CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA …
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CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA CULTIVABLE, ASOCIADA AL RESIDUO LIGNOCELULOSICO DEL PROCESO DE BENEFICIO DE LA HOJA FIQUE (Furcraea andina) EN MOGOTES, SANTANDER MARIA PAULA VARGAS GUTIERREZ UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y AGROPECUARIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BUCARAMANGA 2018
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CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA
CULTIVABLE, ASOCIADA AL RESIDUO LIGNOCELULOSICO DEL
PROCESO DE BENEFICIO DE LA HOJA FIQUE (Furcraea andina) EN
MOGOTES, SANTANDER
MARIA PAULA VARGAS GUTIERREZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BUCARAMANGA
2018
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CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA CULTIVABLE, ASOCIADA AL RESIDUO LIGNOCELULOSICO
DEL PROCESO DE BENEFICIO DE LA HOJA FIQUE (Furcraea andina) EN MOGOTES, SANTANDER.
MARIA PAULA VARGAS GUTIERREZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director Rigoberto Pinilla Corzo
Master Ingeniería Ambiental
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BUCARAMANGA
2018
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3
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por darme la fe, la fortaleza, la salud y la esperanza de
terminar este trabajo a pesar de las dificultades.
A mis padres por haberme forjado como la persona que soy; muchos
de mis logros se los debo a ellos entre los que se incluye este; a mis
hermanos porque me brindan su apoyo en todo momento, son un espejo
en el que me quiero reflejar pues poseen virtudes infinitas a nivel
personal y profesional que me hacen admirarlos cada día más.
A mis amigos en especial a Andrés Leonardo Rincón Pérez, por su
colaboración y apoyo en la realización de este proyecto.
A mi codirector Bayron Agualimpia, por estar pendiente durante la
elaboración de este documento, y por toda la dedicación y entrega en
su enseñanza.
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RESUMEN
TITULO: CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA
CULTIVABLE, ASOCIADA AL RESIDUO LIGNOCELULOSICO DEL
PROCESO DE BENEFICIO DE LA HOJA FIQUE (Furcraea andina) EN
MOGOTES, SANTANDER
AUTOR: Maria P. Vargas, Rigoberto Pinilla
PALABRAS CLAVE:Planta de fique, diversidad microbiológica, residuo
lignocelulósico, caracterización morfológica, pruebas bioquímicas.
DESCRIPCIÓN:
El propósito del presente estudio fue contribuir al reconocimiento de la
diversidad de microorganismos presentes en el residuo lignocelulósico
proveniente del proceso de beneficio de la hoja de fique Furcraea andina; las
muestras fueron tomadas en la finca experimental José Exelino Forero, ubicada
en el municipio de Mogotes, Santander.
El aislamiento de los microorganismos cultivables se dio miente el uso de
medios de cultivo específicos después de realizar diluciones seriadas hasta 10-
6, posteriormente se establecieron los grupos microbianos asociados a este
residuo mediante claves morfológicas realizando tinción de Gram y pruebas
bioquímicas como oxidación y fermentación de azucares y pruebas enzimáticas,
por último se determinó la abundancia de microorganismos por cada una de
las muestras recolectadas mediante el uso de recuento de unidades formadoras
de colonia por mililitro.
Se logró obtener un total de 55 aislados correspondientes a 36 bacterias, 6
hongos y 13 levaduras. En la caracterización macroscópica y microscópica, se
seleccionaron 20 bacterias 70% de las bacterias fueron Gram negativa y 30%
Gram positiva, con las pruebas bioquímicas se pudo deducir que
presuntivamente puede existir la presencia de bacterias de la familia
Enterobacteriaceae y de los géneros Pseudomonas sp. y Bacillus sp. De igual
manera para los hongos se seleccionaron 6 aislados, de las se encuentra en
mayor proporción el género Penicillium sp.. Por último, se seleccionaron 8
cepas de levaduras, las cuales según resultados obtenidos en el API 20 AUX,
se encuentra la presencia de dos microorganismos de interés industrial,
Candida famata y Rhodotorula glutinis, las demás levaduras según literatura
son reportadas como patógenas para los humanos. Finalmente, los aislados
caracterizadas se conservaron con el propósito de mantener este material
biológico en un estado viable y estable, mediante la conservación por método
tubo con agar inclinado en aceite mineral.
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ABSTRACT
TITLE: MORPHOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF
THE CULTIVABLE MICROBIAL DIVERSITY, ASSOCIATED TO THE
LIGNOCELLULOSIC RESIDUE OF THE PROCESS OF BENEFIT OF THE
FIQUE LEAF (FURCRAEA ANDINA) IN MOGOTES SANATNDER.
AUTHOR: Maria P. Vargas, Rigoberto Pinilla
KEY WORDS: Sisal plant, microbiological diversity, Lignocellulosic residue,
morphological characterization, biochemical tests.
DESCRIPTION: The purpose of the present study was to contribute to the recognition of the diversity of microorganisms present in the residue lignocellulosic from the process of benefit of the sisal leaf Furcraea andina, the samples were taken at the experimental farm Jose Exelino Moreno, located in the municipality of Mogotes, Santander. The isolation of the culturable microorganisms was given through the use of specific culture media, after performing serial dilutions up to 10-6, later the microbial groups associated whit this residue were established by means of morphological keys and biochemical tests and finally the abundance of microorganisms were determined for each of the samples collected. We obtained a total of 55 isolates correpondian to 36 bacteria, 6 fungi and 13
yeast. In the macroscopic and microscopic characterization, 20 bacteria were
selected 70% of the bacteria were Gram negatives and 30% Gram positive.
Subsequently whit biochemical tests it could be deduced that there may be the
presence of the family Enterobacteriaceae and of the genera Pseudomonas sp.
and Bacillus sp. In the same way for the fungi, 7 isolates were selected, of which
according to the technique of micro-culture and the taxonomic keys, one finds in
greater proportion the genus Penicillium sp.. Finally, we selected 8 isolates of
yeast, which according to the results obtained in the API 20 AUX, is the presence
of two microorganisms of industrial interest Candida famata y Rhodotorula
glutinis, the other yeasts according to the literature are reported as pathogenic
for humans. Finally, the isoletes characterized were retained for the purpose of
maintaining this biological material in a viable and stable state by method tube
whit angle agar in mineral oil.
6
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 11
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 13
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ................................................................. 14
4. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 15
5. MARCO TEÓRICO Y BIBLIOGRÁFICO ........................................................ 16
5.1 CARACTERÍSTICAS DEL FIQUE ........................................................... 16
5.2 PROCESO DE BENEFICIO DEL FIQUE .................................................... 17
5.3 PRODUCCIÓN A NIVEL NACIONAL. .......................................................... 20
5.4 COMPOSICIÓN DEL FIQUE Y SU IMPACTO AMBIENTAL. .................. 21
5.5 DESARROLLO TECNOLÓGICO E INVESTIGACIONES ......................... 23
5.6 AGENDA DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO TECNOLÓGICO DE
LA CADENA PRODUCTIVA DE FIQUE 2009-2018 COLOMBIA .................. 24
5.7 COMUNIDADES MICROBINAS Y LA IMPORTANCIA DE
ESTUDIARLAS ....................................................................................................... 25
5.8 DIVERSIDAD MICROBIANA EN SUELOS Y PLANTAS .......................... 27
La biodiversidad es la riqueza de organismos vivos de un ecosistema, así
como los complejos ecológicos de los que forman parte; comprende la
variación dentro de cada especie, entre las especies y los ecosistemas (de
la Cruz-Leyva, Zamudio Maya, Corona Cruz, Gonzales de la Cruz , & Rojas
Herrera, 2014). El conocimiento de la biodiversidad requiere considerar los
diferentes niveles jerárquicos de organización de la vida (genes, especies,
poblaciones, comunidades y ecosistemas), junto con sus atributos de
composición, estructura y funcionalidad............................................................. 27
6. OBJETIVOS ........................................................................................................ 30
6.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 30
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 30
7. METODOLOGÍA ................................................................................................. 31
7.1 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL
RESIDUO LIGNOCELULÓSICO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA 32
SIEMBRA Y RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS ........................... 32
7
7.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PARA BACTERIAS Y
LEVADURAS. ......................................................................................................... 35
7.3 MÉTODO DE CONSERVACIÓN .................................................................. 35
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 37
8.1 AISLAMIENTO DE MIRCROOGANISMOS PRESENTES EN EL
RESIDUO LIGNOCELULOSICO ......................................................................... 37
8.2 CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA ................ 38
8.2.1 CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA PARA
BACTERIAS ........................................................................................................ 38
8.2.2 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS DE
LOS HONGOS .................................................................................................... 42
8.3 BIOQUÍMICA .................................................................................................... 49
8.3.1 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PARA LAS BACTERIAS ......... 49
8.4 CARACTERIZACIÓN PARA LEVADURAS ................................................ 54
8.5 CONSERVACIÓN DE AISLADOS ................................................................ 55
9. CONCLUSIONES ............................................................................................... 56
10. RECOMENDACIONES ................................................................................. 56
11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 58
12. ANEXOS .......................................................................................................... 64
8
TABLA DE FIGURAS
FIGURA 1 FIQUE – BORDE DE ORO (FURCRAEA CASTILLA). FUENTE:
RIGOBERTO PINILLA CORZO .............................................................. 16
FIGURA 2. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO DE BENEFICIO DEL FIQUE, FUENTE:
EVALUACIÓN DE LOS EFLUENTES PROVENIENTES DE LA AGROINDUSTRIA
DEL FIQUE EN EL MUNICIPIO DE TOTORÓ - CAUCA. ............................... 17
FIGURA 3. DESFIBRADO. FUENTE: RIGOBERTO PINILLA CORZO .................. 19
FIGURA 5 MUNICIPIO DE MOGOTES EN EL DEPARTAMENTO DE SANTANDER.
FUENTE: HTTPS://TIERRACOLOMBIANA.ORG/MUNICIPIOS-DE-
SANTANDER/ ..................................................................................... 31
FIGURA 6 CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS PARA BACTERIAS SEGÚN
(MACFADDIN,2006) .......................................................................... 34
FIGURA 8 PORCENTAJE DE LOS TAMAÑOS QUE PRESENTARON LAS COLONIAS
AISLADAS. ........................................................................................ 38
FIGURA 9 PORCENTAJE DE LA ELEVACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS
AISLADAS. ........................................................................................ 39
FIGURA 10 PORCENTAJE DE LOS BORDES PRESENTADOS EN LAS CEPAS
AISLADAS. ........................................................................................ 39
FIGURA 11 PORCENTAJE DE LA APARIENCIA DE LOS AISLADOS ENCONTRADOS
EN EL RESIDUO LIGNOCELULÓSICO. ..................................................... 40
FIGURA 12 PORCENTAJE DE LAS PIGMENTACIONES PRESENTADAS POR LAS
CEPAS BACTERIANAS AISLADAS. ......................................................... 40
FIGURA 13 PORCENTAJE DE LAS CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LAS
COLONIAS AISLADAS. ......................................................................... 41
FIGURA 14 NÚMERO DE MICROORGANISMOS AISLADOS PRESENTES EN LAS
TRES MUESTRAS RECOLECTADAS. ...................................................... 64
FIGURA 15 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS HONGOS Y LEVADURAS AISLADAS
A PARTIR DE LAS TRES MUESTRAS ANALIZADAS. ................................... 65
FIGURA 16 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SABOURAUD Y
AGAR NUTRITIVO, DE LAS MUESTRAS ANALIZADAS DEL RESIDUO
LIGNOCELULÓSICO (A. CRECIMIENTO MICROBIANO EN DILUCIÓN 10-6 DE LA
MUESTRA A, B Y C CRECIMIENTO DE CEPA BACTERIANA EN LA DILUCIÓN
10-2 EN AGAR NUTRIVO DE LAS MUESTRAS C Y B RESPECTIVAMENTE. .... 67
FIGURA 17 TINCIÓN DE GRAM REALIZADA A CEPAS AISLADAS DE LAS
MUESTRAS ANALIZADAS DEL RESIDUO LIGNOCELULÓSICO. A. BACILOS
CORTOS GRAM POSITIVOS, B. COCBACILOS GRAM NEGATIVOS, C.
BACILOS GRAM POSITIVOS, D. COCOBACILOS GRAM NEGATIVOS, E.
