Guia de Metodos de Analisis Por HPLC 2012
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
ESCUELA DE QUIMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
INSTRUMENTAL ANALITICO
GUIA DE METODOS DE ANALISIS POR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Caracas 2008
Profa. Rosa Amaro
Prof. Luis Gómez
Prfa. Yosmery Vita
TABLA DE CONTENIDO
Contenido Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C. ............................................................... 3
Justificación .............................................................................................................................................. 3
Objetivos. ................................................................................................................................................. 3
Parte Experimentales ................................................................................................................................ 3
Referencia ................................................................................................................................................. 5
Determinación de cafeína en refresco (PEPSI) ............................................................................................ 6
Justificación .............................................................................................................................................. 6
Objetivos .................................................................................................................................................. 6
Parte Experimentales ................................................................................................................................ 7
Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico ............................................. 9
Justificación .............................................................................................................................................. 9
Objetivos .................................................................................................................................................. 9
Parte Experimental ................................................................................................................................. 10
Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra
biológica ..................................................................................................................................................... 13
Justificación ............................................................................................................................................ 13
Objetivos ................................................................................................................................................ 14
Parte Experimental ................................................................................................................................. 14
Bibliografia ............................................................................................................................................. 16
Determinación de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en analgésicos. ................................... 18
Justificación ............................................................................................................................................ 18
Objetivos. ............................................................................................................................................... 19
Parte Experimental ................................................................................................................................. 19
Estudio Cualitativo ................................................................................................................................. 21
Estudio Cuantitativo ............................................................................................................................... 22
Referencias ............................................................................................................................................. 23
Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C.
Justificación
Objetivos.
GGeenneerraall::
Determinar el contenido de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C
usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC), a
fin de familiarizar al alumno en el uso de dicha técnica.
EEssppeeccííffiiccooss::
Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de
cromatografía líquida de alta eficiencia.
AApprreennddeerr eell ttrraattaammiieennttoo aaddeeccuuaaddoo ddee llooss ssoollvveenntteess yy mmuueessttrraa:: ffiillttrraacciióónn yy
ddeessggaassiiffiiccaacciióónn ddee llooss mmiissmmooss..
Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena
separación de los picos en la muestra de vitamina C.
Preparar patrones de ácido ascórbico.
Analizar cuantitativamente la pastilla de vitamina mediante el uso de una
curva de calibración.
Parte Experimentales
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco
PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y
Tamaño de partícula: 5 (μm)
Preparación del Sistema HPLC
1. Emplear eluentes grado HPLC.
2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.
3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..
4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica
para poder realizar la purga con estos.
5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba
(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow en un
valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego
de esto presionar el botón “pump” para encender la bomba y dejar la purga por 5
min. aproximadamente.
6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo
contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos.
7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se
hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la
bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1
mL/min hasta llegar a 1 mL/min.
8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la
muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.
Condiciones Experimentales
Volumen de inyección 10μL
Detección a 254 nm
Flujo: 1mL/min
Fase móvil: 50 mM de KH2PO4
Preparación de la curva de calibración.
Se prepara una madre de 200 ppm de
acido ascórbico.
Se preparara cuatro patrones de 5/10/15/
20 ppm a partir de esta madre
Se inyectan al HPLC y se realiza una curva de calibración
graficando los valores de área de pico en función de la
concentración
Preparación de la muestra
Se pesa la pastilla inicialmente (Dato que debe ser colocado en el informe)
SSee ppuullvveerriizzaa llaa ppaassttiillllaa::
ssee ppeessaann ttrreess mmuueessttrraass ddee 00..3300000000 gg
SSee ddiissuueellvveenn eenn aagguuaa yy ssee eennrraazzaann eenn 110000mmLL..
SSee rreeaalliizzaa uunnaa ddiilluucciióónn ddee 00..4400mmLL eenn 2255 mmLL ddee ccaaddaa uunnaa ddeessppuuééss
ddee ffiillttrraarr llaa mmuueessttrraa eenn uunn ffiillttrroo ddee cceelluulloossaa
Se inyectan al cromatógrafo por triplicado
Referencia
Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001
Editorial Mc Graw Hill.
Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág.
636-677. Año 2001.
Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. “Determinación de
fósforo y cafeína en bebidas de cola”. Educación química. V.12, pág. 116-120,
año.2001.
http://www.fad.es/sustancias/psicofármacosestimulantes., Revisado 12/11/07.
