La Espectrometria de Masas

en la

Identificacin de ProteinasDra. Irene FernndezServicio de Espectrometria de Masas. UB.

Gel 1. Spot 2. Rentat Extracci 3. Digesti 4. ExtracciProtenaBarreja dePptids trpticsEspectrometria de Masses ElectrosprayMALDIPROTEMICABase de Dades

- Colorantes ( sales de plata, Coomassie Blue, . . . )

- Urea (desnaturalitzacin prot., detergentes )

- Agentes reductores ( DTT, DTE )

- Glicerol, agentes alquilantes, SDSELIMINACIN

RKRKKKRKKProteasas y posiciones de corte especficasEnzimaPosicin de corteTrypsin/K-, /R-, \PChymotrypsin/W-, /Y-, /F-, \PGlu C (V8)/E-, /D, \PLys C/K-, \PAsp N/d-ProtenaTrypsinMezcla de Pptidos trpticos

COOHNH2Digesti Enzimtica ( Trypsina, V8)Qumica (CNBr, BNPS)NH2COOHm/z15.200 DaProtenaPptids trpticsSeqnciaMS/MSNH2COOHMSm/zm/zInformaci massesPunts de digestiModificaciBASE DE DADESMS102587410251025%2155181448

Deteccin en el Masas

A) Muestra pura

EM

t

%

Cromatograma de iones TIC

%

m/z

Espectro

m/zm/z%%12C+14N+16O13C+14N+16O12C+15N+16O2x13C+14N+16O13C+15N+16O

Distribucin isotpicade las seales

12C 10013C 1.112

14N 10015N 0.367

16O 10018O 0.200

32S 10034S 4.43

Monoisotopic MassMonoisotopic MassMonoisotopic MassAverage Mass

ANALISIS DE UNA MEZCLA

1234

HPLC

EM

TIC

%

m/z

%

m/z

%

m/z

%

m/z

%

1

3

2

4

FONTS DIONITZACI ELECTROSPRAY MALDI

ELECTROSPRAY

HPLCFONT ELECTROSPRAYIons : (M+nH)n+, (M-nH)n- analitzadorIntroducci directaLC/MS

Caracterstiques del procs d'ionitzaci (I)

a) Tcnica d'ionitzaci suau

- T. Ambient

- P. Atmosfrica

- Molt poca fragmentaci

b)Pot produir MULTIPLICITAT DE CRREGA en aquelles molcules amb posicions susceptibles d'ionitzar-se, com els grups -NH2 lliures de les protenes.

(

No es necessari disposar d'analitzadors de gran rang de lectura, es a dir amb quadrupols ( < 4000uma ) es poden detectar molcules de 100.000uma.

PAGE

1

H2N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH2Tripptid Lys-Met-Asp ( KMD) MW monoisotopic= 459.3 DaH3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH2H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH3+++A1 (M+H)+= 460.3A2 (M+2H)2+= 461.3/2 = 230.6m/z%AA1A2230.6A2460.3

Espectre real ESIDeconvoluci a lescala real de massesES Myoglobin 20 femtomoles MWaverage=16.951.1m/zmA20A19A18A21Am1-Hm2- m1n =

Barreja: human haemoglobin

n = 1/Dm

Dm

Dm

n= 1Dm= 1

n= 2Dm= 0,5

n= 3Dm= 0,33

- Micro Electrospray : L/min LC/MS amb split

- Nano Electrospray : nL/min. Biomolcules. No LC/MS. Si MS/MS. Lmits de detecci femtomols

Tampons voltils

Molcules solubles en dissolvents polars (H2O, CH3CN, MeOH).

Mostres netes ( no : sals, detergents, SDS, ...), processos previs de purificaci.

Tcnica depenent de la Concentraci

Lectura ions positius i negatius.

