Bioquímica experimental

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

• Los métodos espectrofotométricos principales son:

• UV 280

• Biuret

• Lowry

• Bradford

LEY DE LAMBERT-BEER

METODO UV

Las proteínas muestran un fuerte grado de absorción a 280nm en uv, principalmente por los residuos de triptofano y la tirosina.

Las concentraciones de estos aminoácidos en las proteínas es francamente constante se puede utilizar la absorbancia a 280nm para estimar la concentración de proteínas

VENTAJAS

•método rápido y relativamente sensible (varias veces más sensible que el método de Biuret)

•No existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer

•método no destructivo

•utilizado en detección post-columna de las proteínas

DESVENTAJAS

•Los ácidos nucléicos también absorben en la región de 280nm

•el contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente en varias proteínas.

•la solución debe ser clara e incolora. la turbidez puede producir resultados erráticos

•se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este método

MÉTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y sulfato de cobre (solución alcalina fuerte), el grupo amino de las proteínas reacciona con los iones del cobre del reactivo dando el color púrpura, la cantidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos, y por lo tanto a la cantidad de proteína.

METODO

1. 5 ml de reactivo de Biuret se mezcla con 1ml de solución proteica (1-10 mg de proteína/ml).

2. Después de reposo a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, se lee la absorbancia a 540nm contra un blanco con sólo reactivo.

3. Se debe elaborar una curva estándar de concentración vs absorbancia utilizando albúmina de suero de bovino (BSA) para comparación con la muestra bajo estudio

VENTAJAS:

Rápido (se puede completar en menos de 30 minutos) Es el método más simple de análisis de proteínas No es frecuente encontrar derivaciones de color Pocas substancias no proteicas interfieren con la reacción de Biuret No detecta N de fuentes no proteicas o no peptídicas

DESVENTAJAS:

No es muy sensible comparado con el método de Lowry Requiere de al menos 2 a 4 mg de proteína por prueba Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reacción Debe estandarizarse el color mediante cantidades de proteína conocidas

MÉTODO DE LOWRY

El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas.

A la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

1) Los iones Cu2+, forman complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.

2) Además, provocan el desdoblamiento de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.

3) Se reduce del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador.

4) El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

VENTAJAS

•muy sensible•menos afectado por la turbidez de la muestra•más específico que la mayoría de los otros métodos•relativamente simple•se puede completar en 1 a 1,5 horas

DESVENTAJAS

•El color varía con diferentes proteínas (más que el método de biuret)•El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas•La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción•Las altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfidrilo interfieren con la reaccion.

MÉTODO DE BRADFORD

El azúl brillante G-250 Coomassie se adhiere a la proteína, el colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante cambia de 465 a 595nm. El cambio en la absorbancia a 595nm es proporcional a la concentración de proteína en la muestra.

VENTAJAS

• método rápido (la reacción se puede completar en 2 minutos)• reproducible• sensible (mucho más que el método de Lowry)• no existe interferencia de cationes como K+, Na+, y Mg2+

DESVENTAJAS

•el complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo•el color varía con diferentes tipos de proteínas. •la proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado•interferencia con detergentes.

Método del BCA (acido bicinconínico)

Se basa en las mismas reacciones del ensayo de Lowry.

Las proteínas (en medio alcalino) reaccionan con Cu2+, estos se reducen por los aminoácidos aromáticos.

Sin embargo los iones Cu+ forman complejos con el acido bicinconínico. Este complejo absorbe a 562 nm.

Ventajas: es sencillo, rápido, muy sensible y muestra tolerancia a compuestos que afectan los otros métodos