COCOBACILOS GRAM POSITIVOS Y F. BACILOS GRAM NEGATIVOS. ........ 67
9
FIGURA 18 EVIDENCIA DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS EFECTUADAS A
LAS BACTERIAS AISLADAS A PARTIR DEL RESIDUO LIGNOCELULÓSICO. .... 69
FIGURA 19 LECTURA DE LA PRUEBA API 20 AUX, OBTENCIÓN DE CÓDIGO
PARA IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO EN BASE INFORMÁTICA. .... 69
10
TABLA DE TABLAS
TABLA 1 ZONAS DE PRODUCCIÓN DE FIQUE Y PORCENTAJE DE PARTICIPACIÓN
POR DEPARTAMENTO 2013. ............................................................... 20
TABLA 2 ESTRUCTURA FÍSICA DE LA HOJA DE FIQUE. ................................... 21
TABLA 3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA HOJA DE FIQUE................................ 21
TABLA 4 DESCRIPCIÓN DE CARACTERÍSTICAS DE LAS BACTERIAS SEGÚN
MACFADDIN ..................................................................................... 33
TABLA 6 DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE LOS HONGOS
AISLADOS. ........................................................................................ 43
TABLA 7 PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE LAS CEPAS BACTERIANAS AISLADAS. ...... 50
TABLA 8 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE LEVADURAS API 20 AUX. ............ 54
TABLA 9 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS, HONGOS Y LEVADURAS,
ENCONTRADAS EN CADA DILUCIÓN EN LA MUESTRA A. .......................... 64
TABLA 10 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS, HONGOS Y LEVADURAS,
ENCONTRADAS EN CADA DILUCIÓN EN LA MUESTRA B. .......................... 64
TABLA 11 CONCENTRACIÓN BACTERIAS, HONGOS Y LEVADURAS,
ENCONTRADAS EN CADA DILUCIÓN EN LA MUESTRA C ........................... 65
TABLA 12 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS DE LAS
CEPAS AISLADAS. .............................................................................. 66
11
1. INTRODUCCIÓN
El fique es una planta originaria de la América Tropical, su cultivo se da de manera particular en las zonas andinas de Colombia, Venezuela y Ecuador. En nuestro país se siembra con mayor énfasis en los departamentos de Cauca, Nariño, Santander, Antioquia y Boyacá, siendo el Cauca el mayor productor. Por su parte Santander se posiciona como uno de los primeros productores de fibra de fique y sus derivados a nivel nacional donde se destacan como principales municipios productores: Mogotes y San Joaquí (Acevedo Medina & Serna Gómez, 2004)
El proceso de desfibrado es una actividad en la cual la hoja de la planta
de fique es desbastada para la obtención de la fibra, este proceso genera
un vertimiento líquido el cual es manejado, en la mayoría de los casos,
como residuo sin valor (Arroyave & Velásquez , 2001) con altos
contenidos de contaminantes, los cuales causan graves problemas
ambientales si no son tratados de forma adecuada (Lozano Rivas, 2012).
Según estudios el jugo y el bagazo residual del beneficio del fique pueden ser utilizados en la producción de principios activos farmacéuticos, agentes tensoactivos, bioinsecticidas, papel y producción de Biogás debido a sus características fisicoquímicas (Barrera, Salas , Castro, Ortiz, & Escalante, 2009); se tiene certeza cuantitativa de sus constituyentes, de forma cualitativa que están conformados por: agua (85%), celulosa (6% D-glucosa), materia orgánica y amorfa (8% constituida por sacarosa, proteínas, nitrógeno, fósforo, calcio, potasio, saponinas y sapogeninas) y minerales (1%) (MAVDT, 2006). Estos componentes al ser ricos en celulosa, glucosa, sacarosa, fructuosa, proteínas, fosforo calcio, potasio minerales y agua, los convierten en un medio que puede ser aprovechado por diferentes comunidades bacterianas (Otero R, y otros, 2014); sin embargo no existen muchos estudios relacionados con la riqueza microbiológica presente en este residuo, lo cual nos lleva a un desaprovechamiento sobre las posibles aplicaciones biotecnológicas que puedan tener estos organismos para generar sustancias de interés industrial a partir de este residuo generando posiblemente un valor agregado a este desecho. Debido a lo mencionado anteriormente, el enfoque de este trabajo
consiste en caracterizar microorganismos asociados al residuo
lignocelulósico de la planta de fique (Furcraea andina) mediante medios
selectivos para diferentes grupos funcionales microbianos, los cuales
12
serán identificados de acuerdo a actividades bioquímicas específicas en
pruebas in vitro y claves taxonómicas, los cuales abran o apoyen una
línea base para investigación biotecnológica en este sector agroindustrial
de Santander y del país; con miras a realizar futuras investigaciones
encaminadas al tratamiento de los residuos generados por esta actividad
económica y la posible extracción de sustancias de valor agregado.
13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Colombia las fibras del fique son ampliamente usadas para la fabricación de diferentes productos, no obstante, estas aplicaciones de las fibras del fique suponen el aprovechamiento de sólo el 5% de este vegetal; el 95% restante es subutilizado y frecuentemente desechado. En Colombia, la actividad fiquera genera aproximadamente 4 toneladas de residuos (bagazo) por hectárea sembrada, los cuales causan graves problemas de contaminación debido a su incorrecta disposición (Rivera González, Plata Martínez , Castro Molano, Guzmán Luna , & Escalante Hernández, 2012). Esta fracción no utilizada es una suspensión de características variables que son dependientes de la edad de la planta, la estación del año y las características del suelo; está compuesto principalmente por agua, celulosa, materia orgánica y minerales como potasio, calcio, fósforo, urea -nitrógeno, celulosa, sacarosa, proteínas, esteroides, saponinas y sapogeninas, que forman una espuma abundante y relativamente estable cuando se agitan con agua, disminuyendo la tensión superficial por lo cual se consideran agentes tensoactivos y altamente contaminantes para el desarrollo de la vida acuática, pero que tiene propiedades que permiten darle un uso subproducto (Imbachí Hoyo , Morales Velasco, & Alban Lopez , 2012). Algunas de estas sustancias pueden ser muy apetecidas para la producción química de diferentes sustancias principalmente de la industria farmacéutica, también se han realizado estudios sobre el uso de este residuo para el control biológico, como agente tensoactivo entre otros. Sin embargo, el estudio relacionado con la caracterización de la diversidad microbiológica asociada a este residuo es casi nulo, lo cual nos lleva a un desaprovechamiento sobre las posibles aplicaciones biotecnológicas que puedan tener estos organismos para generar sustancias de interés industrial a partir de este residuo generando posiblemente un valor agregado a este desecho.
14
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es la diversidad microbiana cultivable, asociada al residuo lignocelulósico
del proceso de beneficio de la hoja fique (furcraea andina) en mogotes,
Santander?
15
4. JUSTIFICACIÓN
El residuo lignocelulósico contiene sustancias como lo son los precursores
hormonales, corticoides, sulfatos, celulosa, glucosa, sacarosa, fructuosa,
proteínas, fosforo calcio, potasio, minerales y compuestos de actividad
biopesticida (Barrera, Salas , Castro, Ortiz, & Escalante, 2009), que pueden variar
dependiendo de la edad dela planta y las características del suelo en donde fue
sembrada la planta.
Estas características anteriormente mencionadas lo hacen un sustrato ideal para
varios microorganismos, por tal razón la presente investigación tiene como fin
incrementar el conocimiento relacionado con la diversidad microbiológica
asociada al residuo lignocelulósico de la planta de fique, al caracterizar los
microorganismos asociados a este residuo y conocer sus diferentes
características bioquímicas, para ser utilizados a nivel industrial, dándole un mejor
aprovechamiento a este residuo generando posiblemente un valor agregado del
mismo y disminuyendo la contaminación ambiental.
Esta investigación también tiene el propósito de impulsar la carrera de
microbiología industrial, ya que al conocer la diversidad microbiológica
relacionada al residuo lignocelulósico del beneficio de la hoja de fique se abren
nuevas líneas de investigación encaminadas a procesos biotecnológicos que
promuevan diferentes procesos industriales y/o ambientales; y por último generar
talento humano, en la formación de una futura microbióloga.
.
16
5. MARCO TEÓRICO Y BIBLIOGRÁFICO
5.1 CARACTERÍSTICAS DEL FIQUE
El fique (ver figura 1) es una planta perteneciente al reino vegetal, al
Phylum Spermatophyta, a la clase Angiospermae, la familia Agavaceae
y el género Furcraea que crece en varias regiones de América tropical,
perteneciente a la familia Agavaceae, siendo los géneros Agave y
Furcraea los más representativos. Se presenta principalmente, en las
regiones andinas de Colombia y Venezuela, aunque puede encontrarse
de forma natural desde el sur de México hasta Brasil (Lozano Rivas,
2015). Son plantas grandes, de tallo erguido, su altura varía entre 2 y 7
m, densamente poblado de hojas de color verde, en forma radial, largas
(1 a 3 m), angostas (10 y 20 cm), carnosas, puntiagudas, acanaladas, y
dentado-espinosas; presentado en algunas variedades, líneas o estrías
tenues de unos 3 mm de largo. Su flor es de color blanco verdoso,
llamada magüey o escapo, sólo florece una vez en su ciclo de vida y
luego le sobreviene la muerte (magueciada). Las semillas germinan en la
misma planta y sus propágulos (bulbillos) caen ya formados al suelo por
lo que se considera al fique una planta vivípara. Pueden encontrarse
plantas con más de 50 años de edad, pero su periodo típico de vida varía
entre 10 y 20 años. Poseen gran cantidad de raíces que se expanden y
enraízan profundamente haciéndola una planta anti-erosiva. Su vida útil
(producción de fibra, jugos, etc.) comienza entre los 3 y 6 años,
dependiendo de las condiciones que enfrente (MAVDT, 2006).
Figura 1 Fique – Borde de Oro (Furcraea castilla). Fuente: Rigoberto Pinilla Corzo
17
5.2 PROCESO DE BENEFICIO DEL FIQUE
Para lograr el aprovechamiento de la hoja del fique se ha desarrollado un
proceso agroindustrial que consta de los siguientes pasos (Figura 2):
Figura 2. Descripción del proceso de beneficio del fique, fuente: Evaluación de los efluentes provenientes de la agroindustria del fique en el municipio de Totoró - Cauca.
Dentro de estos procesos se resaltan dos muy importantes que son el
desfibrado y el lavado.
Desfibrado Es la operación de mayor atención durante el proceso de beneficio
(COMPAÑÍA DE EMPAQUES S.A.; Secretaría de Agricultura de
Antioquia, CORANTIOQUIA; Alcaldía de Barbosa., 2004). Consiste en
separar la corteza de las hojas de las fibras que están en su interior, por
métodos manuales o con desfibradora portátil, acondicionada con motor
a gasolina o diésel, siendo esta opción más económica para el proceso
18
(ver figura 3) (Empresa Cooperativa de fibras naturales de Santander-
ECOFIBRAS LTDA., Coohilados del Fonce LTDA. & Secretaria de
agricultura de Santander., 2005). Se calibra el equipo de acuerdo a los
grupos de hoja por desfibrar y se desfibra de la siguiente manera:
Se introduce la hoja despalmada a la máquina, primero por la
parte gruesa o asiento (envés). Se realiza hasta una cuarta
parte de la hoja.
Se invierte y se pasa hasta desfibrarla totalmente, teniendo la
precaución de no dejar ninguna parte sin desfibrar y retirando
las partículas de celulosa restantes de la hoja.
Algunos operarios por costumbre en el desfibrado, introducen la hoja por
la base como es lo correcto, pero lo hacen hasta las tres cuartas partes
de la hoja, ocasionando pérdidas mayores de fibra, ya que al girarla es
mayor el desprendimiento de fibra. No se debe dejar pasar más de 12 a
15 horas entre el corte y el desfibrado, cuando esto ocurre, las hojas
presentan un daño fisiológico que se denomina empalizada; es decir, se
vinagra afectando la calidad de la fibra, este fenómeno ocurre debido al
alto contenido de azucares presentes en la hoja, los cuales se fermentan
afectando la calidad de la fibra (MAVDT, 2006).
