Apuntes de Laboratorios – Microbiología

Laboratorio 1. Tinciones

Tipos Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la

morfología. Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o reactivos y sirven para

clasificar las bacterias u observar sus características especiales. Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro. Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras

refringentes.

Tinciones compuestas.

Tinción de Gram Principio: Composición de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ está compuesta por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana externa con un componente estructural único que son los lipopolisacáridos.

Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta después de la decoloración y son teñidas de rojo con safranina.

Pasos:1) Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con

un asa bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.a. Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia,

igual en muestra semisólida.b. Muestra liquida: colocar la colonia directamente.

2) Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente por el mechero (2 ó 3 veces)

3) Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos (Colorante primario), enjugar con agua seguidamente.

4) Agregar yodo gram durante 40 a 60 segundos (mordente), enjuagar con agua seguidamente

5) Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente (decoloración, disuelve lípidos de la pared de G- )

6) Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua seguidamente.

*Mordente: compuesto químico intensificador de color.

Tinción de Moeller (esporas)

Se suspende una bacteria del genero Bacillus, evidencia capsula incolora en un contraste morado.

1) Se prepara el extendido de la muestra

2) Se deja secar y se fija con calor3) Se tiñe con carbol-fuschina hasta

llenar por completo el portaobjetos4) Pase un mechero por debajo de la

placa calentando hasta que vea que se emiten vapores y sin dejar que hierva por 3 minutos. Si la placa se va secando, ir agregando mas tinte hasta cumplir el tiempo. (Se calienta el tinte para que penetre la espora que contiene dipecolinato de calcio)

5) Se enjuaga con agua y se coloca acido sulfúrico al 1% por 2 minutos (decolorante para retirar el carbol-fuchina)

6) Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno por 1 minuto7) Dejar secar

Tinción de Anthony (cápsula)Es una tinción negativa en donde vemos la cápsula no teñida sobre un fondo morado y se visualiza la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de glicoproteínas o polisacáridos.

1) Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del portaobjetos2) Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde3) Realizar un extendido con la ayuda de

otro portaobjetos4) Se deja secar al aire (no se fija con

calor ya que la leche se pega al portaobjetos)

5) Teñir por 2 minutos con violeta-cristal.6) Lavar con sulfato de cobre.7) Se deja secar al aire.

Laboratorio 2. Cultivo de Bacterias y morfología colonial.

Medios de cultivo, según composición química: Nutritivos: puede crecer cualquier bacteria, ej.: BHI

Selectivo: solo crecen determinadas bacterias, ej.: McConkey (solo bacterias G-)Son inhibidores de G+, contienen sales biliares y violeta-cristal

Diferencial: ej: McConkey(bacterias fermentadoras y no fermentadoras)Contienen rojo neutro que indica cambios de pH, G- fermentadores se tiñen de rosado, los G- NO fermentadores son transparentes.

Enriquecidos: agregados nutrientes extras ej: agar sangre(agregamos sangre)

Medios de cultivo, según composición física: Sólidos ej.: agar Líquidos ej.: caldo Semisólidos: consistencia gelatinosasolo se inocula con aguja sembrando en el

fondo entrando y saliendo en línea recta, verifican motilidad, ej.: SIM

Medios de cultivo, según aspecto físico: Inclinado: Se usa una aguja o asa bacteriológica y se hace un estriado en el plano

inclinado(pico de flauta) Profundo e inclinado: Se usa solo una aguja bacteriológica, se inserta hasta el

fondo y al sacarle se hace un estriado sobre el plano inclinado ej.: TSI

Como Cultivar:1) Usar un asa bacteriológica2) Tomar el plato con agar y proceder a poner la cantidad de colonia en un extremo y

estrié hasta la mitad del plato, incinerar el asa3) Tomar la última porción del primer estriado y continuar con estrías mas separadas

hasta cubrir un cuarto del plato, incinerar el asa4) Tome la última porción del segundo estriado y continúe con el último cuarto del

plato haciendo estrías mas separadas, incinere el asa antes de guardar.

