TRABAJO FINAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN

BIOTECNOLOGÍA

Universidad Nacional de Tucumán

Facultad de Bioquímica Química y Farmacia

SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE VINOS, CON

CAPACIDAD PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE AROMA.

María Luz CardozoEstudiante

Dra. María Cristina Manca de NadraDirectora

Dra. Fabiana M. SaguirCo-directora

2006

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AGRADECIMIENTOS

A mi Directora de Trabajo Final, Dra. María Cristina Manca de

Nadra, quien me brindó la oportunidad de trabajar bajo su dirección y con

su experiencia y capacidad supo guiarme a lo largo de este trabajo,

brindándome sus conocimientos científicos.

A mi Co-Directora, Dra. Fabiana Saguir, que estuvo siempre

presente brindándome consejos y aportando toda su experiencia y

conocimiento durante este Trabajo.

Al personal docente de la Cátedra de Microbiología General,

porque nunca dudaron en ayudarme, compartiendo sus conocimientos y su

calidez humana conmigo.

A mis queridos compañeros de trabajo final: Daniela, Julieta,

Belén, Matías y Daniel, por su invalorable compañía en aquellos largos días de

ensayos.

A mis queridos padres, que me brindaron su amor incondicional,

sus sacrificios sin desmayos y su aliento permanente a través de estos años

difíciles para que pudiera llegar a ser lo que soy.

A Javier por el amor, comprensión, consejos, compañía y ayuda

incondicional que me brindó a lo largo de estos años.

A mis hermanas Gabriela y Agustina, quienes siempre estuvieron

estimulándome durante todos mis estudios.

- 2 -

Las investigaciones de este trabajo final dieron lugar a las siguientes

comunicaciones en reuniones científicas

1- V JORNADAS CIENTÍFICAS Y ENCUENTRO DE JÓVENES

INVESTIGADORES, “AUGUSTO PALAVECINO” . TUCUMÁN,

ARGENTINA (2004)

“AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE VINOS DE ESTANTE.”

Cardozo M. L., Saguir F.M. y Manca de Nadra M.C.

2- XXII JORNADAS CIENTÍFICAS DE LA ASOCIACION DE

BIOLOGIA DE TUCUMÁN. TUCUMÁN, ARGENTINA (2005)

“SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE VINOS

CON POTENCIALIDADES PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE

AROMA.”

Saguir F. M., Cardozo M. L., Manca de Nadra M. C.

3- VI JORNADAS CIENTÍFICAS Y ENCUENTRO DE JÓVENES

INVESTIGADORES, “AUGUSTO PALAVECINO” . TUCUMÁN,

ARGENTINA (2005)

“CARACTERIZACIÓN DE -GLUCOSIDASA Y α-

ARABINOFURANOSIDASA EN CEPAS DE Oenococcus oeni y

Pediococcus pentosaceus AISLADAS DE VINOS.”

Cardozo M. L., Saguir F.M. y Manca de Nadra M.C.

PREMIO: “Primera Mención en el área CIENCIAS APLICADAS”.

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INDICE

Pag.

Generalidades…………………………………………………6-8

Introducción…………………………………………………..10-15

Objetivos……………………………………………………....16-19

Materiales y Métodos…………………………………..…....20-27

Resultados y Discusión...................................................28-72

Conclusiones…………………………………………....…...73-75

Bibliografía……………………………………………….......76-87

- 4 -

Generalidades

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Características generales de las bacterias lácticas

Las bacterias lácticas (BL) son microorganismos Gram (+), catalasa

(-), inmóviles, no esporulantes (Pardo y col., 1992). No poseen nitrato

reductasa ni citrocromo oxidasa. No licuan la gelatina. No producen indol y

solamente algunas especies hidrolizan fácilmente la caseína. Son

débilmente lipolíticas. Fermentan azúcares produciendo ácido láctico como

principal y a veces único producto final. Poseen requerimientos

nutricionales complejos (Fugelsang, 1997; Jackson, 1994; Manca de Nadra

y col, 2003). Saguir y Manca de Nadra (1997, 2002) demostraron en cepas

de Oenococcus oeni aisladas de vinos argentinos que requieren un

mínimo de cuatro aminoácidos para crecer y que algunas de ellas

requieren 19 aminoácidos.

Tradicionalmente, el hombre ha utilizado las BL para elaborar productos

alimenticios fermentados y para su conservación, heredando por generaciones

la tecnología de la fermentación.

Las BL presentan características especiales que favorecen su uso en la

industria alimenticia: no son patógenas, acidifican rápidamente el medio de

cultivo impidiendo la proliferación de microorganismos patógenos como

Salmonella, Staphylococcus o Pseudomonas, producen sustancias

antimicrobianas y pueden mejorar el valor nutritivo de los alimentos a través de

su actividad proteolítica. Los géneros Streptococcus, Leuconostoc y

Lactobacillus son los más usados en este campo.

- 6 -

Género Lactobacillus

Se presentan en forma de bastones largos y delgados o cortos y curvos,

generalmente agrupados en cadenas. Tienen metabolismo homofermentativo,

con producción de más de 85% de ácido láctico a partir de glucosa o

heterofermentativo, con producción de ácidos láctico, acético y CO. Los

isómeros del ácido láctico producido pueden ser: DL, L(+) o D(-) dependiendo

de la cepa.

Género Pediococcus

Se presentan en forma de cocos en tétradas. Poseen metabolismo

homofermentativo con el ácido láctico como principal producto final (Axelsson,

1998; Garvie, 1986). Se describen como la bacteria láctica, acidófila,

homofermentativa, que se divide alternativamente en dos direcciones

perpendiculares para formar tétradas (Simpson y Taguchi, 1995).

