Ciclo de replicación€¢ Virus en terapia génica y su aplicación a la medicina humana y...
Transcript of Ciclo de replicación€¢ Virus en terapia génica y su aplicación a la medicina humana y...
• ¿Quéesunvirus?• ¿Eltamañoeslaprincipalcaracterís>caquedefineunvirus?
• ¿Porquéunvirusesunparasitointracelularobligado?
• ¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?• ¿Losvirussonmicroorganismovivos?• ¿Queotrasaplicaciones>enenlosvirus?
¿Quéesunvirus?
Descubrimientodelosvirus:TMVMaye r , I v a no f s k y , yBeijerinck (1886-1903):organismosmás pequeñosque bacterias -agentesdefinidosporeltamañodeporo de los filtros deChamberland- que nopueden v e r s e e n e lmicroscopio de campoclaro,ypuedenmul>plicarsolamente en células vivasotejidos plantadetabaco
enfermatrituradodehojasenfermas
filtracióndelextractodehojas
filtradodehojasenfermasplantasana
plantaenferma
¿Quéesunvirus?Definición
“Virusesareen>>eswhosegenomesareelementsofnucleicacidthatreplicateinsidelivingcellsusingthecellularsynthe>cmachineryandcausingthesynthesisofspecializedelementsthatcantransfertheviralgenometoothercells.”S.E.Luria,J.E.Darnell,D.Bal>more,andA.Campbell(1978)
EstructuracristalográficadeTMVTMVestáformadoporunacedenadeRNAenvueltaporunacubiertaproteicacompuestapor2130copiasdeunaproteínadeenvolturapequeña.
microgreaselectrónicasdeTMV
cristalesdeTMV
Losprimerosvirusanimales
• 1898-LoeffleryFroschaislaronelvirusdeahosa
• 1901-WalterReeddescubrióelvirusdelafiebreamarillayconfirmólahipótesisdeCarlosJuanFinlayacercadelatransmisiónatravésdemosquitosvectores
• 1911–PeytonRousdescubrióquelosviruspuedencausarcancer
Caracterizacióndeparlculasviralesmediantemicroscopíaelectrónica
bacteriófagoT4noenvueltocomplejo
virusdelmosaicodeltabacohelicoidalnoenvuelto
virusdelaestoma>>svesicularenvuelto
rotavirusicosaédriconoenvuelto
Virusconsimetríaicosahédrica
(A)Losvirusicosahédricosmássimplescon>enen3subunidadesporcarayentotal60subunidadesdecápside.(B)Lascápsidesicosahédricasseensamblanapar>rdepentámerosdesubunidadesindividualesqueformanlosvér>cesdelicosahedro.(CyD)Enicosahedrosmásgrandes,cadaunadelascarastriangularessedivideentriangúlosmáspequeños.Lassubunidadesenlosvér>cesestánorganizadasenpentámeros,ylasdemássubunidadesestánorganizadasenhexámeros(hexones).(E)Lasinteraccionesentresubunidadesenpentámerosyhexonesadyacentessonequivalentes(porejemplo,lasinteraccionescabeza-cabezasonmuysimilaresentodalacápside,independientementedequeocurranentrepentámerosyhexonesoentrehexonesyhexones).
Diámetrode750nm≠viruscomo“agentesfiltrables”GenomadeDNAde1.2millonesdebasesquecodificapara979proteínas- aminoaciltRNAsintetasas,
reparacióndelDNAyhomólogosdegenescelularesquenoseencuentranenotrosgenomasvirales
- proteínassinsimilitudconproteínasdeotrosgenomas
UngrupodegenesencomúnentreMimivirusyMegavirus(otrovirusgiganteevolu>vamentedistante)sugierequeambosvirusprovienendeunancestrocelularcomúnyevolucionaronperdiendogenes
¿Porquéunvirusesunparasitointracelularobligado?