En los métodos manuales, la Secretaría Técnica Nacional de
CADEFIQUE ha podido establecer que, en departamentos como
Antioquia, Nariño, Boyacá, Cundinamarca, Huila, Guajira y en regiones
como las estribaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta (Indígenas
Kamkuamos), aún se realiza el rallado manual de la hoja de fique para
fines artesanales decorativos y utilitarios, con instrumentos como
machete, tijeras especiales, palos, carrizo y cordel, a la vieja práctica
indígena y colonial. Tiene como ventajas la obtención de fibra de mayor
longitud, mejor calidad y suavidad, además de la disminución del impacto
ambiental por jugos y bagazos, aunque también con desventajas como
baja producción, "los que desfibran a mano la penca de fique pierden sus
huellas digitales" (MAVDT, 2006) y pueden ser expuestos a
enfermedades de la piel. Actualmente, se realizan estudios e
investigaciones en áreas de ingeniería electrónica y mecánica para
optimizar la producción manual y hacerla competitiva.
19
Figura 3. Desfibrado. Fuente: Rigoberto Pinilla Corzo
Fermentado y lavado
En el beneficio, la fermentación es básica para la obtención de fibra de
mayor calidad, pues la acción de los microorganismos y levaduras
aumentan la temperatura, descomponiendo así la materia orgánica. Así
mismo, los compuestos químicos del fique hacen que se desprendan los
restos de celulosa dejados entre las fibras. Para la correcta fermentación
de la fibra, se procede de la siguiente manera (MAVDT, 2006):
Llenar el tanque en seco con fibra verde, estirándola a lo largo
y ancho del tanque.
Agregar agua hasta que cubra el límite de la fibra depositada,
así se ahorra agua y el tanque se podrá llenar.
Pisotear, estrujar y/o macerar los manojos de fibra
depositados dentro del tanque con poca agua, esto contribuye
a que se desprenda el ripio. Usar por lo menos dos veces el
agua, está comprobado que las primeras aguas contienen
mayor grado de fermentación, por esta razón el agua se
recomienda reutilizarla. Es adecuado dejar en fermento la
cantidad de hojas en verde desfibradas del día, de tal manera
que al día siguiente se lave y sacuda; ya que esto contribuye
a que la fibra tenga un mejor blanqueamiento y que pique
menos (COMPAÑÍA DE EMPAQUES S.A.; Secretaría de
Agricultura de Antioquia, CORANTIOQUIA; Alcaldía de
Barbosa., 2004). Sobre la ubicación del tanque para el
fermento, es bueno elegir un lugar que quede cerca de la
desfibradora y/o secadero, donde se puede utilizar el producto
del lavado como abono líquido, facilitándose la conducción por
gravedad hacia los potreros, huerta casera y/o diferentes
20
sembríos. Si estos residuos caen directamente a las fuentes
de agua, afectan negativamente la ictiofauna existente,
contaminando el agua para el consumo animal y humano
(MAVDT, 2006).
5.3 PRODUCCIÓN A NIVEL NACIONAL.
Los principales departamentos productores de fique se ubican en la región andina del país, siendo los departamentos de Cauca, Nariño y Santander los que presentan mayor aérea de cultivo (MAVDT, 2006).
Tabla 1 Zonas de producción de fique y porcentaje de participación por departamento 2013.
Departamento Producción en toneladas (Ton)
Porcentaje de Producción
Cauca 7.338 40%
Nariño 6.724 37%
Antioquia 2.309 13%
Santander 1.678 9%
Caldas, Boyaca, Risaralda, Norte de Santander.
277 1%
Total 18.326 100% Libro: Fique en Colombia 2015.
El departamento de Santander es tradicionalmente un fuerte cultivador de fique en Colombia y además se posiciona como uno de los primeros productores de esta fibra (segundo lugar) y sus derivados a nivel nacional, según datos del ministerio de agricultura existen 3.399 productores de fique, quienes se ubican en 6 municipios San Joaquín, Onzaga, Curiti, San Gil, Aratoca y principalmente en Mogotes que, con 1.308 productores, es el de mayor número y Curtí de menor número con 247 productores. Estos municipios tienen una participación importante en la producción fiquera del departamento (Morales Rubiano, 2000). En el proceso de beneficio se aprovecha el 5% de la hoja y el 95% restante se desecha como residuo sin valor (Medina, 2004).
21
5.4 COMPOSICIÓN DEL FIQUE Y SU IMPACTO AMBIENTAL.
Las características físicas y la composición química del fique varían según la planta y el cultivo de la misma. Tabla 2 Estructura física de la hoja de fique.
Componente Porcentaje en la hoja
Porcentaje útil
Usos
Fibra 5 4 Industria textil y empaques
Jugo 70 40 Extracción de esteroides
Estopa 8 3 Pulpa de papel
Bagazo 17 10 Material de construcción, abonos Guía del subsector Fiquero Segunda Edición; 2006.
En la tabla 3, se presenta la caracterización química de la hoja del fique.
Tabla 3 Composición química de la hoja de fique.
Fibra Jugo Bagazo
Cenizas 0,7% Clorofila Cenizas 12,2%
Celulosa 73,8% Carotenoides
Resinas, ceras y grasas
1,9% Saponinas Azúcares
Proteínas Elementos
nitrogenados
9,84% 71,29%
Lignina 11,3% Resinas Calcio 21,65%
Pentosanos 10,5% Flavonoides, ácidos grasos
Fosforo Magnesio
0,09% 0,2%
Total 98,2% Alquitranes, agua, lignina,
calcio, lipoides, fósforo.
Fosforo Sodio Cobre Hierro
Magnesio Zinc
1,81% 0,04% 14ppm
647ppm 33ppm 17ppm
Fuente:Guía del subsector Fiquero Segunda Edición; 2006.
En las principales regiones productoras de fique del país, es muy común que el lavado de la fibra se efectúe muchas veces en las quebradas, contaminando el agua con graves consecuencias para la biodiversidad de las regiones; ello se debe a las propiedades fisicoquímicas de los
22
jugos, por cuanto estos contienen un alto contenido de azúcares, principalmente sacarosa, glucosa y fructosa, proteínas sapogénicas, esteroides y minerales, que como lo demuestra un estudio realizado por la Universidad el Bosque, son extremadamente tóxicos para los peces y los organismos acuáticos (Martinez & Caicedo , 2002). Investigaciones, han determinado que este residuo puede incrementar concentraciones en la demanda biológica de oxigeno (DBO) y DQO en los cuerpos de agua; monitoreos realizados por el proyecto "Agua Limpia", ejecutado en el Río Mogoticos, fuente abastecedora del acueducto de San Gil (Santander) se estimó la DQO en 1.083 mg/l, debido al proceso de lavado de la fibra. En Mogotes (Santander), el proceso de lavado de la fibra de fique se hace durante un período de 30 minutos. Cuando se coloca el fique inicialmente en la corriente, desprende un tinte verde con espuma y un fuerte olor a celulosa, generando así el desprendimiento de compuestos altamente contaminantes para los cuerpos hídricos afectando a este ecosistema. Otros estudios realizados en Santander, demuestran que existe una fluctuación de los indicadores DBO y el DQO. Aguas arriba, el DBO es de 17,8 mg/l, el cual se incrementa por el lavado del fique a 180 mg/l. Aguas arriba la DQO es de 171,3 mg/l, la cual se incrementa a 537,3 mg/l por el lavado de fique (ECOFIBRAS LTDA, 2004). Los valores del DQO son significativamente más altos que los del DBO indicando la presencia de compuestos no biodegradables, los cuales corriente abajo persisten, causando efectos posiblemente perjudiciales, por la composición de saponinas y ácidos orgánicos. La relación DQO y DBO indica la biodegradabilidad del vertimiento; dicha relación debe ser superior a 1, ya que la DQO involucra tanto el contenido de materia orgánica como de materia inorgánica, mientras que la DBO solamente involucra el contenido de materia orgánica. Cuando la concentración de DQO es mayor, indica que el contenido del vertimiento es mayoritariamente inorgánico, como es el caso de los jugos del fique que arrojan aguas abajo en el Río Mogoticos con un coeficiente de 2,98. Esta situación demuestra la importancia de implementar sistemas de tratamientos para el lavado de fique y manejo de vertimientos. En esta misma agua, los análisis fisicoquímicos y microbiológicos mostraron que el conteo de coliformes totales era de 9.500 NMP (Número más Probable), una turbiedad de 2,3 NTU (Unidades Nefelométricas de Turbiedad) y según la resolución 2115 el agua no es apta para consumo humano (ECOFIBRAS LTDA, 2004).
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5.5 DESARROLLO TECNOLÓGICO E INVESTIGACIONES
Como se mencionó anteriormente, en el proceso de beneficio del fique se aprovechan tan sólo el 4% de este vegetal; el 96% restante es subutilizado y frecuentemente desechado. Este porcentaje no utilizado corresponde, en menor parte (aproximadamente 25%), a los biosólidos y/o bagazo generado del proceso de extracción de la fibra y que se dispone frecuentemente sobre los suelos sin control alguno, generando malos olores y atracción de vectores. El 70% faltante, corresponde a los zumos contenidos en sus hojas y que es separado mediante el proceso de extracción de sus fibras. No obstante, sólo el 40% del zumo es extraíble por prensado (Arroyave & Velásquez , 2001). Debido a que el zumo de fique es normalmente desechado como residuo con características contaminantes (CADEFIQUE, 2008), surge la necesidad de desarrollar biotecnologías de bajo costo que mitiguen el impacto ambiental y/o promuevan la valorización de este cultivo, dándole mejores aplicaciones a este residuo, ya que constituye el mayor porcentaje en peso de la hoja. Según la “GUÍA AMBIENTAL DEL SUBSECTOR FIQUERO” Segunda Edición. Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial (MAVDT) y la Cadena Productiva Nacional del Fique (CADEFIQUE), 2006, el jugo de fique es una sustancia que se caracteriza por tener propiedades tensoactivas, plaguicidas, y por poseer esteroides naturales entre los que se han encontrado saponinas y fitoesteroles. Las saponinas presentes en el zumo del fique, son glucósidos anfipáticos que se encuentran naturalmente en diversos vegetales, las cuales tienen la capacidad de producir espumas. Estos compuestos están conformados por dos porciones: gluconas y agluconas. Las gluconas son azúcares, en su mayoría hexosas, pentosas y ácidos urónicos, mientras que las agluconas son conocidas como sapogeninas y corresponden a la porción no sacárida (azucarada) de la saponina. Las sapogeninas son del tipo triterpenoide (C30H48) o esteroide (C27) (Lozano Rivas, 2012). Las saponinas a nivel industrial, presentan una gran cantidad de aplicaciones dentro de las que se destacan como agentes emulsificantes de grasas y aceites, protector de sustancias coloidales, dentífricos, suplemento en piensos, producción de fármacos por sus características anti-inflamatorias, entre otras (Lozano Rivas, 2015).
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5.6 AGENDA DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO TECNOLÓGICO
DE LA CADENA PRODUCTIVA DE FIQUE 2009-2018 COLOMBIA
La definición de una Agenda Prospectiva de Investigación para la Cadena Productiva Fique es un proceso investigativo que se ha venido desarrollando desde finales de noviembre del 2007, con el apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y de las entidades que conforman la Cadena Productiva, como el Consejo Nacional y la Secretaría Técnica; con el fin de aumentar la competitividad del sector agroindustrial colombiano a partir del mejoramiento de los procesos de investigación y desarrollo tecnológico.
La cadena ha desarrollado principalmente dos estudios que se encuentran formalizados a través de los documentos: “La agenda de investigación, innovación y desarrollo tecnológico del sector agropecuario colombiano” la cual tuvo como objetivo de propiciar el fortalecimiento de la investigación, la innovación y el desarrollo tecnológico mediante una agenda única nacional, que permitiera articular eficientemente las diferentes instituciones y canalizar de manera organizada la oferta y la demanda, con el fin de optimizar los recursos disponibles y “El Acuerdo para el Fomento de la Productividad y la Competitividad del Subsector del Fique” del 2004, el cual busca el cumplimiento de la estrategia de internacionalización colombiana, mediante el establecimiento de un marco de cooperación entre los sectores público y privado, en el corto, mediano y largo plazo, a fin de optimizar la competitividad de la cadena en el futuro.