Oenococcus oeni

Se presentan en forma de cocos agrupados en cadenas. Son

quimiorganótrofos. Requieren para crecer jugo de tomate (Garvie, 1986) o jugo

de uva (Dicks y col., 1995). La temperatura óptima de crecimiento está

comprendida entre 20-30ºC. Tienen metabolismo heterofermentativo. Producen

a partir de hexosas ácido D(-) láctico, etanol y CO2. Algunas cepas pueden

formar ácido acético en lugar de etanol. Se distinguen principalmente por su

- 7 -

capacidad para transformar el ácido L-málico en ácido láctico L(+), crecer a

bajos pH (3,0 – 4,8) y en presencia de 10% de etanol.

- 8 -

Introducción

- 9 -

Las bacterias lácticas y su implicancia en la calidad del vino.

En el proceso de vinificación, el mosto de uva es fermentado a etanol,

CO2 y compuestos de aroma por las levaduras, proceso conocido como

fermentación alcóholica.

El ácido L-málico es decarboxilado a ácido L(+) láctico por las BL o

bacterias malolácticas, proceso conocido como fermentación maloláctica

(FML), y que tiene lugar, generalmente, una vez concluida la fermentación

alcohólica (Pardo y col., 1992).

Al final de la fermentación alcohólica las levaduras se lisan, liberan

nutrientes y comienza la multiplicación de las BL hasta alcanzar la población

necesaria y suficiente para desencadenar la fermentación maloláctica, 106

UFC/ml. Este proceso, que reduce la acidez del vino con el concomitante

incremento del pH, le confiere suavidad, estabilización biológica y contribuye a

la complejidad aromática del producto final (Davis y col. 1985; Davis y col.,

1988; Henick-Kling 1993). La fermentación maloláctica es considerada muy

importante para la elaboración de la mayoría de los vinos tintos de calidad y

actualmente de vinos blancos.

Aromas de jugos y bebidas fermentadas. Efecto de las bacterias lácticas

En jugos de frutas y bebidas fermentadas las sustancias aromáticas

contribuyen significativamente a la calidad del producto final. El aroma

producido es consecuencia de propiedades tecnológicas y reacciones

bioquímicas, entre las cuales la fermentación es un proceso clave.

- 10 -

Las BL pueden tener diferentes efectos sensoriales sobre las bebidas

fermentadas, produciendo compuestos volátiles que modifican favorablemente

los aromas frutales o compuestos que deterioran los sabores del producto final

(Bartowsky y col., 2002a, b; Boido y col., 2002; de Revel y col., 1999; Maicas y

col., 1999; Henick-Kling, 1995; Laurent y col., 1994).

Los productos con aromas a ácido láctico como resultado de la actividad

fermentativa de las BL o con sabor mantecoso debido a la formación de

diacetilo u otros compuestos dicarbonílicos han sido muy estudiados en

bebidas fermentadas (Bartowsky y Henschke, 2004; de Revel y col., 1989;

Bertrand, 1981). Se ha demostrado que BL, especialmente aquellas

pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus le otorgan al jugo de

manzana, sabor mantecoso, a ácidos orgánicos y producen el hinchamiento de

los envases por formación de CO2 (Tajchakavit y col., 1998).

Compuestos aromáticos volátiles agradables pueden ser producidos a

partir del catabolismo de aminoácidos a través de reacciones de

transaminación, deshidrogenación, decarboxilación y reducción (Maicas y col.,

1999) o pueden ser liberados a partir de precursores glicoconjugados

presentes en las frutas (Boulanger y col., 1999; Winterhalter y col., 1997;

Williams y col., 1982a). Se ha demostrado la presencia de compuestos

glicoconjugados en papaya (Schwab y col.,1989), uva (Wirth y col., 2001;

Gunata y col., 1985), damasco, durazno y ciruela (Krammer y col., 1991). Estos

compuestos se encuentran principalmente en el jugo de las frutas más que en

la piel y pulpa (Wilson y col., 1986).

- 11 -

Sustancias glicoconjugadas y su relación con el aroma del vino

El aroma del vino es consecuencia principalmente de compuestos

aromáticos volátiles derivados de las uvas que incluyen monoterpenos, C13-

norisoprenoides, derivados bencénicos y alcoholes alifáticos. Estos

compuestos pueden encontrarse en forma libre o ser liberados a partir de los

precursores glicoconjugados cuya fracción glicosídica pueden ser

monoglucósidos o disacáridos glicosilados, con glucosa sustituida por -L-

arabinofuranosil, -L-rhamnosopyranosil, -D-xilopiranosil o -apiofuranosil

(Winterhalter y col., 1997; Williams y Francis, 1996; Marinos y col., 1994).

Fig. 1. Precursores glicoconjugados presentes en uvas ( Williams, 1993).

Los compuestos glicoconjugados pueden ser hidrolizados por acción

química o por efecto de enzimas producidas por microorganismos. La hidrólisis

- 12 -

ácida puede ocurrir muy lentamente durante el almacenamiento debido al bajo

pH del medio (Sefton y col. 1998) o puede ser inducida por calentamiento.

Estos procesos pueden deteriorar la calidad del vino ocasionando cambios

indeseables en la estructura de los aglicones y modificando sus aromas

(Gunata, 1984; Williams y col., 1982b). Por el contrario, la hidrólisis enzimática

rompe el enlace glicosídico sin alterar el aglicon (Williams, 1993; Cordonnier y

col, 1974).

La hidrólisis enzimática de los glicósidos disacáridos involucra la

liberación secuencial en dos etapas, de las unidades de azúcares . En una

primera etapa se hidrolizan los glicósidos disacáridos mediante la acción de

glicosidasas específicas como -L-arabinofuranosidasa, -L-

rhamnopiranosidasa, β-apiofuranosidasa. Luego el aglicon (compuesto volátil)

es liberado de la β-D-glucosa por acción de la enzima β-D-glucosidasa (Gunata

y col., 1988).