Evaluación de las colonias: Tamaño: pequeña (1-5mm), mediana (5-8mm), grande (mayor de 8mm)

Se aíslan colonias en un tejido para ver las morfologías individuales.

Laboratorio 3. Efectos de los agentes físicos y químicos sobre las bacterias

Antiséptico: sustancia que elimina bacterias sobre personasAsepsia: proceso diseñado para evitar que los microorganismos lleguen a un ambiente protegidoDesinfectante: sustancia que elimina bacterias inhibiendo su crecimiento, usado sobre superficies inertesDesinfección: empleo de agentes químicos para destruir microorganismos patógenos con eficacia variable.Esterilización: destrucción de toda forma viviente

Pasteurización: utilización del calor para matar las formas vegetativas de las bacterias.

Métodos de desinfección físicos: Autoclave: el calor húmedo permite la desnaturalización rápida de proteínas y se

utilizan parámetros de presión (15 lb), temperatura (121°) y tiempo de exposición (15 minutos).

Horno: el calor seco requiere de una temperatura de 160° y de 2 horas de exposición.

Rayos UV: requiere de exposición directa, produce la perdida de la capacidad para replicarse, tiempo de 10 a 15 minutos, tiene poco poder de penetración.

Filtración: usado para líquidos, agentes más pequeños que los poros logran atravesar.

Métodos de desinfección químicos: Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas

y como agentes deshidratantes. Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta.

Fenol y compuestos fenólicos son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis.

Cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

Antisépticos: peróxido de hidrogeno, yodofóro

Características del desinfectante ideal: Actividad antimicrobiana a baja concentración Solubilidad No ser tóxico para personas y animales No combinarse con materia orgánica extraña Actividad a temperatura ambiente o del cuerpo Capacidad de penetración No ser corrosivo ni teñir Poder desodorante Disponible y barato

Pruebas de sensibilidad (antibiogramas)

Se usa el agar Mueller Hinton, es un agar nutritivo, porque esta estandarizado y el antibiótico difunde sin ningún problema.

Difusión en plato ó método de Kirby-Bauer Colocar una pequeña cantidad del cultivo en solución salina y llevar la

turbidez hasta hacerla equivaler con el tuve 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108 UFC/ml) (contiene acido sulfúrico y cloruro de bario, la función de esta escala es la estandarización del inoculo)

Sembrar en agar Mueller-Hinton (baja concentración de iones divalentes. Medio recomendado por la NCCLS, no contiene timina o timidina, profundidad en el orden de 4 mm., pH: 7.2 y 7.4)

Usar hisopo esteril impregnado de la suspensión anterior y difuminar varias veces incluso por los bordes.

Colocar discos de antibióticos, alejados unos de otros Incubar a 37° por 24 horas. Se leen los halos de inhibición midiendo el

diámetro y se comparan con las tablas disponibles.

A mayor efecto de antibiótico, mayor halo de inhibición

E-Test (epsilon test): Técnica que combina los métodos de difusión en agar y dilución para determinar la CIM. La sistemática es similar al método de difusión en agar pero en lugar de discos utiliza tiras de E-test.

Estas tiras contienen un gradiente del antimicrobiano en la superficie inferior que difunde en el agar estableciendo un gradiente continuo del mismo a lo largo de la tira. Después de la incubación se forma una zona elíptica de inhibición del crecimiento y la CMI corresponde con el punto donde el área de inhibición del crecimiento intersecciona con la tira.

CIM (concentración inhibitoria mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada.

CBM (concentración bactericida mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.

Laboratorio 4. Flora Normal y del ambiente.

Se conoce como la Flora Indígena, es una colección de organismos que se encuentra habitualmente en el individuo sano normal y que coexisten en forma comensal. Conformada por: hongos, bacterias y parasitos. La colonización del cuerpo humano empieza en el nacimiento, se adquiere a través de la leche materna. La flora normal microbiana en humanos está confinada especialmente a la piel y las mucosas

División del cuerpo en áreas (según presencia o ausencia de F. Normal):• Libres de agentes o estériles

– L.C.R, tejidos, órganos, zonal pleural, pericardio• Posibles presencias

– Sangre, liquido linfáticos, orina• Altamente pobladas

– Piel, boca, nariz, conjuntiva, faringe, intestinos delgado, Int. grueso, regiones urinarias y anales.