La agenda Prospectiva de Investigación y Desarrollo Tecnológico para la Cadena Productiva de Fique en Colombia 2009 – 2018 plantea una serie de lineamientos donde está la necesidad de realizar investigaciones de ámbito bioprospectivo y biotecnológico en el cultivo y la planta de fique, como estrategia de mejoramiento de condiciones agroecológicas del cultivo, procesos de fertilización biológica, entre otras. Los lineamientos tecnológicos están conformados por proyectos que establecen las actividades encaminadas a atender las demandas tecnológicas, permitiendo así resolver problemas específicos de la cadena, impulsar la realización de conjuntos de proyectos de investigación, desarrollo tecnológico e innovación, de acuerdo a las áreas temáticas de interés de la cadena, dentro de las que se destacan: Manejo sanitario y fitosanitario, Material de siembra y mejoramiento genético, Manejo integral del cultivo, tratamiento y valorización de residuos; por tanto se establecen catorce líneas de investigación, entre las cuales
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siete, se encuentran inmersos profesionales en microbiología industrial y dos de estas se encargan de estudiar este residuo. Por tanto, es pertinente realizar investigaciones relacionadas con la riqueza microbiológica asociada a este residuo, que apoyen las líneas de investigación de la agenda prospectiva de fique en Colombia; cuantificando e identificando grupos microbianos, con los cuales se pueda abrir líneas de investigación para desarrollar procesos biotecnológicos que beneficien al sector, como estrategia de mejoramiento de condiciones agroecológicas del cultivo, procesos de fertilización biológica, tratamiento de residuos entre otras (Castellanos D., Torres P, & Rojas L., 2009). Con este proyecto se busca suplir esta necesidad, de conocer sobre la riqueza microbiológica asociada al residuo lignocelulósico del fique, dejando un banco de cepas para continuar con procesos de investigación, que mejoren y ayuden a solucionar las necesidades que demanda este sector agrícola. 5.7 COMUNIDADES MICROBINAS Y LA IMPORTANCIA DE
ESTUDIARLAS
El conjunto de especies que coexisten en un lugar y tiempo determinado, constituyen una comunidad o un consorcio. En un sistema microbiano, el crecimiento celular forma poblaciones; las poblaciones metabólicamente relacionadas se denominan gremios y el conjunto de estas agrupaciones interaccionan formando comunidades microbianas. Por lo tanto, las comunidades microbianas consisten en poblaciones de células de varias especies; que interactúan entre sí desarrollando múltiples actividades funcionales al interior de la comunidad. En el enfoque ecológico, la mayoría de las comunidades microbianas se ven afectadas por diferentes factores abióticos como escasez de alimento, sequía, congelamiento o descongelamiento, exposición a altas concentraciones salinas y otras alteraciones causadas por las variaciones naturales del entorno o por la actividad humana. Estos factores ambientales estresantes y los metabolitos que liberan los microorganismos para enfrentarlas (enzimas, exopolisacáridos, aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos, antimicrobianos, entre otros), crean factores bióticos que generan oportunidades para que nuevas especies se establezcan dentro de la comunidad. Cabe citar que una perturbación fuerte puede causar la desintegración de micro-hábitat, lo que permitirá que los recursos locales estén disponibles para una mayor
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proporción microorganismos de una misma especie. A pesar de estos antecedentes, aún se tiene poca información sobre las relaciones simbióticas, comensales o parasitarias que mantienen los miembros de una comunidad microbiana. La integración de una comunidad microbiana funcional, se regula mediante señales químicas, usadas como comunicación entre las células con las demás especies en el hábitat, estas señales permiten coordinar diferentes funciones de simbiosis, antagonismo, activación o represión de genes específicos, los cuales pueden participar en la determinación de la densidad poblacional, por la competencia de un nicho ecológico o sustrato, formación de biopelículas, síntesis de sustancias antimicrobianas entre otras. Los microorganismos son capaz de utilizar nutrientes y diversos elementos que otros organismos superiores no pueden aprovechar, así mismo ellos desarrollan un papel muy importante en los diferentes ciclos biogeoquímicos que tienen lugar en la tierra. Mediante el reciclado de los elementos regulan la disponibilidad de nutrientes, ayudan a procesos de fertilización de suelos y al desarrollo de las plantas que sustentan el reino animal. De esta manera los microorganismos constituyen la base de la cadena alimentaria donde movilizan a la biosfera compuestos elementales. El análisis de comunidades microbianas permite inferir sobre las funciones positivas y negativas de los gremios o poblaciones que conforman una matriz de estudio (suelo, agua, aire, plantas, etc.), permitiendo el aprovechamiento de los mismos para la obtención de cepas o metabolitos, que puedan ser aprovechables por el hombre (de la Cruz-Leyva, Zamudio Maya, Corona Cruz, Gonzales de la Cruz , & Rojas Herrera, 2014). Este trabajo permite abrir líneas base de investigación a nivel industrial, al generar un banco de cepas asociadas al residuo generado durante el desfibrado del fique, los cuales podrían ser implementados para la producción de sustancias de interés, que suplan diferentes necesidades y aporten un valor agregado al sector.
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5.8 DIVERSIDAD MICROBIANA EN SUELOS Y PLANTAS
La biodiversidad es la riqueza de organismos vivos de un ecosistema, así
como los complejos ecológicos de los que forman parte; comprende la
variación dentro de cada especie, entre las especies y los ecosistemas
(de la Cruz-Leyva, Zamudio Maya, Corona Cruz, Gonzales de la Cruz , &
Rojas Herrera, 2014). El conocimiento de la biodiversidad requiere
considerar los diferentes niveles jerárquicos de organización de la vida
(genes, especies, poblaciones, comunidades y ecosistemas), junto con
sus atributos de composición, estructura y funcionalidad.
La diversidad microbiana puede apreciarse en términos de la variedad
estructural y funcional de los microorganismos, tal como sus variaciones
en el tamaño celular, en la morfología, en la división celular, o bien en la
capacidad metabólica y de adaptación. Se estima que sólo se conoce el
3% de los microorganismos y que pocos se han estudiado con
profundidad, resulta sorprendente su diversidad en relación con la
variedad de plantas y animales, se reconoce que los microorganismos
son más diversos y versátiles que los macroorganismos debido a su
historia evolutiva y a su rápida capacidad para adaptarse a los cambios
ambientales. Su capacidad y eficiencia metabólica permitieron que ellos
colonizaran la superficie terrestre, el aire, los lagos salados y
prácticamente todas las regiones geográficas del planeta (Montaño Arias
, Sandoval Pérez, Camargo Ricalde , & Sánches Yáñez , 2010).
El suelo a pesar de su aparente hostilidad, es el hábitat de innumerables
seres vivos. En el suelo se pueden encontrar una enorme cantidad de
organismos diferentes, de tamaño y funciones muy variable. Son
fundamentales para el desarrollo de la vida en el planeta, jugando un
papel relevante en la formación y estructuración del suelo y en la
movilización de nutrientes. Se han de conocer, pues, los agentes que
viven y trabajan en el suelo, saber cuáles son sus acciones en el suelo y
cómo el hombre puede intervenir para mantener y acrecentar la fertilidad
de los suelos cultivados utilizando a los organismos edáficos en su favor
(Asociación vida sana, 2010).
A escala microscópica se encuentran bacterias, algas, protozoos y
hongos. Subiendo la escala de tamaños encontramos nemátodos,
artrópodos de pequeño tamaño, gusanos, a los que siguen lombrices de
tierra, moluscos y artrópodos. Muchos de ellos realizan su ciclo biológico
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completo en el suelo, mientras que otros sólo son habitantes ocasionales,
o en determinadas fases (Asociación vida sana, 2010).
El suelo es el hábitat ideal para el desarrollo de los microorganismos ya
que su estructura constituye un entramado en el que pueden acomodarse
tanto en el exterior como en el interior. Pero para ello el suelo ha de tener
una buena estructura donde el agua y el aire circulen con facilidad y se
hallen en un equilibrio que permita el desarrollo de las colonias de
microorganismos (Asociación vida sana, 2010).
La mayor concentración de microorganismos se encuentra en la zona
cercana a las raíces en lo que se conoce como en nombre de rizosfera.
Su actividad bioquímica produce unos exudados radiculares, que
contienen, según las especies vegetales, entre el 10 y el 50 % de la
energía fijada por fotosíntesis. Estos exudados ricos en compuestos
carbonatados sirven de alimento a los microbios de la rizosfera que, a
cambio, proporcionan minerales que necesita la planta. Todas las
actividades nutritivas de la planta se hacen por la intermediación de este
recubrimiento microbiano, lo que da idea de las repercusiones que éste
puede tener en el desarrollo y la salud de la raíz y, por tanto, del vegetal.
En general, el efecto de la rizosfera aumenta progresivamente conforme
se va desarrollando la planta, empieza a sentirse en el momento de la
germinación, alcanzando un máximo en el momento de la fructificación,
decreciendo después lentamente. El papel agronómico de la rizosfera es
muy considerable por su intervención en: la modificación de la estructura
del suelo, la nutrición de las plantas (principalmente en el metabolismo
del nitrógeno y por la solubilización de elementos minerales), la secreción
de sustancias activadoras del crecimiento como las hormonas y la salud
de las plantas, por su control en las infecciones patógenas (Asociación
vida sana, 2010).
La planta es un hábitat dinámico en que diversos factores pueden
influenciar la estructura y la composición de la comunidad microbiana.
Las variaciones estaciónales, el tipo de tejido vegetal, especie y
cultivares de hospedero y la interacción con otros microorganismos
benéficos también pueden influenciar el patrón de colonización (Perez C,
Dr Rojas S, & M.Sc. Vale M, 2009). Los microorganismos están
indisolublemente asociadas a las plantas como patogénicas, epifitas,
endófitas, simbióticas y antagónicas. Muchas forman asociaciones
íntimas con las plantas y forman grupos diversos filogenéticamente
representados por especies pertenecientes a los principales taxones.
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Estos microorganismos asociados a las plantas típicamente intercambian
señales con su hospedero y poseen diversos mecanismos para
adaptación y colonización (Preston, Haubold, & Rainey, 1998). Aspectos
importantes de la diversidad microbiana en el ecosistema incluyen los
diferentes procesos que estos realizan, la complejidad de la interacción
y el número de niveles tróficos que los componen. En los últimos años,
ha despertado intereses aspectos relacionados con la composición,
estructura y función de comunidades microbianas en diferentes
ambientes (Ward, 2006).
Los microorganismos cumplen con el papel más conocido e importante.
Sin ellos el ciclo de la vida se interrumpiría y no podrían reciclarse los
residuos orgánicos que llegan al suelo ni integrarse en el ciclo de la vida
los minerales que forman parte de las rocas. Algunas de sus funciones
son: la transformación de materia orgánica y carbonada (azúcares,
almidón, celulosa) son la fuente principal de energía de los
microorganismos, degradan moléculas complejas de materia orgánica,
formando humus, la solubilización de los minerales(K, Ca, Mn, Mg, etc),
la fijación de nitrógeno.
En las plantas viven hongos y bacterias sin causarles daño, tal como los
hongos micorrícicos en las raíces del 97% de las plantas, o la bacteria
Rhizobium, un simbionte de las leguminosas como el fríjol y el chícharo.
En seres humanos también existen bacterias en elevada densidad, como
es el caso de Escherichia coli en el colon del intestino humano. De esta
forma, la diversidad microbiana en un sentido amplio se define como la
variedad de microorganismos y de sus diversos mecanismos de
adaptación.5 En general, de los microorganismos se han descrito 30,800
especies de protozoarios, 70,000 de hongos y 45,000 de bacterias;
aunque se pronostican hasta 2 millones de especies de hongos y de tres
a diez millones
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6. OBJETIVOS
6.1 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar la diversidad microbiana cultivable, asociada al
residuo lignocelulósico del proceso de beneficio de la hoja fique
(furcraea andina) en mogotes, Santander.
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar los microorganismos cultivables presentes en el residuo
lignocelulósico de la hoja de fique (Furcraea andina) mediante el
uso de medios de cultivo específicos.
Establecer los grupos microbianos aislados más predominantes presentes en el residuo lignocelulósico mediante características morfológicas y bioquímicas.
Determinar la abundancia de microorganismos aislados presentes en el residuo lignocelulósico del beneficio de la hoja de fique.