Existe poca información con respecto a las actividades glicosidasas de

BL involucradas en la elaboración del vino (Maicas y col., 1999). Por lo tanto

cepas específicas de BL adaptadas a las condiciones locales de elaboración

del vino y con cualidades para llevar a cabo la fermentación maloláctica

podrían representar una fuente de glicosidasas para actuar bajo las

condiciones físico-químicas de la vinificación optimizando la complejidad

aromática del producto final. Emplear BL para producir compuestos de aromas

en bebidas fermentadas presenta ventajas con respecto a las levaduras y

frutas. Las glicosidas de las BL son más efectivas que las glicosidasas de

frutas (Gueguen y col., 1997; Aryan y col., 1987) o levaduras en condiciones de

fermentación. Al ser inoculadas concluida la fermentación alcohólica, el medio

- 13 -

es más estable que el mosto y presentan menos actividades enzimáticas no

deseadas que las levaduras.

- 14 -

Objetivo

- 15 -

Investigar la capacidad de cepas de bacterias lácticas aisladas

de vinos argentinos para sintetizar enzimas glicosídicas que

actúen sobre compuestos no aromáticos glicoconjugados ,

normalmente presentes en el medio natural, produciendo

compuestos volátiles de aromas .

- 16 -

Objetivos específicos

- 17 -

Aislamiento de bacterias lácticas de vinos

argentinos.

Identificación fenotípica de las bacterias lácticas

aisladas, en base a morfología celular, coloración de Gram, pruebas

fisiológicas y bioquímicas.

Los parámetros de crecimiento, fase lag,

velocidad de crecimiento, tiempo de generación y concentración

celular final.

Determinación de las actividades de enzimas

relacionadas con la producción de compuestos aromáticos volátiles

derivados de precursores glicoconjugados, normalmente presentes

en frutas:

- Actividad -glucosidasa

- Actividad -arabinofuranosidasa

Evaluación de las actividades enzimáticas en

diferentes condiciones de cultivos.

Evaluación de las actividades enzimáticas en

suspensiones celulares, sobrenadantes de cultivos y extractos

libres de células.

- 18 -

Caracterización físico química de las actividades

enzimáticas. Efecto de parámetros que influyen en la elaboración

de bebidas fermentadas:

o pH, Temperatura, etanol

Materiales y Métodos

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Muestras

- Vino sin filtrar ni clarificar de Cafayate-Salta.

- Vino artesanal patero de Cafayate-Salta.

- Vino fino tinto de Mendoza de góndola de supermercado de Tucumán.

Medios de cultivo

- PCA: con la siguiente composición en g/l: peptona de caseína, 5;

extracto de levadura, 2,5; glucosa, 1; agar-agar, 14. pH 7 (Martley y col.,

1970) .

- MRS: se utiliza como medio basal (de Man y col., 1960) con la

siguiente composición en g/l: glucosa, 20; peptona, 10; extracto de carne,

10; extracto de levadura, 5; ortofosfato mono potasio, 2; acetato de sodio,

5; citrato de amonio, 2; sulfato de magnesio.7H2O, 0,20; sulfato de

manganeso.4H2O, 0,30; y tween 80, 1,1 ml. El pH se ajusta a 5,5, 6,5 y 4,8

para las cepas de Lactobacillus hilgardii, Pediococcus pentosaceus y

Oenococcus oeni, respectivamente.

- MRS modificado: Medio basal suplementado con 10% de jugo de

uva.

- Jugo de uva: se extrae de uvas cosechadas en la región de

Cafayate, Salta y se clarifica por centrifugación. El jugo, pH 4,7, se

suplementa con 5 g/l de extracto de levaduras.

- 20 -

Los medios PCA y MRS se esterilizan en autoclave durante 20 min a

121ºC. El medio jugo de uva se esteriliza en autoclave hasta alcanzar

121ºC y se apaga inmediatamente.

Procesamiento de las muestras de vinos para aislamiento

Las muestras de vinos se centrifugan a 4000 g 20 min. El pellet se resuspende en solución fisiológica y se realizan diluciones sucesivas. 0,1 ml de la dilución correspondiente se siembra en medio PCA para el aislamiento de aerobios totales, medios MRS y MRS modificado agar pH 4,8 y 6,5 para el aislamiento de bacterias lácticas. Se adiciona 1,3 μg/ml de pimaricina a los medios de cultivos MRS y MRS modificado para inhibir el desarrollo de células eucariotas. Los medios de cultivos se incuban a 30ºC durante 10 días. Los medios MRS y MRS modificado se incuban en condiciones de microaerofilia. Se seleccionan colonias al azar de cada muestra para su posterior identificación. Las colonias Gram positiva y catalasa negativa se clasifican como BL y se identifican por métodos fenotípicos.

Identificación fenotípica de bacterias lácticas

Las BL se caracterizan en base a morfología celular, pruebas

fisiológicas y bioquímicas:

- Actividad catalasa. Se adiciona agua oxigenada a suspensión celular

del microorganismo en estudio. La reacción positiva se determina por aparición

de burbujas como consecuencia de la descomposición del peróxido de

hidrógeno.

- Producción de NH3 a partir de arginina. Se siembran los

microorganismos en medio arginina y se incuba a temperatura óptima de

crecimiento. Si el microorganismo hidroliza el aminoácido se visualiza la

producción de NH3 con reactivo de Nessler .

- Producción de CO2 a partir de glucosa en medio agarizado de Gibson

(Gibson y Abdel - Malek, 1945). La producción de gas se determina por

- 21 -

aparición de grietas en el medio agarizado, indicando que el microorganismo

posee metabolismo heterofermentativo. El resultado negativo corresponde a

metabolismo homofermentativo.

- Tipo de isómero de ácido láctico producido, D, L o D-L. Se determina

por método enzimático (Kit de Boheringer, Alemania).

- Pruebas de fermentación de azúcares en medio líquido con campana

de Durham y el indicador de pH púrpura de bromo cresol. Si el microorganismo

presenta metabolismo fermentativo vira el color del indicador de púrpura a

amarillo por acidificación del medio. La producción de gas se observa por

formación de burbuja en la campana de Durham.

- Crecimiento a diferentes temperaturas de incubación y pH.

