Comparacin de bacterias cido lcticas productoras de Nisina y Pediocina en embutidos (salchicha)

NDICE

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 52. HIPTESIS.. 53. JUSTIFICACIN 64. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS.. 75. ANTECEDENTES. 86. MARCO TERICO. 106.1. BACTERIAS CIDO LCTICAS. 106.2. BACTERIOCINAS. 116.2.1. PROPIEDADES BIOQUMICAS DE LAS BACTERIOCINAS... 126.2.2. PRODUCCIN DE LAS BACTERIOCINAS 136.2.3. BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS CIDO LCTICAS 146.2.3.1. CLASIFICACIN DE LAS BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BAL..166.2.3.2. ESPECTRO DE INHIBICIN 186.2.3.3. MODO DE ACCIN 207. NISINA.. 218. PEDIOCINA... 229. APLICACIN DE BACTERIOCINAS EN ALIMENTOS. 2310. PROCUCTOS CRNICOS 24 11. EMBUTIDOS ESCALDADOS: SALCHICHAS... 2612. EVALUACIN SENSORIAL... 2713. MATERIALES Y METODOS.. 2813.1. ETAPA 1: AISLAMIENTO, PURIFICACIN, IDENTIFICACN Y CONCERVACIN DE CEPAS DE BACTERIAS CIDO LCTICAS. 2813.2. ETAPA 2: CONSERVACIN Y DETERMINACIN DE LA TERMORESISTENCIA DE LAS ESPECIES PRODUCTORAS DE PEDIOCINA Y NISINA. 29 13.3. ETAPA 3: INOCULACIN Y ANLISIS EN LA VIDA DE ANAQUEL DE LAS BACTERIAS TERMORESISTENTES. 3013.4. ETAPA 4: PRUEBA DE ACEPTACIN, DISEO EXPERIMENTAL Y ANLISIS ESTADSTICO DEL EFECTO DE LA INOCULACIN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE BACTERIOCINAS.. 3114. RESULTADOS. 32 15. CONCLUSIN... 3516. BIBLIOGRAFA.. 36 17. ANEXO A.. 41 18. CRONOGRAMA 42

NDICE DE TABLAS TABLA 1. EJEMPLO DE BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS CIDO LCTICAS.. 16 TABLA 2: MICROORGANISMOS NO LCTICOS Y LA RESPECTIVA BACTERIOCINA DE BACTERIAS CIDO LCTICAS QUE LO INHIBE.. 19TABLA 3: PRUEBA DE ACEPTACIN DE LAS SALCHICHAS INOCULADAS CON LAS BAL TERMORESISTENTES COMPARADAS CON UN CONTROL SIN INOCULAR.. 33

NDICE DE FIGURAS FIGURA 1. FERMENTACIN LCTICA: A) HOMOFERMENTATIVA; B) HETEROFERMENTATIVA. 10FIGURA 2. MECANISMO DE ACCIN DE LA NISINA EN DOS ETAPAS. 20FIGURA 3. ESTRUCTURA QUMICA DE LA NISINA 21FIGURA 4. PASOS PARA EL AISLAMIENTO DE L. lactis Y P. acidilactici. 28FIGURA 5. TINCIN GRAM Y MORFOLGICA MICROSCOPICA DE LA BACTERIAS a) L.lactis Y b) P. acidilactici 29FIGURA 6. POBLACIN MICROBIOLGICA DE LAS MUESTRAS INOCULADAS CON L. lactis PARA ENTEROBACTERIAS EN LAS MUESTRAS CONTROL 34

Comparacin de bacterias cido lcticas productoras de nisina y pediocina en embutidos (salchicha).

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Diariamente la industria crnica se enfrenta a diferentes situaciones relativas a la aparicin de peligros y/o riesgos para la salud de los consumidores. Muchos de estos peligros se dan cuando la conservacin de estos mismos no es la adecuada, o cuando los peligros microbiolgicos estn latentes, producindose el deterioro de los productos en poco tiempo. Este problema es causa de elevadas prdidas econmicas en las industrias por lo que, en la actualidad, se estn aumentando los esfuerzos para minimizar o reducir los costes derivad30 kDa) y termolbiles. Las bacteriocinas ms conocidas de esta clase son helveticina J, acidofilicina A, lactacinas A y B y la caseicina 80. Todas ellas producidas por cepas de Lactobacillus spp (Martnez Fernndez, 1996). Clase IV: Bacteriocinas complejas. Son pptidos con una parte proteica y una o ms fracciones lipdicas o glucdicas necesarias para su actividad biolgica. Por tanto, esta clase incluye bacteriocinas que se consideran como glicoprotenas (lactocina S) o como lipoprotenas (mesenterocina 52). Clase V: Bacteriocinas de estructura circular y no modificadas postraduccionalmente. A esta clase pertenecen la enterocina AS-48 y la gasericina A.