Tipos de Flora normal• La Flora basal: Son agentes que están siempre presente en un sector.

– S. epidermidis: en la piel – E. coli : en el intestino

• La Flora transitoria: Son agentes que colonizan de forma intermitente un determinado sector. – S. aureus – Enterobacterias y Acinetobacter en axilas e ingle.

Importancia de la Flora normal:• Es una barrera biológica contra la

colonización de agentes patógenos.

• Contribuye a la respuesta inmune: – aumenta la producción de

anticuerpos e interferones – estimula la fagocitosis.

• Producción de bactericidas– bacteriocinas, colicinas (M.

sec. y baja O2).

Localización EjemplosPiel (zonas de piel con mas flora: cuero cabelludo, cara, oído, axila, región urinaria y anal, plantas y espacios interdigitales de los pies)

Staphylococcus epidermidisStaphylococcus aureusStreptococcus

Boca Streptococcus mitisStreptococcus mutansStreptococcus sanguisStreptococcus salivarus

Vagina (pre-pubertad) StaphylococcusStreptococcusDifteroidesEcherichia Coli

Vagina (post-pubertad, pH 4-4.5) Lactobacillus o lactobacilos DonderleinCandida albicansThichomona vaginalis (pH 5.5)

Nariz Staphylococcus aureus(20% población)Staphylococcus epidermidisMicrococcusStreptococcusDifteroides

Intestino Grueso Bacteroides spFusobacterium spEnterococo faecalisEnterobacterias (E. Coli, Klebsiella sp,

Salmonellas)LactobacillusPseudomonasEubacteriasBifidobacterias

• Consumo de compuestos esenciales• Producción de vitaminas (K, B)

La vaginosis bacteriana es una infección cervicovaginal muy común dentro de la consulta ginecológica. Se caracteriza principalmente por un incremento del fluido vaginal, lo cual origina malestar en las pacientes. En esta patología se ha observado un aumento importante en la concentración de microorganismos, sustancialmente de Gardenerella vaginalis y los anaerobios presentes en la vagina. Se conoce también con el nombre de vaginitis no específica, nombrada así por los médicos que al no encontrar ni tricomonas ni levaduras. Otros sinónimos son vaginitis anaeróbica o vaginosis anaeróbica.

UCF= Numero decoloniasTiempo x0.2 IC= UFC /m 3(interior)UFC /m3(Exterior )

IC= Índice de contaminaciónIC menor que 1 es bueno, IC de 1 a 3 es regular, IC mayor de 3 es malo.

Laboratorio 5. Cocos Gram + de importancia medica

Prueba de Catalasa (peróxido de hidrogeno)Observa un burbujeo es +No se observa burbujeo es –

Prueba de Coagulasa (Staph Plus)Si se observa un coagulo es coagulasa +No se observa coagulo es coagulasa –

Prueba de manitol-sal (indicador rojo fenol)Color amarillo +Color rojo ó rosa –

Prueba de BiliesculinaColor negro oscuro +Color verde oliva -

Prueba de CAMPLa interacción del factor CAMP de Streptococcus agalactiae con β-lisinas de Staphylococcus aureus potencia la hemolisis de S. agalactiae formando la zona de hemolisis en forma de flecha. El desconocido se siembra perpendicular al S. aureus si es S. agalactiae se formara la flecha.

Clasificación de Lancefiel, Rebeca Lancefield, basada en los carbohidratos de la pared celular (antígenos de membrana), Grupos A-G

Clasificación por hemolisis en agar sangre:Alpha-color verdeBeta-TransparenteGamma-Nada

Laboratorio 9. Microbiología de aguas y alimentosEnfermedades de transmisión alimentaria (ETA) pueden darse por el consumo de sustancias toxicas o microorganismos patógenos.