Microorganismos

Lactobacillus hilgardii 5w, Oenococcus oeni X2L, m y ST y Pediococcus

pentosaceus 12p aislados de vinos argentinos (Strasser de Saad y Manca de

Nadra, 1987; Manca de Nadra y Strasser de Saad, 1987).

Mantenimiento de cultivos

Los cultivos puros sin desarrollar se mantienen en medio MRS a 4º C

por cortos períodos de tiempo (1 a 3 meses). Para sembrar los medios, los

cultivos bacterianos en medio MRS se incuban a 30ºC durante 20-30 h para

iniciar el desarrollo y se activan por sucesivas transferencias a medio fresco.

Preparación del inóculo y condiciones de crecimiento

- 22 -

Los cultivos provenientes de medio MRS modificado se cosechan al final

de fase exponencial de crecimiento, se lavan con agua destilada estéril y

resuspenden en un volumen adecuado de agua estéril para alcanzar una

D.O.560nm= 1,0. La suspensión celular se utiliza para sembrar los medios de

prueba.

Estimación del crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano se determina espectrofotométricamente a 560

nm en espectrofotómetro Bausch & Lomb 20 y se cuantifica por el método de

las diluciones sucesivas. Las muestras se toman a intervalos de 2-4 h en fases

de crecimiento exponencial y estacionaria en las distintas condiciones de

ensayo.

Determinación de actividades -glucosidasa y -arabinofuranosidasa

Las actividades glicosidasas se miden por método colorimétrico de

acuerdo a lo descrito por D’Incecco y col. (2004) usando p-nitrofenil--D-

glucopiranósido (Sigma cat no. N7006) y p-nitrofenil--L-arabinofuranósido

(Sigma cat no. N3641) como sustratos para -glucosidasa y -

arabinofuranosidasa, respectivamente.

Las células se cultivan en medios MRS, MRS modificado y jugo de uva a

30C, se cosechan a mitad y final de fase exponencial y fase estacionaria de

crecimiento y se resuspenden en buffer acetato de sodio 0,1M pH 5,1. La

mezcla de reacción compuesta por : 50 l de la suspensión celular,

sobrenadante de cultivo o extracto libre de células cosechados a distintos

tiempos de incubación, 250 l de buffer acetato de sodio (0.1 M, pH 5.1) y 300

- 23 -

l del sustrato (1 mM en buffer acetato de sodio 0.1 M, pH 5.1), se incuba a

37ºC durante 30 min. La reacción se detiene por adición de 400 l de solución

de carbonato de sodio 1 M. El p-nitrofenol liberado se mide

espectrofotométricamente a 400 nm.

La actividad específica se expresa como nmoles de p-nitrofenol liberado

por hora por miligramo de peso seco celular.

Preparación de extracto libre de células

Células provenientes de 800 ml de cultivo se cosechan en mitad o

final de fase exponencial de crecimiento según corresponda, se centrifugan

y se lavan 2 veces con buffer acetato de sodio 0,1 M pH 5,1. Luego se

resuspenden en cantidad necesaria del mismo buffer para obtener una

suspensión de células al 30% (p/v). Las células se rompen por sonicación

usando prensa French (French Pressure Cell Press, ThermoSpectronic,

FA-078).

Determinación de las condiciones óptimas de las actividades enzimáticas

- pH: 3,5; 5,1 y 6,5.

- Temperatura: 20, 30 y 37°C

- Tiempo de incubación: 30, 60 y 120 min.

- Concentración de etanol: 8 y 12%

Determinación de proteínas

- 24 -

La determinación de proteínas en los extractos libres de células se

realiza utilizando el Método de Bradford (Bradford, 1976).

Determinación de glucosa

Glucosa residual se determina en sobrenadantes de cultivo, por el

método de glucosa oxidasa, Kit de Wiener (Rosario, Argentina).

Determinaciones de pH

Las medidas de pH se realizaron con pH-metro Instrumentalia S. A.

Reproducibilidad

Los ensayos se realizan por triplicado, dos veces.

- 25 -

Resultados y Discusión

- 26 -

Aislamiento e identificación

de bacterias lácticas de vinos

Argentinos

Pocas bacterias son capaces de crecer en vino debido a las desfavorables condiciones físico-químicas y bajo contenido de nutrientes del medio. Las bacterias acéticas y BL son los microorganismos más frecuentemente aislados. Las BL principalmente encontradas corresponden a Oenococcus, Pediococcus y Lactobacillus siendo Oenococcus oeni la especie mejor adaptada para sobrevivir a las condiciones de bajo pH y alta concentración alcohólica del vino.

- 27 -

Aislamiento de microorganismos de vino artesanal

De la muestra de vino artesanal se aíslan 8 y 6 colonias de medios

PCA y MRS pH 6,5, respectivamente. No se observa desarrollo en medio

MRS pH 4,8. En Tabla 1 se clasifican las colonias aisladas provenientes de

medio PCA en 7 grupos de acuerdo a la morfología celular, coloración de

Gram, actividad catalasa y capacidad para fermentar glucosa. La mayoría

de los aislados corresponden a bacterias Gram positivas, catalasa

positivas (62,5%). El aislado del grupo 5 presenta además estructura

refringente y se confirma la formación de espora con la coloración especial

de Shaeffer - Fulton. Sólo el aislado perteneciente al grupo 1 se identifica

como BL. Los aislados del grupo 6 y 7 se clasifican como enterobacterias.

