“CALIBRACIONES, FORMAS DE CALCULO Y MATERIALES DE CONTROL EN QUIMICA CLINICA”Por Lic. Wilfredo Gochez,

Calibraciones, formas de calculo y materiales de control en Quimica Clinica.

El proceso de la calibracion en Quimica Clinica es uno de los pasos mas criticos quedefine la calidad de los resultados en las pruebas.

Sin embargo en la literatura tradicional se encuentra muy poco material queexplique de forma clara, precisa y facil como realizarlo de manera que los principiantes en esta materia comprendan de manera practica y teorica en queconsiste la calibracion de las pruebas. Ademas la automatizacion de los analisis en quimica clinica han dotado a los laboratorios de modernos equipos de Quimicaclinica, con caracteristicas modernas y de vanguardia, pero que aun necesitan de los criterios que el profesional en laboratorio clinic debera considerer para podervalidar las calibraciones del equipo.

Para comenzar se debe definir el termino calibracion para que todos tengamos un concepto definido a que se refiere este proceso.

DEFINICION CALIBRACION:

La palabra calibracion se deriva del termino: “CALIBRADOR” que es sinonimo de ESTANDAR. Lo cual quiere decir que Calibrador es igual a Estandar. Ahoradefinamos que es un Estandar segun la CLSI (Clinical Laboratory Standar Institute), se define como estandar: Aquella substancia altamente pura cuya concentracionespecifica de un analito, substrato o enzyme es conocida y esta no varia. La tolerancia de pureza segun ACS es de 100% mas o menos 0.02. Estas substanciasson fabricadas con materias primas de la mas

Alta pureza con calidad de AR (Analitycal Reagent), UP (Ultra pure), QP ( Quimicamente pura) segun la ACS(American Chemical Society).

Dependiendo de la matriz de la cual este Estandar este hecho asi se definen los tipos de calibrador, que pueden ser Estandares primaries o secundarios. Ambos estan hechos con materiales de alta calidad certificados cuya concentracion esgarantia de que es exactamente segun lo define el fabricante y las variaciones son practicamente inexistentes. Lo cual nos permite tomarlos como material de calibracion confiablez, siempre y cuando tengan las certificaciones de purezanecesarias.

El CLSI es una organizacion sin fines de lucro ubicada en Waye PA, USA ( EstadosUnidos) cuyo objetivo es mejorar la calidad de los resultados de laboratorio clinicopor medio de la estandarizacion de procesos unificados y mejorados en busquedade la excelencia cientifica.

Ahora sabemos que un Estandar no es una susbstancia comun y corriente, si no al contrario, una sustancia de valor conocido que no varia y la cual ha sido fabricadacon las mas altas y mejores materias primas, lo cual garantiza su pureza y concentracion. Siempre hay que evaluar la calidad de los reactivos a usar y la calidad del agua destilada. (Ver clase sobre este tema)

Concentración

Magnitud

Muy bien, ahora que ya defiimos que es un Calibrador o Estandar entoncesdefinamos que significa la palabra calibrar:

“Se define CALIBRAR como: obtener un factor de Calibracion para ser usado en la medicion cuantitativa de una prueba usando un espectrofotometro o analizador de quimica clinica”.

Entonces recordemos que es un factor de calibracion?

DEFINICION FACTOR DE CALIBRACION:

“El factor de calibracion es la relacion matematica entre una substancia de valor o concentracion conocida y que se utiliza para determiner la concentracion de otrassubstancias desconocidas”.

Cuya formula matematica es la siguiente:

FC = ( Concentracion Estandar/ Abs. Estandar)

El FC x Abs. de la Muestra desconcida = Concentracion Muestra

Que es igual a la formula:

Abs. Muestra / Abs. Estandar x Concentracion Estandar.

