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INFORME TECNICO FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACION. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADULTERACIONES DE CARNE MOLIDA DE RES POR MEDIO DE UN MODELO SIMCA Y ANÁLISIS MULTIVARIABLE.

SIP 20080866

1. RESUMEN La naturaleza de la carne molida de res ofrece muchas posibilidades para adulterarse con carne

más barata (carne de caballo), con vísceras o despojos (hígado, riñón y pellejos) y/o proteínas

vegetales (proteína de soya texturizada).

Las técnicas tradicionales para identificar adulteraciones en la carne molida de res consumen

mucho tiempo, son costosas y/o necesitan cantidades considerables de disolventes y reactivos. La

Espectroscopia Infrarroja Media por Transformada de Fourier (MID-FTIR) representa una técnica

muy empleada en el control de calidad, debido a que es un método rápido (las pruebas pueden

llevarse acabo en 1-2 minutos), no se requiere preparación de la muestra, es fácil de usar, no es

invasivo ni destructivo, se utiliza poca muestra en el análisis y no se produce material de desecho

durante el estudio. El desarrollo de modelos quimiométricos basados en la señal infrarroja por

Transformada de Fourier (FTIR-HATR) ha demostrado ser una opción atractiva para identificar

adulteraciones y para determinar simultáneamente la composición química (humedad, grasa,

proteínas, cenizas y carbohidratos) de las muestras. Asimismo, existen modelos quimiométricos

como SIMCA (Soft Independent Modeling Class Analogy) que permiten clasificar diferentes

materiales y discriminar muestras desconocidas.

Con base en lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar modelos quimiométricos

acoplados a Espectroscopia Infrarroja Media por Transformada de Fourier con Reflectancia Total

Atenuada Horizontal (MID-FTIR-HATR) para identificar y cuantificar adulteraciones en carne molida

de res y proporcionar al mismo tiempo su análisis proximal. También se desarrolló el modelo

quimiométrico SIMCA para discriminar entre muestras adulteradas y no adulteradas.

2. INTRODUCCION El interés por identificar adulterantes en los alimentos ha aumentado especialmente en productos

con alto valor comercial, ya que el reemplazo parcial o total de estos productos por ingredientes de

menor costo representa beneficios económicos para quienes comercializan alimentos adulterados

(Marcos et al., 2002).

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Un producto de alto valor comercial es la carne de res pues es nutritiva debido a su aporte en

proteínas de alto valor biológico, ácidos grasos indispensables, vitaminas del complejo B y

minerales como hierro, zinc y fósforo (Pearson y Dutson, 1994). Entre las diferentes

presentaciones de la carne de res, la molida es una de las más solicitadas y por su naturaleza es

fácil adulterarla con carne de otras especies (caballo, cerdo), con vísceras o despojos (hígado,

riñón, pellejos) o con proteínas de origen vegetal (soya texturizada) que son más baratas (Hargin,

1996).

La adulteración, es decir, sustitución de carne con las alternativas más baratas, es un tipo de

fraude que puede implicar una amenaza de salud a los consumidores (Barai et al., 1992). Por ello,

los comerciantes y consumidores necesitan asegurarse que cuando adquieren un producto

específico, reciban exactamente lo que pagan y no un material adulterado (Dean et al., 2006). Se

ha informado de este tipo de adulteraciones en diferentes partes del mundo, por ejemplo, en

Australia se ha encontrado que la carne de canguro y caballo por ser más baratas se emplean para

sustituir la de res (Barai et al., 1992; Ding y Xu, 1999).

De esta manera, varios tipos de carne como la de res, carnero, canguro y caballo, solo se pueden

distinguir cuando se encuentran en cortes grandes, pero después de que se han molido es difícil

identificarlas sin un método analítico (McElhinney et al., 1999).

Para determinar adulteraciones en la carne de res se han propuesto varias técnicas como la

cromatografía de gases (Saeed et al., 1986), separación de proteínas por electroforesis (Barai et

al., 1992), pruebas inmunológicas (Whittaker et al., 1983) y ensayos de DNA (Ebbehoj y Thomsen,

1991a,b), sin embargo estos métodos son laboriosos, costosos, consumen tiempo y reactivos.

En los últimos años, la espectroscopia de infrarrojo, se ha convertido en una opción para el

análisis cualitativo y cuantitativo de los alimentos. En particular, la región media del infrarrojo (MID)

proporciona información de la estructura química de los constituyentes de la muestra a través de

las bandas de absorción del espectro. Gracias al desarrollo de los modernos espectrofotómetros

infrarrojos mediante la aplicación de la Transformada de Fourier (FTIR), se han podido identificar

los constituyentes presentes en una muestra. Con la combinación de la Espectroscopia Infrarroja

Media por Transformada de Fourier (MID-FTIR) y los programas computacionales estadísticos

multivariables, se pueden desarrollar modelos de predicción, los cuales permiten conocer

cuantitativamente la composición de una mezcla, lo que se conoce con el nombre de análisis quimiométrico.

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El desarrollo de métodos quimiométricos utilizando Espectroscopia Infrarroja Media por

Transformada de Fourier se han empleado en la industria de los alimentos. Las aplicaciones son

diversas, por ejemplo:

Adulteración en purés de fresa (Holland et al., 1998)

Ablandamiento de carnes (Iizuka y Aishima, 1999)

Caracterización de bebidas alcohólicas (Coimbra et al., 2002; Noriega y López, 2000; Palma y

Barroso, 2002; Duarte et al., 2004, Lachenmeier, 2007)

Clasificación de harinas (Cocchi et al., 2004)

Caracterización de cultivares de fresa (Macías et al., 2004)

Adulteración y caracterización del aceite de oliva (Lai et al., 1995; Marcos et al., 2002; Tapp,

2003)

Determinación de α-tocoferol en aceite de palma (Che-Man et al., 2005a).

Análisis de quesos y leche (Chen e Irudayaraj, 1998; Iñón et al., 2004, Fagan et al, 2007)

Control de calidad en la miel (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a,b; Paradkar et al., 2003; Kelly et

al., 2004; Tewari e Irudayaraj, 2004, Kelly et al., 2006, Zuñiga, 2007)

Determinación de azúcares en bebidas de frutas y carbonatadas (Holland et al., 1997; Rambla

et al., 1998; Cadet, 1999; Duarte et al., 2002; Kelly y Downey, 2005)

Calidad de aceites y grasas comestibles (Van de Voort et al., 1993; Lai et al., 1994; Guillén y

Cabo, 1997; Chippie et al., 2002; Ozen et al., 2003; Innawong et al., 2004, Yang et al., 2005;

Morales, 2006; Sinelli, et al., 2007)

Caracterización del café (Briandet et al., 1996; Downey et al., 1997; Lyman et al., 2003)

Determinación de cafeína en bebidas carbonatadas (Paradkar y Irudayaraj, 2002a)

Determinación de colesterol en productos lácteos (Paradkar y Irudayaraj, 2002b)

Caracterización de varios productos de soya (Isiguro et al., 2005)

Evaluación de sacarosa en bagazo de caña de azúcar (Tewari y Malik, 2007)

Autenticidad de alimentos de acuerdo a su variedad y lugar de origen (Wilson, 1990; Edelmann

et al., 2001)

Adulteración en productos de chocolate y pasteles (Che-Man et al., 2005b; Syahariza et al.,

2005)

Evaluación de frescura en pescado (Karoui et al., 2007)

Determinación de antocianinas en vino rojo (Soriano et al., 2007)

Identificación y caracterización de ginseng y sus productos (Yi-Lwern et al., 2007)

Con base a la probada utilidad de los modelos quimiométricos utilizando Espectroscopia MID-FTIR-

HATR para resolver problemas de adulteración y autenticidad de los alimentos, el presente trabajo

tiene como finalidad desarrollar modelos quimiométricos acoplados a Espectroscopia Infrarroja

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Media por Transformada de Fourier (MID-FTIR) con Reflectancia Total Atenuada (HATR) para

identificar y cuantificar adulteraciones en la carne de res molida.

3. MATERIALES Y MÉTODOS. META 1 (Obtención y Selección de la Materia Prima)

3.1 Materia prima. Se analizaron muestras de carne de res (corte falda), carne de caballo (corte falda), hígado riñón,

pellejos de res y proteína de soya texturizada marca Soybean adquiridos en mercados de la

Ciudad de México. 3.2 Reactivos. Detergente Extran 10% (Merck), Ácido bórico al 4% (Merck), Ácido clorhídrico 0.1 N (Merck), Ácido

sulfúrico concentrado (Merck), Éter de petróleo (Merck), Gránulos de Zinc (Merck), Hidróxido de

sodio 40% (Baker), Sulfato de cobre pentahidratado (Baker), Parafina, Solución indicadora de

Wesselow, Sulfato de potasio en polvo (Baker).

3.3 Equipos. Espectrofotómetro MID-FTIR (Marca PerkinElmer, modelo FTIR-1600).

Accesorio de Reflectancia Total Atenuada Horizontal (HATR) con cristal de Selenuro de Zinc

(ZnSe) (Ángulo de incidencia: 45°) (Marca PerkinElmer, modelo L136-0266).

Programas de computación:

Spectrum QUANT+ versión 4.51.02 (Copyright 2000 PerkinElmer, Inc.)

PE GRAMS Analyst 1600 version 3.0.0.32 (Copyright 1991-1994 Galactic Industries Corp.)

SPECTRUM verosión 5.3 (Copyright 2005 PerkinElmer, Inc.)

AssureID Method Explorer version 3.0.0.0132 (Copyright 2005 PerkinElmer, Inc.)

Balanza digital (Marca Scientech, modelo SA 210D).

Balanza analítica (Marca Mettler, modelo H31).

Aparato de Kjeldahl.

Aparato Soxhlet.

Picadora de carne de uso doméstico (Marca Girmi).

Mufla (Marca Furnace, modelo 1400).

Estufa (Marca Uniterm, modelo 1000/A).

Equipo común de laboratorio.

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3.4 Desarrollo experimental. En la siguiente se muestra el desarrollo experimental de la presente investigación.

META 2 (Caracterización de la Materia Prima) 3.4.1 Caracterización de la materia prima La carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada se

caracterizaron el mismo día de su adquisición con base en la determinación de algunas

propiedades químicas: humedad, grasa, cenizas y proteína. En el caso de la proteína de soya

texturizada (marca Soybean) se caracterizó en forma deshidratada y rehidratada.

Alimentación de los espectros FTIR-HATR junto con porcentajes de

adulteración (10-90% p/p) y valores analíticos de composición química al

programa QUANT+

Calibración (PCR, PLS1, PLS2)

Validación

Optimización (PCR, PLS1, PLS2)

MATERIA PRIMA (Carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya

texturizada)

CARACTERIZACIÓN QUÍMICA Humedad (AOAC 24.003)

Grasa (AOAC 24.005) Cenizas (AOAC 24.009) Proteína (AOAC 24.027)

PREPARACIÓN DE MUESTRAS ADULTERADAS

res-carne de caballo (10-90% p/p) res-hígado (10-90% p/p) res-riñón (10-90% p/p)

res-pellejos (10-90% p/p) res-soya texturizada (10-90% p/p)

OBTENCIÓN DE ESPECTROS FTIR-HATR

DESARROLLO DE MODELOS

QUIMIOMÉTRICOS

Molienda en picadora domestica

DESARROLLO DEL MODELO QUIMIOMÉTRICO SIMCA

OBTENCIÓN DE ESPECTROS FTIR-HATR DE LAS MUESTRAS

ADULTERADAS

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3.5 Métodos analíticos. Corresponden a los indicados en el AOAC (1989): humedad (24.003), grasa (24.005), cenizas

(24.009) y proteína (24.027). Se hicieron por triplicado. El contenido de carbohidratos se obtuvo por

diferencia.