Informaci : Pes Molecular (

TIC

MALDI

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

hn LaserIonsAnalitzador( TOF, quadrupol)(M+H)+(M-H)-MALDICristal.litzaciConcentracions:Peptids,protenes : 0.1 a 10pmol/mLOligonucletids :10 a 100pmol/mLMatriu ( SA, CHCA, THAP, DHB)Mostra1 mL

- Tcnica senzilla i rpida. Fcil preparaci mostra.

- Informaci :. Pes Molecular. Fins 300KDa.Poca fragmentaci. Anlisi barreges sense separaci prvia ( digerits proteics ). Seqenciaci : PSD, ISD, Enzimtica(informaci estructural ). Protenes, pptids, oligonucletids, oligosacrids, . . . .

- Quantitat de mostra : mL, conc. :

20173.140394.3ADAPptids trpticsTRYPSINA

Daniel C. Liebler Introduction to Proteomics. Humana Press, 2002

Diapositiva 13 de 65

Daniel C. Liebler Introduction to Proteomics. Humana Press, 2002

(Time of flight)

DetectorDetector

INFORMACI ESTRUCTURAL

Lectura dels ions formats a la font

Possibilitat de fragmentaci (MSn). Informaci estructural Pptids i protenes

MS

Anlisi dels ions de la font. A+ , B+ , C+

MS2

Selecci d'un dels ions anteriors: Precursor A+

Excitaci del Precursor per a fragmentar-lo. A+ A+1 , A+2 , A+3

Lectura dels ions resultants

A+1 , A+2 , A+3

MS3

Selecci d'un dels ions anteriors: A+1

Excitaci per a fragmentar-lo: A+1

A+11 , A+12

. . . . .

. . . . . .

FONT

ANALITZADOR

DETECTOR

400 / 401 uma

- Resoluci

400,0000 / 400,0001

Caracterstiques

- Sensibilitat Lmits detecci

- Rang d'anlisi Valors de m/z

Resoluci

Sensibilitat

Rang

Sector Magntic

ALTA

BONA

10.000

Quadrupol

UNITAT

MITJANA

4.000

TOF

MOLT BONA

BONA

300 KDa

ION TRAP

BAIXA

MOLT BONA

1.000

ICR

MOLT ALTA

MOLT BONA

10.000

NH2COOHPptidos trpticosDigestinInformacin masasMSCOOHNH2ProtenaMS/MSNH2COOHm/zm/zBASES DE DATOS10258741025m/z = 10252155181448725A-L-R-S-C-D-K-Rp*Secuencia pptidos trpticosProtena

SEQNCIACI EN MS- Maldi-TOF : PSD, ISD- Electrospray i Maldi-TOF/TOF: MS/MS

- Comparaci MS vs Seq. EDMAN. MS mesura masses. AA nous o modificats espoden detectar b.. N-terminal no lliure no s problema. MS es pot fer directament sobre barreges senzilles. Adquisici rpida i no gasta reactius. Tamany de pptids fins a 25 residus aprox.. Linformaci a vegades no es complerta i alguns pptids presenten dificultats. Quantitat : pmol de substncia

MALDI-TOF INFORMACIO ESTRUCTURAL (ISD) ( In Source Decay )-La DM entre els diferents fragments ens informa de la seqnciaTant en protenes com en DNA

Roepstorff, P.; Fohlmann, J. Biomed.Mass Spectrom, 11, 601 (1984)H2N------aa1------aa2------aa3------COOHSECUENCIACIN DE PPTIDOS Fragmentos inicos

NH2- C- -C- -N- -C- -C- -N- -C- -C- -N--C

CO2H

H

H

H

H

H

H

H

R4

R3

O

O

R2

R1

O

z1

c3

b3

a3

c2

b2

a2

c1

b1

a1

y1

x1

z2

y2

x2

z3

y3

x3

N-Terminal

C-Terminal

- Immonium Ions ( Fragmentaciones caractersticasde cada aminocido H2N+=CHRn)

672.1434.8535.11107.1819.2719.0994.1848.11108.1407.0994.9271.7518.1536.0435.81109.11080.1849.2654.2983.2343.8581.9482.6259.9282.9618.5736.2176.4966.3389.01125.9943.4803.31011.9242.4315.71179.31213.6In precursor doblemente cargado: 627.3Mr = 1253.6 DaSecuencia: qCYFHQFLKEjemplo espectro MS/MS-Espectros complicados. Programas secuenciacin DE NOVO.Introduccin en las bases de datos.