Elcicloviralocurreendosetapas:1. etapaextracelular=virión2. etapademul>plicaciónenuncélula
infectada=genomaviral
Lacaracterís>caquedefinealosvirusesquedependendenestrictamentedeunhospedadorvivoparareplicar
virus célulainfectadauniónyentrada
traducción
replicacion
ensamblado
salida
¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?
Lapandemiadeinfluenzaen1918provocómásmuertesquela1ªGuerraMundialLahistorianaturaldelaviruela>enemásde2000añosysedeclaróerradicadaen1977ElHIVinfectómásde70millonesdepersonasdesdeelcomienzodelaepidemiaysees>maque~0,8%delapoblaciónadulta(15-49años)viveconHIV
¿Todoslosvirusenfermanasuhospedador?
Losvirusestánentodaspartes!• Losvirussonlasen>dadesmásabundantesenlabiosfera
– LabiomasadevirusqueinfectanbacteriasennuestroplanetaesmilvecesmásgrandequeladetodosloselefantesenlaTierra
– Losviruscomprendenel94%delasparlculasquecon>enenácidosnucleicosenlosocéanosyson15vecesmásabundantesqueBacteriayArchaea
– Elnúmerodecélulasenunapersonapromedio(~1013células)es10vecesmáschicoqueelnúmerodebacteriasy100vecesmáschicoqueelnúmerodeparlculasdevirus
• Losvirusinfectantodoslosseresvivosincluyendoinsectos,plantas,bacteriasyhastaotrosvirus
ElvirusSputnikinfectalasfábricasviralesysecuestralamaquinariademimivirusenelcitoplasmadelasamebasinfectadasparareplicar.Lascélulasco-infectadasconSputnikproducenmenosmimivirusyparlculasdefec>vasquehacenqueelvirusseamenosinfec>vo.
mamavirusvirussatéliteSputnik
¿Porquéenfermamos?
Concentracióndeparlculasviralesinfec>vasInteracciónconcélulassuscep.blesypermisivasenelsi>odeinvasiónEfectodelamul>plicaciónviralenlacélulahospedadoraRespuestaan>viralypropagacióndelvirus
¿Losvirussonmicroorganismovivos?
life.noun1c:anorganismicstatecharacterizedbycapacityformetabolism,growth,reac>ontos>muli,andreproduc>on"Life."Merriam-Webster.com.Merriam-Webster,n.d.Web“Losvirussonen>dadesestrictamenteintracelularesypotencialmentepatógenasconunafaseinfecciosa,y(1)poseenunsolo>podeácidonucleico,(2)semul>plicanenlaformadesumaterialgené>co,(3)nosoncapacesdecrecerydividirseporfisiónbinaria,(4)noposeensistemasquegeneranenergía.”Lwoff(1957)
¿Queotrasaplicaciones>enenlosvirus?
• Virusenestudiosdebiologíacelularymolecular• Virusenterapiagénicaysuaplicaciónalamedicinahumanayveterinaria
(terapiadelcáncer).• Terapiaconbacteriofagosparacontroldebacteriaspatogénicas• Nanotecnología(paraintroducirpequeñassecuenciasgenómicas
modificadasalgenomadelacélulahospedadora)• Viruscomoarmasbiológicasobioterrorismo• Virusenagricultura(modificacionesgenomicasmediantevectoresvirales
ylaobtenciondeplantasyanimalestransgénicosmásproduc>vos).• VirusosubunidadescomoVacunas• Vacunasosubunidadescomovacunasparaprevenirelcáncer(virusde
hepa>>sBypapillomavirusparaprevenirelcancerdehigadoydecuellouterino,respec>vamente).