3.5.1. Determinación de humedad (AOAC 24.003). Se determinó desecando una muestra a una temperatura elevada y expresando la pérdida de peso

como agua. Este método consiste en lo siguiente: En una charola metálica de fondo plano (a peso

constante) se pesaron de 3 a 5 g de muestra. La charola se colocó en la estufa (100 °C) durante 2-

4 horas (dependiendo de la muestra). Se retiró la cápsula de la estufa y se dejó enfriar en un

desecador. Se pesó tan pronto se alcanzó la temperatura ambiente. La cápsula se introdujo de

nuevo a la estufa durante una hora y se volvió a pesar. El procedimiento se repitió hasta que las

variaciones entre dos pesadas sucesivas no excedieron 2 mg. El peso perdido por la muestra se

expresó como % de agua.

3.5.2. Determinación de grasa (AOAC 24.005). El método de mayor precisión para determinar el extracto etéreo (grasa bruta) implica la extracción

de la grasa de una muestra desecada, con éter etílico anhidro o éter de petróleo. A continuación se

elimina el solvente del extracto por evaporación y se pesa el residuo que se expresa como grasa. A

continuación se describe el método:

El matraz del equipo Soxhlet se llevó a peso constante. La muestra previamente deshidratada se

colocó en un cartucho de extracción con un poco de algodón.

Se adicionaron 75 mL de éter de petróleo en el matraz y se conectó al refrigerante a través de la

unión esmerilada. Se conectó el sistema de condensación y se extrajo durante unas 4 horas

funcionando a una velocidad de condensación de 5-6 gotas por segundo. Se eliminó el éter del

matraz evaporándolo con precaución y se desecó el residuo en una estufa de aire a 100°C durante

30 minutos. Se enfrió y se pesó.

Expresión de resultados:

Donde:

A = Peso del cartucho con la muestra

B = Peso del cartucho con muestra desengrasada

m = Peso de la muestra deshidratada

NOTA: La determinación también se hizo llevando el matraz a peso constante.

% Extracto etéreo = A – B

mX 100

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6.5.3. Determinación de cenizas (AOAC 24.009). 3e pesó entre 5-10 g de muestra en un crisol a peso constante. La muestra se carbonizó

lentamente, para evitar pérdidas por arrastre de humo y proyecciones de la muestra fuera del

crisol. Cuando el desprendimiento de humo cesó, el crisol se llevó a la mufla a una temperatura de

525°C hasta que las cenizas estuvieron libres de carbón (cenizas grises o blancas). El crisol se

pasó a la estufa, se enfrió paulatinamente y se llevó al desecador. Se pesó tan pronto se alcanzó la

temperatura ambiente.


Donde:

a = Peso del crisol con cenizas.

b = Peso del crisol vacío.

m = Peso de la muestra en gramos.

3.5.4. Determinación de proteínas (AOAC 24.027). Es el método más aceptado para determinar el nitrógeno total o proteína bruta, implica la oxidación

de la materia orgánica con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador y la simultánea formación

de sales de amonio y aminas a partir de los compuestos nitrogenados de la carne. Posteriormente

se destilan las aminas y el amoniaco y se recoge en ácido bórico. La solución ácida se titula a

continuación con álcali estándar y se calcula la cantidad de nitrógeno (amoníaco). El valor proteína

bruta se obtiene multiplicando el valor del nitrógeno por 6,25. El método consiste en lo siguiente:

Se pesó 1 g de muestra en un papel libre de nitrógeno (egapack). Se envolvió la muestra en el

papel y se colocó en un matraz Kjeldahl. Se añadieron 3 g de mezcla de catalizadores (sulfato de

cobre pentahidratado y sulfato de potasio) y 10 mL de ácido sulfúrico. El matraz se colocó en el

digestor y se calentó hasta completar la oxidación.

Terminada la digestión se enfrió el matraz y se añadieron 300 mL de agua, unos gránulos de Zinc y

antiespumante (parafina). Bajo el refrigerante de destilación. se colocó un matraz erlenmeyer de

500 mL, con 75 mL de ácido bórico al 4% junto con unas gotas de indicador de Wesselow. Al

matraz Kjeldahl, se añadieron 5 mL de NaOH 40% por cada mL de ácido sulfúrico adicionado, más

10 mL de NaOH 40%. Se conectó al sistema de destilación del aparato de Kjeldahl. Se destilaron

250 mL, para garantizar el paso de todo el amoniaco. El destilado se tituló con solución de HCl 0.1

N.

% Cenizas = (a – b) x 100

m

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Donde:

V = Mililitros de HCl gastados en la titilación

N = Normalidad de la solución valorada de HCl (0.1)

m = Peso de la muestra en gramos

meq = Miliequivalentes de nitrógeno (0.014 g)

% de proteína = % de nitrógeno x factor de conversión (6.25)

Meta 3 (Análisis estadístico de la caracterización de la materia prima)

3.6. Análisis estadístico. Los datos obtenidos de la composición química fueron sujetos a un análisis estadístico para

calcular la desviación estándar de cada valor. Se usó el programa estadístico de Excel para

Windows 2005.

Meta 4. (Preparación de las muestras adulteradas) 3.7. Preparación de muestras adulteradas (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada). Las muestras se procesaron el mismo día de su adquisición. En el caso de la carne de res, carne

de caballo, hígado y riñón se removió el exceso de sangre, tejido graso y tejido conectivo para

asegurar la cuantificación de carne magra. La proteína de soya texturizada se preparó de acuerdo

a las indicaciones señaladas en la etiqueta del producto.

Cada muestra se molió por separado en una picadora de carne, la cual previamente se lavó con

detergente Extran al 10%, se enjuagó con agua destilada y finalmente se secó cuidadosamente.

Una vez que las muestras se molieron, se prepararon mezclas de: res-carne de caballo, res-

hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada, en porcentajes del 10 al 90% p/p

con cambios de concentración del 2% (Al-Jowder et al., 1999). Después de la preparación de las

mezclas, éstas se revolvieron muy bien con el fin de adquirir una mezcla homogénea. Se

obtuvieron 41 muestras con cada adulterante.

Meta 5. (Obtención de espectros FTIR-HATR)

3.8. Método espectrofotométrico FTIR-HATR.

% N = m

V x N x meq x 100

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3.8.1. Obtención de espectros FTIR-HATR de carne de res molida, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res, proteína de soya texturizada y de muestras adulteradas (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada). Se utilizó el espectrofotómetro por Transformada de Fourier (FTIR) PerkinElmer 1600 equipado con

un accesorio de Reflectancia Total Atenuada Horizontal (HATR) con cristal de Selenuro de Zinc

(ZnSe) (ángulo de incidencia: 45°), con ayuda del programa PE GRAMS Analyst 1600 versión

3.01b. Los espectros FTIR-HATR se registraron a una resolución de 4cm-1 en el intervalo de

número de onda de 4000 a 550 cm-1 (región del espectro infrarrojo medio). Se realizaron 64

barridos (scans) para obtener una lectura del espectro con buena resolución de los picos de

absorbancia FTIR (Al-Jowder et al., 2002). Los espectros FTIR se obtuvieron en unidades de

Absorbancia (A).

Antes de la lectura de cada muestra se tomó un espectro de fondo (del ambiente) (“background”)

contra aire, esto se logra haciendo una lectura con el cristal del HATR vacío y cuyo resultado se

almacena en la computadora para tomarlo como blanco de referencia. El background se leyó bajo

las mismas condiciones que las muestras (Al-Jowder et al., 2002).

Para obtener los espectros, cada muestra se colocó sobre el cristal de ZnSe asegurando que la

muestra y el cristal tuvieran buen contacto (sin aire). Después de cada determinación, el cristal de

ZnSe se limpió completamente usando detergente líquido (Extran al 10%), seguido de un lavado

con acetona, posteriormente se enjuagó con agua destilada y se limpió con pañuelos desechables.

Finalmente se secó con aire comprimido. Se ha registrado que este procedimiento es eficaz para

remover trazas de grasa en el cristal de ZnSe (Fagan et al., 2007). Para corroborar la limpieza del

cristal de ZnSe se verificó la línea base del espectro para asegurar que no hubiera residuos de

muestras anteriores retenidas en la superficie del cristal.

3.9. Desarrollo de modelos quimiométricos para identificar adulteraciones y su composición química.

Meta 6. (Selección de la señal espectral) 6.9.1. Selección de la región espectral. Un parámetro importante para el desarrollo de un modelo quimiométrico es establecer la región

espectral que se utilizará en la construcción del modelo. Si bien, en el espectro FTIR existen

regiones en donde los picos de absorción son muy intensas, estas no son lineales con respecto a

la Ley de Lambert-Beer, por lo que muchas veces no es adecuado utilizarlas (Sivakesava e

Irudayaraj, 2001a).

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La selección de las regiones adecuadas para el análisis se hizo identificando la correlación

espectral entre la absorbancia y las concentraciones de cada adulterante (carne de caballo,

hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada). Por tanto, las regiones que mostraron

alta correlación fueron seleccionadas para el análisis multivariante.

Meta 7 (Desarrollo de los modelos de calibración) 3.9.2. Desarrollo de modelos de calibración para cada adulterante. Para obtener los modelos de calibración de cada adulterante (carne de caballo, hígado, riñón,

pellejos de res y proteína de soya texturizada), se alimentaron al programa estadístico de análisis

multidimensional llamado QUANT+, los espectros FTIR-HATR de las muestras adulteradas

(pertenecientes a cada sistema de calibración) junto con los valores de los diferentes porcentajes

utilizados en la adulteración (10, 12, 14, 16……..90% p/p) y los valores obtenidos por los métodos

analíticos de la AOAC (1989): humedad (24.003), grasa (24.005), cenizas (24.009), proteína

(24.027) y carbohidratos (por diferencia). De esta manera se construyó una matriz de patrones

(para calibración) que relacionó matemáticamente la absorbancia de los espectros a diferentes

números de onda con el porcentaje de adulteración y con los valores analíticos de los parámetros

de composición química.

Posteriormente se desarrolló la calibración del modelo, es decir, la elección del algoritmo más

adecuado para este trabajo. El programa QUANT+ cuenta con tres diferentes algoritmos: PCR

(Regresión de Componentes Principales), PLS1 (Mínimos Cuadrados Parciales, sin interacción

entre variables) y PLS2 (Mínimos Cuadrados Parciales, con interacción entre variables), que hacen

posible diagnosticar, mediante gráficas y datos estadísticos, el comportamiento del modelo; lo cual

permite tomar la decisión de entre cual de los algoritmos representa mejor el grado de adulteración.

Meta 8 (Optimización de los modelos de calibración) 3.9.2.1. Optimización de modelos quimiométricos. Con la finalidad de obtener datos estadísticos óptimos se llevó a cabo el manejo de las

herramientas con las que cuenta el programa multivariante QUANT+. Para optimizar todos los

modelos de calibración, se inició con el desarrollo de un modelo en donde se incluyeron los

espectros FTIR en la región completa del infrarrojo medio (4000 a 550 cm-1), junto con los datos de

concentración del adulterante y los valores de los parámetros de composición química. En este

intervalo espectral se utilizaron los tres algoritmos disponibles (PCR, PLS1 y PLS2).

Se analizaron gráficas del grado de influencia variable (variable leverage) de las bandas

espectrales para los tres algoritmos con el fin de conocer qué regiones espectrales dominaban en

la construcción de los modelos quimiométricos. Además se eliminó el ruido electrónico, se varió el

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intervalo del espectro y el número de factores, es decir, se corrió el programa cambiando el número

de factores “n” veces, hasta obtener valores en el Error Estándar de Calibración (SEC) y en el Error

Estándar de Predicción (SEP) lo más bajo posible (PerkinElmer, 1991).

Finalmente, a los espectros FTIR se les aplicó un suavizado (smooth) con la finalidad de eliminar el

ruido que acompaña a la señal analítica y que no está relacionada con el analito o la propiedad de

interés (Macho, 2002). Se utilizó una herramienta basada en un ajuste polinómico como es el filtro

de Savitzki-Golay. Este es el método más comúnmente usado para disminuir el ruido espectral

(Beebe et al., 1998).

