IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROVARIEDADES DE...
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IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS
ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS
Autora: Andrea Zambrano Cobos
Directora: BSc. Karina PonceCodirector: Dr. Marcelo Grijalva
Sangolquí - Ecuador2012
TABLA DE CONTENIDOS TABLA DE CONTENIDOS
Escherichia coli (Enterobacteriaceae)
CARACTERÍSTICAS:
•Anaerobio facultativo, Gram -•Pared celular rígida y porosa •Flagelos y pilis•Membrana celular (lípidos y proteínas) •Una sola cadena circular de ADN•Aproximadamente 5000 genes
1. EPEC2. ETEC3. EIEC4. EHEC5. EAEC6. DAEC
CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS
•Poseer distintos factores de virulencia•Causar un síndrome diarreico diferente•Presentar distinta epidemiología•Pertenecer a distintos serotipos O:H
Métodos específicos de detección
MECANISMO DE PATOGENICIDAD MECANISMO DE PATOGENICIDAD
Variabledepende E. coli diarreicas
• Invasividad.
• Adherencia a la superficie de la mucosa.
• Producción de enterotoxinas.
• Producción de citotoxinas
ETAs
EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla.
ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados.
EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería.
EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal
EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes
DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
• Países desarrollados y subdesarrollados
• Datos epidemiológicos
• No existen reporte de E. coli patógenas
DETECCIÓN
1. Propiedades bioquímicas
2. Serotipo (Ciertas variedades)
3. Reacciones inmunoenzimáticas 4. Cultivos celulares
5. PCR
6. Hibridación de sondas
Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST
PCR MÚLTIPLEX
Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn
Amplifica
• Diagnóstico rápido
• Alta confiabilidad
• Sensible y específico
Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad
Objetivo General
Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
• Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación
• Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente
• Determinar la sensibilidad analítica del sistema. • Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la
identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas.
Objetivos específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO
Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación.
Diseño PCR Multiplex
Sensibilidad
Especificidad
Controles positivos y primers
Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia
Cebadores
DAEC EPEC EHEC EIEC EAEC ETEC
eltBestAeae vt1 vt2 ipaH aggRDa
322 pb
147pb
376pb
130pb
298pb
600pb
254pb
750pb
Extracción ADN genómico
Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification
Temperatura de hibridación
Rango: 56ºC-68ºC
OPTIMIZACIÓN
Concentración de Primers
0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM
DISEÑO DE PCR MULTIPLEX
1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn
2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC
3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B
Tiempos de amplificación
1 min-45 seg- 30 seg
LÍMITE DE DETECCIÓNCepas de referencia : EHEC y ETEC
ESPECIFICIDAD
Escherichia coli Escherichia coli ATCC 51313Escherichia coli ATCC 25922Klebsiella pneumoniaeSalmonella serotipo EnteritidisVibrio cholerae
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Microbiología
ADN Genómico
ETEC: 33,6ng/uL
EPEC: 20,2 ng/uL
EIEC: 17,8 ng/uL
EHEC: 17,3 ng/uL
EAEC: 47,5 ng/uL
DAEC: 10,8 ng/uL
Temperatura de hibridación
M ipaH ipaH ipaH ipaH eae eae eae eae
M eltB eltB eltB eltB aggR aggR aggR aggR
EIE
C-E
PE
CE
TE
C-E
AE
C
EIE
C-E
CD
A M ipaH ipaH ipaH ipaH Da Da Da Da
M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c-
EH
EC
Concentración de cebadores
0,4 uM 0,2 uM
vt1 eae eltB aggR Da vt1 eae eltB estA Da Da Da
Diseño PCR multiplex
Pool DNA
Primer Ensayo
Concentración de primers
Segundo Ensayo
PCR Dúplex
Tercer Ensayo
MULTIPLEX A Y B
A: EHEC-EPEC-DAEC
B: ETEC-EIEC-EAEC
B A
Tercer Ensayo
MULTIPLEX A Y B
Limite de detección
Multiplex A : EHEC
Multiplex B : ETEC
0,0029 ng/uL
0,011 ng/uL
ESPECIFICIDAD
M ETEC Salm Vibrio K.pneu C-
Amplifica E. coli patógenas!!!
Prueba de Campo
M m1 m2 C1+ C1- m1 m2 C2+ C2-
Múltiplex A Múltiplex B
EPEC ETEC
Conclusiones
Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex
Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex.
Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45”.
Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA.
La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL.
La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación
Recomendaciones
Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex
optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos.
Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos.
Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc.
AGRADECIMIENTOS