Ej. Determine la concentracion de glucose y el FC tomando en cuenta los siguientesdatos:

ST Glucosa = 0.34 Concentracion ST glucose= 100 mg/dl

Muestra desconocida 1: 0.30

Muestra desconocida 2: 0.68

Aplicando la formula:

FC = 100 / 0.34 = 294

Muestra 1:

294 x 0.30 = 88.2 mg/dl o igual a: 0.30 / 0.34 x 100 = 88.2

Muestra 2:

294 x 0.68 = 200 mg/dl o igual a: 0.68 / 0.34 x 100 = 200

Muy bien con este sencillo ej. aplicamos la formula del FC y ademas comprobamosque es el mismo resultado que relacionar abs. de Estandares y muestras. El uso de FC es mas practico cuando necesitamos aplicarlo en el calculo de varios resultadossimultaneous.

Ademas los FC son utiles como parametros de referencia para conocer del estadodel equipo, reactivos y estandares, y son de gran ayuda en la deteccion de erroresde tipo sistematico.

Entonces definiremos el proceso de CALIBRACION como:

La obtencion de un factor de calibracion (FC) por prueba para ser utilizado en el calculo de la concentracion de una sustancia desconocida. Usando Estandares de la mas alta calidad y pureza disponibles en el mercado. Para garantizar que esteproceso se realize correctamente se deberan corer simultaneamente los sueroscontrol de nivel normal y anormal (I , II) obteniendo resultados, deseables, entre las1 Dst y maximo 2 Dst. (Ver clase de Control de Calidad Interno)

Este mismo principio que se usa en equipos manuales y semi automatizados, es el que usan los aparatos de Quimica Automatizados, por ello es primordial que se comprenda este proceso para poder facilitar el uso posterior de equiposautomatizados.

Otro parametro a analizar son los factores que intervienen en las reaccionesquimicas, ya que estos son los que directamente inciden en los resultados finales de las pruebas, y debemos tenerlos en consideracion para mantener controladotodo el entorno que pueda afectar los resultados finales en la cuantificacion de los analitos, substratos o enzimas en quimica clinica.

Factores que intervienen en las pruebas quimicas(Puntos criticos):

1- Protocolo de los Reactivos

2- Tiempos de incubacion y lecturas

3- Temperaturas de reaccion y pH

4- Relacion de volumenes exactos de Muesta / reactivos

5- Formas de Calculo

6- Instrumentacion usada para la medicion de la reaccion.

Etc.

Vale aclarar que solo estamos considerando la fase analitica, en esta presentacion, sin embargo las otras 2 fases juegan un rol critic en los resultados finales (Fases Pre y Post Analiticas).

De todos los puntos criticos que inciden directamente en las reaccionesestudiaremos uno de los mas importantes y que muchas veces es uno de los temasmas olvidados en la literature de Quimica clinica, debido a la relative novedad en estos metodos, nos referimos a las formas de calculo.

DEFINICION: Formas de Calculo

Se define como formas de calculo a la relacion matematica que expresa la reaccionquimica (estequiometria) que ha ocurrido en el tubo de ensayo o en la cuveta de reaccion del equipo, y que sirve para cuantificar en forma exacta la cantidad de la substancia, analito, enzyme que esta presente al final de la reaccion.

Estas formas de calculo vienen expresadas en los protocolos de las tecnicas, perodeben ser insertados en las fichas tecnicas de los equipos semi y automatizadospara que se cumpla a cabalidad la estequiometria de la reaccion y esta pueda sermedida de forma satisfactoria. En casos de proceos manuals, el operador tendraque llevar los tiempos, incubaciones, lecturas y calculus respectivos para podercuantificar la reaccion.

Existen diferentes formas de calculo usadas para distintas cuantificaciones de pruebas, pero en este capitulo estudiaremos las mas importantes y de usofrecuente en los laboratorios clinicos.

El uso de estas depende mucho de la clase de equipos utilizados y su tiempo de fabricacion. Los equipos mas nuevos son los que generalmente traen incorporadosen sus softwares estas formas de calculo.

DIFERENTES FORMAS DE CALCULO:

1- Punto final (End Point)

2- Tiempo fijo (Fixed Time)

3- Modo diferencial (Diferential Mode)

4- Modo Cinetico (Kinetic Mode)

5- Multiestandar (Curvas de Calibracion)

6- Modo Corte (Cutt – Off)

7- Etc.