A todos los espectros FTIR se les aplicó un suavizado de entre 5 y 13 puntos, dependiendo de las

necesidades de cada señal espectral. Se eligieron estos intervalos por ser los más recomendables,

ya que si se aplica un puntaje más alto el ruido continuamente disminuye, pero conforme aumenta,

algunos picos pueden desaparecer (Macho, 2002).

Esto se hizo con cada uno de los sistemas de adulteración, hasta obtener los modelos

quimiométricos optimizados.

La selección del mejor modelo de calibración (optimizado) dependió de los siguientes criterios

estadísticos: a) Coeficiente de correlación (R2 ) que debe ser lo más cercano a 1, b) Error Estándar

de Calibración (SEC) y c) Error Estándar de Predicción (SEP) ambos deben ser lo más bajo

posible.

Meta 9 (Validación de los modelos quimiométricos) 3.9.2.2. Validación de modelos quimiométricos. Con el objetivo de definir el modelo quimiométrico que mejor capacidad de predicción presenta, se

llevó a cabo la validación formado por cinco muestras con concentraciones conocidas para cada

sistema de adulteración (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de

soya texturizada) estas muestras fueron distintas a los de la matriz de calibración, pero que se

encontraban dentro de los intervalos de concentración para los que fue construido el modelo.

Al validar el modelo, se desplegaron para cada muestra de validación, información de los valores predichos quimiométricamente, así como el Error Estándar de Predicción (SEP) que debe ser lo

más bajo posible, la Distancia de Mahalanobis que debe ser menor a 1 y determina la similitud

espectral de las muestras y finalmente el Error Residual que debe ser menor a 3 (PerkinElmer,

1991). Por medio de estos parámetros estadísticos se determina la certeza de las predicciones. Se

usó una hoja de cálculo de Excel para Windows 2005 con la finalidad de correlacionar los datos

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actuales (reales) con los predichos (calculados) de cada adulterante y de los parámetros de

composición química (humedad, proteínas, grasa, cenizas y carbohidratos) y de esta manera

obtener el coeficiente de correlación (R2 ) que debe ser lo más cercano a 1.

Meta 10. (Desarrollo de un modelo SIMCA) 3.10. Desarrollo del modelo SIMCA. Cuando se genera un modelo SIMCA, se requiere definir las clases de cada muestra, de esta

manera, el modelo SIMCA requiere de una base de datos de referencia (a partir de los espectros

FTIR-HATR de los estándares), para definir las clases de cada muestra. Este tipo de análisis recibe

el nombre de “asimétrico” porque involucra en esencia grupos diferentes de muestras, en este

caso, carne de res molida, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res, proteína de soya

texturizada y muestras adulteradas (res-caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-soya

texturizada).

Para lograr esto, se adquirieron en diferentes lugares de la Cd. de México 20 muestras de cada

estándar (carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos y proteína de soya texturizada) y

se obtuvieron sus espectros FTIR-HATR bajo las condiciones descritas en el punto 6.8.1. En total

se adquirieron 120 espectros FTIR-HATR de los cuales 90 se utilizaron para construir el modelo

SIMCA y 30 para validarlo (cinco espectros de cada material analizado). Asimismo, se utilizaron 41

espectros FTIR-HATR de cada sistema de adulteración (res-caballo, res-hígado, res-riñón, res-

pellejos y res-soya texturizada), en total 180 espectros FTIR-HATR fueron para construir el modelo

y 25 para validarlo (cinco espectros de cada sistema de adulteración).

De esta manera, los espectros de los estándares (carne de res molida, carne de caballo, hígado,

riñón, pellejos de res, proteína de soya texturizada y muestras adulteradas), se alimentaron al

programa AssureID, se les asignó nombre y se generó el modelo.

3.10.1. Optimización del modelo SIMCA. A partir del primer modelo obtenido se procedió a generar “n” modelos hasta optimizarlo. Para

lograr esto, se eliminó el ruido electrónico, se varió el intervalo espectral, las regiones de blancos,

el suavizado (smooth) de los espectros y se aplicaron filtros ambientales para eliminar el ruido

causado por CO2 y H2O.

La selección del mejor modelo dependió de los siguientes parámetros estadísticos: a) modelo sin

muestras extremas ni traslapadas, b) distancia interclase (la que existe entre cada clase), c) porcentaje de reconocimiento y rechazo interclase (entre cada clase) e intraclase (entre la

misma clase) (PerkinElmer, 2005).

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3.10.2. Validación del modelo SIMCA. Para corroborar la funcionalidad del modelo desarrollado fue preciso su validación, que se realizó

con 55 muestras (cinco espectros de cada estándar) que no pertenecían al modelo pero que eran

parte de las poblaciones estudiadas. Al realizar la validación, se desplegó para cada muestra

(PerkinElmer, 2005):

a) material identificado. Material identificado durante la validación

b) resultado. Indica si la muestra fue identificada, rechazada o no pertenece al modelo

c) distancia total. Debe ser menor de 1 para que una muestra sea clasificada. Muestras con

distancias mayores a 1 no son clasificadas

d) distancia límite. Debe ser igual a 1. Indica que el espectro validado pertenece a la población

especificada

e) distancia del modelo. Debe ser igual a 0. Una distancia mayor que 0.00 indica que la muestra

queda fuera de la variación descrita por el modelo. Este valor es la diferencia de la distancia del

espectro validado con respecto a la distancia de los espectros del modelo.

f) distancia residual. Debe ser menor a 3. Una distancia residual grande indica que la muestra

contiene una fuente de variación que no se ha encontrado previamente. En este sentido, SIMCA

usa el tamaño de los residuales igual que si los localizara sobre el mapa de scores (espectros

graficados como ejes que indican la cantidad de variación) para decidir si el material es aceptado o

no.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

META 1, 2 y 3 OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANALISIS ESTADÍSTICO

DE LA MATERIA PRIMA

4.1 Caracterización de la materia prima. Los resultados obtenidos de los análisis químicos se realizaron por triplicado por lo que se presenta

la desviación estándar de cada valor (Cuadro1).

Los datos obtenidos se encuentran entre los reportados en la literatura. Los mayores

constituyentes son el agua, proteína y grasa, aproximadamente un 1 % de cenizas y en menor

cantidad o pueden no estar presentes los carbohidratos que se encuentran en forma de glucógeno

o ácido láctico. El hígado, carne de caballo y riñón presentan un porcentaje de carbohidratos

superior al de otras carnes y son éstos los responsables del característico sabor dulce de este tipo

de carnes.

La carne de res y de caballo tienen composición química, color y textura similares por ello, ésta

última se emplea con frecuencia para sustituir la de res y los primeros intentos para identificarla se

basaron en valoraciones químicas, considerando el elevado contenido de glucógeno de la carne de

14

caballo. Así mismo, un color amarillo muy intenso de la grasa hace sospechar que se trata de

carne de caballo (Kirk et al., 1996).

La composición química de los diferentes cortes de carne puede variar considerablemente, el

mismo corte tomado de diferentes animales también puede mostrar variabilidad. Aunque la

determinación de las propiedades químicas no era la finalidad del presente estudio, fue necesario

examinar los valores de composición química para corroborar que se encontraban dentro de los

reportados en la literatura y por tanto, utilizarlos en el estudio de adulteración. Cuadro 1. Composición química de la carne de res molida, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada (deshidratada y rehidratada).

% Humedad ♦ % Grasa ♦ % Cenizas

♦ % Proteína ♦ % Carbohidratos ◊

Carne de res molida

61.55 (± 0.01) (61 - 62.2)

18.12 (± 0.07) (18 - 20.5)

0.96 (± 0.02) (0.9 - 1)

19.37 (± 0.05) (16.8 - 19.9)

0 (0)

Carne de caballo 73.05 (± 0.03) (73 - 75)

5.06 (± 0.03) (1 - 6)

0.97 (± 0.01) (1)

19.39 (± 0.01) (19 - 23)

1.53 (± 0.06) (2)

Hígado 68.04 (± 0.15) (68.6 - 70)

7.85 (± 0.11) (7.8 - 8)

1.34 (± 0.03) (1.4)

20.29 (± 0.28) (19.7 - 21.1)

2.48 (± 0.19) (2.2 - 6)

Riñón 79.54 (± 0.13) (75 – 79.8)

2.69 (± 0.03) (2.6 - 3)

1.08 (± 0.01) (1.1)

15.76 (± 0.02) (15 - 15.8)

0.93 (± 0.12) (0.9)

Pellejos de res 23.77 (± 0.08) (24)

66.91 (± 0.01) (66.9) 0.48 (± 0.01) 8.84 (± 0.08)

(8.9) 0

(0) Proteína de soya

texturizada (deshidratada)

8.42 (± 0.06) (6-10)

1.51 (± 0.06) (0.5-2)

5.83 (± 0.02) (6)

49.87 (± 0.2) (50)

34.37 (± 0.08) (33.5-35)

Proteína de soya texturizada

(rehidratada)

69.82 ------

0.03 ------

1.85 ------

45.68 ------

0 ------

♦ Corresponde a un promedio de tres repeticiones ◊ Se obtuvo por diferencia La desviación estándar se presenta en paréntesis ( ) Los datos en cursiva corresponden a los valores reportados en la literatura (Hart 1991; McCance et al., 1991; Chan et al., 1995, Andujar et al., 2000 y Luengo 2001) La proteína de soya texturizada rehidratada no cuenta con valores reportados en la literatura META 4 y 5 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS ADULTERDADAS Y OBTENCIÓN DE LOS ESPEROS FTIR-HATR DE MUESTRAS SIN ADULTERAR Y ADULTERADAS La preparación de las muestras adulteradas fue explicado en el capitulo de Metodos. 4.2. Interpretación de espectros FTIR-HATR. 4.2.1. Interpretación de espectros FTIR-HATR de carne de res molida, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada. Las características de la composición química de los diferentes tipos de muestras se reflejan en los

espectros infrarrojos, debido a que el agua, proteína, grasa y carbohidratos tienen grupos

funcionales característicos y propios que absorben fuertemente en el Infrarrojo Medio.

15

En las Figuras 4.1 y 4.2 se presentan los espectros FTIR de la carne de res molida, carne de

caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada en la región completa del

infrarrojo medio (4000-550 cm-1), en esta región del espectro infrarrojo se encuentran señales de

las vibraciones de los enlaces moleculares, los cuales pueden precisar la composición química de

las muestras. El espectro total de las muestras (Figuras 4.1 y 4.2) refleja su composición química

ya que se pueden observar bandas de absorción asociadas principalmente con el agua, proteína,

grasa y carbohidratos.

Los espectros FTIR-HATR de las muestras analizadas presentan bandas de absorción a 3500-

3400 cm-1, 3400-3200 cm-1, 2950-2850 cm-1, 1750-1710 cm-1, 1650-1550 cm-1, 1460-1235 cm-1 y

1200-950 cm-1. También en la muestra de pellejos de res se observan picos de absorción a 3008

cm-1, 1485-1380 cm-1, 1250-1100 cm-1, 988 cm-1 y 723 cm-1 (Figuras 4.1 y 4.2).

Figura 4.1. Espectros FTIR-HATR en la región completa del infrarrojo medio (4000-550 cm-1) de muestras no adulteradas de: carne de res molida (rojo), carne de caballo (verde), hígado (negro), riñón (azul) y proteína de soya texturizada (lila).

2950-2850 cm-1

C-H (CH3 y CH2)

1460- 1235 cm-1

C-N (amidas I y II)

1750-1710 cm-1

C=O (lípidos) 1200-950 cm-1

C-O-C (glucógeno)

1650-1550 cm-1

N-H (aminas I y II) C=O (amidas I y II)

cm-1

3400-3200 cm-1

O-H (agua)

3500- 3400 cm-1

N-H (amidas I)

Abs

orba

ncia

1650 cm-1

O-H (agua)

16

1485-1380 cm-1

O = C – O –

cm-1

988 cm-1

C=C-H Enlace cis

2950-2850 cm-1

C-H (CH3 y CH2)

723 cm-1

C=C-H Enlace cis

3008 cm-1 C=C-H

Enlace cis

3400-3200 cm-1

O-H

1750-1710 cm-1

O = C –

o puede ser

O = C – O –

1250-1100 cm-1

O = C – O –

Figura 4.2. Espectro FTIR-HATR en la región completa del infrarrojo medio (4000-550 cm-1) de pellejos de res no adulterado.

