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Bacterias lácticas no fermento y Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos

Jornadas

5 y 6 de junio de 2014

Dra. Erica Hynes

Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos

Las bacterias lácticas no fermento se desarrollan en todos

los quesos madurados

Predominan en los productos de maduración media y

prolongada

Pueden crecer en las condiciones ambientales del queso:

20015010050010

1

102

103

104

105

106

107

108

109

1010

Días de maduración

UFC g-1

no fermento

fermento

• Humedad 30 - 60 %

• pH 5,0-5,4

• % de NaCl en la humedad entre 2-6

• Bajo potencial redox (Eh –150 mV)

• Ausencia o cantidades muy bajas de azúcares fermentables

• Bajas temperaturas de maduración (7- 12 ºC)


Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II

Lactobacillus casei /paracasei – Lactobacillus plantarum -Lactobacillus pentosus - Lactobacillus rahmnosus, etc.

También se pueden considerar NSLAB:

• Lactobacilos heterofermentativos del grupo III Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis

• Bacterias lácticas termófilas no agregadas con el fermento (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus)

• Leuconostoc spp., pediococos y enterococos


Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso

Leche cruda

Fuente mayoritaria de NSLAB en el queso

La elaboración de queso en condiciones asépticas o extra higiénicas

reduce sólo levemente la contaminación con NSLAB (McSweeney, 1994)

Se han encontrado cepas NSLAB que se recuperan luego de 72°C -

90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 5 10 15 20 25

Tiempo (días)

Lo

g U

FC

/ m

l

Recuperación de células de L. plantarum DPC2739 (ca. 7,0 log UFC/ml) calentadas 72 °C 90 seg, en leche estéril a 7 °C por 20 días



La leche cruda

Es la fuente mayoritaria de NSLAB en el queso

Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurización

– 73°C 15 seg - y termización – 60 °C 5 min) (Christiansen et al., 2006)

La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos

plantas distintas comparte gran parte de las cepas (Poznanski et al., 2004)

Las leches con muy baja contaminación inicial desarrollan NSLAB

mucho más lentamente o alcanzan menores números, al igual que

leche de quesería microfiltrada (Crow et al., 2001)



La contaminación post pasteurización

También contribuye al desarrollo de las NSLAB en el queso

A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de

leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta

de cheddaring y la torre formadora de bloques (2-4 log UFC/ml)(Sommers et al., 2001; Agarwarl et al., 2006)

La tecnologíay el medioambiente que ésta define

Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo

�Tratamiento térmico


La tecnologíay el medioambiente que ésta define

Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo

�Tratamiento térmico de la leche


�Fermento primario

�Temperatura de maduración

�Proteólisis primaria por coagulante y plasmina

�Fermento primario

�Temperatura de maduración

�Proteólisis primaria por coagulante y plasmina

� tratamiento térmicotermización, pasteurización y cocción


La tecnologíaBacterias lácticas no fermento y calidad de quesos

La pasteurización introduce una acción de selección sobre la

biota inicial de la leche de quesería.

9

10

11

CF

U g

-1

Fermento y NSLAB para quesos Pategrás

(♦) y semiduro de leche cruda (■)

quesería.

En los quesos de leche cruda el

número inicial de NSLAB es más alto (Bude Ugarte et al., 2006)

6

7

8

7 22 37 52 67

Ripening time (days)lo

g 1

0CF

U g

� tratamiento térmicotermización, pasteurización y cocción


La tecnologíaBacterias lácticas no fermento y calidad de quesos

Tanto los quesos de leche cruda como los de leche pasteurizada se han encontrado comunidades bacterianas diversas (Babini et al., 2010).

