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Técnicas de Análisis en Biotecnología 2017

Materia de Especialización

CEBI_E1

HPLC de muestras proteicas,

Electroforesis SDS-PAGE,

tinciones y análisis de

resultados.

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Trabajo Práctico: Evaluación de productos proteicos solubles

El objetivo del presente Trabajo Práctico es llevar adelante un proceso de análisis de control de calidad de

muestras finales de proceso, analizando el perfil proteico de las muestras, describiendo pureza y

concentración específica de la proteína de interés.

Introducción:

El análisis cuantitativo de proteínas es un requisito fundamental y prioritario para el desarrollo

de muchos productos y procesos Biotecnológicos, alimenticios, ensayos clínicos y científicos de

calidad. Muchas veces, de dicha cuantificación dependen productos que pueden afectar

directamente a la población como ser “cuantificación de proteínas en una vacuna inyectable”, o

indirectamente en “cuantificaciones proteicas para investigación científica.

La determinación de Pureza por HPLC-UV es una técnica robusta que permite dar una idea de

contaminantes orgánicos en general, y es un método muy utilizado en los estudios de

homogeneidad en procesos de certificación Proteicos y control de calidad de productos terminados,

debido a la gran precisión de este tipo de ensayos. A diferencia del HPLC convencional, las proteínas

se procesan utilizando columnas de gran porosidad (tamaño 300 Angstroms), y se utiliza ácido

trifloro acético (TFA) tanto en la fase móvil acuosa como en la orgánica, el cual minimiza las

interacciones de tipo iónicas dentro de la columna. Alguno de los solventes orgánicos más

empleados para la técnica en fase reversa son Metanol, Acetonitrilo e iso-propanol (en orden de

fuerza de elución creciente) (1). Generalmente además se trabaja a temperaturas superiores a 40°C

dado que se comprobó que altas temperaturas ayudan a la elución de la proteína (2). La detección

de la proteína es realizada generalmente a longitudes de onda de 215 o 280 nm (2).

La proteína Albúmina Sérica Bovina (BSA), es una proteína extraída del suero bovino que es

ampliamente usada en muchos procedimientos de bioquímica como Western blot y ELISA. También

es usada como nutriente en cultivos celulares (3). Su peso molecular calculado a partir de su

secuencia amino-acídica es de 66,399 KDa (4). Su estructura cristalográfica puede observarse en la

figura 1; su punto iso-eléctrico se encuentra entre 4,7 y 5, mientras que su punto iso iónico se

encuentra entre 4.9 y 5,6 (5). La proteína se encuentra compuesta por 583 residuos aminoacídicos

(4).

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Figura 1: Estructura cristalográfica obtenida del Research Collaboratory for Structural

Bioinformatics Protein Data Bank.

La BSA es universalmente reconocida como el estándar proteico a partir de la cual se realizan

cuantificaciones proteicas relativas a la señal generada cuando se emplean métodos colorimétricos

tales como Lowry, Bradford y BCA(6).

La purificación de proteínas de plasma sanguíneo por precipitación en condiciones de pH, bajas

temperaturas y etanol, fue estudiada por Cohn et al. (7) quién observó que, a distintos pH, en

condiciones de bajas temperaturas y en presencia de distintas concentraciones de etanol,

precipitaban fracciones proteicas insolubles (tabla 1).

Fracción Fracción I Fracción II Fracción III Fracción IV Fracción V

Etanol (%) 8 25 18 40 40

pH 7,2 6,9 5,2 5,8 4,8

Temperatura (°C) -3 -5 -5 -5 -5

Fracción proteica 5,1 3 3 3 1

Tabla 1: Condiciones de precipitación en plasma sanguíneo. Adaptado de Cohn, 1946.

El proceso propuesto por Cohn (1946) fue mejorado (8),(9) y actualmente es ampliamente

utilizado para purificación de distintas fracciones proteicas a partir de plasma. Dentro de esas

fracciones, la Fracción V es la de mayor interés comercial y contiene entre sus principales

componentes BSA y alfa globulina (10).