La primera banda de absorción (3500-3400 cm-1) (Figura 4.1) se debe a las vibraciones de tensión

de los enlaces N-H de amidas primarias de las proteínas. La segunda banda (3400-3200 cm-1)

(Figuras VII.1 y VII.2) pertenece a las vibraciones de tensión de los enlaces O-H presentes en

moléculas como el agua, se presenta como una banda ancha (Gangidi et al., 2003). Esta banda

está presente en todos los espectros pero es de menor magnitud en los pellejos de res ya que

normalmente, a medida que el contenido de grasa aumenta, la humedad disminuye.

El espectro FTIR de pellejos de res (Figura 4.2) muestra una banda a 3008 cm-1, que es propia de

la vibración de tensión de los grupos olefínicos =CH- cis de los lípidos (Guillén et al., 2005).

Los picos en el intervalo 2950-2850 cm-1 (Figuras 4.1 y 4.2) se atribuyen a las vibraciones de

tensión de los enlaces C-H de metilos (CH3) y metilenos (CH2) y se deben principalmente a los

lípidos (Cocchi et al., 2004). Estos picos están presentes en todos los espectros pero son de mayor

magnitud en los pellejos de res (Figura 4.2) ya que la composición química de esta muestra está

formada principalmente de grasas (66.91%). Por el contrario, la proteína de soya texturizada

(rehidratatda) carece de esta banda ya que su contenido de grasa es mínimo (0.03%) (Figura 4.1 y

Cuadro2).

O-H N-H C=O A

bsor

banc

ia

17

La banda de absorción indicada a 1750-1710 cm-1 (Figuras 4.1 y 4.2) se debe al grupo funcional

C=O de ésteres o cetonas de algunos lípidos, en ambos casos el grupo funcional C=O presenta

vibraciones de tensión (Coates, 2000), en los espectros FTIR de la carne molida, hígado y riñón

esta banda no se presenta ya que la grasa subcutánea fue eliminada manualmente, en cambio en

el espectro FTIR de pellejos de res (Figura 4.2) esta banda es muy alta. Esto refleja la diferencia en

el contenido de lípidos entre las muestras y concuerda con los datos de la composición química.

Las bandas de absorción en esta región corresponden a los ácidos grasos insaturados, por

ejemplo, el ácido oleico absorbe a 1725 cm-1, mientras que los triglicéridos saturados e insaturados

tienen su máxima absorción a 1760-1725 cm-1 (Downey et al., 2002), esto es de esperarse ya que

en la grasa de la carne de res, el ácido graso insaturado más abundante es el oleico, además de

otros ácidos grasos saturados como el palmítico y el esteárico (Forrest, 1979).

La banda de 1650-1590 cm-1 (Figuras 4.1 y 4.2) son asignadas a las vibraciones de flexión N-H de

aminas primarias y secundarias, la banda de 1650-1550 cm-1 corresponden a las vibraciones de

tensión del carbonilo C=O de amidas primarias y secundarias (Figuras 4.1 y 4.2); estas dos bandas

de absorción se asocian con las combinaciones de los modos vibracionales de los grupos amido de

los aminoácidos en las proteínas y es particularmente importante, ya que esto refleja las

modificaciones en la estructura secundaria de la proteína (Wellner et al., 1996). En esa misma

región aparece una banda (1650 cm-1) sobrelapada que pertenece a las vibraciones de tensión de

los enlaces O-H de moléculas del agua (Al-Jowder et al., 1999).

Así mismo, los picos de 1460-1235 cm-1 (Figura 4.1) se atribuyen a las vibraciones de tensión de

los enlaces C-N de amidas primarias y secundarias, que son el grupo característico de las

proteínas (Coates, 2000). Muchas bandas de absorción son atribuibles a los grupos funcionales

que constituyen las proteínas y es de esperarse ya que después del agua, las proteínas son los

componentes mayoritarios en la carne, vísceras (hígado, riñón) y proteína de soya texturizada.

Cabe resaltar que en el espectro FTIR de la proteína de soya texturizada (Figura 4.1) las únicas

bandas de absorción se encuentran entre 3400-3200 cm-1 y 1650-1590 cm-1 y se deben

respectivamente a las vibraciones de tensión de los enlaces O-H presentes en el agua y a las

vibraciones de flexión N-H de aminas primarias y secundarias asociadas con las proteínas.

En la región de 1200-950 cm-1 (Figura 4.1) se encuentran las vibraciones de tensión de los enlaces

C-O-C que se atribuyen al contenido de glucógeno de las muestras analizadas (Al-Jowder et al.,

1999).

18

Si bien las muestras contienen poco o nada de carbohidratos, los espectros muestran algunas

bandas de absorción en esta región, las cuales varían con respecto al contenido de glucógeno en

las diferentes muestras. Aunque los carbohidratos exhiben absorciones fuertes en esta región,

otros compuestos químicos incluso las grasas dan lugar a bandas menores y éstas pueden

atribuirse a otros constituyentes químicos que absorben en esta región (Al-Jowder et al., 1999). Por

ejemplo, existen reportes en donde se ha encontrado que las bandas a 1160 cm-1 pueden deberse

a vibraciones de tensión de los enlaces C-O de los ésteres de algunos lípidos y los picos a 1075

cm-1 corresponden a vibraciones de tensión de los enlaces S=O de los compuestos de azufre

(Gangidi et al., 2003). Esto es importante ya que algunos aminoácidos que forman proteínas

contienen azufre.

Lo antes citado se demuestra en el espectro FTIR de los pellejos de res (Figura VII.2) ya que las

bandas que se presentan en la región de 1485-550 cm-1 se deben a los grupos funcionales de los

lípidos, por ejemplo, a 1485-1380 cm-1 se presentan vibraciones de tensión C=O de ésteres, los

diversos picos que se presentan entre 1250-1100 cm-1 corresponden a vibraciones de tensión de

los enlaces C-O- de ésteres (PerkinElmer, 2006). A 988 cm-1 aparece una banda que se ha

asociado con las vibraciones de flexión de grupos dienos conjugados C=C-H trans-trans (t-t) y cis-

trans (c-t) de los lípidos (Guillén et al., 2005). Finalmente a 723 cm-1 se presentan vibraciones de

tensión C=C-H (éster) enlace cis de los lípidos.

De esta manera, las diferencias más notables entre los espectros FTIR se presentaron en la zona

conocida como huella digital, ya que las absorciones que aparecen en esta región provienen

principalmente de las vibraciones de tensión, donde cada compuesto tiene una absorción

característica.

Las bandas de absorción antes señaladas son consistentes con lo que se esperaba sobre los datos

de la composición química de las muestras analizadas, ya que el espectro infrarrojo ayuda a

revelar la estructura de un compuesto mostrando cuáles grupos funcionales están presentes o

ausentes en la molécula, por tanto, el espectro FTIR es altamente sensible para precisar la

composición de las muestras de carne. Las bandas de los espectros FTIR antes descritas

coinciden con las obtenidas por Al-Jowder et al., (1999) y Al-Jowder et al., (2002).

Cabe resaltar que la interpretación de espectros infrarrojos es mucho más que asignar bandas de

absorción, ya que un espectro FTIR es rico en información y por tanto revela información acerca de

los enlaces moleculares presentes en las muestras. Otro aspecto que debe tomarse en

consideración para la interpretación exitosa es apoyarse no sólo en la presencia de bandas

particulares dentro del espectro, sino también en la ausencia de otras bandas importantes. De esta

19

manera, el espectro infrarrojo puede usarse como una huella digital para identificar una muestra

desconocida (Reid et al., 2006).

Aunque los espectros de las muestras de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y

proteína de soya texturizada son visualmente muy similares, algunas regiones pueden ser

estadísticamente diferentes, por ello, se requiere de un análisis multivariante (quimiométrico) para

detectar estas posibles diferencias.

4.2.2. Interpretación de espectros FTIR-HATR de las muestras adulteradas (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada). Se obtuvieron 41 espectros FTIR de carne de res molida con cada adulterante. Los espectros FTIR

de las muestras adulteradas se obtuvieron bajo las mismas condiciones que las muestras sin

adulterar.

En las Figuras 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 y 4.7 se muestran por claridad 15 de los 41 espectros FTIR de

cada sistema de adulteración: res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-

proteína de soya texturizada respectivamente en la región de la “huella digital” (1800-900 cm-1). En

el caso de los espectros FTIR del sistema de adulteración con pellejos de res (Figura 4.6) se

presentan en el intervalo de 1800-1000 cm-1 pues se eliminó el ruido electrónico. Las flechas

indican la dirección del aumento o disminución en las bandas de absorción conforme se incrementa

la concentración del adulterante.

Los espectros FTIR muestran diferencias en la magnitud de absorbancia para cada una de las

muestras adulteradas (Figuras 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 y 4.7), de tal manera que cada curva se relaciona

directamente con una determinada concentración del adulterante. Esto refleja el cambio en la

composición química de las muestras conforme aumenta la concentración del adulterante y esto es

esencial para el desarrollo de los modelos quimiométricos.

En los espectros FTIR de los sistemas de adulteración con caballo, hígado y riñón (Figuras 4.3,

VII.4, VII.5) se observan las mismas bandas de absorción pero en diferente magnitud conforme

aumenta la concentración del adulterante, de tal manera que el espectro que tiene un 10% del

adulterante es de menor magnitud que aquel que tiene un 40% para los tres sistemas de

adulteración (Figuras 4.3, 4.4, 4.5).

20

Figura 4.3 Espectros FTIR en la zona de la huella digital (1800-900 cm-1) de carne de res molida adulterada con carne de caballo

Figura 4.4. Espectros FTIR en la zona de la huella digital (1800-900 cm-1) de carne de res molida adulterada con hígado.

Incremento en las proporciones del

adulterante

cm-1


adulterante

Abs

orba

ncia

A

bsor

banc

ia

21

Figura 4.5. Espectros FTIR en la zona de la huella digital (1800-900 cm-1) de carne de res molida adulterada con riñón.

Figura 4.6. Espectros FTIR en la zona de la huella digital (1800-900 cm-1) de carne de res molida adulterada con pellejos de res.

cm-1

cm-1

res-pellejos 60:40


adulterante

Abs

orba

ncia

A

bsor

banc

ia


adulterante

22

Figura 4.7. Espectros FTIR en la zona de la huella digital (1800-900 cm-1) de carne de res molida adulterada con proteína de soya texturizada.

En los espectros FTIR del sistema de adulteración con pellejos de res (Figuras 4.6), se observa un

cambio notable en la composición química de las muestras adulteradas al incrementarse la banda

de 1750-1710 cm-1 correspondiente a las vibraciones de tensión de los enlaces tipo éster C=O de

algunos lípidos, esto refleja la diferencia en el contenido de grasas de las muestras adulteradas, ya

que conforme aumenta la adulteración, el contenido de lípidos también se incrementa (Figuras 4.6).

Este comportamiento también se observa en el pico de 1485 cm-1 (C=O, ésteres) y entre 1250-

1150 cm-1 (C-O-, ésteres) mismos que aumentan conforme se incrementa el porcentaje del

adulterante. La banda de 1650-1590 cm-1 asignadas a vibraciones de flexión N-H de aminas

primarias y secundarias así como la región 1650-1550 cm-1 de vibraciones de tensión del carbonilo

C=O de amidas primarias y secundarias y la banda de 1650 cm-1 de las vibraciones de tensión O-H

del agua, también cambian de magnitud ya que normalmente a medida que el contenido de grasa

aumenta la combinación de humedad y proteína se desplaza en dirección opuesta (Figuras 4.6).