En los quesos duros donde existe cocción, esta etapa también puede tener un impacto en la composición de la flora no fermento, aunque la

temperatura no influye en el recuento promedio (Sheehan et al., 2007)

� fermento primario

La tecnología


Si existe galactosa disponible, el crecimiento de las NSLAB correlaciona

con la disminución de galactosa en el queso

7

8

9

recu

ento

de

lact

ob

acil

os

(Lo

g

25

30

Gal

acto

sa (

mm

ole

s/K

g)

Lactobacillus

rahmnosus Exp

NSLAB control

Galactosa E

Galactosa C

Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus

además de L. lactis

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6

tiempo de maduración (meses)

recu

ento

de

lact

ob

acil

os

(Lo

g

cfu

/g)

0

5

10

15

20

Gal

acto

sa (

mm

ole

s/K

g)

Galactosa C

Tiene un fuerte impacto en la velocidad de crecimiento

9 Leche cruda

1 ºC 8 ºC 12 ºC

8 * 104 UFC g-1 1 * 107 UFC g-1 1 * 108 UFC g-1

Cheddar

6 meses

� temperatura de maduración

La tecnología


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120 150 180

Tiempo (días)

log

UF

C g

-1

Leche cruda1ºC

Lechepasteurizada1ºC

Leche cruda8ºC

Lechepasteurizada8ºC

Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000

La distribución temporal y espacial


Fitzimons, 2001

El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos

En quesería industrial generalmente se las asocia a los defectos

� Formación de gas

� Cristales de de lactato de calcio

� Off flavours


� Off flavours

� Inconstancia de la calidad

La calidad

� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas


Quiberoni et al., 2004

La calidad


Causas

• Contaminación elevada en la leche cruda

Leuconostoc sp

Lactobacilos heterofermentantes obligatorios

Lb. brevis y Lb. fermentum


Lb. brevis y Lb. fermentum

• Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador –

períodos de trabajo muy largos, contaminación del equipo con S.

thermophilus

• Fermento poco activo, consumo lento de la lactosa

No se han informado fallos asociados a lactobacilos heterofermentantes facultativos, como Lb. paracasei y Lb.

plantarum.

La calidad


Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformeso levaduras – que se produce muy tempranamente en la


o levaduras – que se produce muy tempranamente en la maduración – y del defecto de hinchazón tardía en quesos duros.

La calidad



• No afecta negativamente el aroma o sabor de los productos – nota sabor de los productos – nota intensa a manteca

• No trae problemas de inocuidad• Deprecia el producto por su aspecto

y características físicas: aceptación por parte del consumidor y operaciones como corte y empacado.

La calidad


Los sustratos para la producción de gas por NSLAB


• Lactosa residual• Galactosa residual• Citrato• Aminoácidos• Lactato (?)

La calidad


la fermentación proceso biológico


puede ser afectado de distinta forma por la actividad de los microorganismos presentes y la tecnología de elaboración,

distintas velocidades de desaparición de lactosa y sus componentes, glucosa y galactosa

La calidad



Sample descriptions Lactose determination by

enzyme kit

(mg 100 g-1)

D-galactose

determination by

enzyme kit

Jarlsberg (Norwegian) <10 <10

Tesco Continental Gouda 140 <10

Sainsbury’s Dutch Gouda 30 <10

Asda Edam Wedge 20 <10

Sainsbury’s Mature West Country 30 <10Sainsbury’s Mature West Country

Farmhouse Cheddar

30 <10

Tesco Continental Jarlsberg <10 <10

Asda West Country Farmhouse Cheddar 30 <10

Asda Gouda Wedge 100 20

Sainsbury’s Extra Mature West Country

Farmhouse Cheddar

60 <10

Tesco Fresh Italian Parmesan 30 <10

Sainsbury‘s Mature Gouda 40 <10

Portnoi & McDonald, 2009

La calidad



Cheddar

Portnoi & McDonald, 2009

La calidad

� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o

aberturas

capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y formar CO2


especie y cepa dependiente

vinculada a la presencia de azúcares en el medio y al estado fisiológico de las células


La producción no deseada de CO2 debería controlarse a través de:

la microbiota

la composición

la temperatura de enfriado del queso y de maduración


Metabolismo del lactato

La calidad

� Cristales de lactato de calcio

• Pequeños cristales visibles en superficies de corte• son inocuos pero pueden ser confundidos con hongos por el

consumidor lo que provoca rechazo• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos


• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos duros

• las bacterias lácticas del fermento producen L-lactato pero muchas NSLAB producen directamente D-lactato, menos soluble, o lo forman a partir del L- lactato

• este defecto se ve favorecido por enfriado lento de bloques grandes de queso, bajo pH y alta temperatura de maduración, así como el ahumado natural.