Determinación de cafeína en refresco (PEPSI)
Justificación Un grupo importante de consumidores de refrescos es la población universitaria. Se
piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un
excesivo consumo de estos productos no causa más daño que caries dental y un
aumento de peso debido al alto contenido de azúcar. Un refresco contiene ácido
fosfórico, cafeína y nuez de cola entre sus componentes principales, estos elementos
pueden llegar a causar diferentes trastornos al organismo. El fósforo está relacionado
con el calcio tanto en la nutrición humana como en la absorción de este mineral... La
cafeína, por su parte, es la droga psicotrópica de mayor consumo en el mundo, es un
compuesto alcaloide (del grupo de las xantinas) que actúa como estimulante en los
humanos. La cafeína produce vasoconstricción; presenta efectos a nivel de los sistemas
cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, actúa a nivel de los
músculos esqueléticos, del flujo sanguíneo renal, la glucogenólisis y de la lipólisis. El
consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicación. Sus síntomas son
insomnio, nerviosismo, excitación, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas
gastrointestinales. En algunas personas los síntomas aparecen consumiendo cantidades
muy pequeñas, como 250 mg por día. Más allá de un gramo al día puede producir
contracciones musculares involuntarias, desvaríos, arritmia cardiaca, y agitaciones
psicomotrices. Los síntomas de la intoxicación con cafeína son similares a los del
pánico y de ansiedad generalizada. La *LD50 estimada de la cafeína es de 10 g, cuyo
equivalente es de un promedio de 51 tazas de café.
Objetivos
General:
Determinar el contenido de cafeína en una lata de refresco (PEPSI) por HPLC.
Específicos:
Ajustar las condiciones experimentales para la determinación de la cafeína en el
refresco.
Determinar el contenido de cafeína en la muestra problema aplicando el método de
calibración absoluta.
Determinar la exactitud y la precisión de los resultados analíticos obtenidos a través
del método aplicado.
Parte Experimentales
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco
PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y
Tamaño de partícula: 5 (μm)
Preparación del Sistema HPLC
1. Emplear eluentes grado HPLC.
2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.
3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..
4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica
para poder realizar la purga con estos.
5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba
(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow en
un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido
luego de esto presionar el botón “pump” para encender la bomba y dejar la purga
por 5 min. aproximadamente.
6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario
si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos.
7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se
hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la
bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1
mL/min hasta llegar a 1 mL/min.
8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra
a analizar y los patrones para la cuantificación.
Condiciones Experimentales
Volumen de inyección 10μL
Detección a 254nm
Flujo: 1mL/min
Fase móvil: 60% agua, 40% metanol
Preparación de la curva de calibración.
Preparación de la muestra
La muestra es desgasificada en un ultrasonido por 15
min o una corriente de He por 3 min.
La muestra es diluida en un factor de ~1/4, se filtra en
un filtro de celulosa y esta se inyecto directamente al
cromatógrafo
Se prepara una madre de 2000 ppm de
cafeína.
Patrón de 100 ppm
Se prepararon cinco patrones de 10/20/30/
40/50 ppm
Se inyecta los patrones y se realiza una curva de calibración
graficando los valores de área de pico en función de la
concentración
Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico
Justificación El particulado atmosférico contiene muchos metales pesados, óxidos acídicos,
sustancias orgánicas y virus bacteriales, los cuales afectan el ambiente atmosférico y
causan daños a la salud humana. Por lo tanto, el estudio del particulado atmosférico es
un campo vital de la ciencia ambiental. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)
están ampliamente distribuidos en el ambiente, y algunos tipos de PAHs tienen
características orgánicas carcinógenas y/o mutagénicas.
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son compuestos constituidos por anillos
bencénicos condensados. Son compuestos cancerígenos cuyos efectos se activan por
medio de una enzima, el citocromo P450, presente en el hígado. Esta enzima metaboliza
el tolueno y otras sustancias xenobióticas (moléculas extrañas al organismo). La enzima
incorpora oxígeno a la estructura del PAH, originando aductos tipo epóxidos, que
reaccionan fácilmente con las bases heterocíclicas del ADN, alterando los genes.