• Viruscomocontrolbiológicodepestesenlaagricultura
TaxonomíaLaclasificacióndelosvirusempleacuatrocaracterís>cas:1.elácidonucleicoenlaparlculaviral(DNAoRNA)2.simetríadelacubiertaproteica(cápside)3.presenciaoausenciademembranalipídica(envoltura)4.dimensionesdelaparlculaylacápside
LaclasificacióndelosvirusreconoceSIETEórdenes1. Caudovirales:bacteriófagosdedsDNA(3familias)2. Herpesvirales:virusgrandesdeeucariotasdedsDNA(3familias)3. Ligamenvirales:virusdearqueasdedsDNAlineal(2familias)4. Mononegavirales:virusdeplantasyanimalesdessRNAnosegmentadoyde
polaridadnega>va(5familias)5. Nidovirales:virusdevertebradosdessRNAdepolaridadpositva(4familias)6. Picornavirales:viruspequeñosdeplantas,insectosyanimalesdessRNAde
polaridadposi>va(5familias)7. Tymovirales:virusdeplantasdessRNAmonopar>to(4familias)
82familiasnoasignadasaningúnorden:Arenaviridae,Baculoviridae,Flaviviridae,Mimiviridae,Poxviridae,Retroviridae
Taxonomía
MorfologíayevolucióndelosvirionesUnconjuntocomúndeformassimplesdanlugaraunamul>tuddeestructurascomplejas• Losdiseñoscompar>dospor
losvirusqueinfectanlostresdominioscelularessonsimples
• Formasavanzadasderivandeversionesmássimples
• Lasformasfilamentosasseex>endenhaciaBacteriayArchaea
• Formasesféricasseex>endenhaciaBacteriayEukarya
• Launidaddeformasesféricasydecabeza-colaestántambiénapoyadasporsimilitudesestructurales
Nasiretal.(2015)Ann.N.Y.Acad.Sci.1341:61-74
ElsistemadeBal>more• Losvirusseagrupanporel>podegenoma• TodoslosvirusconvergenenlasíntesisdeunmRNAqueesdecodificadoporlamaquinaria
delhuésped
Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed
Relacionesentreel>poderepliconviralyelrangodehuésped
LosvirusdeRNAestánausentesenarqueaysonrarosenbacteriasLosvertebradoshospedannumerososvirusdeRNAyretrovirusLosvirusdedsDNAsonrarosenplantasylosvirusdedsDNAsonabundantesenhongosLosretrovirusestánintegradosenelgenomadeeucariotasmul>celularesyestáncompletamenteausentesenlosgenomasmicrobianosNohayviruscapacesdecruzarlasbarrerasentredominiosNasir et al. (2014) Frontiers Microbiology 5: 194
CiclodereplicaciónLareplicaciónviralpuededescribirseenelcontextodetrespropiedadesfundamentales:1. Todoslosgenomasviralesestánempaquetadosen
parlculasquemedianlatransmisiónentrehospedadores2. Elgenomacon>enelainformaciónparainiciary
completaruncicloinfec>voenunacélulasuscepKbleypermisiva.Elcicloinfec>voincluyeadsorciónyentrada,decodificacióndelainformacióndelgenoma,replicacióndelgenoma,yensambladoyliberacióndelaprogenieviral
3. Lainfecciónviraldeunhospedadorseestablecedemanerataldeasegurarlapropagaciónenlapoblación
Elgenoma+ssRNAdepicornavirus
virusnoenvueltoesféricode30nmlacápsideicosaédricarodeaelgenomadeRNA
ssRNA(+)7,1-8,9kbunúnicoORFcodificaunapoliproteínaextremo5´unidoalaproteínaviralVPgIRESycoladepoli(A)
Elgenoma+ssRNAdeflavivirus
virusenvueltoesféricode~50nmproteínasdeenvolturaenunarregloconsimetría>poicosaédrica