La calidad

�Cristales de lactato de calcio


H

C

COOHH3C

HO

H

C

HOOCCH3

OH

Pyruvate

Oxidation of L-lactateto pyruvate by L-lactate dehydrogenase

Reduction to D-lactate byD-LDH (NSLAB)

L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid

McSweeney, 2003

En quesería artesanal o productos de alto valor agregado (con denominación de origen o productos probióticos, por ejemplo) el rol de las NSLAB se revaloriza

� Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour


La calidad


� Aceleración de la maduración

� Degradación de péptidos amargos

� Diversificación de notas de aroma

� Potencial probiótico

AROMA Y SABOR DEL QUESO

McSweeney & Sousa, 2000

AROMA Y SABOR DEL QUESO

Sólo starterStarter + NSLAB1

Starter + NSLAB2

Starter + NSLAB3

James Steele, 2012

Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos

principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por

aminotransferasas

desarrollo de flavour durante la maduración de quesos

Amino acids

α-keto acid

Glutamateα-ketoglutarate

Glutamate

(Glutamate deshidrogenase)

(Aminotransferase)

GDH

AT

α-keto acid

Hydroxyacid

Carboxylic

Acid

P-Cresol (Tyr)

Skatole (Trp)

Acyl-CoA Aldehyde

Alcohol

Benzaldehyde (Phe)

Methylthioacetaldehyde (Met)

Dimethyldisulphide

Dimethyltrisulphide

α -keto acid

dehydrogenase α -ketoacid

decarboxylase

Tanous et al. (2002)Antonie van Leeuwenhoek

82: 271–278, 2002.

alcohol

dehydrogenase

Methanethiol (Met)

Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos

principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por

aminotransferasas

desarrollo de flavour durante la maduración de quesos

Aspartate

Oxaloacetate

Glutamateα-ketoglutarate

Glutamate

Oxaloacetate

GDH

Asp-AT

Piruvate

2-acetolactate

Oxaloacetate

descarboxilase

CO2

Acetoin

Diacetyl

Butanediol

NADH

NADO2

CO2

Diacetyl reductase

NADNADH

CO2

Acetaldehyde TPP

CO2

Le Bars and Yvon (2008)J Appl Microbiol 104 ,171–177

Acetolactate

synthase

Acetolactate

descarboxylase

Alcoholes isohexanal Ésteres metileno bis(metilsulfuro)

1,2-butanodiol 2-metilbutanal acetato de etilo Compuestos nitrogenados 2-butanol 3-metilbutanal benzoato de etilo 2-acetil-1-pirrolina

etanol 2-metilpropanal butirato de etilo Pirazinas 2-etilbutanol Nonanal hexanoato de etilo 2,3-dietil-5-metilpirazina

2-etilhexanol (E,E)-2,4 nonadienal isobutanoato de etilo 2-etil,3-5-dimetil-pirazina

2-heptanol (Z)-2-nonenal octanoato de etilo 2-metoxi-3-

isopropilpirazina

hexanol (E)-2-nonenal 2-metilbutanoato de etilo Furanos isobutanol octanal butanoato de isobutilo 2-etil-4-hidroxi-5-metil-

3(2H)furanona

3-hidroxi-4,5-dimetil-

2(5H)furanona

4-hidroxi-2,5-dimetil-3-

(2H)furanona

2-metilbutanol pentanal acetato de 3-metilbutilo Compuestos fenólicos 3-metilbutanol propanal metil-2-metilbutanoato p-cresol