Los PAHs se forman como subproductos de la combustión del carbón. Aunque se
encuentran presentes a bajas concentraciones en los gases de escape de los automóviles,
su presencia aumenta en las partículas de hollín emitidas por los motores Diesel o en el
humo desprendido en la quema de carbón o incendios forestales.
En los últimos años, se ha focalizado la investigación de los PAHs en particulado
atmosférico, en particular, se ha evaluado el tipo de particulado, distribución del tamaño
de partícula, la concentración y fuentes de PAHs, específicamente, por técnicas
cromatográficas acoplados a masas. Basados en todas la investigaciones previas, el
objetivo de este trabajo es, determinar y cuantificar los PAHs presentes en muestras
determinadas de particulado, atmosférico y de suelos, por medio de cromatografía de
gases y cromatografía líquida de alta eficiencia a fin de comparar los resultados
obtenidos por ambas técnicas y establecer las ventajas y desventajas de cada técnica
Objetivos General
Análisis cualitativa de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en una
muestra de particulado atmosférico líquida de (naftaleno, antraceno,
fenantreno, fluoreno y criceno)
Determinación cuantitativa de los HAP en una muestra de Particulado
atmosférico.
Específicos
Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de
líquidos (HPLC).
Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en
la manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.
Estudiar los diferentes parámetros operativos que pueden afectar la
separación (fase móvil, flujo) y encontrar las condiciones óptimas de
análisis.
Realizar el análisis cualitativo por (HPLC) para la identificación de los
componentes de la muestra mediante el uso de estándares.
Análisis cuantitativo de HAP en particulado atmosférico.
Parte Experimental
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco
PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y
Tamaño de partícula: 5 (μm)
Preparación del Sistema HPLC
1. Emplear eluentes grado HPLC.
2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.
3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..
4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica
para poder realizar la purga con estos.
5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba
(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow
en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como
preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para encender la
bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.
6. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se
hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a
la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,2 a 2 mL/min y esperar
unos 10 min.
7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la
muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.
Condiciones Experimentales
Volumen de inyección 10μL
Detección a 254 nm
Flujo: 2 mL/min
Fase móvil: 65% acetonitrilo-35% agua desionizada
Preparación de muestra
Para la muestra pese 0,5000 g y extraiga con 5 mL de acetronitrilo por una hora en un
ultrasonido, filtre en forma cuantitativa la solución y recoja el filtrado en un balón de 25
mL y luego enrace. La muestra antes de inyectar debe ser filtrada con un filtro para
jeringa para solvente orgánico de 0,45 um
Preparación de Patrones
Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en Metanol:
Tabla 1. Concentración de los hidrocarburos aromáticos policiclicos.
Compuesto Peso (g)
Pureza
(%)
Volumen aforo
(mL)
Concentración
(ppm)
Naftaleno 200
Antraceno 100
Fenantreno 100
Fluoreno 100
Pireno 100
Una vez obtenidas una dilución (solo una por componente) de cada patrón según
los rangos de trabajo mostrado en la tabla 2, inyecte los mismos para determinar
los tiempos de retención de cada PAH.
Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma
Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de
calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se
encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2
Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva
de calibración.