ssRNA(+)10-11kbunúnicoORFcodificaunapoliproteínaqueesprocesadoporproteasascelularesyvirales5’capy3’estrucutrado
Replicacióndepicornavirusyflavivirus
Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed
ElgenomadeRNAesinfec>voysirvedemRNAparalatraduccióndelasproteínasviralesydemoldeparalasíntesisdeRNAan>genómico
Elgenoma-ssRNAdeorthomixovirusvirusenvueltoesféricode80-120nmdediámetroHAyNAformanespículasinsertadasenlamembranaM2,M1yNEP8segmentosdessRNA(-)asociadosaNPyalcomplejodelatranscriptasaviral
8segmentosdessRNA(-)deentre890y2340ntcodificanpara11proteínas- splicingalterna.vodelos
mRNAsdeMPyNS- leakyscanningdelmRNAde
PB1
Elgenoma–ssRNAdefilovirusvirusenvueltofilamentosode970nmdelargoGPyproteínadematriznucleocápsidecilíndricapolimerasaLunidaalgenomadessRNA(-)
ssRNA(-)de18-19kbcodificapara7proteínasRdRpviral- transcribecadaunodelosgenes- cappingypoliadenilacióndemRNA
Retrovirusvirusenvueltoesféricode80-100nm
doscopiasdessRNA(+)asociadasalaRTviral
proteínasestructuralesyenzimas
ssRNA(+)de9,75kbconcapypoli(A)provirus- DNAintegrado- moldeparalatranscripciónde
mRNAgenómico- splicingincompletoy
completo
ElgenomadsDNAcirculardepapillomavirus
viruspequeño,noenvuelto,icosaédricode60nmcápsideydsDNAasociadoahistonascelulares
dsDNAcircularde8kbproteínastempranas(noestrucutralesregulatorias,E1-E7)ytardías(estrucutrales,L1yL2)seexpresanmediantesplicingalterna>vo
Hospedadoresparaelcul>vodevirus
animalesdelaboratorio
huevosembrionados
célulasencul>volineasycul>vosprimarios
Animalesdelaboratorio
• Huéspednaturaloanimalesdelaboratoriocomoconejos,ratones,ratasyhamsters
• Lainfecciónexperimentaldeanimalesdelaboratorioesesencialparaestudiarlapatogénesisdelasinfeccionesvirales
Huevosembrionados
• Enelhuevoembrionadounavariedaddetejidosdiferenciadospuedeservirdesustratosparaelcrecimientodeviruscomoorthomyxovirus,paramyxovirus,rhabdovirus,togavirus,herpesvirus,ypoxvirus
• Eselmétodomáscomunmenteu>lizadoparacrecerelvirusinfluenzaenellaboratorioyparalaproduccióndevacunas
InfeccióndelíneascelularesEfectocitopá>co• cambiosmorfológicosinducidos
porlainfecciónquesereconocenenelmicroscopioóp>co:sincicios,placasdelisis,etc.
• cuerposdeinclusión
Hemadsorción• adsorciónespecíficadeglóbulosrojos
acélulasinfectadas>medidaindirectadelasínteisdeproteínasvirales
A549
noinf virussarampión
BSC4
0
noinf vaccinia
Fieldsvirology/Knipe,Howley.–6thed
notodoslosviruscrecenenlíneascelulares…
Elcrecimientodepapillomavirusencul>vorequieredelacoplamientodelaregulacióndelaexpresióndegenesviralesconelestadodediferenciacióndelacélulablanco,queestáasociadoalaarquitectura3Ddelaepidermisquesepierdeencélulasencul>vo.Lareplicacióndelplásmidoocurreencélulasdelepitelioescamosobasal.Enquera>nocitosdiferenciados(dondenohaysíntesisdeDNAcelular)hayreplicaciónvegeta>vaysíntesisdeDNAviralconproducciónac>vadeviriones.