2-metilpropanol propenal 3-octil acetato Ácidos grasos 2-nonanol thripfen-2-aldehído acetato de pentilo acetato

(Z)-1,5- Cetonas acetato de fenetilo butirato

Compuestos aislados como componentes de “flavour” en varios tipos de quesos

AROMA Y SABOR DE QUESOS

(Z)-1,5-

octadien-3-ol Cetonas acetato de fenetilo butirato

2-octanol Acetoína butirato de propilo caproato

1-octen-3-ol Acetona Lactonas decanoato

2-pentanol 2,3- butanodiona

(diacetilo) δ-lactona isobutirato

feniletanol 2-butanona γ-lactona metilacetato

2- feniletanol h-damaescenona δ-dodecalanctona ác. 2-metilbutírico

1-prropanol 2-heptanona δ-octalactona ác. 3-metilbutírico

2-propanol 2-hexanona (Z)-6-dodecen-γ-lactona octanoato

Aldehídos 3-metil-2-butanona Compuestos azufrados fenilacetato

acetaldehído 2-nonanona dimetil disulfuro propionato

decanal 3-octanona dimetil sulfuro valerato

heptanal 1-octen-3-ona trimetil disulfuro

(Z)-4-heptenal 2-pentanona metanotiol

hexanal 2-tridecanona metional

2-hexenal 2-undecanona hexanotiol

tipos de quesos

(Marilley & Casey, 2003)

Se conocen los compuestos que se necesitan para formar el flavour del queso, pero no cómo combinarlos de manera adecuada para conseguir la percepción global deseada en una determinada matriz

La sinfonía del flavour:

“…… stimuli such as flavour compounds, notes of music, or

colours in a picture do not generate the same response whenthey act singly, as when they act together in a rapid sequencethey act singly, as when they act together in a rapid sequence(e.g., an arpeggio) or even simultaneously (e.g., in a chord,

which can be harmonious or not).” “In each case, the whole ‘matrix’ or

environment must be considered”

Bosset, J. O. & Gauch, R. (1993) International Dairy Journal, 3, 359 –

377

“ We have our flavour orchestra:• Chamber – cheese structure• Flavour instruments – processes tocreate flavour notes• Flavour notes – cheese flavour compounds

The challenge is to conduct the orchestra todeliver the symphony of cheese flavour”deliver the symphony of cheese flavour”

Holland & Coolbear, 2012

• Si se agrega αααα-cetoglutarato al queso, el aroma general aumenta significativamente.

• Si se utilizan cepas de lactococos donde se inhibió la síntesis de aminotransferasas, el aroma y sabor del queso disminuye. Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se


Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad

Controlar el catabolismo de los aminoácidos por los microorganismos del queso promete ser una manera eficaz de controlar la formación de aroma y sabor en

el queso

Yvon & Rijnen, 2001

Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se aumenta, el sabor y aroma del queso se incrementan

En quesos madurados únicamente con bacterias lácticas, la mitad de los componentes clave en el flavour provienen del catabolismo de los aminoácidos.

Patentes:

• FR 97 05133, PCT/FR98/00828 – 2000 - M. Yvon y J-C Gripon.

Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base



Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base de queso

• WO2003056025 - 2003 - M. Yvon, E. Chambellon, A. Gori. Selección y utilización de cepas de bacterias lácticas capaces de producir a-cetoglutarato a partir de citrato y de glutamato a lo largo de la maduración de quesos para la transformación de aminoácidos en moléculas de aroma.

• EP1789542 - 2006 - M. Yvon, C. Tanous, E. Chambellon, M. Nardi . Gene que codifica una glutamato dehidrogenasa, plásmido conteniendo dicho gene y sus utilizaciones.