6.2.3.2. ESPECTRO DE INHIBICINEl espectro de inhibicin muestra que tipo de microorganismos son sensibles a ser inhibidos por las bacteriocinas. El espectro de inhibicin es reducido para las bacterias cido lcticas, generalmente es sobre microorganismos relacionados taxonmicamente, de forma que presentan actividad bactericida solamente frente a cepas sensibles. La susceptibilidad de las bacterias Gram negativas a las bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas es mucho ms limitada y hasta hace poco no se conocan bacteriocinas producidas por bacterias lcticas de origen alimentario activas naturalmente frente a bacterias Gram negativas (Vzquez et al., 2009), pero recientemente se han encontrado algunas cepas como el L. curvatus y el L. casei que inhiben el crecimiento de cepas patgenas de E. coli y Salmonella enerica sin necesidad de tratamiento previo y se han desarrollado tambin bacteriocinas que inhiben bacterias Gram negativas a partir de los gneros Lactobacillus, Streptococcus y Staphylococcus (Rodriguez Pea & Torres Lozano, 2006).El espectro de inhibicin de las bacteriocinas o sus extractos puede verse afectado segn el tratamiento al que son sometidos, como liofilizacin, concentracin del sobrenadante, purificacin y neutralizacin, entre otros. En el caso particular de los extractos de bacteriocinas, la actividad es mayor cuando son concentrados, pero es necesario tener en cuenta la termoresistencia para evitar la alteracin de la funcionalidad de la bacteriocina. Adems, la accin combinada de dos o ms bacteriocinas puede reforzar considerablemente la accin inhibitoria (Lpez et al., 2008).

Tabla 2. Microorganismos no lcticos y la respectiva bacteriocina de bacterias cido lcticas que lo inhibe.

6.2.3.3. MODO DE ACCINEl modo de accin de las bacteriocinas est determinado por la composicin de la membrana citoplasmtica, la estructura y la expresin de una protena en funcin de la inmunidad, adems de la composicin qumica del medio ambiente (Monroy et al., 2009).La formacin de poros en la membrana citoplsmica de clulas sensibles es un mecanismo de accin comn, presentado por las bacteriocinas producidas por bacterias lcticas (Gonzlez et al., 2003). En este proceso las bacteriocinas actan destruyendo la integridad de la membrana citoplasmtica del microorganismos sensible a travs de la formacin de poros, lo que provoca la salida de compuestos pequeos, prdida de iones K, ATP o la alteracin de la fuerza motriz de protones (fuente de energa celular) necesaria para la produccin de energa y sntesis de protenas o cidos nucleicos (Gonzlez et al., 2003). La prdida de estas sustancias origina a su vez una prdida potencial de membrana, consumo de las reservas energticas celulares, descenso en la sntesis de ADN, ARN y protenas originando finalmente la inhibicin o muerte celular (Vzquez et al., 2009).

Figura 2. Modelo sobre el mecanismo de accin de la nisina.

En la figura 2 se observa un modelo que muestra el mecanismo de accin dual de la nisina. En la etapa 1 la nisina posee una carga neta positiva que incrementa su interaccin con las cargas negativas de los componentes de la pared celular. Posteriormente en la etapa 2, la nisina se une al lpido II, principal transportador de las subunidades de peptidoglucano del citoplasma a la pared celular interfiriendo con su sntesis, lo que lleva a la bacteria a muerte celular. Finalmente en la etapa 3, adicionalmente, varias molculas de nisina utilizan al lpido II para anclarse e insertarse en la membrana celular y comenzar con la formacin de los poros, lo que lleva a la bacteria a una rpida muerte celular.

7. NISINADesde su descubrimiento (Rogers, 1928) y sus primeras aplicaciones como agente inhibidor del desarrollo de microorganismos alterantes en la fabricacin de quesos (Hirsch et al., 1951), la nisina ha sido objeto de continuos y extensos estudios, tanto moleculares como tecnolgicos, y se ha convertido en el lantibitico por excelencia. Adems, a pesar de los numerosos ensayos que ponen de manifiesto el potencial biotecnolgico de otras bacteriocinas, la nisina es la nica admitida como conservante (aditivo) de grado alimentario y se produce a escala industrial para su comercializacin.La produccin de nisina es un fenotipo muy extendido dentro de la especie L. lactis. Se han aislado lactococos productores de nisina de ambientes muy variados como leche y productos lcteos, vegetales fermentados, productos crnicos con orgenes geogrficos muy diversos y leche humana (Martnez et al., 1995; Rodrguez et al., 1995a; Olasupo et al., 1999; Ayad et al., 2002; Beasley et al., 2004). Se ha estimado que aproximadamente un tercio de los lactococos bacteriocinognicos aislados producen nisina, lo que se puede considerar como un claro reflejo de la ventaja selectiva que les confiere.

Figura 3. Estructura qumica de la nisina.La estabilidad, solubilidad y actividad biolgica de la nisina depende del pH. La nisina es ms soluble y estable a pH cidos por lo que su aplicacin como conservante se ve favorecida en alimentos cidos o fermentados. A pH 2 la solubilidad es de 56 mg/ml mientras que a pH 7 disminuye a 1 mg/ml. La estructura relativamente sencilla de la nisina le confiere una alta resistencia al tratamiento trmico. La nisina soporta el autoclavado (121 C, 15 min.) a pH 2. Del mismo modo que ocurre con la solubilidad, la termorresistencia disminuye al aumentar el pH.La nisina ejerce un efecto bactericida sobre un amplio rango de microorganismos Gram positivos entre los que se incluyen bacterias lcticas (Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc), patgenos (Listeria, Staphylococcus) y formadores de endoesporas (Bacillus, Clostridium). Los microorganismos Gram negativos son sensibles siempre que se destruya la membrana externa que acta como escudo protector. La nisina inhibe tambin la germinacin de las esporas. Este efecto parece ser, en principio, diferente a la inhibicin de las clulas vegetativas ya que en mutantes con la sustitucin Dha5Ala pierden su actividad biolgica frente a las esporas pero no as sobre las clulas vegetativas (Chan et al., 1996).