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7. METODOLOGÍA
Se aplicó la metodología publicada por Felix J. Gutiérrez (Gutierrez, 2010) con algunas modificaciones, en las instalaciones de la Universidad de Santander UDES – Bucaramanga. Esta investigación fue de tipo descriptivo, donde se describieron los hechos observados y los datos son presentados de forma cuantitativa.
SITIO DE MUESTREO
Se realizó una visita a la finca experimental Jose Exelino Forero que cuenta con 4 hectáreas y alrededor de 3000 plantas de fique (Furcraea andina), ubicada en Mogotes Santander (ver figura 4); el municipio se encuentra a 33 kilómetros de San Gil en la provincia Guanentina del departamento, ubicado a 6° 29’ latitud norte, 72° 58’ longitud oeste.
Figura 4 Municipio de Mogotes en el departamento de Santander. Fuente:
https://tierracolombiana.org/municipios-de-santander/
TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras se realizó de forma aleatoria en tres diferentes tiempos durante el proceso de beneficio de la hoja de fique, con ayuda de recipientes de vidrio estériles de 200mL, se recolectaron 3 muestras cada una 150mL de residuo lignocelulósico, estas fueron transportadas en refrigeración a 4°C, con el fin de evitar la proliferación de otros
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microorganismos diferentes a aquellos presentes en las muestras. y procesadas en el laboratorio de agromicrobiología de la UDES. Las muestras fueron tomadas y transportadas según lo indicado por el manual para la toma de muestra para análisis microbiológico de la secretaria distrital de salud de Bogotá D.C. (Moreno Rojas , Zambrano Rodríguez , Martínez Lopera, Gonzáles Cuéllar, & Henríquez Iguarán , 2008) y tratadas de manea ética según lo propuesto por el Comité de ética para la investigación en salud lineamientos y síntesis del proceso 2009-2014 (Granada Osorio , 2014). PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
El método implementado fue el de dilución en placa. Las muestras fueron
homogenizadas a 100 RPM durante cinco minutos con ayuda del shaker;
transcurrido este periodo de tiempo se realizaron diluciones sucesivas en
base diez, hasta 10-6; tomando tubos de ensayo con 9mL de agua
destilada estéril y adicionando con ayuda de una micropipeta, 1000µL de
cada muestra al tubo 10-1 y así sucesivamente hasta la dilución de 10-6.
Cada tubo de dilución se agito en el vortex durante un minuto antes de
preparar la siguiente dilución.
7.1 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL
RESIDUO LIGNOCELULÓSICO Y CARACTERIZACIÓN
MORFOLÓGICA
SIEMBRA Y RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS
Las siembras se realizaron por duplicado, implementando la técnica de superficie en medio sólido de las diluciones 10-2, 10-4, y 10-6 con la ayuda de un asa triangular drigalsky o asa de hockey previamente esterilizada; se tomó 100µL de inóculo de cada dilución, con ayuda de una micropipeta y puntas estériles, el cual fue depositado en cajas de petri con agar Saboraud (Sabo) para el desarrollo de levaduras, Rosa de Bengala (RB) para el crecimiento de hongos filamentosos, y agar nutritivo (AN) (ver anexos 5-7)para bacterias las cuales mantuvieron durante 24 horas en control de calidad. La dilución permitió generar colonias separadas, cada colonia pudo proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad viable), la cual se contó como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas pudieron ser usadas no sólo para el conteo de poblaciones microbianas, sino también para el aislamiento de organismos (Ramirez., y otros, 1992).
33
Las cajas inoculadas se incubaron de la siguiente manera: Por 7 días a temperatura ambiente cajas con agar RB y de 24 a 48 horas, a 37ºC las cajas de petri con AN y Sabo. al finalizar los periodos de incubación para cada medio de cultivo se realizó su respectivo recuento directo, aplicando la siguiente formula:
𝑼𝑭𝑪
𝒎𝒍𝒐
𝑼𝑭𝑪
𝒈=
𝑵𝒐. 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒑𝒐𝒓 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 ∗ 𝒆𝒍 𝒇𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏
𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒔𝒆𝒎𝒃𝒓𝒂𝒅𝒂
(Linares, y otros, 2006)
IDENTIFICACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA
Bacterias En la caracterización macroscópica se seleccionó el método según MacFaddin en el 2006. La sección macroscópica consistió en observar las colonias que se desarrollan sobre la superficie del medio presentando una morfología con características comunes y particulares según los grupos bacterianos. Por lo tanto, se tuvo en cuenta los siguientes criterios: Tabla 4 Descripción de características de las bacterias según MacFaddin
(MacFaddin, 2006).
En la microscopia se tuvo en cuenta los siguientes criterios la cual está constituida por Forma, Agrupación y Tinción de Gram (MacFaddin, 2006).
Criterio Descripción
Tamaño Grande, mediana, pequeña y puntiforme
Forma de crecimiento Borde
Elevacion de la colonia No elevada: plana, Elevada: convexa, umbilicada, mamelonada y papilar
Consistencia Blanda, dura, mucoide
Aspecto Brillante u opaco, mate o translucida
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Figura 5 Caracteristicas microscópicas para bacterias según (MacFaddin,2006)
Tinción de Gram La tinción Gram es una prueba potente y rápida que nos permitió diferenciar dos clases de bacterias: Bacterias Gram positivas y las Gram negativas (MacFaddin, 2006). Las Bacterias Gram positivas se tiñen de morado ya que el colorante queda atrapado en la capa gruesa de peptidoglucano que rodea a la célula. Las Bacterias Gram negativas tienen una capa de petidoglucano mucho más delgada es por ello que no retiene el cristal violeta y por esto las células se tiñen con safranina y las observamos rojo rosado. Hongos Filamentosos Para lograr la visualización de estructuras de los hongos se utilizó la tinción con azul de lactofenol. Para la identificación de los hongos filamentosos asilados fue necesario la utilización de claves taxonómicas, para ello se tuvo en cuenta las características macro y microscopias, es así como fue preciso examinar los aislamientos en el medio de cultivo y confrontarlo con las descripciones reportadas en la literatura sobre la
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identificación de hongos filamentosos (Barnett, 1972). Además, el uso de la aplicación mycelium touch diseñada para la caracterización microscópica y macroscopica de hongos filamentosos la cual permitió reconocer la estructura de microorganismos Ofrecido por: mycelium touch versión 1.0 Correo electrónico del programador [email protected] PURIFICACIÓN DE COLONIAS
Después de realizar la caracterización morfológica y seleccionar las
colonias que presentaban diferencias en su caracterización
macroscópica, se procedió a realizar la purificación de colonias para
bacterias, hongos y levaduras en agar nutritivo, agar rosa de bengala y
agar papa dextrosa respectivamente.
7.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PARA BACTERIAS Y
LEVADURAS.
BACTERIAS
Al obtener las bacterias previamente aisladas, se caracterizaron
bioquímicamente teniendo en cuenta lo reportado por Koneman en el
2008 con las siguientes pruebas: Fermentación y oxidación de hidratos
de carbono y Rojo de metilo (RM) y MacFaddin en el 2008 para las
pruebas de: Voges Porskauer (VP), TSI (Tres Azucares), SIM (Sulfuro-
Indol-Movilidad), LIA (Agar lisina – hierro), Reducción de nitratos (ver
anexos 8-14).
LEVADURAS Las levaduras fueron identificadas mediante la técnica API 20 AUX, la cual consta de una galería de 20 cúpulas con sustratos deshidratados que permitieron realizar 10 pruebas de asimilación. Las cúpulas se inocularon con un medio mínimo semisólido y las levaduras solo se reproducen si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Esta prueba permite identificar 34 especies diferentes. La lectura de estas reacciones se realizó por comparación con un control de crecimiento y la identificación se obtuvo, a partir de un código numérico, mediante un catálogo analítico o un programa informático (Linares Sicilia & Solís Cuesta, 2007 ).
7.3 MÉTODO DE CONSERVACIÓN
TUBO CON AGAR INCLINADO
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Este tipo de técnica es utilizada con gran frecuencia para aplicaciones microbiológicas, especialmente en la conservación de cepas. Para ello se precisa una superficie grande de medio de cultivo, que se puede obtener mediante agar inclinado (Koneman, y otros, 2008).
Se preparó con medio de cultivo PDA para hongos, AN para bacterias y
Sabo para levaduras esterilizado en tubos con el respectivo agar
inclinado, seguidamente se sembraron los microorganismos
respectivamente que van a ser conservados a 4°C o 9°C con aceite
mineral.
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8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 AISLAMIENTO DE MIRCROOGANISMOS PRESENTES EN EL
RESIDUO LIGNOCELULOSICO
SIEMBRA Y RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS Los microorganismos que se lograron aislar después de realizar las siembras fueron 55 microorganismos entre bacterias hongos y levaduras (tabla 6) a partir del bagazo de fique. Tabla 6. Número de microorganismos aislados presentes en las tres muestras recolectadas.
Muestra A Muestra B Muestra C Total
Bacterias 12 12 12 36
Hongos 2 3 1 6
Levaduras 2 4 7 13
Total 16 19 20 55
A partir de las tres muestras analizadas se obtuvo un total de 33 aislados bacterianos, 6 de hongos y 13 de levaduras; estos resultados resultan ser similares a los resultados obtenidos en diversos estudios realizados a la pula del café (41 aislados), el bagazo de caña de azúcar (93 bacterias) y residuos lignocelulósicos de la higuerilla (40 aislados), presentándose un mayor porcentaje de bacterias seguido de los hongos y por ultimo de las levaduras (Payán Bastidas, 2011) (Valiño, Torres, & Abelo, 2002) (Meneses Cabezas, 2011). Los microorganismos encontrados utilizan el residuo lignocelulosico como sustrato, para su desarrollo, debido a que este contiene grandes cantidades de celulosa, glucosa, sacarosa, fructuosa, proteínas, fosforo calcio, potasio minerales y agua, los cuales son aprovechados por las diferentes comunidades microbianas, donde ocurren procesos de biotransformación metabólica y se pueden encontrar sustancias de interés industrial.
La concentración de microorganismos encontrados por cada muestra
varia significativamente (Ver anexo 2 y 3), esto puede deberse tanto a las
características físicas y químicas que presentaba la hoja del fique al
momento de su proceso de desfibrado, ya que estas características
pueden variar dependiendo de la edad de la planta y las condiciones del
cultivo en el que se encuentra. Las hojas a procesar son recolectadas
aproximadamente 24 horas antes de realizar el proceso de desfibrado
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este tiempo da paso al inicio de fermentación de la misma generando un
aumento en la concentración de levaduras, encargadas de realizar estos
procesos fermentativos
8.2 CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA
8.2.1 CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA
PARA BACTERIAS
En el proceso de recuperación se obtuvieron 3,18X107 UFC/ml para las
bacterias de las tres muestras recolectadas; las cepas fueron
enumeradas para poder realizar los procedimientos de identificación. En
total se aislaron 20 aislados (anexo 4) sembrados en el medio agar
nutritivo y se les realizó una descripción macroscópica y microscópica
como se observa en las siguientes figuras 7, 8, 9, 10, 11 y 12:
Figura 6 Porcentaje de los tamaños que presentaron las colonias aisladas.
40%
50%
10%
Tamaños de los aislados
Puntiforme Pequeña Mediana
39
Figura 7 porcentaje de la elevación de las cepas bacterianas aisladas.
Figura 8 porcentaje de los bordes presentados en las cepas aisladas.
40%
20%
40%
Elevación de los aislados
Elevada Plana Convexa
80%
20%
Borde de los aislados
Entera Irregular
40
Figura 9 Porcentaje de la apariencia de los aislados encontrados en el residuo lignocelulósico.
Figura 10 Porcentaje de las pigmentaciones presentadas por las cepas bacterianas aisladas.
35%
30%
35%
Apariencia de los aislados
Brillante Opaca Traslucida
95%
5%
Pigmentación de los aislados
Crema Amarillas
41
Figura 11 Porcentaje de las características microscópicas de las colonias aisladas.