En lo que se refiere a los espectros FTIR del sistema de adulteración con proteína de soya

texturizada (Figuras 4.7) el efecto más notable de la adulteración se manifiesta al disminuir la

banda de 1650-1590 cm-1 asignada a las vibraciones de flexión N-H de aminas primarias y

secundarias y la banda de 1650-1550 cm-1 que corresponden a las vibraciones de tensión del

carbonilo C=O de amidas primarias y secundarias. De esta manera, conforme aumenta el

porcentaje de adulteración la magnitud de absorción de estas bandas van disminuyendo (Figura

4.7). Por tanto, estas diferencias pueden usarse para desarrollar el modelo quimiométrico para

detectar este tipo de adulteración.

res-proteína de soya texturizada 60:40

res-proteína de soya texturizada 90:10

cm-1


adulterante Abs

orba

ncia

23

Al analizar los espectros FTIR de todos los sistemas de adulteración (res-carne de caballo, res-

hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada), se demuestra que el espectro

proporciona información sobre un número muy grande de analitos, así mismo, las bandas de

absorción son muy sensibles a los estados físicos y químicos de los constituyentes individuales. De

esta manera, la alta proporción de señal-ruido que se obtiene de los espectros FTIR permite

identificar los constituyentes presentes en bajas concentraciones, así como mínimas diferencias en

la composición de los constituyentes a analizar.

Por tanto, para identificar posibles adulteraciones en la carne de res por medio de un espectro

FTIR es determinando la proporción de algunos constituyentes químicos y asumir que estas

proporciones son componentes constantes en la carne. De esta manera, la adición de cualquier

sustancia(s) a la carne de res modificará estas proporciones y por consiguiente resultará en un

espectro FTIR diferente al original. Sin embargo, no siempre es posible distinguir espectros FTIR

de muestras adulteradas de las no adulteradas solo con inspección visual, por lo cual es necesario

analizar los datos por métodos multivariantes (quimiometría) para desarrollar modelos de

predicción y obtener un estudio más exacto referente a muestras heterogéneas.

En investigaciones relacionadas (Al-Jowder et al., 1997), se ha demostrado que es muy difícil

distinguir espectros FTIR de muestras no adulteradas de las adulteradas en diferentes tipos de

carne (res, pollo, pavo y cerdo) sin la ayuda de quimiometría.

Por último, cabe señalar que el cambio en la variación espectral fue lo suficiente en cada uno de

los sistemas de adulteración (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-

proteína de soya texturizada) para desarrollar modelos quimiométricos sólidos y confiables.

4.3. Desarrollo de modelos quimiométricos para identificar adulteraciones y composición

química.

META 6. SELECCIÓN DE LA SEÑAL ESPECTRAL 4.3.1. Selección de la región espectral. Un importante parámetro que se utilizó para desarrollar la calibración de los modelos fue

seleccionar el intervalo espectral que se empleó para construir el modelo. Una vez que se

obtuvieron los espectros FTIR de las muestras adulteradas se hizo un análisis espectral y se

seleccionaron las regiones que mostraron alta correlación entre la absorbancia de cada número o

longitud de onda en el espectro contra las concentraciones de cada adulterante (carne de caballo,

hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada). Esto es necesario ya que si se eligen

fuertes picos de absorción, los factores PCR, PLS1 y PLS2 no pueden corregir sobreabsorbancias

(A>2.0) (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a). Además, si todos los números de onda se usaran en la

24

calibración existiría el riesgo de ‘‘diluir” las regiones útiles del espectro, haciendo los picos

espectrales mayores menos visibles a los algoritmos, al mismo tiempo que se incorporaría ruido en

el modelo de calibración (Soriano et al., 2007).

Por tanto, después de varios intentos, la región que se eligió para construir los modelos de

calibración de cada sistema de adulteración (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-

pellejos de res y res-proteína de soya texturizada) fue de 1800-900 cm-1 (región de la “huella

digital”) ya que esta zona presentó la correlación más alta. Además, esta región proporciona la

información más útil del espectro infrarrojo, al mismo tiempo, esta restricción acelera el

procesamiento de los datos (McElhinney et al., 1999). A su vez, en esta región de los espectros

FTIR se encuentran los componentes mayoritarios (agua, proteínas, grasas y carbohidratos) de las

muestras analizadas.

META 7. DESARROLLO DE LOS MODELOS DE CALIBRACIÓN

4.3.2. Desarrollo de modelos de calibración para cada adulterante. Los modelos de calibración multivariante se desarrollaron utilizando los algoritmos PCR, PLS1 y

PLS2. Estos modelos establecen una correlación entre los datos espectrales y la concentración

del adulterante y con los valores analíticos de los parámetros de composición química. En la

construcción de cada modelo, se obtuvieron datos estadísticos para cada sistema de adulteración y

para cada algoritmo aplicado (PCR, PLS1 y PLS2), los cuales ayudaron a elegir el mejor modelo de

calibración.

7.3.2.1. Calibración de los sistemas de adulteración (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada). El número de factores, coeficiente de correlación (R2) y Error Estándar de Calibración (SEC) de

los algoritmos PCR, PLS1 y PLS2 son los datos más importantes a analizar, ya que éstos

determinan cuál algoritmo predice mejor. La información que PCR, PLS1 y PLS2 arrojaron en forma

de valores estadísticos de calibración se presenta en el Cuadro VII.3. El algoritmo con mayor

capacidad predictiva se presenta en negrita y cursiva.

25

Cuadro 4.3. Datos de calibración de los modelos desarrollados con los algoritmos PCR, PLS1 y PLS2 de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de los sistemas de adulteración: res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-proteína de soya texturizada.

CALIBRACIÓN Sistema de

adulteración Algoritmo Parámetro Factores a R2 b SEC c

Adulteración 1.513 Humedad 0.1747 Proteínas 0.0002 Grasas 0.1938 Cenizas 0.2001

PCR

Carbohidratos

10 0.9975

0.0187 Adulteración 1.750

Humedad 0.1819 Proteínas 0.0002 Grasas 0.2370 Cenizas 0.2901

PLS1

Carbohidratos

5 0.9982


Proteínas 0.1690 Grasas 0.0002 Cenizas 0.1899

RES-CARNE DE CABALLO

PPLLSS22

Carbohidratos

5 0.9991



PCR

Carbohidratos

10 0.9977



PLS1

Carbohidratos

6 0.9969



RES-HÍGADO

PLS2

Carbohidratos

7 0.9979



PCR

Carbohidratos

5 0.9974

0.0109 Adulteración 11..002211

Humedad 00..11884488 Proteínas 00..00336699 Grasas 00..11557766 Cenizas 00..00001122

PPLLSS11

Carbohidratos

66 00..99998844

00..00008855 Adulteración 1.508

Humedad 0.2730 Proteínas 0.0545

RES-RIÑÓN

PLS2

Grasas

4 0.9971

0.2329

Cuadro VII.3. Continuación

26

Cenizas 0.0017 Carbohidratos 0.0126 Adulteración 11..227788


PPCCRR

Carbohidratos

1144 00..99994422

00..00000022 Adulteración 2.496


PLS1

Carbohidratos

3 0.9064



RES-PELLEJOS DE RES

PLS2

Carbohidratos

8 0.9867



PCR

Carbohidratos

11 0.9987



PLS1

Carbohidratos

4 0.9980

0.1061 Adulteración 00..55779944


RES-PROTEÍNA DE SOYA

TEXTURIZADA

PPLLSS22

Carbohidratos

77 00..99999966

00..00558844 a Número óptimo de factores b Coeficientes de correlación (R2), debe ser lo más cercano a 1 c Error Estándar de Calibración (SEC), debe ser lo más bajo posible NOTA: El algoritmo con mayor capacidad predictiva se presenta en negrita y cursiva

Los datos que se presentan se obtuvieron después de analizar y modificar diferentes parámetros

(número de factores, intervalo del espectro, eliminar ruido electrónico, suavizado, regiones blanco)

en varios modelos previamente desarrollados hasta lograr su optimización, por tanto, los valores

que se presentan corresponden a los modelos quimiométricos optimizados.

Al analizar los datos y comparar los tres algoritmos (PCR, PLS1 y PLS2) se observa que para los

cinco sistemas de adulteración (res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-

proteína de soya texturizada), todos los modelos desarrollados tienen coeficientes de correlación

(R2) muy cercanos a la unidad, lo cual indica que cualquiera de los modelos quimiométricos

27

desarrollados son confiables para predecir concentraciones de adulteración en muestras problema

(Cuadro 4.3).

De igual manera, los valores de SEC de los tres algoritmos de todos los modelos desarrollados se

encuentran por debajo de 3 que es el límite máximo permitido, por tanto, todos los modelos

quimiométricos de los diferentes sistemas de adulteración se consideran confiables (Cuadro VII.3).

La selección del mejor modelo de calibración dependió del Coeficiente de correlación (R2), que

debe ser lo más cercano a 1 y del Error Estándar de Calibración (SEC) que debe ser lo más bajo

posible. Con base en esto, para los sistemas de adulteración: res-carne de caballo, res-hígado y

res- proteína de soya texturizada, el algoritmo PLS2 mostró los mejores resultados, mientras que

PLS1 lo fue para res-riñón y PCR para res-pellejos (Cuadro 4.3), por obtener valores de SEC más

bajos y coeficiente de correlación (R2) más altos en comparación con los modelos desarrollados

con los otros algoritmos. Del mismo modo, estos valores indican la precisión alcanzada en la

calibración y validación. De acuerdo a los criterios propuestos por Shenk y Westerhaus (1996) un

valor de R2 más grande que 0.91 indica información cuantitativa “excelente”, mientras que un valor

entre 0.7 y 0.9 se describe como “bueno”. Un valor de R2 entre 0.5 y 0.7 demuestra poca

separación de muestras, indicando que la calibración sólo puede usarse con propósitos

preliminares.

Los resultados obtenidos (Cuadro 4.3), muestran que los modelos desarrollados con los algoritmos

PCR, PLS1 y PLS2 son muy cercanos, aunque PLS ligeramente da mejores resultados. Esto se

debe a que PLS es una técnica cuantitativa de descomposición espectral, capaz de correlacionar los cambios espectrales con los cambios en las concentraciones de un componente de interés (en

este caso la adulteración). Esto causa que los espectros de las muestras con concentración más

alta tengan más influencia que las muestras con concentración más baja. De esta manera el

objetivo de PLS es construir un modelo lineal que permita la predicción de características

deseables (porcentaje de adulteración) de los espectros analizados. Por ello, PLS es el algoritmo

más frecuentemente utilizado para correlacionar datos espectrales con datos químicos o físicos

(Defernez y Kemsley, 1997).

De PLS se distinguen dos versiones: PLS1 y PLS2. PLS1 maneja solo una variable (espectros) a la

vez, es decir, para cada constituyente de interés se calcula un juego de scores y vectores

(factores), por tanto, este algoritmo proporciona predicciones más exactas que PCR y PLS2 ya que

construye matrices separadas para cada constituyente de interés. Por otro lado, PLS2 maneja

muchas variables simultáneamente y es útil para una apreciación global preliminar en el análisis de

los datos explorados, en este sentido, PLS2 se calibra para todos los constituyentes

simultáneamente (Li et al., 1996). A diferencia de PLS, PCR no considera los valores de referencia

para construir los componentes espectrales (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a,b). Esto puede

28

explicar porque PLS desarrolla mejores modelos que PCR. La única desventaja de usar PLS1 es la

lentitud de calibración ya que al calcular parámetros estadísticos para cada constituyente de interés

los cálculos conllevan más tiempo.

Con los datos obtenidos en la presente investigación, se demuestra que es evidente la versatilidad

de los modelos de calibración. Los argumentos en la literatura generalmente muestran que PLS

tiene habilidad predictiva superior. En muchos casos, las versiones de PLS darán mejores

resultados que PCR y PLS1 será más exacto que PLS2. Sin embargo, hay investigaciones donde

ciertas calibraciones han arrojado mejores resultados usando PCR o PLS2 en lugar de PLS1.