8. PEDIOCINALas primeras referencias de la pediocina PA-1 se remontan a los aos 80 cuando el grupo de Gonzlez y Kunka en 1987 la aislaron de una cepa de origen crnico: P. acidilactici PAC1.0 (PA-1).La pediocina es la bacteriocina mas caracterizada despus de la nisina, es una bacteriocina producida por cepas de las especies Pediococcus acidilactici de origen crnico, Pediococcus parvulus de origen vegetal y una cepa de L. plantarum aislada de queso. La pediocina PA- 1 es un pptido de 44 aminocidos que no se modifican postraducionalmente. Tiene carga neta positiva a pH 6,0 y pH bsico entre 8,6 y 10. La secuencia primaria conocida es suficiente para inducir un efecto txico en las clulas sensibles (Dez Aldama, 2011). La pediocina es activa frente a un gran nmero de bacterias Gram positivas relacionadas, tales como algunas especies de los gneros Lactococcus, Lactobacillus y Enterococcus. Tambin posee actividad frente a otras bacterias Gram positivas ms lejanas filogenticamente, entre las que se encuentran las responsables de algunas toxinfecciones alimentarias como el Bacillus, la Brochotrix, la Listeria y el Staphylococus. Con respecto a las bacterias Gram negativas, sus cubiertas celulares impiden el acceso de las bacteriocinas a la membrana plasmtica. Sin embargo, tal como ocurre con la Nisina, es suficiente alterar la permeabilidad de sus membranas externas para permitir la accin antimicrobiana de las bacteriocinas (Dez Aldama, 2011).Es utilizada como conservador en productos vegetales y crnicos y por su elevada actividad contra especies de Listeria tiene un alto potencial para ser utilizada como conservante en alimentos lcteos (Gonzlez et al., 2003). La pediocina PA-1 aadida al agua que se emplea para higienizar hortalizas crudas (repollo, coliflor, entre otras) como alternativa al tratamiento con hipoclorito o junto con las clulas lisadas productoras de la bacteriocina en carne de pollo cruda sometida a radiacin. Esta comercializada bajo el nombre de Alta 2341 y consiste en un fermentado de un cultivo iniciadorde P. acidilactici productor de pediocina, recomendado especialmente para productos crnicos y lcteos (Dez Aldama, 2011).

9. APLICACIN DE BACTERIOCINAS EN ALIMENTOSLa biopreservacin puede ser aplicada en alimentos y especficamente en crnicos por mtodos bsicos (Hugas M., 1998; Chen H. y Hower D., 2003), en los que se aplica bacteriocinas o sus bacterias productoras. 1. Aadiendo un cultivo puro BAL viables productoras de bacteriocina. De esta manera ofrece una forma directa de incorporar bacteriocinas en el alimento, dependiendo su xito de la habilidad del cultivo para crecer y producir bacteriocina en el alimento bajo condiciones ambientales y tecnolgicas (temperatura, pH, aditivos, entre otros). En el caso de la carne, (que es un alimento que no puede ser sometido a pasterizacin antes de la adicin de las cepas iniciadoras), los cultivos biopreservadores o fermentadores deben ser capaces de competir con la microflora natural, no debe tener impacto en las propiedades fisicoqumicas y organolpticas del alimento, no debe producir gas ni exopolisacaridos para evitar el inflamiento en el empaque debido a la acumulacin de gases y la formacin de viscosidades en las superficies de la carne (Castellano P., et al, 2000).

2. Aadiendo preparaciones de bacteriocina cruda (extracto crudo), licor fermentado o concentrados obtenidos por el crecimiento de BAL productoras de bacteriocina en sustrato complejo. Este mtodo evita el uso de compuestos purificados que pueden tener regulacin legal y ahorra costos en la purificacin de cada compuesto.

3. Adicionando sustancias antagnicas puras o semipuras como las bacteriocinas producidas por BAL. Al usar este mtodo la dosis de bacteriocina es ms precisa y por ende ms predecible. Sin embargo la aplicacin se limita de acuerdo a la regulacin de cada pais concerniente a aditivos en alimentos (Hugas M., 1998).La primera metodologa podra denominarse mtodo in situ de biopreservacin (por inoculacin del sistema alimenticio con la cepa productora de bacteriocina en condiciones que favorezcan su produccin); mientras las dos ltimas seran metodologas ex situ (donde la bacteriocina es producida por fuera del alimento en condiciones controladas y luego aplicada al alimento). En el caso de usar sustancias antagnicas puras o semipuras, es necesario utilizar tcnicas de precipitacin de la protena adaptadas a las condiciones de cada laboratorio, debe inicialmente estandarizarse la produccin y precipitacin de la bacteriocina, hasta garantizar su reproducibilidad antes de la aplicacin en alimentos para asegurar una cantidad adecuada con suficiente poder inhibitorio.

