipos de tratamiento de muestras:
A) Denaturación directa de las muestras:
- Mezclar 25 uL de la fracción + 15 uL de Loading Buffer (Buffer de carga)
- Hervir por 4 - 5 minutos
- Cargar 20-25 uL en el gel.
B) Precipitación previa a denaturación
- Se utilizará el protocolo de precipitación con Etanol (33%)
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Actividad enzimática Cantidad de Proteína (Pirazinamidasa) (Bradford)