Tabla 1. Microorganismos aislados de vino artesanal en medio PCA

Grupo MorfologíaColoración

de Gram

Actividad

catalasa

Fermentación

de glucosa

1 Cocobacilos, cadenas cortas + - +

2 Cocos en pares

o agrupados

+ + +/gas

3 Bacilos, cadenas cortas + + -

4 Cocos, largas cadenas + + Débil

5 Bacilos, cadenas cortas + + Débil

6 Bacilos en cadenas - + -

- 28 -

7 Bacilos en cadenas - + +

En Tabla 2 se clasifican en 4 grupos las colonias aisladas

provenientes de medio MRS pH 6,5 de acuerdo a morfología celular,

coloración de Gram y pruebas bioquímicas. Los grupos 1 y 2 están

constituidos por dos aislados y los 2 grupos restantes por uno. El grupo 1 esta

formado por levaduras. Las características de los aislados del grupo 2

coinciden con las del grupo 2 provenientes del medio PCA. En ambos casos

corresponden a cocos dispuestos en pares o agrupados en forma irregular,

coloración de Gram y actividad catalasa positivas. El microorganismo del grupo

3 presenta propiedades que son características de un contaminante que se

aísla frecuentemente en aguas de desecho de bodegas. Solamente el aislado

del grupo 4 se identifica como BL y en base a su morfología celular típica de

cocos en tetradas se identificaría como perteneciente al género Pediococccus.

Tabla 2. Microorganismos aislados de vino artesanal en medio MRS*

Grupo MorfologíaColoración

de Gram

Actividad

catalasa

Fermentación

de glucosa

1 Levadura + ND ND

2 Cocos en pares

o agrupados +

+ + /gas

3 Bacilos, cadenas cortas + + +

4 Cocos en tetradas + - +

*pH 6,5.

- 29 -

ND: no determinado

En Tabla 3 se indican las pruebas realizadas a los microorganismos

del grupo 4. Los resultados coinciden con aquellos obtenidos por miembros

del género Pediococcus, lo que confirmaría su identificación.

Tabla 3. Características de los microorganismos del grupo 4.

pH Temperatura Cl Na

4,2 7,5 8,5 35°C 40°C 50°C 4% 6,5% 18%

- + + + + - + + -

Aislamiento de microorganismos de vino sin filtrar ni clarificar

De la muestra de vino sin filtrar ni clarificar sembrada en medio PCA

se obtienen recuentos significativamente mayores que los determinados en

vino artesanal filtrado y clarificado. En esta condición se alcanza una

concentración celular final de 1,2 x 105 UFC/ml.

De medio MRS modificado adicionado con pimaricina, pH 6,5, se

seleccionan al azar colonias blancas lenticulares, Gram positivas, catalasa

negativas con morfología celular de cocos en tetradas, típica del género

Pediococcus para su posterior identificación (Tabla 4).

De medio MRS modificado adicionado con pimaricina, pH 4,8, luego

de 7 a 10 días de incubación a 30°C, se seleccionan al azar colonias

puntiformes y blanquecinas, Gram positivas, catalasa negativas con

morfología de células esféricas o lenticulares dispuestas en largas

cadenas, características de la especie Oenococccus oeni. Se las cultiva en

- 30 -

medio líquido MRS modificado pH 4,8 para su posterior identificación

(Tabla 4).

Los resultados de la Tabla 4 indican que los microorganismos sfc1 y

sfc2 corresponderían a Pediococcus sp. sobre la base que crecen a pH 6,5

y 30ºC, producen amoníaco a partir de arginina, utilizan glucosa por la via

homofermentativa y forman ácido L-láctico. Las aislados comprendidos

entre sfc3 y sfc17 corresponderían a Oenococcus oeni sobre la base que

crecen a 30ºC y pH 4,8, no hidrolizan arginina, producen gas a partir de

glucosa como consecuencia de su metabolismo heterofermentativo y el

isómero D del ácido láctico. Además crecen en presencia de 10% etanol,

fermentan fructosa y glucosa con producción de gas en medio líquido

(datos no mostrados en Tabla 4).

Tabla 4. Características de bacterias lácticas aisladas de vino sin filtrar ni clarificar

Aislado

Pruebas diferenciales

Crecimiento a NH3 de

Arginina

D/L

láctico

Glucosa

pH TemperaturaÁcido Gas

4,8 6,5 9 30°C 45°C

sfc1 + + – + – + L + –

sfc2 + + – + – + L + –

sfc3 + – – + – – D + +

sfc4 + – – + – – D + +

sfc5 + – – + – – D + +

sfc6 + – – + – – D + +

sfc7 + – – + – – D + +

sfc8 + – – + – – D + +

sfc9 + – – + – – D + +

- 31 -

sfc10 + – – + – – D + +

sfc11 + – – + – – D + +

sfc12 + – – + – – D + +

sfc13 + – – + – – D + +

sfc14 + – – + – – D + +

sfc15 + – – + – – D + +

sfc16 + – – + – – D + +

sfc17 + – – + – – D + +

En conclusión, de vino fino de estante no se aíslan microorganismos.

De vino artesanal se aíslan principalmente microorganismos

contaminantes Gram +, catalasa +.

De vino sin filtrar ni clarificar se aíslan Pediococcus sp. y

Oenococcus oeni.

De los microorganismos aislados, se seleccionan la cepa de

Oenococcus oeni sfc5 y Pediococcus sp para realizar estudios

relacionados con la producción de aromas.

- 32 -

Crecimiento de bacterias lácticas

- 33 -

a

5,5

7,5

9,5

11,5

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (h)

Lo

g U

FC

/ml

b

3

3,5

4

4,5

5

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (h)

pH

en medios MRS y MRS modificado

Crecimiento y modificación de pH de cepas de Oenococcus oeni en

medio MRS

- 34 -

Fig. 2. Crecimiento de Oenococcus oeni (a) y modificación de pH (b) en medio

MRS. Cepas: m (Δ), ST (■), X2L (▲) y sfc5 ().