La aplicacin de bacteriocinas depende de las variables tecnolgicas a las que sean sometidas los cultivos, en los casos ex situ, la produccin de bacteriocina puede llegar a ser una metodologa ms costosa ya que no solo requiere de las cepas iniciadoras (microorganismos completamente aislados), sino de medios de cultivo y equipos para el desarrollo de las cepas y para la produccin de la bacteriocina. Adicionalmente se debe garantizar la actividad de cada extracto o de la bacteriocina e incluso puede llegar a ser necesario determinar la concentracin mnima inhibitoria contra patgenos. La utilizacin de estos sistemas de biopreservacin requiere en cualquier caso estudios preliminares para determinar el comportamiento de las bacterias en el medio de cultivo en que se desarrolla (curvas de crecimiento), y la estandarizacin de las tcnicas para lograr producirlas en cantidades suficientes.Glvez y colaboradores (Galvez A. et al, 2007) mencionan que la aplicacin de cultivos productores de bacteriocinas, ofrece varias ventajas por ser una produccin in situ comparada a la produccin ex situ, concerniente al aspecto legal y de costos. Disminuir los costos en los procesos biopreservativos puede ser altamente atractivo, especialmente para economas pequeas y pases en desarrollo, donde la seguridad alimenticia puede estar altamente comprometida.

10. PRODUCTOS CRNICOSEl conocimiento de un material crnico como materia prima, tanto desde el punto de vista de su funcionalidad, la de sus componentes y de la manera como stos interactan con los dems materiales que hacen parte de una formulacin determinada, lleva a la calidad industrial, la cual est ntimamente ligada a la funcionalidad, y puede definirse como aquellas caractersticas de la carne que la habilitan para ser usada industrialmente como materia prima en la elaboracin de productos crnicos (Goll et al., 1977).La calidad de los productos elaborados, depender de la correcta utilizacin y de la calidad de las materias primas. Las materias primas ms importantes son:

La carne: es el tejido muscular de los animales. Para elegir la carne debe tomarse en cuenta su color y su estado (que no haya descomposicin); la carne debe provenir de animales sanos, y tratados higinicamente durante su matanza. La carne de puerco es la que ms se usa para estos fines, aunque se puede utilizar todo tipo de animal. La grasa de los animales contiene grasa orgnica y grasa de tejidos.

La grasa orgnica: como la del rin, vsceras y corazn, es una grasa blanda que normalmente se funde para la obtencin de manteca. La grasa de los tejidos, como es una grasa resistente al corte y se destina a la elaboracin de los productos crnicos.

Sales curantes: ellos constituyen un ingrediente primordial en el proceso de conservacin de las carnes. Se dividen en dos:

Nitritos y nitratos: ayudan al curado de las carnes, mejoran el poder de conservacin, el aroma, el color, el sabor y la consistencia. Adems sirven para obtener un mayor rendimiento en peso, porque tienen una capacidad fijadora de agua. Lo ms importante, es que protege a las carnes del Botulismo, una de las peores formas de envenenamiento que conoce el hombre. Se usan en cantidades muy pequeas para no afectar al producto.

Sal comn: prolonga el poder de conservacin, mejora el sabor de la carne, aumenta el poder de fijacin de agua y favorece la penetracin de otras sustancias curantes.

Especias y condimentos: son sustancias aromticas de origen vegetal que se agregan a los productos crnicos para conferirles sabores y olores peculiares.

Segn el mtodo, el sabor de la carne, el modo de presentacin, el grado de salazn, curacin, desecacin y ahumado, los productos crnicos se clasifican en:

Embutidos crudos: chorizos y longanizas. Embutidos escaldados: salchichas. Embutidos cocidos: queso de puerco y morcilla o rellena. Carnes curadas: jamn, tocino y chuleta. .

Los diferentes productos son simplemente carne de cerdo, res, ternera, pollo, pavo o conejo, junto con grasa de cerdo, sazonada con sal, cebolla, ajos, chiles y otros condimentos, todo eso metido en una tripa de cerdo o simplemente procesado.

La carne tiene un nmero de propiedades intrnsecas las cuales hacen que el uso de bacteriocinas sea ms problemtico que en alimentos lquidos. En particular es difcil alcanzar una distribucin homognea, puede haber problemas de solubilidad, las bacteriocinas pueden separar la fase grasa, o simplemente ligarse a las protenas crnicas (Hill, 1999). Para alimentos crnicos, las bacteriocinas pueden llegar a sustituir el uso de nitritos, sin embargo es necesario determinar la bacteriocina adecuada que no requiera de una elevada concentracin de aplicacin (Rojas & Vargas, 2008). Se han realizado estudios con nisina con el objetivo de reducir el nivel de nitritos en carnes, los resultados muestran que se requieren altos niveles de nisina para alcanzar un buen control de Clostridium botulinum debido a la unin de la nisina con partculas crnicas, distribucin no homognea, pobre solubilidad en sistemas crnicos o a la posible interferencia en la actividad de fosfolpidos crnicos (Abee, 2005).