Las colonias bacterianas poseen una medida, forma, textura y en algunos
casos color característico lo cual permite diferenciar bacterias en cultivos
mezclados. Sin embargo, esto no es suficiente para una identificación
completa, se requiere estudiar su microscopia y sus características
bioquímicas. Como se observa en la Figura 7, los crecimientos de las
colonias de bacterias presentaban características variadas; aquellas
colonias que se describen puntiformes tienen aproximadamente 0,5mm
de diámetro o inferiores, medianas al rededor 1 a 2mm de diámetro y las
grandes de 4 a 6mm de diámetro (MacFaddin, 2006).
Aquellas colonias que en sus características presentaron un aspecto donde su borde es definido, se debe a presencia de capsula bacteriana debido a que está formada por una serie de polímeros orgánicos que se depositan en el exterior de su pared celular. Generalmente contienen glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y amino-azúcares. Por otro lado, la capa de material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa mucosa o glucocalix. Estas características son comunes bacterias gram negativas. (Tauro & Kapoor, 1996).
Se obtuvieron 20 aislados, los cuales presentaron características macroscópicas de forma: puntiforme (40%), irregular (15%) y circular (80%), borde: continuo (80%), irregular (20%); elevación: plana (20%),
35%
5%
10%15%
5%
30%
Caracteristicas microscópicas
Bacilos Gram negativos Bacilos cortos Gram positivos
Cocobacilos Gram positivos Bacilos Gram positivos
Bacilos cortos Gram negativos Cocobacilos Gram negativos
42
elevada (40%), convexa (40%); propiedad óptica: brillante (40%), brillante traslucida (30%) y opaca (30%); tamaño: pequeñas (55%) y mediana (45%).
La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular. Se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndricas o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral). De las 20 bacterias seleccionadas la morfología más predominante fue la bacilar con un 60%, presentándose, bacilos muy cortos denominados cocobacilos con un 40%, al realizar una coloración diferencial como lo es la tinción de Gram se obtuvo que la mayoría fueron bacterias Gram negativos con un 70%, y un 30% que presentaban tinción Gram positiva; se encontraron bacilos Gram negativos 35%, cocobacilos Gram negativos 30%, bacilos Gram positivos 15%, cocobacilos Gram positivos 10% y bacilos cortos Gram positivos y bacilos cortos Gram positivos 5% cada uno ver figura 12.
La cantidad de aislados bacterianos encontrados en este estudio arrojaron un resultado similar al encontrado en el estudio “BACTERIAS AISLADAS DEL JUGO DE FIQUE CON ACTIVIDAD ANTAGÓNICA SOBRE Phytophthora Infestans (Mont.) de Bary” realizado por Otero y colaboradores en el 2014, donde encontraron 25 aislados bacterianos del jugo de fique con características microscópicas similares.
8.2.2 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS
DE LOS HONGOS
Después de los recuentos realizados (ver anexo 1) en los medios PDA y RB, se realizó la purificación de aquellos que presentaban características macroscópicas diferentes en medios de cultivo selectivos para determinar el tipo de microorganismo y definir características macroscópicas y microscópicas de cada una de las colonias.
A partir de la técnica de dilución en placa fue posible el aislamiento de hongos filamentosos, debido a que se utilizó un medio enriquecido y selectivo gracias a la adición de Cloranfenicol que permitió obtener un estimativo de la población viable cultivable (Valencia & Cabrales, 2001). Por otro lado, Mueller y colaboradores, 2004 confirman que es uno de los métodos más utilizados por ser sencillo y rápido para el crecimiento de hongos (Mueller, Bills, & Foster, 2004). A continuación, se realizó la descripción de las morfologías microscópicas, macroscópicas de los hongos aislados.
43
Tabla 5 Descripción macroscópica y microscópica de los hongos aislados.
H1
Descripción Observación Macroscopía
Este hongo presenta una forma circular, con un color frontal verde grisáceo y en su reverso un color oscuro, presenta una elevación baja y una textura aterciopelada
Fuente: autor
Observación Microscopía
44
Presenta hifas hialinas, con ausencia de septos, su conidióforo es delgado y simple, presenta metulas múltiples, las fialides son ramificadas en forma de botella, sus esporas están dispuestas en cadena con estructura circular y pared lisa, no presenta clamidosporas.
Fuente: autor
H2
Descripción Observación Macroscópica
Presenta una forma irregular, su color frontal es grisáceo y el reveso claro, su elevación es baja y su textura es pulverulenta.
Fuente: autor
Observación Microscópica
En su microscopia se observan hifas gruesas, hialinas y sin septos, su conidióforo es simple y su metula engrosada, sus esporas son circulares de borde liso.
Fuente: autor
45
H3
Descripción Observación macroscópica
Presenta una forma irregular, su color frontal es grisáceo y el reveso oscuro, su elevación es baja y su textura es pulverulenta
Fuente: autor
Observación microscópica
Presenta hifas hialinas, con ausencia de septos, su conidióforo es delgado y simple, presenta metulas ramificadas, las fialides son ramificadas en forma de botella y cortas, sus esporas están dispuestas en cadena con estructura circular y pared lisa, no presenta clamidosporas
Fuente: autor
H4
Descripción Observación macroscópica
46
Presenta una forma circular, su color frontal es blanco y su reverso es claro, tiene una elevación alta, y una textura algodonosa
Fuente: autor
Observación microscópica
Este hongo presenta hifas hialinas sin presencia de septos, su conidióforo es delgado y ramificado, presenta metulas ramificadas, las fialides son ramificadas en forma de botella y cortas, no presenta clamidosporas
Fuente: autor
H5
Descripción Observación macroscópica
Presenta una forma circular, con anillos concéntricos, su color frontal es verde y blanco por el micelio más joven y su color en el reverso es color cremoso, presenta elevación y su textura es aterciopelada
Fuente: autor
47
Observación microscópica
Presenta hifas hialinas, con ausencia de septos, su conidióforo es delgado y simple, presenta metulas ramificadas, las fialides son ramificadas en forma de botella y muy cortas, sus esporas presentan una estructura circular y pared lisa, no presenta clamidosporas
Fuente: autor
H6
Descripción Observación macroscópica
Este hongo presenta una forma irregular, su color frontal es grisáceo, el color en su reverso es cremoso con una ligera tonalidad rosada en el lugar de punción, presenta elevación solo en el centro del mismo y su textura es pulverulenta.
Fuente: autor Observación microscópica
Presenta hifas hialinas, con ausencia de septos, su conidióforo es delgado y ramificado, presenta metulas ramificadas, las fialides son ramificadas en forma de botella, sus esporas están dispuestas de a dos, con
48
estructura circular y pared lisa, no presenta clamidosporas
Fuente: autor
Los hongos descomponedores son un grupo ecológicamente importante de microorganismos involucrados en el reciclamiento del carbono en los suelos y su hábitat es la parte superior de los suelos en bosques y prados, que son ricos en materia orgánica como la celulosa, hemicelulosa y lignina, provenientes de plantas muertas (hojas y ramas). La biodegradación de la lignina es un paso clave para el reciclamiento de carbono en los ecosistemas terrestres, donde los basidiomicetes degradan los polímeros de la madera facilitando la utilización de la celulosa por poblaciones microbianas. Sin embargo, estudios demuestran que existen Ascomycetes capaces de degradar la lignina como Fusarium oxysporum, Penicilium sp. y sobre todo el género Aspergillus (Meneses Cabezas, 2011).
Según estudios realizados por (Atlas & Barttha, 2005) ATLAS & BARTHA
(2005), los géneros de hongos encontrados más frecuentemente en
residuos con presencia de celulosa son hongos celulolíticos como
Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Trichoderma. En este trabajo se
encontró la presencia principalmente de dos hongos Aspergillus sp. y
Penicillium sp. que se lograron identificar al comparar las estructuras de
los hongos con la clave taxonómica de hongos imperfectos de Barnet y
Hunter. Estos hongos también fueron encontrados en estudios realizados
por (Payán Bastidas, 2011), (Meneses Cabezas, 2011) y (Escobar
Escobar , Mora Delgado , & Romero Jola, 2012), en bagazo de café,
residuos de higuerilla y residuos orgánicos (pulpa de café, banano,
gallinaza y bovinaza) respectivamente.
49
Las especies del género Aspergillus, son consideradas de gran
importancia en las actividades humanas, son capaces de asimilar como
alimento una enorme variedad de sustancias, debido al gran número de
enzimas que pueden producir para degradarlas. Los dos requisitos
principales que deben tener los diferentes sustratos para que se
desarrollen estos hongos son la presencia de algún tipo de materia
orgánica y un poco de humedad; esta adaptabilidad a cualquier sustrato
y condición ambiental puede ser aprovechada para procesos de
biorremediación o biotransformación beneficiosos para el hombre y el
medio ambiente.
Este organismo es ampliamente utilizado en la producción de una gran
variedad de glucanasas, capaces de degradar completamente la
celulosa. Las glucanasas son utilizadas en muchos procesos industriales,
como bioblanqueo, panificación, extracción y clarificación de jugos,
elaboración de alimento animal, industria textil (Arias Cifuentes & Pieros
Espinosa, 2008).
Los microorganismos del genero Penicilillium presentan una gran
distribución por todo el mundo y consideradas saprófitas, muchas de
ellas viven en el suelo o en materia orgánica en descomposición. El
primer y mayor uso industrial de Penicillium fue la produccion de la
penicilina, sin embargo, sus usos a nivel industrial fueron aumentando
con el paso de los años hasta lograr la obtención de enzimas,
principalmente de pectinasas, gluconasa oxidasa y catalasa; este hongo
al igual que otros comparte muchas rutas metabólicas con animales y
plantas y poseen la capacidad de sintetizar metabolitos muy complejos
como los benzodiacepinas (Martínez Benítez, 2003).
8.3 BIOQUÍMICA
8.3.1 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PARA LAS BACTERIAS
De las cepas aisladas y purificadas presentadas en la tabla 8. se
realizaron las siguientes pruebas bioquímicas:
OF: Glucosa (GLU), Sacarosa (SAC), Manitol (MANI), Maltosa
(MAL), Lactosa (Lac).
Motilidad
Rojo de metilo (RM)
Voges Porskauer (VP)
50
Reducción de Nitratos (RN)
Prueba de agar tres azucares (TSI)
Agar Lisina Hierro (LIA)
Fenilalanina desaminasa (FEA)
Sulfuro-Indol-Motilidad (SIM)
Tabla 6 Pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas aisladas.
Colonia FEA TSI RM RN (nitritos
residuales)
LIA SIM Motilidad VP SAC GLU MANI MAL LAC
1 - - - + - - + - + + - + -
2 - - - - - - + - - - + + +
4 - - + + + - + - - - - - -
5 - - - - + + + - + - + - -
6 - - + + + - - - - - - - -
8 - + - + - - + - + + + + +
9 - + - + - - + - + + - + +
10 - - - + - - + - - + + - +
11 - - + + - - + - + - - - -
12 - - - + - - + - - + + + +
14 - + + + - - + - + + + + +
15 - - + + - - + - - - - - -
16 - + - - - - + - + + + + +
17 - + - + - - + - + + + + +
18 - - - + - - + - - - - + -
19 - + + + - - + - + + + + +
20 - - - + - - + - + + + + -
Fenilalanina desaminasa: esta prueba permite la detección de la
fenilalanina desaminasa, es útil para la diferenciación inicial de especies
de Proteus. Morganella y Providencia (Winn, y otros, 2008) como se
observa en la tabla los microorganismos aislados no presentan esta
enzima responsable de la desaminación oxidativa de la fenilalanina,
descartando la presencia de las especies ya mencionadas.
Agar tres azucares: Para determinar la fermentación de
carbohidratos y la producción de sulfuro. cuando un microorganismo
no puede fermentar la glucosa, en el tubo de ensayo se presenta una
reacción alcalina en todo el agar (sin cambios), los microorganismos
51
contrastados a esta prueba no presentaron cambios en la coloración del
agar exceptuando las cepas (8,9,14,16,17,19), lo cual indica la ausencia
de producción de ácido y la incapacidad de los microorganismos para
degradar los tres azucares, por otro lado la producción de ácido por la
fermentación de la glucosa, sacarosa y lactosa, genera una reacción
acida/acida (A/A). Esta se evidencia por la aparición de un color amarillo
(Cambio del indicador rojo de fenol) en el medio de cultivo, que indica la
reacción positiva (Koneman, y otros, 2008).
Rojo de metilo: esta es una prueba cuantitativa de la producción de
ácido, que requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes
como láctico, acético fórmico, a partir de la glucosa mediante la vía de
fermentación ácido mixta, lo cual produce que se baje el pH del medio.