La Figura 2a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococcus

oeni m, ST, X2L y sfc5 en medio MRS. La cepa m desarrolla con velocidad

de crecimiento de 0,25 h-1 y una concentración celular final de 2,5 x 1012

UFC/ml mientras que las cepas ST y X2L desarrollan con velocidad de 0,24

h-1 y 0,21 h-1 y alcanzan una concentración celular final de 1,6 x 1012 y 1,3 x

1012 UFC/ml, respectivamente. Oenococcus oeni sfc5 crece más lentamente

que el resto de las cepas estudiadas (0,10 h -1), alcanzando la fase

estacionaria en 100 h de incubación con concentración celular final de 6,3 x

1011 UFC/ml.

Saguir y Manca de Nadra (1997, 2002) demostraron en Oenococcus

oeni m, ST, X2L y L2 que la cepa m presentó el menor número de

requerimientos en aminoácidos esenciales. Este resultado explicaría su mejor

respuesta de crecimiento. El menor desarrollo de la cepa sfc5 podría estar

relacionada con falta de adaptación al medio de cultivo de laboratorio,

considerando que fue aislada recientemente durante este estudio.

El pH inicial de 4,8 disminuye a valores entre 3,5 y 3,8 aproximadamente en todos los casos (Fig. 2b), como resultado de sus metabolismos heterofermentativos. Los valores se relacionan con las velocidades de crecimiento determinadas en los diferentes cultivos.

Utilización de glucosa en medio MRS por cepas de Oenococcus oeni

Tabla 5. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de cepas de

Oenococcus oeni en medio MRS.

- 35 -

b

3

3,5

4

4,5

5

0 20 40 60 80

Tiempo (h)

pH

a

5,5

7,5

9,5

11,5

0 20 40 60 80

Tiempo (h)

Lo

g U

FC

/ml

Glucosa residual (g/l)

Tiempo Cepas

X2L ST m sfc5

0 20 20 20 20

Exponencial a 14,5 14,3 14,8 15,8

Estacionaria b 12,4 11,6 10,1 13,1 a Mitad de fase exponencial; b Inicio de fase estacionaria.

En mitad de fase exponencial de crecimiento los microorganismos

consumen entre 5,7 y 4,2 g/l de glucosa. El consumo del azúcar incrementa a

valores comprendidos entre 9,1 y 6,9 g/l al final del crecimiento (Tabla 5). La

menor velocidad y concentración del carbohidrato utilizado por la cepa sfc5

coincide con los menores parámetros de crecimientos alcanzados por este

microorganismo .

La disminución de pH inicial de los medios de cultivos (Fig. 2 b) se

relaciona directamente con el consumo del carbohidrato y la producción de

ácidos orgánicos como consecuencia de sus metabolismos fermentativos.

Los altos niveles de glucosa residual obtenidos al final del crecimiento

microbiano sugiere que la fermentación se detuvo por el bajo pH del medio y

no por pérdida del sustrato carbohidrato.

Crecimiento y modificación de pH de cepas de Oenococcus oeni en

medio MRS modificado

- 36 -

Fig. 3. Crecimiento de Oenococcus oeni (a) y modificación de pH (b) en

medio MRS modificado. Cepas: m (Δ), ST (■), X2L (▲) y sfc5 ().

La Figura 3a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococcus

oeni m, ST, X2L y sfc5 en medio MRS modificado. En esta condición las

cepas de Oenococcus oeni desarrollan con velocidades de crecimiento 54,5,

57,1, 48, 39% superiores que en medio basal para m, ST, X2L y sfc5,

respectivamente. Este comportamiento estaría relacionado con el aporte

adicional de fuentes de carbono y energía del jugo natural al medio complejo .

Las concentraciones celulares finales son similares a las determinadas en

medio MRS.

El pH inicial de 4,8 disminuye a valores comprendidos entre 3,5 y 3,8

aproximadamente (Fig. 3b). Los valores se relacionaron con las

velocidades de crecimiento determinadas en los diferentes cultivos.

Utilización de glucosa en medio MRS modificado por cepas de

Oenococcus oeni

Tabla 6. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de cepas de

Oenococcus oeni en medio MRS modificado.

Glucosa residual (g/l)

Tiempo Cepas

X2L ST m sfc5

0 20,8 20,8 20,8 20,8

Exponencial a19,2 18,2 18,1 19,5

- 37 -

b

3,5

4,5

5,5

6,5

0 10 20 30 40 50 60Tiempo (h)

pH

a

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (h)

Lo

g U

FC

/ml

Estacionaria b17,5 16,9 16,3 17,8

a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria.

El consumo final de glucosa varía entre 3,7 y 2,2 g/l. La mayor utilización

del azúcar corresponde a la cepa m y la menor a la cepa sfc5. En esta

condición, se alcanzan valores finales de glucosa residual superiores que en

medio MRS (Tabla 6). Este hecho estaría relacionado con el aporte adicional

de azúcares del jugo de uva al medio complejo.

La disminución del pH en los medios de cultivos (Fig. 3b) se relaciona

directamente con el consumo del carbohidrato y el metabolismo fermentativo

de las cepas de Oenococcus oeni.

Crecimiento y modificación de pH de Pediococcus pentosaceus 12p y

Pediococcus sp. en medio MRS

- 38 -

Fig. 4. Crecimiento de Pediococcus pentosaceus 12p () y Pediococcus

sp.(•) (a) y modificación de pH (b) en medio MRS.

La Figura 4a muestra el crecimiento de la cepa de Pediococcus

pentosaceus 12p y Pediococcus sp. en medio MRS.

La cepa 12p alcanza la fase estacionaria en 45 h de incubación a

30°C con una velocidad de crecimiento de 0,43 h-1 y una concentración

celular final de 4 x 1011 UFC/ml. Pediococcus sp. crece más lentamente

con una velocidad de 0,39 h-1 y alcanza una concentración celular final de 1 x

1011 UFC/ml.

El pH inicial, 6,5 desciende a 3,8 y 3,9 para Pediococcus pentosaceus

12p y Pediococcus sp., respectivamente (Fig 4b). Los valores se correlacionan

con las velocidades de crecimientos.

La adición de jugo de uva 10% al medio basal no modifica

significativamente los parámetros de crecimientos en ambos microorganismos.

Utilización de glucosa en medio MRS por Pediococcus pentosaceus 12p y

Pediococcus sp.