Luckansky et al. (1992) inocularon una cepa productora de pediocina y otra no productora de pediocina en pasta de salchicha tipo vienesa la cual fue subsecuentemente inoculada con 4 cepas de Listeria monocytogenes. El nmero de listerias permanecieron altos (105/g) en las vienesas que contenan la cepa no productora de pediocina, mientras que en la que contena la cepa productora de pediocina el nmero de listerias descendi a menos de 102/g. Adems, la pediocina producida sobrevivi al proceso de coccin al final de la fermentacin y fue detectable a lo largo de los 60 das de almacenamiento a 4C. Estos mismos investigadores desarrollaron una forma de gelatina de pediocina, producida por una bacteria cido lctica, que protege a los embutidos de la contaminacin con Listeria (Hill, 1999).

11. EMBUTIDOS ESCALDADOS: SALCHICHA

Se conoce con el nombre genrico de embutido a los productos crnicos que se han producido mezclando las carnes con otros ingredientes, tales como agua, grasa, sal, especias y aditivos, y donde la mezcla ha sido introducido en fundas, tripas o tubulares, que pueden ser naturales o artificiales, mediante el uso de una embutidora.

Los productos escaldados son sometidos a un proceso de escaldado que equivale a una pasterizacin, es decir, llevando el ncleo del producto hasta una temperatura de 68 a 72 grados Centgrados.

Existe una variedad de productos escaldados, un ejemplo de ello es la salchicha, uno de los productos con mayor demanda en el mercado. La salchicha es un producto crnico cuya elaboracin pasa por varias etapas: desde el picado de los ingredientes hasta la obtencin de una masa a la cual se aade agua o hielo y aditivos (como los fosfatos y nitritos para favorecer la fijacin del agua y dar estabilidad a la masa), hasta ser embutido en tripa natural o sinttica (como el celofn). Su composicin vara de marca a marca: mientras unas contienen carne de cerdo, otras llevan res, pavo, pollo o alguna mezcla de stos. Con respecto a sus ingredientes, el principal es el agua (que vara del 46% al 70% entre las diferentes marcas del mercado), adems de la carne y los aditivos, a los que pueden adicionarse otros ingredientes como protena no crnica (soya o protena de leche), almidones y grasas (casi siempre de cerdo). Pero la incorporacin de estos ingredientes se hace a costa del contenido de carne, con lo cual se abarata el producto. Las salchichas aportan protenas y grasas; dependiendo de la marca, estos contenidos tienen variaciones que van del 7% al 19%, y del 5% al 36%, respectivamente. El tipo de grasa tambin vara, ya que las salchichas elaboradas a base de pavo tienen menos grasas saturadas (las que aumentan los niveles de colesterol en sangre) que las elaboradas a base de res o cerdo. Es conveniente sealar que existen salchichas de pavo adicionadas de grasa de cerdo, con lo que aumentan el contenido de grasas saturadas.

Los avances en la elaboracin de salchicha, constituyen ahora uno de los rubros ms dinmicos en la industria crnica y es de complejidad si se tiene en cuenta que en la actualidad se elaboran ms de 1500 tipos de salchichas para el mercado mundial (Llamas, 2007).

12. EVALUACIN SENSORIAL

La Evaluacin Sensorial es una disciplina desarrollada desde hace algunos aos; naci durante la segunda guerra mundial, ante la necesidad de establecer las razones que hacan que las tropas rechazaran en gran volumen las raciones de campaa. El hecho apareca inslito e inesperado: las dietas estaban perfectamente balanceadas y cumplan los requerimientos nutritivos de los usuarios; pero stos las rechazaban.Luego de reunir abundante informacin a travs de entrevistas y encuestas, y analizar cuidadosamente la situacin, se concluy que la causa del rechazo era el deterioro en mayor o menor grado de algunos o todos los parmetros de calidad organolptica de los alimentos que conformaban la dieta.Se postularon diferentes hiptesis con el fin de determinar las causas que producan el deterioro, sealndose que ste podra provenir de la materia prima, o del proceso de elaboracin, o del envasado, o del almacenamiento. Una herramienta muy valiosa para investigar estas causas ha sido la Evaluacin Sensorial.La Evaluacin Sensorial trabaja en base a paneles de degustadores, denominados jueces, que hacen uso de sus sentidos como herramienta de trabajo. Los jueces se seleccionan y entrenan con el fin de lograr la mxima veracidad, sensibilidad y reproducibilidad en los juicios que emitan, ya que de ello depende en gran medida el xito y confiabilidad de los resultados. Mediante un entrenamiento adecuado es posible obtener el mismo grado de seguridad que en un mtodo instrumental, teniendo la ventaja que la sensibilidad del test sensorial es mayor, esto es, los sentidos son capaces de pesquisar concentraciones menores. As por ejemplo, cuando los mtodos instrumentales se aplican a anlisis de trazas, en que se alcanza el lmite de deteccin del mtodo, cuando en el anlisis cromatogrfico ya no aparecen ms "peaks", es posible la mayora de las veces percibir claramente "algo" en el sabor y aroma. Se evidencia lo que Jellinek llama el "detector biolgico". (Jellinek, 1973).Los mtodos de Evaluacin Sensorial tienen tambin limitaciones puesto que se trabaja con paneles de laboratorio, formados por seres humanos, sujetos tambin a ciertas limitaciones que han sido descritas en estudios biolgicos. Los jueces estn sujetos a variaciones en las respuestas debido a un gran nmero de factores, que al ser conocidos pueden evitarse o minimizarse. Adems los resultados se expresan en trminos relativos y no en trminos absolutos. Para llegar a resultados vlidos se requiere de mucho tiempo y material. De ah la importancia de contar con un panel bien entrenado que entregue resultados confiables y reproducibles.La realidad demuestra que la Evaluacin Sensorial proporciona informacin integral de la calidad, junto con proporcionar una informacin de las expectativas de aceptabilidad por parte del consumidor.