%m/zLinearDetectorLaserReflector DetectorSeleccin m/z=MALDI-TOF con REFLECTORSecuenciacin - PSDTof-LinealFuenteReflectorLserEspectro

PSD del Pptido de MW=1404.6

Peso de los fragmentos Introduccin Protein Databases NCBI base de datos Swiss Prot OWLSecuencia AKLMRLQ Gene Databases dbEST

IonizacinLectura FragmentosSeleccinFragmentacinEspectro fragmentosm/z%Fragmentacin MS/MS- Analizadores en Tandem- Ion Trap

IonizacinLectura FragmentosSeleccinFragmentacinFragmentacin MS/MSAnalizadorAnalizadorC.C.FuenteTriple Quadrupolo QQQQuadrupolo-TOF QTOFSector Magntico Quadrupolo BQTOF-TOF

ESI/Q-TOFIonizacinQuadrupoloTOFCIDmuestra(M+H)+nMS/MSseparacin m/zFuenteseparacin m/z

m/z

%

908.5

A

1816.3

A2

A3

MS/MS

m/z

y3

y4

y5

y6

y7

y9

y10

MS/MS dun pptid trptic de la Myoglobina

V

N

L

V

QQ

W

%

GLSDGE-W-QQ-V-L-N-V-WGK

GLSDGEWQQVLNVWGKMW=1815.3

AGCA

AQCAG

AGCAAQCAG

INFORMACI ESTRUCTURAL

Lectura dels ions formats a la font

Possibilitat de fragmentaci (MSn). Informaci estructural Pptids i protenes

MS

Anlisi dels ions de la font. A+ , B+ , C+

MS2

Selecci d'un dels ions anteriors: Precursor A+

Excitaci del Precursor per a fragmentar-lo. A+ A+1 , A+2 , A+3

Lectura dels ions resultants

A+1 , A+2 , A+3

MS3

Selecci d'un dels ions anteriors: A+1

Excitaci per a fragmentar-lo: A+1

A+11 , A+12

. . . . .

. . . . . .

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

1) FOSFORILACIONES : Serina (S), Threonina (T) y Tyrosina (Y)Cambios Biolgicos

. Activacin/desactivacin enzimtica. Alteracin interacciones y asociaciones proteicas. Cambio estructura protenas, degradacin. . .

Cambios observables en el masas

. Adicin Grupo Fosfato : PO4H3 M-S-D-K M- p S-D-K

. DM de la Protena/Pptido + 80 uma por cada fosforilacin. MS/MS Prdida PO4H3 m/z=1 DM = - 98

Prdida PO3 m/z=1 DM = - 79

Fosforilacin de S , T y Y

***G-N-D-T-T-L-D-S-S-M-EG-N-D-T-T-L-D-S-S-M-E****Modificaciones Postraduccionales : Fosforilacin11.266

11.347

11.427

11.506808080*****

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

2) GLICOSILACIONES : Adicin de un Carbohidrato o un Polisacrido dando lugar a una glicoprotena. Molculas complejas debido a la heterogeneidad de los azcares.

. >60% Protenas en mamferos

. Marcadores interacciones clula/clula, clula/molcula :

Fertilizacin, respuesta immune, replicacin viral, infecciones parasitarias, crecimiento de la clula, inflamaciones, degradaciones . . .

Cambios observables en el masas

. Adicin azcares en posiciones N-Linked NH2 Asn

O-Linked Ser, Thr

. Incremento del peso de la protena en funcin de la modificacin.

N- y O-linked Protein Glicosylation

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

2) GLICOSILACIONES : Anlisis

. Identificacin de la Protena Glicosilada, tipo de Glicosilacin y posicin en la cadena peptdica, caracterizacin de la Glicosilacin : Secuencia de las cadenas

. Incremento del peso de la protena en funcin de la modificacin.