Dicha fracción puede ser sometida a un proceso adicional de purificación mediante el uso de

resinas de intercambio iónico como la resina de afinidad Capto Blue (GE Healthcare Life

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Sciences)(11), para obtener BSA de alto grado de pureza, que se emplea actualmente como

suplemento en medios de cultivo de células de mamíferos.

Marco de trabajo: proceso y producto a desarrollar

Una industria biotecnológica se encuentra desarrollando un proceso productivo de BSA, a

partir de plasma Bovino, cuya utilidad será BSA de alta pureza para cultivos celulares.

El producto final será fraccionado en Sachets de 10 ml de Sc. 7% BSA, en buffer 0,02 M de

NaCl, pH 6,5-6,8, esterilizado por filtrado de poro 0,2µm y pureza >99%.

Para tal fin, el desarrollo del proceso consiste en dos etapas: la etapa 1, que consta de la

puesta a punto del proceso productivo partiendo de 10 ml de plasma Bovino (figura 2); y la etapa 2,

que consta del escalado final para obtener 200 envases de 10 ml de producto proteico BSA (figura

3).

Figura 2: Desarrollo del proceso productivo a baja escala.

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Figura 3: Escalado Final.

Especificaciones del producto final:

1- La muestra deberá alcanzar un alto grado de Pureza >99%.

2- La concentración del producto final deberá ser de 70mg/ml, concentración en la cual la proteína es

más estable en solución (12).

Actividades específicas del TP:

Usted se encuentra realizando tareas de control de calidad en una industria biotecnológica, el sector de

purificaciones genera una solicitud de análisis acompañada de las respectivas Muestras A0 y Muestra B1,

provenientes de la purificación de BSA en la etapa 1, desarrollo del proceso de purificación previo al

escalado (figura 2).

Las muestras recibidas son:

1. Muestra A0 (BSA purificado por el proceso de Cohn).

2. Muestra B1 (BSA purificada por cromatografía de Afinidad).

Nota: La matriz en al que se hallan las muestras es NaCl 0,02M pH 6,5-6,8.

Los análisis de las muestras solicitados son los siguientes:

1. Cuantificación del contenido de BSA en muestras A0 y B1 por HPLC y colección de fracciones.

1.1. Cuantificación

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1.2. Cálculo de parámetros del cromatograma

1.3. Cálculo de recuperación porcentual.

1.4. Cálculo del carry-over en la columna.

2. Cuantificación de Pureza proteica por HPLC.

3. Cuantificación de proteínas por Bradford

4. Determinación de Perfil proteico por Coomassie Blue de los picos de elución. Determinación de

Impurezas por Tinción Plata.

Consignas:

1) Cuantificación de BSA

1.1) Determinar la Concentración de BSA por HPLC de las muestras A0 y B1.

A) Para ello realizar una dilución 1/2 de la muestra A0 y 1/3 de la muestra B1 e inyectar por

simplificado en la columna 20 µl de la misma. Luego, hallar la concentración por

extrapolación en la curva (ver datos complementarios 1).

Nota: El ensayo se realizará por simplificado, debido a que cada corrida dura 33 minutos.

B) Deberán colectar 3 Picos de la corrida de HPLC:

1. Pico A0 BSA (Rt.: 7,9 min).

2. Pico A0 Imp (Rt.: 9,7 min)

3. Pico B1 BSA (Rt.: 7,9 min).

1.2. Parámetros de cromatograma:

Calcular los siguientes parámetros sobre los picos de BSA para las muestras A0 y B1 (Rt 7,9

min.):

- Asimetría.

- Platos teóricos.

- Altura del pico.

1.3. Recuperación:

A. Calcular el porcentaje de recuperación de la BSA en cada punto de la curva de calibración

utilizada (ver datos complementarios 2).

Recuperación % = (Área con Columna ∗

Área Sin Columna ∗∗) ∗ 100

*= Datos complementarios 1

**= Datos complementarios 2

1.4. Carry-Over:

Verificar la ausencia de carry over entre corridas superponiendo los cromatogramas Blanco,

Pico de BSA y Blanco, en caso de poder calcularlos, se calculan de la siguiente manera:

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Carry over = (Área Blanco 2 − Área blanco 1

Área de la muestra) ∗ 100

Nota: El carry over deberá ser como máximo el 1% del área de la muestra (o menor al LOQ). Y

la recuperación se espera que sea entre 80 y 120 %. ¿Por qué es importante tener un carry-

over bajo?