Compuesto Rango de concentración para la curva de calibración
Naftaleno 40-100 ppm
Antraceno 1-4 ppm
Fenantreno 5-40 ppm
Fluoreno 10-60 ppm
Criseno 10-60 ppm
Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra biológica
Justificación Los solventes orgánicos se utilizan ampliamente en la industria química en general;
constituyen los componentes básicos de productos comerciales como los adelgazadores,
pinturas, tintas y adhesivos, entre otros. El abuso de estos productos puede causar
dependencia hacia la sustancia inhalada, desarrollo de tolerancia a algunos de sus
efectos y la presentación de un síndrome de abstinencia al suspender su consumo
caracterizado por estados de ansiedad, depresión, irritabilidad, fatiga y falta de
apetito (1)
. Los disolventes también están presentes en ciertos ambientes de trabajo. La
exposición industrial afecta principalmente a los empleados que desempeñan su trabajo
en la fabricación de pinturas, gomas, productos de limpieza, motores, pegamentos,
tintas o cualquier otro servicio que involucre disolventes industriales. Entre los
solventes orgánicos estudiados con particular énfasis dado su elevado grado de
toxicidad están los hidrocarburos aromáticos, los cuales son compuestos derivados del
petróleo, mediante una serie de procesos petroquímicos, en particular la destilación
catalítica, la destilación del petróleo crudo y la alquilación de hidrocarburos aromáticos
de las series más bajas (2)
. Las investigaciones que se han hecho sobre la toxicidad de los
hidrocarburos aromáticos, están principalmente enfocadas sobre tres compuestos en
particular: benceno, tolueno, y xileno, dado los efectos perjudiciales que ejercen sobre
la salud: actúan directamente como depresores del sistema nervioso central, la
intoxicación aguda por estos compuestos produce cefalea, náuseas, mareo,
desorientación, confusión e inquietud. La exposición aguda a dosis altas puede incluso
provocar pérdida de consciencia y depresión respiratoria. Uno de los efectos agudos
más conocidos es la irritación respiratoria (tos y dolor de garganta). También se han
observado síntomas cardiovasculares, como palpitaciones y mareos. Los síntomas
neurológicos de la exposición crónica pueden ser cambios de conducta, depresión,
alteraciones del estado de ánimo y cambios de la personalidad y de la función
intelectual. Por lo que existen límites máximos de exposición, reportados en
concentraciones de ppm, permitidos en personas expuestas. Estos hidrocarburos
aromáticos se absorben fácilmente en el organismo humano por diversas vías: mediante
inhalación, ingestión y en poca cantidad por vía cutánea, se metabolizan mediante la
biooxidación del anillo; si existen cadenas laterales, preferiblemente de grupos metilo,
éstas se oxidan y el anillo permanece sin modificar. En gran parte se convierten en
compuestos hidrosolubles y posteriormente se conjugan con glicina, ácido glucurónico
o ácido sulfúrico y se eliminan en la orina. Se presentan entonces ciertos metabolitos
que pueden monitorearse biológicamente; los cuales serán indicativos de los niveles
absorbidos por un individuo expuesto a estos compuestos. Para el tolueno el metabolito
correspondiente es el denominado ácido hipúrico (AH) y los isómeros orto, meta y para,
del acido metilhipúrico, los son de la exposición al xileno (3)
. El Ácido Hipúrico es un
metabolito inespecífico del Tolueno, ya que se puede producir también en la
metabolización del Etil-benceno, Ácido Benzoico, Benzoato de Sodio, ciruelas y
arándanos 11(4)
. Además, la excreción urinaria del Acido Hipúrico se inhibe con el
Etanol (5)
. Asimismo, hay supresión mutua del Tolueno con el Benceno (6)
. No obstante
sigue utilizándose como un indicador clásico de los niveles de tolueno en orina, aunque
últimamente se ha propuesto la medida de cresol, como indicador del mismo (3)
. Se
recomienda tomar la muestra urinaria del Tolueno al final de la jornada de trabajo, o
incluso, durante la jornada de trabajo, ya que la vida media biológica de éste asciende a
1.5 hrs. Con respecto a los Ácidos Metilhipúricos Urinarios (orto, meta y para) si son
metabolitos específicos de los Xilenos (o-m-p). En razón de la vida media biológica del
xileno que es de 3.6 hrs. se recomienda que las tomas de muestras urinarias se realicen
al final de la jornada de trabajo (4)
. Una parte insignificante se deposita en el tejido
adiposo con una vida media biológica de 30 hrs. pero no tiene ningún efecto
significativo en la excreción urinaria de los Ácidos Metilhipúricos 18(5)
. Dado que la
determinación de estos metabolitos se realiza en muestras de orina, debe señalarse que
el ácido hipúrico es un componente habitual de la orina, que presenta valores de
referencia (0,00 - 0,37) g de AH/ g creatinina, en personas no expuestas, mientras que el
valor límite de exposición reportado es (1,6 g de AH/ g creatinina), para el ácido
metilhipúrico dicho valor límite es de (1,5g/gr creatinina), establecidos por la American
Conference of Governmental Industrial Hygienists( ACGIH)(3)
, que determinan la
cantidad mínima de éste ácido que debe contener un individuo para no encontrarse
contaminado. Es importante señalar que estos valores de los metabolitos se reportan con
respecto a la creatinina; porque esta se usa para normalizar las orinas diluidas o
concentradas; dado que esta es un catabolito que se excreta, en términos generales, de
manera uniforme y regular, salvo que haya alguna patología, sobre todo renal, que
pueda trastocarla; por lo que la creatinina se debe medir en cada muestra(6)
.