13. MATERIALES Y MTODOS La presente investigacin se llev acabo en el laboratorio del departamento de microbiologa del instituto tecnolgico de Tuxtla Gutirrez, ubicado en la carretera panamericana Km. 1080, en la ciudad de Tuxtla Gutirrez, Chiapas.

13.1. ETAPA 1. Aislamiento, purificacin, identificacin y conservacin de cepas de bacterias lcticas. Obtencin de cepas de bacterias lcticas Se seleccionaron cepas de bacterias lcticas, Lactococcus lactis y Pediococcus acidilactici de la Coleccin Mexicana de Cultivos Microbianos del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del I.P.N. (CINVESTAV), Mxico, D.F. Aislamiento El aislamiento de L. lactis y P. acidilactici se realiz en placas con 20 mililitro de agar MRS con un pH de 4.5, inoculando colonias seleccionadas por el mtodo de estra abierta cruzada, para la obtencin de colonias aisladas (Ver figura 4).

Figura 4.- pasos para el aislamiento de L. lactis y P.acidilactici

Las placas inoculadas llevaron a incubacin se realiz a una temperatura de 37C, por un tiempo de 24 horas. Purificacin e identificacin microscpica y morfolgica De cada cepa aislada se tomaron tres colonias aisladas, cada colonia se inocul por estra abierta cruzada en caja Petri conteniendo agar MRS con un pH de 4.5, de tal manera que se obtendran cepas puras. Seguido de su incubacin en anaerobiosis, se realiz la identificacin microscpica (por triplicado) por el mtodo de Tincin Gram. Observando en un microscopio ptico su morfologa y clasificacin (Ver figura 5).

a) b)Figura 5.- Tincin de gram y morfologa microscpica de las bacterias a) L. lactis y b) L. acidilactici

13.2. ETAPA 2. Conservacin y determinacin de la termoresistencia de las especies productoras de pediocina y nisina

Conservacin de bacterias lcticas Las cepas ya purificadas e identificadas como Lactococcus y Pediococcus, se cultivaron 15 ml de caldo MRS a pH de 4.5, inoculados con una colonia individual de cada cepa, incubados a 37C por 24 horas. Se conservaron por congelacin a una temperatura de -22C en tubos eppendorf conteniendo 500l de conservador (composicin: leche descremada 10% y glicerol 10%) y 500l de cultivo. Determinacin de termorresistencia La termorresistencia de cada cepa fue determinada adaptando la metodologa de Anderson et al. (1991) y Ptaja (1991). Se colocaron 10 mL de cada cepa resuspendida en tubos con tapa verticalmente posicionados en baos de agua a diferentes temperaturas (50, 60 y 70 C), y se mantuvieron para cada temperatura durante 30, 45 y 60 min. Despus del tratamiento trmico, 1 mL de caldo de cada tubo calentado a las diferentes temperaturas y tiempos fue sembrado en cajas petri con agar con medio MRS e incubados a 352 C durante 24 horas, reportando el nmero de colonias supervivientes. Las cepas con un crecimiento abundante (>300 UFC/mL) fueron consideradas como termorresistentes.

Preparacin de las cepas resuspendidas Se realiz una cintica para observar el comportamiento de las cepas termorresistentes, cultivando una pequea cantidad en caldo MRS, con una agitacin de 120 rpm, la evaluacin del crecimiento se realiz mediante densidad ptica (D.O.) a una = 620 nm y siembra en placa. Una vez obtenido los datos de la evaluacin de crecimiento, se realiz de igual forma el procedimiento anterior pero esta vez solo hasta obtener 1x10-2 UFC/g, porque es una cantidad menor de microorganismos mesofilos aerobios (1x10-6 UFC/g) permitidos por la NORMA Oficial Mexicana NOM-122-SSA1-1994 (Secretaria de salud, 1994).

13.3. ETAPA 3: Inoculacin y anlisis en la vida de anaquel de las bacterias termo resistentes

Elaboracin e inoculacin salchichas Se utiliz una formulacin tpica para salchicha tipo Viena (Guerrero et al., 2002), con ciertas modificaciones. La formulacin bsica consisti en carne de res (39%), carne de cerdo (19%), lardo o grasa dorsal de cerdo (15%), sal, mezcla de fosfatos comerciales Hamine (McCormickPESA, Ciudad de Mxico) y sal pura (6,5% p/p de nitrato de sodio). La carne de res y cerdo fueron adquiridas en carniceras locales; se limpi tejido conectivo visible y grasa, moliendo con un cedazo de 0.42 cm en un molino para carne. La carne molida, sal, fosfatos y la mitad de hielo fueron mezclados en una cutter de 5 L Hobart modelo 84145 (Hobart Corp., Troy, Ohio) durante 2-3 minutos hasta la completa incorporacin de los ingredientes. Se aadi entonces el lardo congelado y el resto de hielo, incorporando todos los ingredientes por 5 minutos ms, cuidando que la temperatura del batido permaneciera entre 122 C. Se aadieron la cepas termorresistentes resuspendidas (5% v/p), se dej en reposo 15 min y despus de este tiempo se embuti manualmente en tripas de celulosa de 20 mm de dimetro y se cocinaron a 70 C durante 20 min.Las salchichas fueron enfriadas, empacadas al vaco y almacenadas a 42 C durante 12 das. Se elaboraron dos lotes de 1 kg, para la cepa termorresistente y un control sin inocular.