Desafortunadamente, no hay reglas definidas y solo la práctica puede determinar el mejor modelo

para cada sistema individual. De esta manera, ninguno de los tres algoritmos es teóricamente

mejor que otro, por tanto, los modelos desarrollados con alguno de los tres algoritmos deben

juzgarse por los resultados que alcancen (Li et al., 1996).

Una forma de evaluar la capacidad de predicción de los modelos calibrados, es mediante gráficas

que permiten visualizar la correlación entre los valores especificados (concentración real del

adulterante) y los valores estimados (concentración predicha del adulterante por el modelo

desarrollado). Así, las Figuras 4.13, 4.14, 4.15, 4.16 y 4.17 presentan la correlación obtenida de los

valores especificados contra los valores estimados de cada sistema de adulteración y de los

parámetros químicos para: res-carne de caballo con el algoritmo PLS2 (Figura 4.13), res-hígado

con PLS2 (Figura 4.14), res-riñón con PLS1 (Figura 4.15), res-pellejos de res con PCR (Figura 4.16)

y res-proteína de soya texturizada con PLS2 (Figura 4.17) por ser los modelos con mayor

capacidad para predecir la adulteración y los parámetros químicos.

Se observa que los coeficientes de correlación de los modelos quimiométricos que predicen la

adulteración y cada parámetro (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) son muy

cercanos a 1: res-carne de caballo R2=0.9991, res-hígado R2=0.9979, res-riñón R2=0.9984, res-

pellejos R2=0.9942 y res-proteína de soya texturizada R2=0.9996; este valor es uno de los

indicadores que determina buena predicción de los modelos y manifiesta que existe correlación

muy buena entre lo especificado contra lo estimado por el modelo quimiométrico, lo que revela la

precisión de la calibración y como ya se mencionó, de acuerdo a Shenk y Westerhaus (1996)

valores de R2 más altos que 0.91 se consideran “excelentes”.

29

Figura 4.13. Valores especificados contra valores estimados para el modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS2 para: a) carne de res adulterada con carne de caballo y parámetros químicos: b) humedad, c) proteínas, d) grasas, e) cenizas y f) carbohidratos.

R2 = 0.9991

62

64

66

68

70

72

74

62 64 66 68 70 72 74

Valor especificado (%)

Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9991

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100Valor Especificado (%)

Valo

r Est

imad

o (%

)

R2 = 0.9991

19.35

19.45

19.55

19.65

19.35 19.45 19.55 19.65


Valo

r est

imad

io (%

)

R2 = 0.9991

0.966

0.971

0.976

0.966 0.971 0.976


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9991

5

7

9

11

13

15

17

5 7 9 11 13 15 17


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9991

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 0.4 0.8 1.2 1.6


Valo

r est

imad

o (%

)

a b

c d

e f

Humedad

Proteínas Grasa

Cenizas Carbohidratos

- 3%

+ 3%

30

Figura 4.14. Valores especificados contra valores estimados para el modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS2 para: a) carne de res adulterada con hígado y parámetros químicos: b) humedad, c) proteínas, d) grasas, e) cenizas y f) carbohidratos.

R2 = 0.9979

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Valor Especificado (%)

Valo

r Est

imad

o (%

)

R2 = 0.9979

62

64

66

68

62 64 66 68


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9979

8

10

12

14

16

18

8 10 12 14 16 18


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9979

0.98

1.08

1.18

1.28

0.98 1.08 1.18 1.28


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9979

19.4

19.6

19.8

20

19.4 19.6 19.8 20


Valo

r est

imad

io (%

)

R2 = 0.9979

0.3

0.9

1.5

2.1

2.7

0.3 0.9 1.5 2.1 2.7


Valo

r est

imad

o (%

)

a b

c d

e f

Humedad

Proteínas Grasa


- 4

+ 4

31

R2 = 0.9984

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100


Valo

r Est

imad

o (%

)

R2 = 0.9984

62

66

70

74

78

62 66 70 74 78


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9984

15.5

16.5

17.5

18.5

19.5

15.5 16.5 17.5 18.5 19.5


Valo

r est

imad

io (%

)

R2 = 0.9984

3579

11131517

3 5 7 9 11 13 15 17


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9984

0.97

1.02

1.07

0.97 1.02 1.07


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9984

0.15

0.35

0.55

0.75

0.15 0.35 0.55 0.75


Valo

r est

imad

o (%

)

a b

c d

e f

Humedad


- 3

+ 3

Proteínas Grasa

Figura VII.15. Valores especificados contra valores estimados para el modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS1 para: a) carne de res adulterada con riñón y parámetros químicos: b) humedad, c) proteínas, d) grasas, e) cenizas y f) carbohidratos.

32

R2 = 0.9942

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100


Valo

r Est

imad

o (%

)

R2 = 0.9942

26313641465156

26 31 36 41 46 51 56


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9942

8

10

12

14

16

18

20

8 10 12 14 16 18 20


Valo

r est

imad

io (%

)

R2 = 0.9942

2026323844505662

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9942

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9942

0.1

0.102

0.104

0.106

0.108

0.11

0.1 0.102 0.104 0.106 0.108 0.11 0.112


Valo

r est

imad

o (%

)

a b

c d

e f

Humedad

Cenizas

- 4

+ 4

Proteínas Grasa

Figura 4.16. Valores especificados contra valores estimados para el modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PCR para: a) carne de res adulterada con pellejos de res y parámetros químicos: b) humedad, c) proteínas, d) grasas, e) cenizas y f) carbohidratos.

33

R2 = 0.9996

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100


Valo

r Est

imad

o (%

)

R2 = 0.9996

61

63

65

67

69

61 63 65 67 69


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9996

17.2

17.7

18.2

18.7

19.2

19.7

17.2 17.7 18.2 18.7 19.2 19.7


Valo

r est

imad

io (%

)

R2 = 0.9996

2468

1012141618

2 4 6 8 10 12 14 16 18


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9996

1

1.2

1.4

1.6

1.8

1 1.2 1.4 1.6 1.8


Valo

r est

imad

o (%

)

R2 = 0.9996

0.6

2.6

4.6

6.6

8.6

0.6 2.6 4.6 6.6 8.6


Valo

r est

imad

o (%

)

a b

c d

e f

Humedad


- 3

+ 3

Proteínas Grasa

Figura 4.17. Valores especificados contra valores estimados para el modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS2 para: a) carne de res adulterada con proteína de soya texturizada y parámetros químicos: b) humedad, c) proteínas, d) grasas, e) cenizas y f) carbohidratos.

De acuerdo a esto, lo ideal es que todas las muestras caigan sobre la línea de 45°, en este sentido,

la mayoría de las muestras caen dentro de esta línea con una desviación máxima de ±3% en los

sistemas de res-carne de caballo, res-riñón y res-proteína de soya texturizada, mientras que en

34

res-hígado y res-pellejos la desviación máxima es de ±4%. Esto indica que los modelos

quimiométricos desarrollados están modelando la información correctamente.

META 9. VALIDACIÓN DE LOS MODELOS QUIMIOMÉTRICOS

4.3.2.2. Validación de modelos quimiométricos. Antes de aplicar los modelos quimiométricos a un sistema real, fue necesario corroborar que tan

preciso era para la predicción. Para ello, se llevó a cabo la validación externa formado por un

conjunto de cinco muestras diferentes de las empleadas para construir y calibrar el método

QUANT+, pero que se encontraban dentro de los intervalos de concentración para los que fue

construido el modelo.

La validación externa se ha aplicado en diversas investigaciones mostrando excelente capacidad

de predicción de los modelos (Al-Jowder et al., 1999; McElhinney et al., 1999; Kemsley et al., 2001;

Al-Jowder et al., 2002 y Tewari e Irudayaraj, 2004).

Se usó una hoja de cálculo de Excel para Windows 2005 para correlacionar los valores de predicción (calculados) con los valores actuales (reales) de cada adulterante y de los parámetros

de composición química (humedad, proteínas, grasa, cenizas y carbohidratos) y así obtener el coeficiente de correlación (R2). La agudeza de las predicciones se evaluó mediante el coeficiente

de correlación (R2) que debe ser lo más cercano a 1 y el Error Estándar de Predicción (SEP) que

debe ser lo más bajo posible.

El coeficiente de correlación (R2) y el Error Estándar de Predicción (SEP) de las muestras de

validación de los modelos desarrollados para los cinco sistemas de adulteración se muestran en el

Cuadro 4. 4.

En todos los casos (Cuadro 4.4) se observa que los Errores Estándar de Predicción (SEP)

presentan valores aceptables (el límite debe ser menor a 3) y los coeficientes de correlación (R2)

son muy altos (cercanos a 1) que de acuerdo a Shenk y Westerhaus (1996) se consideran

“excelentes” lo que indica que los modelos calibrados presentan buenas predicciones para la

adulteración y composición química de las muestras problema en los cinco sistemas de

adulteración.

Los Cuadros 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 y 4.9 contienen la información de los valores reales (contenido especificado del adulterante y de los parámetros químicos: humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras que se utilizaron para validar y evaluar la capacidad

predictiva de los modelos quimiométricos desarrollados: res-carne de caballo (PLS2), res-hígado

35

Cuadro 4.4. Coeficiente de correlación (R2) y Error Estándar de Predicción (SEP) de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación de: res-carne de caballo con PLS2, res-hígado con PLS2, res-riñón con PLS1, res-pellejos con PCR y res-proteína de soya texturizada con PLS2.

VALIDACIÓN

Sistema de adulteración Parámetro R2 a SEP b

Adulteración 0.9997 0.454 Humedad 0.9997 0.1690 Proteínas 0.9995 0.0002 Grasas 0.9996 0.1899 Cenizas 0.9901 0.0001

Res-carne de caballo (PLS2)

Carbohidratos 0.9998 0.0204 Adulteración 0.9998 0.710

Humedad 0.9998 0.1112 Proteínas 0.993 0.0122 Grasas 0.9997 0.1756 Cenizas 0.9984 0.0061

Res-hígado (PLS2)



Res-riñón (PLS1)



Res-pellejos de res (PCR)



Res-proteína de soya texturizada

(PLS2)

Carbohidratos 0.9998 0.1007 a Coeficientes de correlación (R2) debe ser lo más cercano a 1 b Error Estándar de Predicción (SEP) debe ser lo más bajo posible

(PLS2), res-riñón (PLS1), res-pellejos de res (PCR) y res-proteína de soya texturizada (PLS2)

respectivamente.

36

Se incluyen los valores predichos (contenido calculado del adulterante y de los parámetros químicos), la Distancia de Mahalanobis (que debe ser menor a 1) y el Error Residual (que debe

ser menor a 3), mismos que ayudaron a definir la certeza de las predicciones. La Distancia de

Mahalanobis es un parámetro de confiabilidad en el resultado predicho (concentración porcentual),

es una descripción útil de la similitud entre muestras y representa la desviación estándar del centro

de un juego de muestras a otra muestra. Las muestras que están más alejadas del centro tienen

mayores diferencias que las que están cercanas al mismo. Así, las muestras problema que no son

representativas de la curva de calibración empleada, se pueden detectar a través de la Distancia

de Mahalanobis. Una Distancia mayor a 1 indica que las características espectrales de la muestra

desconocida no se encuentran reflejadas en el grupo de estándares utilizados en el modelo de

calibración. Cuadro VII.5. Datos de predicción de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación: res-carne de caballo con PLS2.