Objetivos General
Determinar el ácido hipúrico y los isómeros (orto, meta y para) de ácido
metilhipúrico en muestras de orina, utilizando un método de fase reversa con
detector de ultravioleta/Cromatografía líquida de alta resolución.
Específicos
Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de líquidos
(HPLC).
Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en la
manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.
Evidenciar cualitativamente la presencia de ácido hipúrico y los isómeros del
ácido metilhipúrico en orina de individuos expuestos y no-expuestos a solventes
orgánicos.
Establecer las condiciones experimentales adecuadas para la aplicación del
método al análisis cuantitativo.
Parte Experimental
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco
PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y
Tamaño de partícula: 5 (μm)
Preparación del Sistema HPLC
1. Emplear eluentes grado HPLC.
2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.
3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..
4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica
para poder realizar la purga con estos.
5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba
(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow
en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como
preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para encender la
bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.
6. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se
hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a
la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,1 a 2 mL/min y esperar
unos 10 min.
7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la
muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.
Condiciones Experimentales
Velocidad de flujo: 1,4 mL/ min
Volumen de inyección: 10 µL
Detector: UV/Vis a 254 nm
Fase móvil: 1% ac. acético, 40% metanol, resto de agua desionizada (59%)
Presión del sistema:
Preparación de muestra
Se acidifican una alícuota de 20 mL a pH=2 con ácido clorhídrico concentrado se lleva
a un balón de 25 mL y se filtra con filtros de 0,45 m, adaptables a jeringa de celulosa y
posteriormente se inyecta directamente al puerto de inyección para su análisis por
HPLC
Preparación de Patrones
Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en la fase móvil:
Tabla 1. Concentración de las madres.
Compuesto Pureza % Peso (g) Vol aforo (mL) Concentración (ppm)
ac. Hipurico 99 50 1000
2-metil ac. hipurico 98 50 1000
3-metil ac. hipurico 98 50 1000
4-metil ac. hipurico 98 50 1000
Con estas soluciones madres se hallara el factor de dilución de manera de no
saturar el sistema, para ello inicie con una solución de 100ppm
Una vez obtenidas las diluciones de los patrones, inyecte los mismos para
determinar los tiempos de retención de cada ácido.
Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma
Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de
calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se
encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2
Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva
de calibración.
Compuesto Rango de concentración para la curva de calibración
ac. Hipurico 0.05 – 2.0
2-metil ac. hipurico 0.05 – 2.0
3-metil ac. hipurico 0.05 – 2.0
4-metil ac. hipurico 0.05 – 2.0
Bibliografia
1. García Liñan, C. ¿Qué son las drogas?. Inhalables. Editorial Arbol S.A. de C.V.
México, 1990.
2. Enciclopedia de la Salud y el Trabajo , pp.104-282.
3. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo. Ministerio de Trabajo y
Asuntos Sociales, Vizcaya, España. Norma MTA/MB-022/A95. Determinación De
los ácidos fenilglioxílico, mándelico, hipúrico y orto y para-metilhipúrico en
orina. Método de Fase reversa con detector ultravioleta/Cromatografía líquida de
Alta Resolución. www.mtas.es.
4. American Conference of Governmental Industrial Hygienists Inc. Documentation of
the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices, 1991, Sixth Edition,
Volume 1, BEI-171.
5. SATO Akio et. al. Chapter 28. Effects of Ethanol on Uptake, Distribution, and
Elimination of Inhaled Vapor of Organic Solvents, Biological Monitoring of
Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana
Ogata, ACGIH Inc.1990; pp. 155-158.
6. IKEDA Masayuki, Chapter 27, Suppression of Metabolism in Workers Exposed
to Mixtures of Benzene and Toluene and to Thrichloroethylene and
Tetrachloroethylene, Biological Monitoring of Exposure to Industrial
Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc. 1990;
pp. 151-154.
7. Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág. 636-
677. Año 2001.
8. Daniel C Harris Análisis Químico Cuantitativo 3era Edición Editorial Reverte, Pag.
548-577 y 607-639. 2007 (Nota esta edición es la que tiene la información
requerida)
9. Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001
Editorial Mc Graw Hill.
Determinación de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en analgésicos.