Un resultado positivo se representa por la formación de un aro rojo en la
superficie al agregar la solución de rojo de metilo, para las bacterias
puestas a prueba solo las cepas 4,6,11, 14, 15 y 19 produjeron una
reacción positiva (Koneman, y otros, 2008).
Reducción de nitratos: la reducción de nitratos a nitritos es uno de los
primeros pasos empleado por los microorganismos para liberar oxigeno
el cual es un aceptor final de hidrogeno en el metabolismo oxidativo, la
presencia de una coloración rojiza al agregar ácido sulfanílico y α-naftol
indica que el nitrato fue reducido a nitrito pero si no se presenta esta
coloración la reacción no se ha completado o la reducción a proseguido
hasta la formación de otros compuestos o hasta gas nitrógeno, en
nuestro caso solo las cepas 2,5 y 16 lograron el proceso de reducción de
nitratos a nitritos, las demás cepas al agregar polvo de zinc la coloración
se tornó roja lo que indica la presencia de nitratos residuales (Koneman,
y otros, 2008) dándose un resultado negativo de la prueba.
Agar lisina hierro: Algunos microorganismos son capaces de provocar
la descarboxilación de los aminoácidos por inducción de enzimas
específicas, el resultado de esta descarboxilación es la producción de
una amina (o diamina) y dióxido de carbono, con este medio se puede
detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una
reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como
indicador purpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio
hacia amarillo en el fono indica que la reacción fue acida por la
fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Las
cepas con un resultado positivo (4,5,6) indican que produce lisina
descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la
52
cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando
un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa (Koneman,
y otros, 2008).
Sulfuro indol motilidad: este es un medio combinado para la detección
de motilidad, la producción de indol y sulfuro de hidrógeno; algunas
bacterias tienen la capacidad de liberar azufre de los aminoácidos que
contienen este elemento u otros compuestos en forma de sulfuro de
hidrogeno (H2S), para la detección del sulfuro se emplea un sulfuro
insoluble de un metal pesado, que produce un precipitado negro en el
medio. De las cepas evaluadas solo una presento una coloración negra
(5) indicando la producción de H2S; en cuanto a la motilidad, es un factor
importante en la identificación final de una especie, las bacterias capaces
de moverse lo hacen por medio de flagelos que pueden ser múltiples y
su localización varía dependiendo de la especie, para determinar que una
bacteria posee motilidad se evidencia una turbidez y una difusión en el
medio teniendo como base la línea de inoculación del microorganismo,
en cuanto a esta prueba en la tabla 6 se muestra que la única cepa que
no presento motilidad fue la número 6; por último el indol, es uno de los
productos de la degradación del metabolismo del aminoácido triptófano,
las bacterias que poseen la enzima triptofanasa pueden dividir el
tirptofano en indol, ácido pirúvico y amoniaco, para detectar la presencia
del indol se debe agregar el reactivo de Kovacs o de Ehrlich, este último
es utilizado principalmente cuando se evalúan bacilos no fermentadores
o anaerobios debido a que su producción es mínima y este reactivo es
más sensible, de acuerdo con los resultados obtenidos solo una cepa
presento producción de indol la mismas capaz de producir H2S la número
5.
Voges Porskauer: esta prueba se basa en la conversión del
acetilmetilcarbinol en diacetilo, mediante la acción del hidróxido de sodio
y el oxígeno atmosférico, mediante la vía de la fermentación del 2,3
butilenglicol, las bacterias capaces de implementar esta vía son
principalmente de los grupos Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Hafnia,
ellas no producen grandes cantidades de ácidos mixtos, por lo que el pH
del medio Rojo de metilo no desciende y no se produce un cambio de
color, en consecuencia la mayoría de las especies de enterobacterias VP
positivas (con raras excepciones), son Rojo de metilo negativas y
viceversa, en nuestro caso las cepas evaluadas no presentaron la
conversión de acetoína en diacetilo (Koneman, y otros, 2008).
53
O-F: Oxidación-Fermentación de carbohidratos (Glucosa, sacarosa,
lactosa, manitol, maltosa): La utilización del sustrato en el tubo de
ensayo abierto (Sin recubrimiento de aceite) indica un metabolismo
oxidativo y el tubo de ensayo cerrado que está cubierto con aceite mineral
determina el metabolismo fermentativo. El medio contiene azul de
bromotimol como indicador de pH que vira de verde (pH = 6.9) a amarillo
(pH < 6.6) cuando se acidifica el medio (Koneman, y otros, 2008).
A partir de los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas y las
comparaciones realizadas en los libros de Manual de Bergey y
Diagnostico microbiológicos, se pudo determinar presuntivamente de las
20 bacterias aisladas la existencia de 9 microorganismos del género
Pseudomonas, 4 Bacillus y 7 de la familia Enterobacteriaseae.
Los organismos del género Pseudomonas son ampliamente distribuidos
en el ambiente, pueden encontrarse en suelos y agua tanto dulce como
salada; son microorganismos predominantes de la rizosfera y la filosfera
de las plantas. Su diversidad metabólica le permite colonizar un amplio
rango de nichos. Este género es uno de los más implementados en la
degradación de compuestos orgánicos, ya que presentan un amplio
potencial catabólico; son microorganismos claves en el reciclado de
materia y en los comportamientos aeróbicos de los ecosistemas; juegan
un papel esencial en la mejora y el mantenimiento de la calidad
medioambiental. El uso a nivel industrial de estas bacterias vas desde la
fabricación de bioplásticos hasta técnicas de biocontrol (Payán Bastidas,
2011). Algunas de estas bacterias son capaces de presentar roles de
oportunistas en humanos, ser patógenos de platas o promotoras de
crecimiento vegetal (PGRP) por sus sigas en inglés, en la producción de
Auxinas, solubilizadoras de fosfatos y pueden presentar antagonismo
ante microorganismos fitopatógenos (Rodriguez Gonzalez, 2013); en
este estudio que la mayoría de bacterias aisladas fueran de este género
puede deberse a su capacidad de generar antagonismo ante otros
microorganismos, lo cual leda una ventaja en la colonización de este
residuo lignocelulósico.
El género Bacillus sp. son bacterias saprofitas y es posible encontrarlas
en diferentes ambientes, algunas de sus especies son usadas a nivel
industrial para el control biolgico como el caso de B. thurigiensis (Payán
Bastidas, 2011),también poseen la capacidad de comportarse como
PGRP al producir giberelinas, ácido indol acético y citoquinas, también
causan beneficio a las plantas mediante la prduccion de biosurfactentes
54
y antibióticos, solubilización de fosfatos y actividad antagónica frente a
otros microorganismos fitopatógenos (Rodriguez Gonzalez, 2013).
La Familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos y cocobacilos
gram negativos anaerobios facultativos, no formadores de esporas,
fermentadores de glucosa, no presentan actividad de citocromooxidasa
(son oxidasa negativa), reducen nitratos a nitritos y las especies móviles
lo son mediante flagelos de distribución peritrica. Están diseminadas en
la naturaleza, y pueden ser encontradas en diferentes matrices de
estudio (Puerta & Mateos, 2010). Algunas especies de esta familia tiene
la capacidad de realizar asociaciones con plantas, son capaces de fijar
nitrógeno, pueden degradar materia lignocelulosica para la producción
de etanol y son capaces de solubilizar fosfatos (Rodriguez Gonzalez,
2013).
En estudios realizados a residuos lignocelulósicos de Higuerilla y Café,
se encontraron microrganismos de las especies de Achromobacter,
Klebsiella sp, Bacillus sp, Pseudomonas sp y Halomonas sp,
identificadas molecularmente (Meneses Cabezas, 2011) (Payán
Bastidas, 2011).
8.4 CARACTERIZACIÓN PARA LEVADURAS
En el caso de las levaduras se lograron aislar 17 levaduras, las cuales
pertenecieron presuntivamente según pruebas bioquímicas para
levaduras API 20 AUX a 8 géneros diferentes como se observa en la
tabla
Tabla 7 Identificación bioquímica de levaduras API 20 AUX.
Cepa Resultado API 20 AUX
Lev 2 Candida famata
Lev 4 Cryptococcus laurentii
Lev 5 Cryptococcus terreus
Lev 6 Candida boidinii
Lev 7 Stephanoascus ciferrii
Lev 11 Rhodotorula glutinis
Lev 12 Candida zeylanoides
Lev 15 Candida sphaerica
Según estudios realizados por Olvera en el 2003 citado en (Huanaco,
2008), se han registrado hongos levaduriformes con la capacidad de
55
degradar lignina, como Candida sake, Cryptomyces laurentii,
Rhodotorula glutinis.
Candida famata es una levadura perteneciente al grupo de las levaduras
flovogenicas por su capacidad de producir riboflavinas en ausencia de
hierro; durante muchos años en estados unidos se implementaron
algunas cepas de esta levadura para la producción de riboflavinas por
sus características de resistencia a la salinidad y sus capacidad de
generar herramientas básicas para la ingeniería metabólica, como los
sistemas de transformación, marcadores selectivos, en la mutagénesis
inserciones entre otros (V. Dmytruk & A. Sibirny, 2012), esta levadura
también es causante de infecciones en sangre en los humanos y graves
retinopatías (University of Houston College of Pharmacy, 2013 ).
Rhodotorula glutinis esta levadura fue considerada por mucho tiempo
como saprofita, estudios recientes han demostrado su potencia
biotecnológico, esta levadura es capaz de sintetizar numerosos
metabolitos implementados en la industria como lípidos, carotenoides y
enzimas, dentro de su principal ventaja metabólica está su capacidad de
crecimiento y síntesis de metabolitos en sustratos de desechos
industriales, lo cual incrementa la rentabilidad en procesos
biotecnológicos (Kot, Błażejak, Kurcz, Gientk, & Kieliszek, 2016 ).
Con respecto a las otras levaduras según la literatura hacen parte de
microorganismos oportunistas causantes de diferentes infecciones y
micosis como infecciones en sangre, infecciones pulmonares y micosis
invasivas en pacientes inmunodeprimidos.
8.5 CONSERVACIÓN DE AISLADOS
Los aislados fueron conservadas en tubos de ensayo con agar inclinado
según el tipo de microorganismos; Bacterias en agar nutritivo, Hongos en
agar Rosa de Bengala y Saboraud para Levaduras, con aceite mineral,
esto con el fin de iniciar un banco de aislados de este residuo, para el
desarrollo de futuras investigaciones.
56
9. CONCLUSIONES
La metodología empleada para el aislamiento, logró una gran cantidad de 55 aislados entre bacterias, hongos y levaduras a partir del residuo lignocelulósico de la hoja de fique, encontrándose mayor porcentaje de bacterias con un 65%, esta abundancia microbiana se relaciona con la carga encontrada en diferentes residuos lignocelulosicos y en el suelo cultivado con esta planta donde la mayor carga es bacteriana. Mediante la clasificación morfológica y las pruebas bioquímicas
realizadas se identificaron presuntivamente microorganismos del genero
Aspergillus sp., Penicillium sp, Candida famata, Rhodotorula glutinis los
cuales pueden ser implementados en procesos industriales de gran
interés, la conservación de estos microrganismos genera la obtención de
un banco de cepas, lo que abre paso a futuras investigaciones que
permitan mitigar el impacto ambiental, implementando estos residuos y
generando un valor agregado a este cultivo.
Las muestras con mayor abundancia de microorganismos, fueron la A y
la B con un aproximado de 173,74 y 180,74 UFC/mL respectivamente,
esto puede explicarse a las características físico-quimicas de la hoja al
momento de beneficio, ya que estas características pueden variar
dependiendo de la edad de la planta.
El presente estudio amplia el conocimiento sobre la carga microbiológica
presente en el residuo lignocelulosico del fique, ya que son pocas las
investigaciones realizadas sobre este tema.
10. RECOMENDACIONES
Las metodologías implementadas para el desarrollo de este proyecto
fueron las indicadas, hasta el punto de demostrar algunas de sus
características bioquímicas hasta llegar a una identificación presuntiva,
pero se recomienda realizar análisis moleculares, para la identificación
de los microorganismos encontrados y así tener una mayor certeza sobre
los posibles usos y aplicaciones industriales.