Anlisis en la vida de anaquelSe tomaron muestras a los 0, 3, 6, 9 y 12 das de tres salchichas tomadas al azar de cada lote de produccin; salchichas sin inocular para el control y salchichas inoculadas con nuestras bacterias lacticas, para llevar a cabo recuentos de enterobacterias en agar de eosina y azul de metileno (Murthy, 1984) y de bacterias lcticas en agar MRS (De Man et al., 1960) con la tcnica de UFC, las placas se incubaron a 37C por 24 horas y los resultados se leyeron como UFC totales por fraccin de tiempo, de cada prueba.

13.4. ETAPA 4: Prueba de aceptacin, diseo experimental y anlisis estadstico del efecto de la inoculacin de bacterias productoras de bacteriocinas.

Anlisis sensorial Para determinar el efecto de la inoculacin de BAL sobre las salchichas, se llev a cabo una prueba de aceptacin con un panel no entrenado. La prueba de aceptacin se llev a cabo a los 1 y 12 das de almacenamiento. Un total de 25 jueces reclutados entre personal acadmico y alumnos evaluaron cada una de las salchichas elaboradas con las 2 cepas termorresistentes, comparndolas contra un control sin inocular. En una sesin previa, se definieron a los jueces los atributos a evaluar: color, sabor, textura y aceptacin general. Cada cepa fue evaluada en una sesin diferente. Cada muestra y el control (2 g de cada una) se presentaron codificadas a temperatura ambiente, evaluando los cuatro atributos en la misma sesin, utilizando una escala no estructurada (10 cm de largo), con la calificacin ms baja del lado izquierdo y la ms alta del lado derecho (Pedrero y Pangborn, 1989). Se midi la distancia marcada como la calificacin correspondiente para cada atributo (Ver evaluacin sensorial en el Anexo A).

Diseo experimental y anlisis estadstico Se utiliz un diseo completamente al azar en la distribucin de las muestras entre los diferentes tratamientos para la prueba de aceptacin, determinando el efecto de la inoculacin de las cepas de bacterias lcticas termorresistentes sobre los atributos de las salchichas mediante un anlisis de varianza en el paquete estadstico SAS versin 8,0 (SAS Institute, Cary, North Carolina). La diferencia entre medias se determin mediante la prueba de Duncan en el mismo paquete estadstico (P < 0,05)

14. RESULTADOSTermorresistencia de las cepas seleccionadas De las cepas seleccionadas, solo una de ellas present una supervivencia adecuada a los tratamientos trmicos. L. lactis tuvo conteos mayores a 300 UFC despus de ser sometidas a 50, 60 y 70 C durante 30, 45 y 60 min. Segn W. Dos Santos (1993) la especie Pediococcus sp. no sobrevivi al tratamiento trmico a 45C durante 30min, ni a mayores temperaturas y/o tiempos ya que las temperaturas mesfilas les son favorablesOtra diferencia importante es la velocidad de calentamiento aplicada hasta alcanzar la mxima temperatura en los baos de agua. En los baos de agua las temperaturas fueron menores pero el tiempo de exposicin fue mayor (de 15 a 60 min). El tiempo que permanecieron las bacterias en los baos de agua a la temperatura mxima de 70 C permiti a las BAL algn tipo de adaptacin al calor aplicado. Esta adaptacin se vio reflejada en la supervivencia de las BAL en los batidos crnicos antes y durante el cocimiento. Milbourne (1983) report que las BAL tienen una mejor sobrevivencia en productos crnicos debido a la accin protectora de los ingredientes del producto.

Prueba de AceptacinLa Tabla 3 presenta los resultados de la prueba de aceptacin llevada a cabo a las muestras inoculadas con las cepas termorresistente y el control sin inocular, la evaluacin sensorial se realiz con un universo de 25 jueces reclutados entre personal acadmico y estudiantes. Al segundo da, los valores ms altos para color, sabor, suavidad y apariencia general, comparados con la muestra control, fueron atribuidos a las muestras inoculadas con L. lactis, con calificacin significativamente (P < 0.05) ms alta.A los 12 das de almacenamiento, los atributos evaluados presentaron cierto detrimento en comparacin con las notas evaluadas en el segundo da. El color y la apariencia general fueron mejor aceptados por parte de los catadores en la muestras control. El color disminuy en aceptacin para las salchichas inoculadas con L. lactis. De manera interesante, el atributo de sabor tuvo las calificaciones ms altas al da 2 y al da 12 del inoculo L. lactis, por lo que la inoculacin de estas BAL no alter el sabor detectado al transcurrir el tiempo de almacenamiento.