Justificación
Los analgésicos son medicinas que reducen o alivian los dolores de cabeza,
musculares, artríticos y muchos otros achaques y dolores. Existen muchos tipos
diferentes de analgésicos y cada uno tiene sus ventajas y riesgos. Algunos tipos de dolor
responden mejor a determinadas medicinas que a otras. Además, cada persona puede
tener una respuesta ligeramente distinta a un analgésico.
La cafeína es una sustancia bastante conocida por todos pero de la que en
realidad, se ignoran muchos aspectos que pueden influir en la actividad física. La
cafeína ha sido consumida por el hombre desde hace siglos. Constituye la sustancia
psicoactiva más empleada en el mundo y se encuentra naturalmente en las hojas de té,
los granos de café y en el cacao. La cafeína es un estimulante directo y moderado del
sistema nervioso central y también estimula el corazón y el sistema cardiovascular.
La combinación del acetaminofén y la cafeína tienen como finalidad obtener un
sinergismo en cuanto al efecto analgésico. La cafeína se ha usado durante muchos años
como adyuvante analgésico. Sin embargo, los efectos analgésicos adyuvantes de la
cafeína no han sido seriamente investigados desde un pool de análisis que se realizaron
en 1984 y que demostraron que la cafeína reduce la cantidad de acetaminofén que se
necesita para conseguir el mismo efecto en aproximadamente un 40%.
Investigaciones in-vitro e in-vivo han proporcionado alguna evidencia de que la
cafeína puede tener acciones antinociceptivas por medio del bloqueo de los receptores
de la adenosina, inhibición de la síntesis de la ciclo-oxigenasa-2, o por cambios en
estados de emoción. Pero esta acción sólo se tiene en cuenta en algunos casos. Esto
sugiere que las actuales dosis usadas de analgésico y cafeína pueden influir en los
efectos analgésicos adyuvantes de la cafeína. Ensayos clínicos sugieren que la cafeína
en dosis mayores de 65mg puede ser provechosa para el aumento de la analgesia, sin
embargo, excepto para el dolor de cabeza, los beneficios son ambiguos.
En este experimento se determinará el contenido de la cafeína, acetaminofén y/o
acetilsalicílico presente en analgésicos disponibles comercialmente, usando la técnica de
curva de calibración externa. Para ello se estudiarán los efectos que tiene el cambio de
la composición de la fase móvil sobre la separación de los componentes de una mezcla
patrón de estos compuestos y se realizará un estudio cualitativo para determinar que
componentes están presentes en la muestra para su posterior estudio cuantitativo.
Objetivos.
GGeenneerraall::
Determinar el contenido de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico
en una pastilla de un analgésico usando la técnica de cromatografía de
líquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin de familiarizar al alumno en el uso
de dicha técnica.
EEssppeeccííffiiccooss::
Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de
cromatografía líquida de alta eficiencia.
Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y
desgasificación de los mismos.
Estudiar los efectos que tiene el cambio de la composición de la fase móvil
sobre la separación de los componentes de una mezcla.
Determinar los componentes de una muestra.
Analizar cuantitativamente la pastilla de analgésico mediante el uso de una
curva de calibración.
Parte Experimental
Instrumentación
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco
PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus (Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y
Tamaño de partícula: 5 (μm)
Preparación del Sistema HPLC
1. Emplear eluentes grado HPLC.
2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica (soluciones A y B) al vacío y
emplear un filtro de 0,45μm, resistente al disolvente empleado (para la
solución
3. B emplear filtro de teflón o nylon).
4. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con
ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He.
5. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica
para poder realizar la purga con estos (ver tabla abajo).
6. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba
(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow
en un valor de 1,5 mL
/min. presionar “enter” para dejar este valor como
preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para encender la
bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.
7. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo
contrario si se va emplear mezcla de eluentes colocar programación de los
mismos.
8. Colocar el flujo en 0,2 mL
/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se
hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a
la bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,2
en 0,2 mL
/min hasta llegar a 1,2 mL
/min.
9. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la
muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.
Condiciones Experimentales
Volumen de inyección 10 μL
Detección a 254 nm
Flujo 1,2 mL
/min
Fase móvil preparar:
Una solución A con la mezcla de 10,00 mL de ácido acético y agua
grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL
Una solución B con la mezcla de 10,00 mL de ácido acético y Metanol
grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL.