57
Se recomienda al momento de recolectar la muestra suplementar la
muestra con un caldo nutritivo, con el fin de obtener una mejor viabilidad
y desarrollo de los microorganismos de la muestra y al momento de
realizar los aislamientos realizar una siembra directa de las muestras,
con el fin de obtener una mejorar la recuperación de los
microorganismos.
58
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12. ANEXOS
Conteo de microorganismos
Anexo 1. Número de microorganismos por muestra se presenta a
continuación:
Figura 12 Número de microorganismos aislados presentes en las tres muestras recolectadas.
Anexo 2. Concentración de bacterias, hongos y levaduras aisladas por
cada muestra analizada.
Tabla 8 Concentración de bacterias, hongos y levaduras, encontradas en cada dilución en la muestra A.
A
Bacterias Hongos Lev UFC/Ml
10,2 30000 100 5100
10,4 717500 67500 25000
10,6 88000000 250000 0
Tabla 9 Concentración de bacterias, hongos y levaduras, encontradas en cada dilución en la muestra B.
B Bacterias Hongos Lev
153,25
123,83 118,58
2,66 6,41 0,83
17,83
50,5
17,16
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
A B C
UFC
Muestras
Recuento de microrganismos por muestra
Bacterias
Hongos
Levaduras
65
UFC/Ml
10,2 30000 1100 14900
10,4 695000 30000 25000
10,6 2000000 5250000 0
Tabla 10 Concentración bacterias, hongos y levaduras, encontradas en cada dilución en la muestra C
C
Bacterias Hongos Lev UFC/Ml
10,2 30000 25 4700
10,4 522500 10000 30000
10,6 3500000 1250000 1500000 .
Anexo 3. concentración de baterías, hongos y levaduras aisladas de las
tres muestras analizadas fue la siguiente:
La concentración de cada microorganismo se representó por UFC/mL.
Figura 13 Concentración de bacterias hongos y levaduras aisladas a partir de las tres muestras analizadas.
Anexo 4. Características macroscópicas y microscópicas de las cepas
bacterianas aisladas del residuo lignocelulósico.
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
3,00E+07
3,50E+07
Bacterias Hongos Levaduras
UFC
/mL
Aislados
Concentracion de microorganismos aislados
66
Tabla 11 Características macroscópicas y microscópicas de las cepas aisladas.
Colonia Características macroscópicas Características microscópicas
1 puntiforme, continua, translucida, opaca Bacilos Gram negativos
2 puntiforme, translucida, continua Bacilos cortos Gram
positivos
3 pequeña, brillante, convexa, continua,
translucida Cocobacilos Gram
positivos
4 puntiforme, brillante, crema, continua Bacilos Gram positivos
5 pequeña, crema, convexa, continua, opaca Bacilos cortos Gram
negativos
6 amarilla, pequeña, convexa, opaca, continua Bacilos Gram positivos
7 pequeña, crema, brillante, continua, convexa Bacilos Gram negativos
8 puntiforme, continua, translucida Bacilos Gram negativos
9 pequeña, opaca, plana, crema, discontinua Cocobacilos Gram
negativos
10 cremosa, pequeña, brillante, continua, convexa Cocobacilos Gram
negativos
11 pequeña, crema, brillante, continua, convexa Cocobacilos Gram
positivos
12 puntiforme, continua, translucida Bacilos Gram negativos
13 puntiforme, continua, translucida Bacilos Gram negativos
14 puntiforme, continua, translucida Bacilo Gram negativos
15 opaca, plana, crema, convexa, brillante Bacilos Gram positivos
16 pequeña, irregular, plana opaca, crema Cocobacilos Gram
negativos
17 pequeña, brillante, continua, cóncava, crema Cocobacilos Gram
negativos
18 opaca, plana irregular, crema, pequeña Cocobacilos Gram
negativos
19 pequeño, continua, crema, convexa, brillante Cocobacilos Gram
negativos
20 puntiforme, continua, crema Bacilos Gram negativos
Anexo 4. Evidencia fotográfica
Aislamientos de microorganismos
67
Figura 14 Aislamiento de microorganismos en medios Sabouraud y agar nutritivo, de las muestras analizadas del residuo lignocelulósico (A. crecimiento microbiano en dilución 10-6 de la muestra A, B y C crecimiento de cepa bacteriana en la dilución 10-2
en agar nutrivo de las muestras C y B respectivamente.
Caracterización microscópica de algunas de las cepas aisladas del
residuo lignocelulósico.
Figura 15 Tinción de Gram realizada a cepas aisladas de las muestras analizadas del residuo lignocelulósico. A. Bacilos cortos Gram positivos, B. Cocbacilos Gram negativos, C. Bacilos Gram positivos, D. Cocobacilos Gram negativos, E. Cocobacilos Gram positivos y F. Bacilos Gram negativos.
A B C
A B C
D E F
68
Evidencia de las pruebas Bioquímicas realizadas a las bacterias aisladas
del residuo lignocelulósico
69
Figura 16 Evidencia de algunas pruebas bioquímicas efectuadas a las bacterias aisladas a partir del residuo lignocelulósico.
Pruebas Api 20 Aux
Figura 17 Lectura de la prueba Api 20 AUX, obtención de código para identificación del microorganismo en base informática.
Medios de cultivo
Medios para aislamiento
Anexo 5. Agar nutritivo
70
Medio de cultivo no selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Es
implementado para análisis de alimentos, aguas y otros materiales de
importancia sanitaria.
Composición (gramos por litro)
Pluripeptona………………5.0
Extracto de carne………...3.0
Cloaruro de sodio…………8.0
Agar…………………………15.0
pH final: 7,3 +/- 0,2
Anexo 6. Agar Sabouraud
Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de
honhos patógenos y saprofitos. También útil para el cultivo de levaduras.
El alto contenido de glucosa, y la presencia de cloranfenicol y el pH ácido,
inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y
levaduras.
Composición (gramos por litro)
Peptona……………………………….5,0
Tripteína………………………………5,0
Glucosa……………………………….40,0
Cloranfenicol………………………….0,05
Agar……………………………………15,0
pH final:5,6 +/- 0,2
Anexo 7. Agar rosa de Bengala
Medio ideal para la recuperación de hongos. Las bacterias
acompañantes son inhibidas por el cloranfenicol, antimicrobiano de
71
amplio espectro. El rosa de bengala limita la invasión dela placa por
mohos de crecimiento rápido.
Composición (gramos por litro)
Polipeptona………………………………5,00
Glucosa……………………………………10,00
Sulfato de magnesio…………………….0,50
Fosfato de potásico……………………...1,00
Rosa de bengala…………………………..0,06
Cloranfenicol……………………………….0,20
Agar………………………………………….15,00
pH final: 7,2 +/- 0,2
Medios para pruebas bioquímicas
Anexo 8. MEDIO DE CULTIVO OF (OXIDACION - FERMENTACION)
SEGUN HUGH Y LEIFSON.
Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suelen utilizar diferentes fuentes de carbono. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador (azul de bromotimol). La bacteria se inocula y se incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado), simultáneamente.
Composición: Peptona 2gr, Glucosa 10gr, Azul de bromotimol 0.03gr, Agar 2.5gr, Cloruro de sodio 5gr, Fosfato dipotásico 0.30gr, Agua destilada 1.000ml. pH 7.1. Color del medio: verde. Interpretación: La producción de ácido fue detectada en el medio por la aparición de color amarillo. Las reacciones pueden ser:
72
Tubo sin aceite Tubo con aceite Tipo de metabolismo Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo Ácido (amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacarolítico Anexo 9. PRUEBA DE ROJO DE METILO - (RM) Composición: Peptona 7.0 gr, Glucosa 5.0 gr, Fosfato dipotásico 5.0 gr, Agua destilada 1.0 Lt. pH final 6.9. Color del medio: amarillo claro Revelador: Rojo de Metilo Técnica: Se Inoculó el caldo RM con una colonia del microorganismo en estudio. Incubar 24-48 horas a 37ºC. Finalizado este período se adicionó 5 gotas del Revelador Rojo de metilo. Interpretación: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indicó que la producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Cuando se dio la formación de un color amarillo la prueba fue negativa. Anexo 10. PRUEBA DE VOGES PROKAUER - (VP) Composición: Los mismos del Caldo Rojo de Metilo.
Reveladores: Solución A: ∝ naftol Solución B: Hidróxido de Potasio al 40% Técnica: Se Inoculó el caldo de VP con una colonia del microorganismo en estudio. Se Incubó a 37ºC por 24 horas. Al finalizar este período se adicionó 6
gotas de la solución A (∝ naftol) y 3 gotas de la solución B (Hidróxido de potasio al 40%). Se agitó el tubo suavemente y se dejó en reposo durante 10-15 minutos. Interpretación:
73
Una prueba positiva fue por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de añadir los reactivos reveladores por la presencia de acetoína. Una prueba negativa se da si el color es cobrizo. Anexo 11. AGAR TSI (TRES AZUCARES - HIERRO) Composición: Peptona de caseína 15 gr, Peptona de carne 5.0 gr, extracto de carne 3.0 gr, extracto de levadura 3.0 gr, cloruro sódico 5.0 gr, lactosa 10gr, sacarosa 10 gr, glucosa 1.0gr, citrato de amonio de hierro 0.5 gr, tiosulfato sódico 0.3 gr, rojo de fenol 0.024 gr, agar agar 12 gr. pH 7.4. Color del medio rojo naranja. Técnica: Se Inoculó el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio. Se Incubó a 37ºC por 24 horas. Interpretación: A: reacción ácida. Color amarillo. K: reacción alcalina. Color rojo naranja. Burbujas: producción de gas. Precipitado negro: Formación de HS A/A: Fermentación de los tres azúcares K/A: Fermentación de glucosa K/K: No hay fermentación de los tres azúcares Anexo 12. PRUEBA DE INDOL: MEDIO DE SIM (SULFURO-INDOL-MOVILIDAD) Composición: Peptona de caseína 20.0 gr, peptona de carne 6.6gr, citrato de amonio e hierro 0.2 gr, tiosulfato de sodio 0.2 gr, agar agar 3.0 gr. pH: 7.3. Color del medio: amarillo claro. Revelador: Reactivo de Kovacs. Técnica: Se Inoculó el medio realizando siembra por picadura a partir del microorganismo en estudio. Se Incubó a 24 horas a 37ºC. Al finalizar este período, se añadió 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo. Interpretación: El desarrollo de un color rojo fucsia en la interface del reactivo y del medio, segundos después de añadir el reactivo de Kovacs indicó la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.
74
Anexo 13. AGAR LISINA - HIERRO (LIA)
Composición: Peptona de carne 5.0 gr, extracto de levadura3.0gr, glucosa 1.0gr, lisina 10.0gr, tiosulfato sódico 0.04 gr, citrato de amonio e hierro 0.5 gr, púrpura de bromocresol 0.02gr, agar agar 12.5 gr. pH: Color del medio: violeta. Técnica: Se Inoculó realizando siembra mixta a partir de una colonia del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37ºC. Interpretación: A: reacción ácida. Color amarillo K: reacción alcalina. Color violeta R: reacción alcalina. Color rojo K/K: Descaboxilación de la lisina K/A: Fermentación de la glucosa. Descarboxilación negativa. R/A: Desaminación de la lisina. Fermentación de la glucosa. Anexo 14. PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATOS
Composición: Peptona de carne 8.6 gr, cloruro sódico 6.4gr, nitrato potásico 1.5gr. pH: 7.2. Color del medio: amarillo claro. Reveladores: Reactivo de Griess-Ilovays. Técnica: Se inoculó en el medio de nitrato con una parte de la colonia del microorganismo en estudio. Se incubó 24 horas a 37ºC. Después de este tiempo, se añadió al medio 5 gotas del reactivo de Griess-Ilovays. Interpretación: El desarrollo de un color rojo después de añadir el reactivo, indicó la presencia de nitritos y representa una prueba positiva. La ausencia de color tras el agregado del reactivo puede indicar que los nitratos no han sido reducidos (una verdadera prueba negativa) o que han sido reducido a productos distintos de los nitritos, como amoníaco, nitrógeno molecular u óxido nitroso e hidroxilamina. Por lo tanto, es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones negativas. Los iones de zinc tienen afinidad por los nitratos y el desarrollo de un color tras agregar polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.
75