500

1000

1500

2000

Áre

a (u

nid

ades

arb

itra

rias

)

Diacetilo

Acetoína

Peralta et al., 2010

0

500

C1-60 días E1-60 días C2-60 días E2-60 días

Tipo de queso

Áre

a (u

nid

ades

arb

itra

rias

)

Wolf et al., 2009



Adjunto de Lb. paracasei I90

En queso cremoso mini




Adjunto de Lb. paracasei I90

En modelo de queso Reggianito


� Potencial probiótico


La calidad

Algunas cepas de origen NSLAB han demostrado potencial probiótico in vitro y se han probado exitosamente en matrices alimentarias

500

200

250

300

350

400

450

500

Control Control cheese Cheese + Lp I90 Cheese + Lp I91

Nº

IgA

+ c

ells

/10

fiel

ds

Burns et al., 2012

La estrategia de los fermentos adjuntos


� Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena

Busca reunir las ventajas de la presencia de las NSLAB en quesos, incrementando el control sobre la maduración

� Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena

calidad, identificadas y caracterizadas.

� Se agregan a la leche de elaboración además del fermento

primario (starter)

Requisitos de un adjunto

Obligatorios

� No contribuir a la acidificación

� Proliferar rápidamente en la cuajada y mantener la

viabilidad durante la maduración del queso

Fermentos adjuntos


Fermentos adjuntos


viabilidad durante la maduración del queso

� No producir ningún defecto

Facultativos

�Aumentar la proteólisis secundaria

� Disminuir el gusto amargo

� Incrementar la bioformación de flavour

� Tener potencial como probiótico

Fermentos adjuntos


“Gracias a un mejor conocimiento, a través de la investigación en todo el mundo, la industria quesera tiene hoy acceso a una serie de herramientas para obtener quesos de calidad y mejores ingredientes de flavour para quesos. Una aplicación exitosa es la mejora en la constancia del flavour mediante el agregado de fermentos adjuntos de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour comprobadas, a quesos con una mínima cantidad de NSLAB adventicias; esto quiere decir: quesos limpios”

Johnston et al., 2010, Fonterra

Materia prima adecuada + fermentos primarios y adjuntos adecuados + manejo de la temperatura

+ bajo contenido inicial de lactosa/galactosa/citrato


Mayor control de la maduración


Troubleshooting Problema Causa SoluciónProducción de CO2 con ojos y aberturas no deseadas provocado por bacterias lácticas no fermento

Altos recuentos de bacterias lácticas

en leche cruda

Funcionamiento prolongado del

pasteurizador

Fermento primario lento

Agregado de polvos o retentados para

aumentar rendimiento

Enfriado lento de las hormas, cortes en

cadena de frío, altas temperaturas de

maduración

Mejora de la calidad microbiológica

de la leche cruda (Buenas prácticas

de ordeño, Microfiltración)

Ciclos adecuados de trabajo y

limpieza

Fermento primario adecuado

Fermento adjunto

Lavado de la cuajada

Adecuada capacidad de

salado/enfriado

Mantenimiento de la temperatura Mantenimiento de la temperatura

consigna

Producción de cristales de lactato de calcio

Altos recuentos de bacterias lácticas

en leche cruda

Valores de pH bajos

Altas temperaturas de maduración


de la leche cruda (BPO, MF)

Mantenimiento de pH y temperatura

de maduración adecuados

Producción de off flavors Altos recuentos de bacterias lácticas

en leche cruda

Predominio de cepas que producen

notas de flavour no buscadas


de la leche cruda (BPO, MF)

Fermento adjunto

Sabor poco intenso (mild/flat) Bajos recuentos de bacterias lácticas

en leche cruda

Predominio de cepas que no producen

flavour

Fermento adjunto


Control de las NSLAB: las tres K

Las tres K CausaKeep them out

Mantenerlas fuera

Minimizar la contaminación:

Calidad de la materia prima

Sanitización de la planta

Kill themMatarlas

Pasteurizar

Keep them from growing

Mantenerlas en bajo número

Temperatura

Condiciones ambientales

Nutrientes

Bacteriocinas

James Steele, 2012


Muchas gracias!

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