Estudio Cualitativo
Procedimiento:
1.- Prepare soluciones madres de 1000 mg/L de cada patrón. Para ello se disuelve cada
solido en 40,0 mL de la solución B y se enraza a un volumen 100,0 mL usando la
solución A.
2.- Prepare 50 mL de soluciones estándares individuales que contengan 10 mg/L de
acetaminofén, 300 mg/L de acetilsalicílico y 60 mg/L de cafeína. Use la fase móvil A
para realizar el enrase de cada uno de ellos.
Efecto de la Composición de fase móvil
3.- Estudie el efecto sobre el tiempo de retención de los tres componentes en estudio al
usar los tres tipos de fase móvil indicadas a continuación.
Condición % A (H2O/Hac) % B (CH3OH/Hac)
1 80 20
2 55 45
3 65 35
4.- Para ello inyecte cada uno de los patrones preparados anteriormente, una vez
filtrados en un filtro de inyectadora de nylon de 0,45 um, en las condiciones de cada
fase móvil propuesta en la tabla.
5. Proponga la fase móvil que debe utilizar para la separación de una mezcla de los tres
compuestos en estudio.
7.- Prepare 50 mL de una solución estándar que contengan 10 mg/L de acetaminofén,
300 mg/L de acetilsalicílico y 60 mg/L de cafeína. Use la fase móvil A para realizar el
enrase.
8.- Realice la separación de la mezcla de los componentes en estudio con la fase móvil
propuesta (inyecte por triplicado para el calculo de parámetros cromatográficos).
Análisis Cualitativo
9.- Prepare una solución de su muestra desconocida pesando 150 mg y disolviéndolo en
20 mL de la mezcla B y luego enrace a un volumen de 50,0 mL usando la solución A.
10.- Para determinar los componentes de la muestra de mayor concentración diluya 1
mL de la solución anterior en un balón aforado de 100 mL usando la solución A,
seguidamente para determinar los componentes de menor concentración de la muestra
tome una alícuota de 2 mL de la solución anterior y llévela a 10 mL en un balón usando
la solución A, filtre las soluciones antes de inyectarlas al cromatógrafo.
10.- Obtenga los cromatogramas de las disoluciones de la muestra desconocida.
11.- Compare los tiempos de retención obtenidos para los picos en los cromatogramas
de su muestra de analgésicos e identifique los compuestos presentes en ella.
Estudio Cuantitativo
Preparación de la curva de calibración.
Se prepare madres de 1000 ppm de los compuestos identificados
en la muestra disolviendo el solido en 40,0 mL de la solución B
y se enraza a un volumen
100,0 mL usando la solución A.
Prepare cuatro patrones de 25, 50 o 100 mL
(los rangos de trabajo se muestran abajo y los
patrones son mezcla de los componentes en estudio si
fuera necesario)
Compuesto Rango de concentraciones
Acetaminofen ( 5 - 20 ) ppm
Ácido acetilsalicílico ( 100 - 400 ) ppm
Cafeína ( 20 - 80 ) ppm
Se inyectan por triplicado al HPLC y se realiza una curva de
calibración graficando los valores de área de pico en
función de la concentración. Debe comprobar la linealidad
de la curva
Preparación de la muestra
Se determina el contenido de cafeína, acetaminofen o acido acetilsalicílico según la
muestra e indicaciones del profesor
Referencias
Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001
Editorial Mc Graw Hill.
Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág.
636-677. Año 2001.
http://www.osanet.euskadi.net/r85publ01/es/contenidos/informacion/sinopsis_ce
vime/es_1225/sinopsis099.html#02
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/painrelievers.html
ttp://www.howtodothings.com/es/salud-y-vida-sana/c%C3%B3mo-utilizar-la-
cafe%C3%ADna-para-el-tratamiento-de-las-migra%C3%B1as.
Se pesa la pastilla
(Dato que debe ser colocado en el informe)
Se pulveriza la pastilla(s)
Se pesan tres muestras de 0.1500 g
Se disuelven en 40,0 mL de la solución B y se enrazan a
un volumen 100,0 mL usando la solución A
Se filtran 5 mL de las muestras con un filtro de celulosa o
nylon de 0.45 um
Se inyectan al cromatógrafo por triplicado
Se diluye la muestra 1 en 100 mL o 2 en 10 mL si lo que se
desea determinar son componentes de alta o baja
concentración, respectivamente