Parámetros estadísticos calculados quimiométricamente

Muestra adulterada de

validación Parámetro

Contenido real (%)

Contenido predicho (%)

Distancia de Mahalanobis a

Error residual b

RES-CARNE DE CABALLO (PLS2)

Adulterante 28 27.94 Humedad 64.7 64.68 Proteínas 19.4 19.38

Grasas 14.5 14.47

Cenizas 0.97 0.96

28%

Carbohidratos 0.49 0.49

0.6045 0.6484

Adulterante 34 33.73

Humedad 65.4 65.35

Proteínas 19.4 19.38

Grasas 13.7 13.72

Cenizas 0.97 0.97

34%


0.4299 0.2974


Humedad 67.2 67.19


Grasas 11.6 11.66

Cenizas 0.97 0.98

50%


0.7109 0.7516


Humedad 69.3 69.34


Grasas 9.24 9.238

Cenizas 0.97 0.98

68%


0.5248 0.7365

37


Humedad 70.3 70.22


Grasas 8.2 8.24

Cenizas 0.97 0.98

76%


0.3212 1.784

a Distancia de Mahalanobis debe ser menor a 1 b Error Residual debe ser menor a 3 Cuadro 4.6. Datos de predicción de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación: res-hígado con PLS2.



validación Parámetro Contenido

real (%) Contenido

predicho (%) Distancia de

Mahalanobis a Error residual b

RES-HÍGADO (PLS2)

Adulterante 22 21.7

Humedad 62.9 62.86


Grasas 15.9 15.89

Cenizas 1.05 1.04

22%


0.7501 0.2785


Humedad 63.9 63.94


Grasas 14.2 14.21

Cenizas 1.1 1.10

38%


0.9706 0.8294


Humedad 64.9 64.9


Grasas 12.8 12.71

Cenizas 1.15 1.16

52%


0.4621 0.434


Humedad 66.3 66.3


Grasas 10.5 10.53

Cenizas 1.23 1.23

74%


0.2147 0.8478


Humedad 67.2 67.22

Proteínas 20 20

Grasas 9.08 9.09

Cenizas 1.28 1.28

88%


0.3512 0.1536

38

Cuadro 4.7. Datos de predicción de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación: res-riñón con PLS1.




real (%) Contenido

predicho (%)Distancia de

Mahalanobis a Error

residual b

RES-RIÑÓN (PLS1) Adulterante 22 21.21 Humedad 65.4 65.28 Proteínas 18.6 18.61 Grasas 14.7 14.85 Cenizas 0.99 0.99

22%


0.7259 0.3529

Adulterante 30 29.34 Humedad 66.9 66.75 Proteínas 18.3 18.32 Grasas 13.5 13.59 Cenizas 1 1

30%


0.4392 0.2811

Adulterante 62 62.37 Humedad 72.7 72.84 Proteínas 17.1 17.1 Grasas 8.55 8.39 Cenizas 1.04 1.04

62%


0.4211 0.422


76%


0.429 0.7825

Adulterante 86 85.89 Humedad 77 76.99 Proteínas 16.3 16.27 Grasas 4.84 4.86 Cenizas 1.07 1.07

86%


0.5685 0.1343

a Distancia de Mahalanobis debe ser menor a 1 b Error Residual debe ser menor a 3

39

Cuadro 4.8. Datos de predicción de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación: res-pellejos de res con PCR.




real (%) Contenido


Mahalanobis a Error residual

b

RES-PELLEJOS DE RES (PCR) Adulterante 28 28.68 Humedad 50.9 50.64 Proteínas 16.4 16.36 Grasas 31.7 32.08 Cenizas 0.83 0.82

28%


0.8172 0.4835


36%


0.4334 1.189


44%


0.6758 0.8905

Adulterante 64 63.45 Humedad 37.3 37.54 Proteínas 12.6 12.69 Grasas 49.3 49 Cenizas 0.66 0.65

64%


0.6412 0.9296


78%


0.2819 1.718


40

Cuadro 4.9. Datos de predicción de adulteración y composición química (humedad, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) de las muestras de validación: res-proteína de soya texturizada con PLS2.




real (%) Contenido


Mahalanobis a Error

residual b

RES-PROTEÍNA DE SOYA TEXTURIZADA (PLS2) Adulterante 12 12.33 Humedad 62.4 62.39 Proteínas 19.1 19.12 Grasas 16.1 16.07 Cenizas 1.07 1.08

12%


0.6263 0.8977


58%


0.4514 0.668

Adulterante 64 64.12 Humedad 66.4 66.39 Proteínas 18 18.05 Grasas 7.49 7.47 Cenizas 1.52 1.52

64%


0.4757 0.699


78%


0.4367 0.3088


86%


0.4241 0.3263


La validación confirmó que los modelos quimiométricos desarrollados arrojaron buenos resultados

de predicción, pues los porcentajes predichos del adulterante y de los parámetros químicos (calculados por quimiometría) son muy similares a los porcentajes reales de los mismos, así

mismo, la Distancia de Mahalanobis son en todos los casos menores a 1 y los Errores Residuales menores a 3 (Cuadros 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 y 4.9), por tanto, todos los modelos

41

desarrollados pueden aplicarse a sistemas reales de adulteración para predecir adulteraciones y la

composición química en muestras que estén adulteradas con estos adulterantes, con la confianza

de que reflejarán predicciones precisas y confiables.

Con los resultados obtenidos se demuestra que con la técnica de espectroscopia y quimiometría se

obtienen valores similares a los alcanzados con los análisis tradicionales (Cuadros 4.5, 4.6, 4.7, 4.8

y 4.9), pero de manera más económica, rápida (las mediciones se pueden llevar acabo en 1-2

minutos), sin disolventes ni pretratamiento de las muestras a diferencia de los métodos

tradicionales que son laboriosos, costosos, consumen tiempo, necesitan cantidades considerables

de reactivos y disolventes además de considerarse ambientalmente dañinas.

Varios estudios han empleado espectroscopia FTIR y quimiometría para predecir algunos

parámetros químicos, por ejemplo Paradkar e Irudayaraj (2002b) determinaron el contenido de

colesterol en productos lácteos y los resultados los compararon con los obtenidos por métodos

convencionales logrando valores semejantes. De igual manera, se ha empleado para cuantificar el

contenido de sacáridos (fructosa, glucosa, sacarosa y maltosa) y los resultados fueron similares a

los obtenidos por HPLC (Tewari e Irudayaraj, 2004). Por otro lado, Yi-Lwern et al., (2007) realizaron

un protocolo semejante para caracterizar ginseng y sus productos por medio de análisis

tradicionales y espectroscopia con quimiometría, concluyendo que esta última proporciona una

identificación rápida de productos naturales evitando la extracción tediosa y procedimientos de

purificación que se realizan con los métodos tradicionales. Así mismo la técnica se ha empleado

para determinar el contenido de sacarosa en bagazo de caña de azúcar obteniendo valores

similares a los adquiridos por HPLC (Tewari y Malik, 2007). Finalmente se ha empleado en

muestras de queso para predecir atributos de elasticidad, cohesión, adhesividad, dureza y fusión,

arrojando excelentes resultados en los parámetros mencionados (Fagan et al., 2007).

En lo que respecta a estudios relacionados con carne y sus productos, Yang e Irudayaraj (2001)

emplearon la técnica de espectroscopia y quimiometría para determinar el contenido de proteína y

grasa en carne molida de cerdo, salchicha, jamón y pavo. Así mismo, Elvingson y Sjaunja (1992)

utilizaron espectroscopia FTIR para medir el contenido de proteína, grasa y materia seca en

pescado. Villé et al., (1992) determinaron grasa intramuscular en cerdo por el método de Soxhlet y

los compararon con los resultados obtenidos por espectroscopia FTIR. Finalmente Villé et al.,

(1995) emplearon el mismo método de extracción (Soxhlet) para determinar el contenido de

fosfolípidos y grasa intramuscular en carne de res, posteriormente los resultados los compararon

con los obtenidos por espectroscopia FTIR y quimiometría. En todas las investigaciones antes

citadas, los autores concluyen que la técnica de espectroscopia FTIR junto con quimiometría es

confiable y precisa para predecir parámetros de composición química pero de manera más rápida,

económica y fácil, demostrando de esta manera, la habilidad predictiva y exactitud de la técnica.

42

Aunado a esto, es curioso que cuando una técnica como la espectroscopia FTIR, se compara con

un análisis químico tradicional, este último se describe como un “método directo” mientras que la

técnica de espectroscopia se considera “indirecto”. En realidad, la espectroscopia “indirecta” es la

que responde directamente a las interacciones con las estructuras moleculares de la muestra. Por

ejemplo, los enlaces de los péptidos en las proteínas están directamente representadas en el

espectro, mientras que el análisis “directo” de Kjeldahl involucra mediciones del nitrógeno total, que

requiere varios pasos de reacción y la aplicación de un factor de conversión para llegar a medir el

porcentaje de proteína (Scotter, 1997).

Así, queda demostrado que la espectroscopia FTIR es rápida, no destructiva, capaz de analizar

simultáneamente más de un compuesto (agua, proteínas, grasas, cenizas y carbohidratos) con la

confianza de que se obtendrán valores similares a los alcanzados con los métodos tradicionales

pero de manera más rápida y sin manipulación física o química de las muestras en comparación

con los métodos químicos como la extracción con solventes para determinar grasa (Soxhlet) y la

técnica Kjeldahl para determinar proteína que requieren de preparar la muestra además de

consumir mucho tiempo.

META 10 Desarrollo del modelo SIMCA

4.4. Desarrollo del modelo SIMCA (Soft Independent Modeling Class Analogy). Con ayuda del programa AssureID se construyó la base de datos para generar el modelo SIMCA,

mismo que se realizó con quince espectros FTIR-HATR de cada material no adulterado (carne de

res molida, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res y proteína de soya texturizada) y con 36

espectros FTIR-HATR de cada sistema de adulteración. A continuación se describen los resultados

alcanzados.

4.4.1 Modelo SIMCA optimizado. El modelo SIMCA se optimizó variando los parámetros de: intervalo espectral y filtro de ruido

ambiental, de esta manera, las condiciones del modelo SIMCA optimizado fueron: suavizado de 13

puntos, aplicación de un filtro para eliminar el ruido causado por el CO2 y H2O ambientales,

eliminación de ruido electrónico, selección del intervalo espectral de 1800-900 cm-1 (huella digital)

ya que en esta zona se obtuvo el mínimo ruido espectral además de encontrarse los principales

componentes químicos (agua, proteínas, grasas y carbohidratos) de las muestras analizadas.

43

La Figura 4.26 muestra la distribución espacial de las poblaciones analizadas. Aún cuando no se

logra apreciar de manera clara la separación de las clases debido a que existen poblaciones muy

cercanas, el modelo consigue separarlas en grupos bien definidos sin traslaparlas ni confundirlas,

por consiguiente el modelo SIMCA optimizado logró integrar a todos los estándares de las

muestras analizadas sin que se presentaran muestras extremas ni grupos traslapados, por tanto

este modelo optimizado es capaz de identificar el origen de las muestras.

Figura 4.26. Distribución espacial de las poblaciones obtenidas con el modelo SIMCA optimizado.

En el Cuadro 4.12 se muestran las distancias interclase de las poblaciones analizadas, se

observa que estas son más grandes que las obtenidas con el modelo anterior. Las poblaciones con

mayor distancia interclase (mayor separación) son pellejos y res-pellejos, mayor distancia indica

que las poblaciones no son similares y los grupos están más alejados del resto de las poblaciones.

Las clases con menor distancia son carne de res con carne de caballo (5.16) esto se debe a que

son muestras muy parecidas y a que los valores de su composición química son muy similares

entre ambos tipos de carne (Cuadro VII.1)

Cuadro 4.12. Distancias interclase de las poblaciones analizadas (carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos, soya texturizada, res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-soya texturizada) del modelo SIMCA optimizado.