Tabla 3. Prueba de aceptacin de las salchichas inoculadas con las BAL termoresistentes comparadas con un control sin inocular. Medias con la misma letra en la misma fila no son significativamente diferentes (P < 0,05).ControlL. Lactis

Da 2

Color 4.71 5.24

Sabor 3.08 4.46

Suavidad 5.05 6.02

Apariencia general4.51 5.28

Da 12

Color4.99 4.50

Sabor 2.96 3.42

Suavidad2.09 2.20

Apariencia general4.74 4.55

La suavidad de las muestras disminuyo considerablemente en las salchichas inoculadas con L. lactis pasando del da 2 con una aceptacin de 6.02 1.0 al da 12 con 2.20 1.1.Garriga et al. (1998a) reportaron que al inocular BAL en productos cocidos en general los atributos mejoraron por la adicin del inculo, excepto por un sabor cido que no fue aceptado por los jueces. Sin embargo, y con excepcin del sabor, los valores asignados a las muestras inoculadas no cayeron en el extremo de inaceptabilidad.Estos resultados concuerdan con los de Bredholt et al. (1999), que encontraron que los productos crnicos cocidos inoculados con bacterias lcticas pueden presentar propiedades sensoriales aceptables, adems de que se reduce el crecimiento de L. monocytogenes y Escherichia coli (Fries et al. 2000).Anlisis microbiolgicosLa poblacin microbiolgica en las salchichas, tanto para enterobacterias como para BAL, presentaron una tendencia similar aun en las muestras inoculadas con las BAL termorresistentes. La poblacin de BAL se increment respecto al tiempo de almacenamiento, mientras que los conteos de enterobacterias tambin presentaron cierta tendencia a aumentar con respecto al tiempo de almacenamiento, mantenindose por abajo del conteo de BAL.

Figura 6.- Poblacion microbiolgica de las muestras inoculadas con L. lactis para enterobacterias en las muestras control () e inoculadas () y bacterias acido lcticas en las muestras control () e inoculadas ()

La Figura 6 muestra el comportamiento de los anlisis microbiolgicos realizados para las muestras inoculadas con L. lactis. La poblacin de enterobacterias se increment durante el almacenamiento tanto en el control como en las muestras inoculadas. La poblacin de estos patgenos fue ligeramente mayor para las muestras sin inocular que en las inoculadas despus del da 4 de almacenamiento. Los conteos de BAL tuvieron un comportamiento similar, es decir, la poblacin de estos microorganismos se increment durante el almacenamiento.

15. CONCLUSIONComo conclusin, podemos decir que la produccin de bacteriocinas puede ser una excelente opcin para utilizarlas como conservadores, ya que al ser protenas son asimiladas por nuestro organismo y aparentemente no causan ningn efecto secundario.Las bacterias productoras de nisina en comparacin con las de pedocina, tuvieron una mejor respuesta en la determinacin de termorresistencia debido a que las bacterias productoras de pediocina no resisten las altas temperaturas de la elaboracin de las salchichas cocidas. La termorresistencia de algunas cepas de bacterias lcticas es importante, ya que estas pueden ser utilizadas como cultivos inhibidores de microorganismos patgenos.La inoculacin de bacterias L. lactis pueden ser una alternativa viable para mejorar la vida de anaquel de la salchicha, de acuerdo a los resultados no modific las caractersticas sensoriales de las salchicha. Las bacteriocinas o sus bacterias productoras ofrecen buenas oportunidades para la conservacin de productos crnicos, adicionadas de forma individual o empleadas junto con otras barreras o tratamientos por lo que constituye un campo interesante de investigacin para el desarrollo de productos ms seguros, enriquecidos en sabor de forma ms natural, o con propiedades funcionales.

16. BIBLIOGRAFA Tecnologa y Alimentos. (2008). Recuperado el 22 de Junio de 2013, de http://tecnoyalimentos.wordpress.com/2008/06/05/bacteriocinas/Secretaria de salud (1994) recuperado el 10 de mayo de 2015 de: http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/122ssa14.htmlAbee, T. (2005). Bacteriocins: modes of action and potencials in food preservation and control of food poisoning. International Journal of Food Microbiology.Agudelo N. (2013). Tesis de licenciatura. Estado del arte de la obtencin de bacteriocinas a partir de bacterias acido lcticas y su aplicacin en la industria de alimentos. Medelln, Colombia: Universidad Pontificia Bolivariana.Amezquita A, Brashears MM (2002) Competitive inhibition of Listeria monocytogenes in ready-to-eat meat products by lactic acid bacteria. J Food Prot 65:316-325.Alquicira Paez, L. (2006). Tesis de maestria. Determinacin del mecanismo de resistencia a la accin inhibitoria de la bacteriocina producida por Pediococcus parvulus MXVK 133. 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17. ANEXO A

18. CRONOGRAMAActividadSemana

12345678910111213

Obtencin de cepas de bacterias lcticas

Aislamiento

Purificacin e identificacin microscpica y morfolgica

Conservacin de bacterias lcticas

Determinacin de termo resistencia

Preparacin de la suspensin de cepas termo resistentes

Elaboracin e inoculacin de salchichas

Anlisis en la vida de anaquel

Anlisis sensorial

Diseo experimental y anlisis estadstico

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