2) Pureza proteica por HPLC Las muestras A0 y B1 se analizaron para pureza proteica por triplicado. Para su cálculo, integrar

los cromatogramas y calcular la pureza proteica detectada utilizando la siguiente ecuación:

Pureza BSA = Área del pico BSA

Área total de los picos

3) Determinar la concentración de proteínas totales por Bradford.

4) Determinación de Perfil proteico por tinciones con Coomassie Blue y Plata de

las distintas fracciones colectadas. Para ello realizarán la siembra de geles de las fracciones colectadas, explorando por SDS-PAGE

Coomasie Blue Coloidal y Plata las distintas fracciones Colectadas. Se correrán dos geles que se

sembrarán en el siguiente orden:

Calle 1 Calle 2 Calle 3 Calle 4 Calle 5 Calle 6 Calle 7 Calle 8 Calle 9 Calle 10

Bco Bco MPM Mtra A PicoA BSA

PicoA 1.

Mtra B Pico B Bco Bco

15µl 15µl 5 µl 15 µl 15µl 15µl 15µl 15µl 15µl 15µl

Tabla 2: Orden de siembra en los geles de plata y Coomasie blue.

Posteriormente, se analizará el Perfil proteico de todas las muestras por SDS-PAGE utilizando

Tinción de Coomasie Coloidal y Plata.

Nota: Debido a la sensibilidad de la técnica los geles de Plata deberán sembrarse en diluciones

1/10.

Será necesario completar el informe en forma paralela a la realización del TP.

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Informe de resultados

Completar las siguientes tablas de resultados obtenidos para las distintas consignas:

1) Determinar la Concentración de BSA por HPLC de las muestras A0 y B1.

Datos del pico de BSA detectado:

Muestra A0 Muestra B1

Concentración de BSA

Asimetría

Platos Teóricos de la

columna

Alto del Pico

Determinaciones sobre los puntos de la curva de calibración de BSA.

Puntos de la curva

Columna Zorbax 300 A

S1 (2µg) S2 (4µg) S3 (8µg) S4 (12µg)

Recuperación %

Carry- Over.

Tabla 3: Resultados referidos a los picos de BSA.

2) Calcular la pureza de la muestra A0 y B1. (área del Pico de BSA/ área total de picos)

Muestra A0:

Pico Área % respecto de área total

Tabla 4: Picos detectados para la muestra A0.

Muestra B1:

Pico Área % respecto de área total

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Tabla 5: Picos detectados para la muestra B1.

Pureza de las muestras por tres procedimientos distintos:

En el caso de la determinación de la pureza proteica de una muestra, lo recomendable es determinar la

misma por más de un método posible. Completar la siguiente tabla utilizando las tres formas de calcular

pureza proteica que se mencionan a continuación:

1) Pureza proteica por HPLC.

2) Pureza proteica por SDS-PAGE y Densitometría.

3) Pureza proteica por Relación entre proteínas totales y resultados de Cuantificación de BSA por

HPLC según la siguiente ecuación:

Pureza proteica= Concentración de BSA/Concentración de proteínas totales.

Muestra 1)Pureza por HPLC 2)Pureza por

Densitometría

3)Pureza por

relación

Muestra A0

Muestra B1

Tabla 6: Determinación de Pureza Proteica de las muestras A0 Y B1.

3) Cuantificación de proteínas por Bradford

Muestra [prot]- Bradford (mg/ml)

Muestra A0

Muestra B1

Tabla 7: Determinación de proteínas totales de las muestras A0 Y B1.

4) Determinación de Perfil proteico por Coomassie Blue y Plata de las distintas fracciones colectadas.

Con los resultados obtenidos previamente completar el siguiente cuadro:

Volumen de Muestra

[proteína] - Bradford (mg/ml)

[BSA] - HPLC (mg/ml)

Pureza -HPLC

mg totales de BSA

Actividad específica

Factor de purificación

Muestra A 10 ml 1

Muestra B 8 ml

Tabla 8: Resultados de la analítica del proceso.

Mg totales de BSA: % Pureza BSA x concentración de proteínas (mg/ml) x Volumen recuperado (ml).