Tabla 7. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de

microorganismos pertenecientes al género Pediococcus en medio MRS.

- 39 -

Glucosa residual (g/l)

Tiempo

Pediococcus

pentosaceus

12p

Pediococcus

sp.

0 20 20

Exponencial a14,9 13

Estacionaria b11,4 9,1

a

6

7

8

9

10

11

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

Lo

g U

FC

/ml

b

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)

pH

a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria.

En fase exponencial las microorganismos utilizan entre el 25,5 y 35% de

la glucosa inicial. Al final del crecimiento 43 y 54,5 % de la concentración inicial

de azúcar son consumidos por Pediococcus pentosaceus 12p y Pediococcus

sp, respectivamente.

La disminución de pH en los medios de cultivos (Fig. 3 b) se relaciona

directamente con el consumo del carbohidrato y el metabolismo

homofermentativo de estas bacterias.

Crecimiento y modificación de pH de Lactobacillus hilgardii 5w en medio

MRS y MRS modificado

- 40 -

Fig. 5. Crecimiento de Lactobacillus hilgardii 5w (a) y modificación de pH

(b). Medios MRS (), MRS modificado (■).

La Figura 5a muestra el crecimiento de Lactobacillus hilgardii 5w en

medios MRS y MRS modificado. En medio basal el microorganismo

desarrolla con velocidad similar que en el mismo medio enriquecido con jugo

de uva. En ambas condiciones alcanza una concentración celular final de 6,3 x

1010 UFC/ml.

El pH inicial disminuye aproximadamente a 4,0 al final del crecimiento

microbiano en ambas condiciones de cultivo (Fig. 5b)

Utilización de glucosa en medios MRS y MRS modificado por

Lactobacillus hilgardii 5w

Tabla 8. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de Lactobacillus

hilgardii 5w en medio MRS y MRS modificado

a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria

- 41 -

Glucosa residual (g/l)

Tiempo Lactobacillus hilgardii 5w

MRS MRS mod

0 20 20,8

Exponencial a16,2 16,8

Estacionaria b11,8 13,7

En medio MRS y MRS modificado el microorganismo consume 41 y 31,5

% de la glucosa inicial al final del crecimiento, respectivamente. El consumo

final de glucosa es menor en el medio enriquecido con jugo de uva que en

medio basal (Tabla 8).

La disminución del pH se relaciona con el consumo del carbohidrato y el

metabolismo fermentativo del microorganismo.

En conclusión, en medio MRS las cepas de Oenococcus oeni

consumen menos glucosa y desarrollan con menor velocidad específica de

crecimiento que los Pediococcus y Lactobacillus.

La adición del jugo de uva al medio basal estimula significativamente

el crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni, al aportar nutrientes para

sus complejos requerimientos nutricionales.

- 42 -

Actividades glicosidasas en

bacterias lácticas cultivadas en

medios MRS y MRS modificado

- 43 -

El aroma del vino es consecuencia, principalmente, de componentes

volátiles derivados de las uvas (C13-norisoprenoides, monoterpenos, etc) que

pueden ser liberados por acción enzimática a partir de precursores

glicoconjugados no aromáticos, cuya fracción glicosídica puede ser un

monoglucósido o disacáridos glicosilados, con glucosa sustituida por -L-

arabinofuranosil, -L-rhamnosopyranosil, -D-xilopiranosil o -apiofuranosil.

Actividad β-glucosidasa en bacterias lácticas

Se investiga la actividad enzimática en suspensiones celulares,

sobrenadantes de cultivo y extractos libres de células de las cepas de

Oenococcus oeni X2L, ST, m, sfc5, Pediococcus pentosaceus 12p,

Pediococcus sp. y Lactobacillus hilgardii 5w. No se encuentra actividad en

sobrenadantes de cultivos, ni en extractos libres de células de los

microorganismos analizados.

Las actividades enzimáticas solo se detectan en las suspensiones

celulares con actividades específicas que varían de 100 a 14410 nmoles/mg/h.

Los valores más altos de actividad específica β-glucosidasa corresponden, en

general, a suspensiones celulares provenientes de mitad de fase exponencial

- 44 -

de crecimiento y medio MRS. Las cepas de Oenococcus oeni ST y X2L

presentan las mayores actividades específicas. Las actividades específicas de

Pediococcus pentosaceus 12p también son significativas, alcanzando valores

máximos de 5586 nmoles/mg/h. Los valores de actividad especifica de

Pediococcus sp. aislada durante este estudio, son comparables a los

determinados en Pediococcus pentosaceus 12p. Los valores más bajos de

actividades enzimáticas específicas corresponden a las suspensiones celulares

de la cepa de Oenococcus oeni sfc5, también aislada durante este estudio y

Lactobacillus hilgardii 5w (Tabla 9).

Tabla 9. Actividad específica -glucosidasa en suspensiones celulares de

bacterias lácticas.

Actividad especifica (nmoles/mg/h)

Microorganismo

Fase de Crecimiento

Mitad exponencial Final exponencial Estacionaria

MRS MRSmod MRS MRSmod MRS MRSmod

Oenococcus

oeni

X2L 13910 9286 6867 5888 5120 2630

ST 14410 12747 9917 3088 5628 4154

m 7350 5080 4150 2550 2220 2590

sfc5 204 221 235 100 203,4 255,9

Pediococcus

pentosaceus

12p 5586 4296 3183 3598 2719 4095

Pediococcus

sp.

3086 2056 3279 2265 3426 2389

Lactobacillus hilgardii

5w 914 686 738 477 429 429

- 45 -

Los resultados sugieren que la actividad específica β-glucosidasa varía

en función de la especie, Oenococcus oeni presenta los valores más altos, y

cepas. Similares resultados fueron descriptos por Grimaldi y col. (2005b),

Barbagallo y col. (2004) y Mansfield y col. (2002). La composición del medio y

fase de crecimiento también influyen sobre los resultados obtenidos. El medio

MRS modificado estimula el crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni (Fig.