Carne de res

Carne de caballo Hígado Riñón Pellejos Soya

texturizada Carne de res 1 5.16 9.5 4.69 233.4 12.8 Carne de caballo 1 7.47 14.1 133.2 18.6 Hígado 1 14.64 231.4 17.1 Riñón 1 231 21.1 Pellejos 1 36.1 Soya texturizada

1

Carne molida de res

Riñón

Carne de caballo

Hígado

Proteína de soya texturizada

Pellejos de res

44

Res-caballo Res-hígado Res-riñón Res-pellejos Res-soya Carne de res 12.16 34.55 22.61 164.1 28.85 Carne de caballo 7.16 13.8 8.87 150 18 Hígado 15.73 22.82 14.55 83.8 21 Riñón 61.6 247.8 56 431.02 151 Pellejos 824.8 724.1 825 312.7 854.8 Soya texturizada 16.1 21.8 16.3 95.6 6.89 Res-caballo 1 19 10.3 88.7 19.9 Res-hígado 1 14.5 161 35.1 Res-riñón 1 152 113 Res-pellejos 1 18 Res-soya

1

Nota: Mayor distancia interclase indica mejor separación de clases y se obtiene un mejor modelo

El Cuadro 4.13 presenta el porcentaje de reconocimiento y rechazo interclase e intraclase, a

diferencia del modelo generado anteriormente se observa que para las once clases, el modelo

mostró el 100% de reconocimiento de entre los estándares. Así mismo, el modelo presentó el

100% de rechazo con respecto a las otras clases, lo que indica que las muestras no se traslapan

por lo que el modelo logró separar las poblaciones en grupos bien definidos. Por tanto este modelo

SIMCA es capaz de identificar muestras de acuerdo a su origen.

Cuadro 4.13. Índices de reconocimiento y rechazo de las poblaciones analizadas (carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos, soya texturizada, res-carne de caballo, res-hígado, res-riñón, res-pellejos y res-soya texturizada) del modelo SIMCA optimizado.

% Reconocimiento % Rechazo Carne de res 100 (15/15) 100 (255/255) Carne de caballo 100 (15/15) 100 (255/255) Hígado 100 (15/15) 100 (255/255) Riñón 100 (15/15) 100 (255/255) Pellejos de res 100 (15/15) 100 (255/255) Soya texturizada 100 (15/15) 100 (255/255) Res-caballo 100 (36/36) 100 (234/234) Res-hígado 100 (36/36) 100 (234/234) Res-riñón 100 (36/36) 100 (234/234) Res-pellejos 100 (36/36) 100 (234/234) Res-soya texturizada 100 (36/36) 100 (234/234)

Nota: El óptimo porcentaje de reconocimiento y rechazo debe ser de 100%

En estudios similares a la presente investigación se ha puesto a prueba la funcionalidad del modelo

SIMCA, por ejemplo, se ha empleado para clasificar tes de acuerdo a su región de origen (Moreda-

45

Piñeiro et al., 2003), clasificar e identificar cultivares de fresa (Fragariaxananassa Duch.) de

acuerdo a su origen geográfico (Macías-Rodríguez et al., 2004), clasificar sidras con base al tipo de

fermentación (Arias et al., 2005), para cuantificar la adulteración del aceite de soya (Wang et al.,

2006) y para evaluar la calidad del aceite de oliva virgen (Sinelli, et al., 2007) por mencionar

algunos. Al igual que en la presente investigación, todos los estudios antes citados confirman que

el modelo SIMCA es una técnica precisa y confiable de clasificación y discriminación, capaz de

reconocer cuando un juego de muestras no pertenece a cualquiera de las categorías o clases

establecidas.

4.4.3. Validación del modelo SIMCA. Con el objetivo de comprobar el modelo generado, fue preciso su validación que se realizó con 55

muestras (cinco espectros de cada clase) que no pertenecían al modelo pero que eran parte de las

poblaciones estudiadas. Uno de los aspectos más importantes de las técnicas de reconocimiento

como el modelo SIMCA, es la validación de los modelos ya que mediante este proceso se

demuestra que el o los modelos generados son lo suficientemente buenos para realizar la

clasificación de muestras desconocidas (Berrueta et al., 2007).

El Cuadro 4.14 contiene la información de los resultados de validación. Se presentan los datos de:

muestra (son las once clases analizadas), material identificado (material identificado durante la

validación), resultado (indica si la muestra fue identificada, rechazada o no pertenece al modelo), distancia total (debe ser menor de 1 para que una muestra sea clasificada), distancia límite

(debe ser igual a 1. Indica que el espectro validado pertenece a la población especificada),

distancia del modelo (debe ser igual a 0, una distancia mayor que 0.00 indica que la muestra

queda fuera de la variación descrita por el modelo. Este valor es la diferencia de la distancia del

espectro validado con respecto a la distancia de los espectros del modelo y finalmente, distancia residual (debe ser menor a 3) una distancia residual grande indica que la muestra contiene una

fuente de variación que no se ha encontrado previamente.

Cuadro 4.14. Resultados de las muestras de validación del modelo SIMCA optimizado.

Muestra Material identificad Resultado a

Distancia total b

Distancia límite c

Distancia del modelo d

Distancia residual

Res Res Identificada 0.3157 1.0000 0.0000 0.6391 Res Res Identificada 0.3204 1.0000 0.0000 0.6486 Res Res Identificada 0.3157 1.0000 0.0000 0.6391 Res Res Identificada 0.3157 1.0000 0.0000 0.6391 Res Res Identificada 0.2986 1.0000 0.0000 0.6044

Caballo Caballo Identificada 0.4229 1.0000 0.0000 0.8560

46


Distancia total b

Distancia límite c


Distancia residual

Caballo Caballo Identificada 0.4205 1.0000 0.0000 0.8512 Caballo Caballo Identificada 0.6423 1.0000 0.0000 1.3004 Caballo Caballo Identificada 0.2989 1.0000 0.0000 0.6052 Caballo Caballo Identificada 0.3197 1.0000 0.0000 0.6472 Hígado Hígado Identificada 0.3187 1.0000 0.0000 0.6452 Hígado Hígado Identificada 0.3594 1.0000 0.0000 0.7276 Hígado Hígado Identificada 0.3594 1.0000 0.0000 0.7276 Hígado Hígado Identificada 0.3590 1.0000 0.0000 0.7268 Hígado Hígado Identificada 0.3461 1.0000 0.0000 0.7007 Riñón Riñón Identificada 0.0010 1.0000 0.0000 0.0020 Riñón Riñón Identificada 0.0830 1.0000 0.0000 0.1680 Riñón Riñón Identificada 0.3967 1.0000 0.0000 0.8032 Riñón Riñón Identificada 0.2601 1.0000 0.0000 0.5266 Riñón Riñón Identificada 0.4125 1.0000 0.0000 0.8352

Pellejos Pellejos Identificada 0.3007 1.0000 0.0000 0.6087 Pellejos Pellejos Identificada 0.2400 1.0000 0.0000 0.4859 Pellejos Pellejos Identificada 0.5248 1.0000 0.0000 1.0624 Pellejos Pellejos Identificada 0.2400 1.0000 0.0000 0.4859 Pellejos Pellejos Identificada 0.3007 1.0000 0.0000 0.6087

Soya Soya Identificada 0.4484 1.0000 0.0000 0.9078 Soya Soya Identificada 0.3303 1.0000 0.0000 0.6687 Soya Soya Identificada 0.3269 1.0000 0.0000 0.6618 Soya Soya Identificada 0.3265 1.0000 0.0000 0.6611 Soya Soya Identificada 0.3271 1.0000 0.0000 0.6622 Res-

caballo Res-

caballo Identificada 0.1894 1.0000 0.0000 0.8264

Res-caballo

Res-caballo Identificada 0.9876 1.0000 0.0000 0.5285

Res-caballo


Res-caballo


Res-caballo


Res-Hígado

Res-Hígado Identificada 0.6922 1.0000 0.0000 0.9472

Res-Hígado


Res-Hígado


Res-Hígado


Res-Hígado


Res-riñón Res-riñón Identificada 0.7888 1.0000 0.0000 1.0434 Res-riñón Res-riñón Identificada 0.7323 1.0000 0.0000 0.9678

47


Distancia total b

Distancia límite c


Distancia residual

Res-riñón Res-riñón Identificada 0.9271 1.0000 0.0000 1.0092 Res-riñón Res-riñón Identificada 0.9548 1.0000 0.0000 1.0001 Res-riñón Res-riñón Identificada 0.5382 1.0000 0.0000 0.9892

Res-pellejos

Res-pellejos Identificada 0.5846 1.0000 0.0000 0.8059

Res-pellejos


Res-pellejos


Res-pellejos


Res-pellejos


Res-soya Res-soya Identificada 0.7903 1.0000 0.0000 1.0617 Res-soya Res-soya Identificada 0.7616 1.0000 0.0000 1.0233 Res-soya Res-soya Identificada 0.6253 1.0000 0.0000 0.8400 Res-soya Res-soya Identificada 0.7459 1.0000 0.0000 1.0021 Res-soya Res-soya Identificada 0.9851 1.0000 0.0000 1.0092

a Resultado, indica si la muestra fue identificada o rechazada (no pertenece al modelo) b Distancia total, debe ser menor de 1 c Distancia límite, debe ser igual a 1 d Distancia del modelo, debe ser igual a 0 e Distancia residual, debe ser menor a 3 Las 55 muestras empleadas para validar el modelo SIMCA fueron reconocidas correctamente

(Cuadro VII.14). La validación confirmó que el modelo generado es útil y confiable para identificar

correctamente y separar en grupos las clases analizadas, pues en todos los casos, las distancias

totales son menores a 1 y las distancias residuales menores a 3.

Cabe señalar que a pesar de que los espectros de las muestras adulteradas pudieran ser

semejantes al de las muestras sin adulterar, todos los estándares fueron correctamente

clasificados por el modelo SIMCA ya que éste puede detectar variaciones mínimas en los

espectros de cualquier muestra analizada. De esta manera, el modelo SIMCA es capaz de

reconocer y distinguir diferentes estándares separándolos en grupos aún cuando se trate de

muestras cuya composición química sea similar.

En caso de que una muestra esté adulterada, el modelo SIMCA la clasificará dentro de alguna de

las poblaciones adulteradas y como alternativa se podrá analizar con el modelo quimiométrico

desarrollado con el programa QUANT+ para ese sistema de adulteración e identificar con cuánto

está adulterada y su composición química.

48

De esta manera, el potencial de los modelos quimiométricos queda demostrado en la presente

investigación pues el modelo SIMCA permite identificar y determinar con exactitud si la carne de

res está o no adulterada y al enlazarse al programa QUANT+ determinar porcentaje de

adulteración y composición proximal de la muestra.

5. IMPACTO

Los modelos quimiométricos desarrollados tienen gran utilidad pues simplifican el manejo de las

muestras para análisis. En la siguiente figura se muestra el diagrama de flujo para la utilización de

los modelos quimiométricos desarrollados en este trabajo.

Los modelos quimiométricos desarrollados probaron ser de gran utilidad en identificar si la

muestra está o no adulterada, con qué está adulterada y al aplicar el modelo quimiométrico

desarrollado con el programa QUANT+ correspondiente, se obtiene el porcentaje de

adulteración y su composición química en un tiempo aproximado de 3 minutos, sin la

necesidad de pretratar la muestra o el uso de reactivos ni disolventes, lo que demuestra el

enorme potencial de la quimiometría en situaciones reales

MUESTRA PROBLEMA DE CARNE

OBTENCIÓN DE ESPECTRO FTIR-HATR - Resolución de 4 cm-1

- Infrarrojo medio (4000-550 cm-1) - 64 barridos (scan)

ALIMENTACIÓN AL MODELO SIMCA

MUESTRA PROBLEMA ESTÁ ADULTERADA con alguno de los adulterantes utilizados en el

modelo

Espectro FTIR-HATR se alimenta al programa QUANT+ correspondiente al adulterante

identificado

MUESTRA RECHAZADA: Muestra problema es carne de otro tipo a los incluidos en el modelo

DISCRIMINACIÓN DE MUESTRAS

MUESTRA PROBLEMA ES: Carne de res, carne de caballo, hígado, riñón, pellejos de res o

proteína de soya texturizada

MODELO QUIMIOMÉTRICO QUANT+ predice: • Porcentaje del adulterante y • Composición química

49

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INFORME TECNICO FINAL DEL PROYECTO DE … · cromatografía de gases (Saeed et al., 1986),...

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