Tipos de contaminaciónFísica ej.: pedazos de vidrioQuímica ej.: insecticidasMicrobiana ej.: virus, bacterias, hongos

Como suceden: Enfriamiento inadecuado (principal causa de ETA) Calentamiento o recalentamiento a T° inadecuadas que no eliminan las bacterias Agregan ingredientes crudos o contaminados a los alimentos Mala higiene Descomposición y almacenamiento (descongelar y volver a congelar) Contaminación cruzada (alimentos crudos contaminan a los listos para comer) Ingerir alimentos de alto riesgo (muy manipulados, crudos)

Requerimientos de producción de bacterias en alimentos: Humedad, nutrientes, tiempo, pH, temperatura

Laboratorio 10. Bacilos Gram -: fermentadores y no fermentadores

Características relevantes: Amplia distribución en el tracto gastrointestinal (TGI) Reducción de nitratos Fermentadores de glucosa (excepto Pseudomona sp) Citocromo oxidasa negativo (excepto Pseudomona sp)

Medios de cultivoEMB (Eosina azul de metileno)Este medio es selectivo y diferencial para el aislamiento de bacilos entéricos que permite una diferenciación entre las colonias de microorganismos fermentadores de lactosa y aquellos que no la fermentan. La presencia de sacarosa permite para ciertos miembros del grupo coliforme, fermentarla con más facilidad que a la lactosa. Las colonias lactosa positivas son verdes con brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras. Mientras que aquellas que son negativas en lactosa o sacarosa son rosa pálido translucidas.

McConkey

La inhibición de los microorganismos Gram positivos se obtiene mediante la mezcla de sales biliares y cristal violeta. La acción diferencial del medio se basa en la fermentación de la lactosa. Esta fermentación baja el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rosa intenso con halo de inhibición precipitación. Los microorganismos no fermentadores de la lactosa dan colonias de color ámbar o transparentes.

Salmonella-Shigela (SS)La inhibición de microorganismos Gram positivos se debe a su contenido de sales biliares, verde brillante y citratos. La diferenciación de los microorganismos entéricos se logra por la incorporación de lactosa en el medio. Los microorganismos que fermentan la lactosa producen ácido, el cual al reaccionar con el indicador rojo neutro, forma colonias de color rojo. Los microorganismos no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras. Este último grupo contiene la mayoría de los microorganismos patógenos intestinales incluyendo Salmonella y Shigella. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico, facilitan la detección de sulfuro de hidrógeno, manifestándose por colonias con centros negros.

Pruebas Bioquímicas

Citrato: para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

TSI (triple azúcar hierro): es un medio nutriente y diferencial que

permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Sirve para la identificación de enterobacterias según la fermentación de tres azúcares (lactosa[10 g/l], sacarosa[10 g/l] y dextrosa[1 g/l, se va al fondo]) y producción de sulfhídrico. El sulfato férrico sirve como indicador y el rojo fenol como indicador del pH.

Pico alcalino/fondo alcalino K/KNo hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino/fondo ácido K/AGlucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp. Pico alcalino/fondo negro K/A H2S+Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonella spp. Pico ácido/fondo ácido A/AGlucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no.   E.coli  A/A H2S +A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/AgH2S-.

*NUNCA va a haber A/K

Urea: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. La urea será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa produciendo amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. El indicador es el rojo fenol.

MR-VP (Rojo metilo_Voges-Proskauer): estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.

Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.

0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.

SIM: se mide la producción de sulfuro, la producción de indol (con revelador) y la movilidad de la bacteria. Se pulla el agar en tubo hasta el fondo sin mover. Si el

tubo sale turbio hay movilidad (caminito es -), si queda negro hay producción de sulfuro y si tiene un anillo rojo arriba hay producción de indol. Ni B. magaterium ni B. subtillis son móviles (-).

Fenilalanina: determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias. Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml (3 gotas) de una solución de cloruro férrico (FeCl3) al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.