EstrategiaGlcNacDeteccin yaislamiento de la ProtenaProteolisisGlcNacLC-MS/MSMALDI-TOF/TOF. Identificacin Protena ( DataBase). Identificacin grupo GlcNac. Posicin en la cadena peptdica . Secuenciacin azcares

GlcNacm/z%Secuenciacin cadena glicosdica

. Enzimtica ( glicosidasas ). MS/MS

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

3) Acetilaciones: Adicin de un grupo Acilo ( -COCH3) en el grupo amino terminal o los grupos amino libres (Lisina K )DM = 42

Oxidaciones: Metioninas DM = 16

Aductos acrilamida: Cistenas DM = 71

Carbamidometilacin : Adicin grupo -CH2CONH2 en el grupo -SH de las cistenas DM = 57

Comprovacin Interaccin Especfica entre ProtenasDaMyo DDominio DaFusionado con GSTGST-DaMw= 36 KDaDominio Myo DFusionado con polyhistidinasMyo DMw= 15 KDa?

Secuencia His6 MYO-DMW aprox 15300Da

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPSSSSAMAPKKKRKVPGVPSSNCIDWIX

KRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLR

DQGSPGTELNCGR

1)Extracto Proteico+GST-DaColumna afinidad GSTLavadoEluidoGST-DaProt. InteraccionanteLiberacin protenaMW1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE2)Protenas no interaccionantes3)Interaccin proteica

ELUDO CROMATOGRAFA DE AFINIDADVoyager Spec #1=>NR(0.80)=>NR(1.00)[BP = 15457.7, 629]MyoD ?GST-Da degradationGST-DaGST-Da (2+)15407365041828827179GST-DaMyoD?Espectro MALDI-TOF

Voyager Spec #1[BP = 1175.7, 16833]1175.742073.002058.011177.751206.722075.001333.661404.701050.59842.552060.011406.711080.451208.722327.122014.021300.682665.341478.671180.662251.202384.181717.961052.60861.10957.472055.951613.861308.771838.85770.342649.341935.012146.982776.532515.281422.751513.432894.57Digerido trptico de la protena interaccionante con DaEspectro de MALDI-TOF-Recorte-Dig. Trypsina-Extraccin pptidos-Anlisis MS

Identificacin Protena Interaccionante con Da Myo DBases de DatosPeptide MassFingerprintingMS/MS SpectraMS-TAG

Resultado: Protena Myo D Pptidos trpticos identificados - VNEAFETLKR YIEGLQALL

Index Number: 127240Acc. #: P10085 INCLUIRIMAGEN \d "Image1.gif"

Species: MOUSE Name: Myoblast determination protein 1pI of Protein: 5.3Protein MW: 34219Amino Acid Composition: A36 C9 D25 E19 F8 G22 H8 I7 K9 L27 M4 N9 P36 Q9 R25 S32 T13 V10 W1 Y9

1

11

21

31

41

51

61

71

MELLSPPLRD

IDLTGPDGSL

CSFETADDFY

DDPCFDSPDL

RFFEDLDPRL

VHVGALLKPE

EHAHFSTAVH

PGPGAREDEH

81

91

101

111

121

131

141

151

VRAPSGHHQA

GRCLLWACKA

CKRKTTNADR

RKAATMRERR

RLSKVNEAFE

TLKRCTSSNP

NQRLPKVEIL

RNAIRYIEGL

161

171

181

191

201

211

221

231

QALLRDQDAA

PPGAAAFYAP

GPLPPGRGSE

HYSGDSDASS

PRSNCSDGMM

DYSGPPSGPR

RQNGYDTAYY

SEAVRESRPG

241

251

261

271

281

291

301

311

KSAAVSSLDC

LSSIVERIST

DSPAAPALLL

ADAPPESPPG

PPEGASLSDT

EQGTQTPSPD

AAPQCPAGSN

PNAIYQVL