Moody(2010)NatureReviewsCancer
notodoslosviruscrecenenlíneascelulares…
• ElcrecimientodeHCVencul>vosedesarrollóapar>rdeldescubrimientodeunacepaaltamenteinfec>va(JFH-1)
• ElgenomadelacepaJFH-1oquimerasdelasgenesnoestructuralesdeJFH-1ygenesestructuralesdeotrosgenomasreplicaneficientementeencélulasHuh-7yproducenprogenieviralinfecciosatantoencélualsencul>vocomoenmodelosanimales
Ensayoscuan>ta>vos
cuan>ficacióndelnúmerototaldeparlculasvirales
hemaglu>nación,recuentodeparlculasporEM,medicionesdeDO,métodosinmunológicos
EnsayosNsicos
medicióndelainfec>vidad
diluciónlímite,ensayosdeformacióndeplacas,formacióndefocos
Ensayosbiológicos
Ensayodeformacióndeplacas• Sebasaenlacapacidadde
unaparlculaviralindividualdepropagarlainfeccióndelacélulainfectadainicialmentealascélulasvecinasformandounáreadeefectocitopá>covisiblemacroscópicamenteenunamonocapadecélulas
• Elnúmerodeunidadesinfecciosasenunpocilloesdirectamenteproporcionalaladilucióndelvirus
Eficienciadeplaqueo
Larelaciónentreparlculasyunidadesformadorasdeplacas(UFP)esaltaparalamayoríadelosvirusanimales- presenciadeparlculasno
infec>vas(genomasconmutacionesletalesodañadosdurantelapreparacióndelstock)
- notodoslosvirusenunstocklograncompletarunciclodereplicación
Hemaglu>naciónDetectalasíntesisdeproteínasviralesencélulasinfectadasmediantelaadsorcióndeeritrocitosasusuperficieSevisualizacomoáreasquese>ñendecolorrojoluegodelaexposicióndecélulasinfectadasapreparacionesdeeritrocitosDeteccióndelainfecciónconvirusqueno>enenefectocitopá>co
Comparacióndelaeficienciadeensayoscuan>ta>vos
nosepuedeasumirunacorrelaciónentreensayos
-¿quépropiedadsemide?númerodeparlculas≠infec>vidad-¿cuáleslasensibilidaddelensayo?recuentodirectodeparlculas≠hemaglu>nación
¿Quéotrasu>lidades>eneelensayodeformacióndeplacasdelisis?
AnálisisdevirusmutantesEfectodemutacionesqueinterfierenenlareplicacióndelvirusdeldengue
AnálisisdecompuestosanKviralesInhibicióndelapropagacióndelvirusvaccinia
Mul>plicidaddeinfección(moi)• Midelacan>dadpromediodevirusqueseagregaporcélulaenuna
infección• Seexpresausandounamedidacuan>ta>vadelltuloviral
SiseinfectaunculKvodecélulasaunamoi=1¿cadaunadelascélulasrecibeunvirus?ElnúmerodevirusquerecibecadacélulaaunadeterminadamoisigueunadistribucióndePoissonConunamoi=3seinfectanel99%delascélulasencul>vo
Curvadecrecimientoenunpaso
• cursotemporaldelareplicaciónviral• rendimientodevirusporcélulaenunaúnicarondadeinfección
• ámoiàunciclodereplicación• âmoiàmúl>plesrondasdereplicación
Ciné>casdereplicacióndevirusdeDNAyRNA
LascurvasdevirusdeDNAmuestranfaseslargasdelatenciaysíntesisParavirusdeRNAelciclosecompletaen<12hsParavirusquemaduranporbrotaciónaniveldelamembranaplasmá>canosedetectavirusintracelularinfeccioso
Propiedadesesencialesdelosvirus① Losvirussonmáspequeñosquebacteriasypasanatravésde
filtrosquenopermitenelpasajedebacterias② losvirussólopuedenreplicardentrodecélulashospedadoras③ losviruspuedenestarcompuestossólodeproteínasyácidos
nucleicos④ elácidonucleicoquecomponemuchosvirusesRNA⑤ elácidonucleicodelosviruscon>enetodasuinformación
gené>ca⑥ duranteunaetapadesureplicaciónlosviruspuedenexis>rsólo
comosuácidonucleico⑦ losvirusdependendelmetabolismodelacélulahospedadoraque
proveelaenergíaylosmaterialesnecesariosparasureplicación