Las reacciones de Punto Final son expresadas en la siguiente ecuacion:

R1 + Mx --------- Abs Donde: R1= Reactivo 1 o 2

Mx= Volume de Muestra (suero,etc)

Abs= Absorvancia final(unica)

Estas reacciones son aquellas que desarrollan un color que es directamenteproporcional a la concentracion de la muestra (Ley de Beer-Lamber) o sea la Absorvancia es directamente proporcional a la concentracion de la muestra. Son reacciones visibles a simple vista y fueran las primeras en usarse en quimica clinicaa travez de la colorimetria. Ej. Glucosa, Colesterol, Trigliceridos, Ac. Urico, Albumina, Proteinas totals, etc. Estas se realizan en los rangos de la luz visible.

Las reacciones de Tiempo fijo, son aquellas que se expresan en la siguiente ecuacion:

RT + Mx ---- Abs1 --Abs2 Donde: RT= Reactivo de trabajo

Mx= volume de muestra

Abs1, 2= Abs 1 (inicial)

Abs 2 (final)

Delta= Abs. 2 – Abs 1

Estas reacciones son conocidas tambien como cineticas de 2 puntos. Y se refiere a la medicion de 2 absorvancias una despues de una incubacion inicial y luego de un lapsode tiempo la Abs. final. El calculo se realiza usando el valor del Delta que es igual a Abs2 – Abs1. Para esta prueba hay que preparer un reactive de trabajo. Ej. Creatinina, BUN UV.

EL calculo para el modo diferencial se expresa en la siguiente ecuacion:

RT + Mx -------- Abs – BMx Donde: RT = Reactivo de Trabajo

Abs= Absorvacia final

BMx= blanco de muestra

En estas reacciones se montan simultaneamente a las muestras, calibradores, etc. blanco de muestra el cual debera ser substraido antes de la lectura de la absorvancia final. Ej. Bilirrubina Total y Directa.

El modo Cinetico (Kinetic) como lo dice su nombre es la cuantificacion del consume de un Substrato de una enzyme en un tiempo determinado. Es unareaccion en movimiento, la cual se realiza en el espectro de la luz U.V. (Ultravioleta) a 340 nm. Se expresa en la siguiente ecuacion:

RT + Mx ---Abs1 ---Abs2---Abs3--Abs4--Absx

Donde: RT= Reactivo de trabajo

Abs1,2,3,4,X = No. de Absorvancias medidas en un lapso tiempodeterminado.

Se calcula un delta a partir de la substracion de Abs1 – Abs2, Abs2 – Abs3

Abs3 – Abs4, luego el Delta se multiplica por el Factor de Calibracion dado por el faricante dependiendo de la temperature de la reaccion.

El modo de calculo Multiestandar se expresa en las curvas de calibracion, las cualesse construyen a partir de el tiraje de varios estandares simultaneous. Se expresa asi:

Concentración

Magnitud

Dependiendo del tipo de analisis asi sera el tipo de curva de caliracion: Poligonal, Spline, Recta de regression, etc.

Ej. TSH, T3, T4, PSA, etc.

El modo de Cutt-Off o corte se refiere a la principal forma de calculo en las pruebasde tamizaje. Donde se dee determiner la positividad o negatividad de pruebasinfecto contagiosas. Ej HIV, HCV, Habs, Toxo IgG, IgM, Rubeola, etc.

En estas pruebase se realiza a partir de la Absorbancia de las muestras y controlespositivos Fuertes y positivos debiles un corte donde se descriminaran las pruebasque salgan positivas de las negativas a partir del valor de Abs. Un valor intermedioentre estas se denominara como zona gris o de indeterminados.

Existen muchas otras formas de calculo mas que se utilizan sobre todo en investigaciones y desarrollo biotecnologicos de nuevos productos. Sin embargo estas seis formas de calculo abarcan la mayoria de pruebas que se usan en el area de quimica clinica actual, por lo tanto es responsabilidad del alumno conocerlas y entender como se desarrolla la estequiometria de la reaccion, que a final se expresa en un resultado cuantitativo.

MATERIALES DE CONTROL:

La forma mas efectiva de garantizar que nuestras calibraciones son correctas estirando simutanemente o posterior a esta los materiales de sueros control valorados de Nivel I, II. Para asegurarnos que la calibracion ha sido realized exitosamente,

Bibliografia