Actividad Específica: mg de BSA totales/mg de proteína total (concentración de proteínas (mg/ml) x Volumen recuperado (ml)).

Factor de purificación: Actividad Especifica inicial/actividad específica del primer paso.

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Preguntas Generales para discusión de los Resultados:

1) Teniendo en cuenta los resultados finales (en especial el factor de purificación):

1.1 ¿Considera usted necesaria la purificación por columna de afinidad? Teniendo en cuenta

que el paso de purificación por afinidad utilizó 0,5 ml de Resina sobre 1 ml de muestra A0.

1.2 ¿Cuánta resina esperaría comprar para obtener lotes de 200 sachets (según la figura 3)?.

1.3 En este caso ¿qué volumen de muestra A0 (BSA purificada por el proceso de Cohn)

requeriría para producir la muestra B1 como producto final?

1.4 El pico de BSA tiene una asimetría de alrededor de 2,47, lo que indica que quizás haya co-

elución de la proteína con otras formas proteicas. ¿Qué otras técnicas recomendaría para estudiar este

problema? (Sugerencia: podría ser de utilidad el material suplementario (13) y/o la co-relación entre esta

pregunta y el Punto 4 de las consignas de la Guía de trabajos prácticos).

2. Comparando los geles obtenidos por Plata y Coomasie: ¿podría usted afirmar que la muestra final

se encuentra completamente pura?

Discutir la validez de los resultados de Pureza proteica teniendo en cuenta las Publicaciones

(13), (14) y la tabla 2 del informe.

3. ¿Los resultados obtenidos para Cuantificación de proteínas totales, la pureza proteica detectada

y la cuantificación específica de BSA por HPLC en las muestras A0 y B1, son consistentes?

4. Analizando el Perfil proteico de todas las muestras por SDS-PAGE utilizando Tinción de Coomasie

Coloida l y Plata.

a. ¿Qué puede decir de los contaminantes referentes al último paso de Purificación en

referencia a ambas tinciones? Existen bandas diferenciales?

b. ¿Qué puede decir de la sensibilidad de cada una de estas técnicas?

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Bibliografía

(1) HPLC for peptides and proteins “Methods and protocols by Marie Isabel Aguilar” Methods in

molecular Biology vol 251.

(2) A universal, high recovery assay for protein quantitation through temperature

programmed liquid chromatography (TPLC). Dennis J. Ortona, Alan A. Doucetteb,∗ Journal of

Chromatography B, 921–922 (2013) 75– 80.

(3) Albumin and mammalian cell culture: implications for biotechnology applications. Geoffrey

L. Francis. Cytotechnology. 2010 Jan; 62(1): 1–16.

(4) http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=3V03.

(5) Andrea Salis, Mathias Boström et al 2011. Measurements and theoretical interpretation of

points of zero charge/Potential of BSA protein. Langmuir 2011, 27, 11597-11604.

(6) Liqing Wu, Bin Yang, Jiaming Bi, King Wang. Development of bovine serum albumin certified

reference material. Anal Bianal Chem (21/04/2011) 400:3443-3449.

(7) Cohn et Al. j. Amer chem. Soc., 68, 459-475 (1946).

(8) European Patent application 0143648 A 2. Macieod, Alexander James, 167, Mayfied road,

Edingburgh eh93ay (GB). Process of preparing Component of a cell groth medium.

(9) Alexander R. Neurath, Bermard Horowitz. Undenatured virus-free biologically active protein

derivativez 10 de sep. 1985. 7

(10) Edward Shanbrom. US4314997A. Purification of plasma protein products. 09 Feb. 1982.

(11) http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/ProductDisplay?categoryId=11419

&catalogId=10101&productId=22229&storeId=11789&langId=-1

(12) Standardization of Serum Protein Analyses, BERNARD KLEIN.

(13) Emilio Camafeira, Enrique Méndez 1998. Multiple Peaks in HPLC of proteins: Bovine Serum

Albumn Eluted in a Reversed-Phase System.

(14) Balázs Bobály et, al. Recovery of proteins Affected by Mobile Phase Trifluoroacetic Acid

Concentration in Reversed-Phase Chormatography.