3a) pero no favorece la actividad específica β-glucosidasa.

Actividad -arabinofuranosidasa en bacterias lácticas

Se investiga la actividad enzimática en suspensiones celulares,

sobrenadantes de cultivos y extractos libres de células de las cepas de

Oenococcus oeni X2L, ST, m, sfc5, Pediococcus pentosaceus 12p,

Pediococcus sp. y Lactobacillus hilgardii 5w. No se encuentra actividad en

sobrenadantes de cultivos, ni en extractos libres de células de los

microorganismos analizados.

Seis de las siete BL analizadas presentan actividad -

arabinofuranosidasa en suspensiones celulares con valores de actividades

específicas que varían de 9 a 1679 nmoles/mg/h, menores que los obtenidos

para la enzima β-glucosidasa. Las máximas actividades específicas -

arabinofuranosidasa corresponden a las suspensiones celulares provenientes

del medio MRS enriquecido con jugo de uva y final de fase exponencial. Estos

resultados difieren de aquellos encontrados para la enzima β-glucosidasa. Las

suspensiones celulares de Pediococcus pentosaceus 12p y Pediococcus sp.

- 46 -

presentan los valores más altos. En las cepas de Oenococcus oeni X2L y ST

éstos también son significativos (Tabla 10).

Los microorganismos aislados durante este trabajo del vino sin filtrar ni

clarificar, presentan actividades especificas -arabinofuranosidasa opuestas.

No se determina actividad en Oenococcus oeni sfc5 mientras que en

Pediococcus sp. los valores son comparables a los encontrados en

Pediococcus pentosaceus 12p (Tabla 10).

Actividad especifica (nmoles/mg/h)

Microorganismo

Fase de crecimiento

Mitad exponencial Final exponencial Estacionaria

MRS MRSmod MRS MRSmod MRS MRSmod

Oenococcus oeni

X2L 933 1036 1102 1481 998 1220

ST 697 941 1081 600 980

m 97 89 51

sfc5

Pediococcus pentosaceus

12p 613 1679 349 1031

Pediococcus sp.

305 1518 9 867

Lactobacillus hilgardii

5w 753 846 345 372

Tabla 10. Actividad específica -arabinofuranosidasa en suspensiones

celulares de BL.

Las experiencias realizadas en sobrenadantes libres de células y

extractos libres de células, no permitieron determinar las actividades

- 47 -

enzimáticas. En el primer caso indicaría que no son liberadas al medio. En el

segundo caso podría relacionarse a ubicación de las enzimas en pared.

Barbagallo y col. (2004) demostraron en 6 cepas de Oenococcus oeni

que la actividad enzimática estuvo ausente en sobrenadantes de cultivos.

Mansfield (2002) describió que la actividad β-glucosidasa sólo estuvo presente

en células enteras de Oenococcus oeni.

Las actividades enzimáticas β-glucosidasa y -arabinofuranosidasa

varían en función del microorganismo, fase de crecimiento y composición del

medio de cultivo.

Las cepas de Oenococcus oeni X2L y ST, Pediococcus pentosaceus

12p y Pediococcus sp. presentan las mayores actividades específicas β-

glucosidasa y -arabinofuranosidasa, respectivamente .

Seleccionamos las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus

pentosaceus 12p para estudios de caracterización físico-química de las

enzimas glicosídicas.

- 48 -

Actividades glicosídicas de

Pediococcus pentosaceus 12p y

Oenococcus oeni ST cultivados en

jugo de uva.

- 49 -

b

3

3,5

4

4,5

5

0 20 40 60 80 100Tiempo (h)

pH

a

6

7

8

9

10

11

12

13

0 20 40 60 80 100Tiempo (h)

Lo

g U

FC

/ml

Evaluamos el crecimiento y las actividades de las enzimas glicosídicas

de los microorganismos seleccionados en jugo de uva enriquecido con 5 g/l de

extracto de levadura.

Crecimiento de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p en

medio jugo de uva suplementado con extracto de levadura.

Fig. 6. Crecimiento de Oenococcus oeni ST (■) y Pediococcus

pentosaceus 12p () (a) y modificación de pH (b) en medio natural.

- 50 -

La Figura 6a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococus oeni

ST y Pediococcus pentosaceus 12p en medio jugo de uva, pH 4,7. La cepa

12p desarrolla con velocidad específica de crecimiento de 0,17 h-1 y una

concentración celular final de 7,4 x 1011 UFC/ml mientras que la cepa ST

desarrolla con velocidad de 0,18 h-1 y alcanza concentración celular

aproximadamente 1 ciclo logarítmico mayor que la cepa 12p (6,3 x 1012

UFC/ml). La mejor respuesta de crecimiento de Oenococcus oeni ST con

respecto a Pediococcus pentosaceus 12p podría estar relacionado con el pH

inicial del medio, 4.7, óptimo para el crecimiento de Oenococcus oeni pero no

para Pediococcus pentosaceus.

En esta condición las cepas ST y 12p de Oenococcus oeni y

Pediococcus pentosaceus desarrollan con velocidades de crecimiento 31,3% y

56,3% menores que en medio MRS, respectivamente.

El pH inicial de 4,7 disminuye a valores entre 3,3 y 3,7 aproximadamente

(Fig. 6b). Los valores se relacionan con las velocidades de crecimiento

determinadas en las diferentes condiciones de cultivos.

Utilización de glucosa por Oenococcus oeni ST y Pediococcus

pentosaceus 12p en medio jugo de uva.

Tabla 11. Variación de glucosa residual de Oenococcus oeni ST y

Pediococcus pentosaceus 12 p durante su crecimiento en medio jugo de uva.

- 51 -

Glucosa residual (g/l)

Tiempo

Microorganismo

Oenococcus oeni

ST

Pediococcus

pentosaceus 12p

0 18,37 18,37

Exponencial a17,04 17,31

Estacionaria b16,35 14,75

a Mitad de fase exponencial; b Inicio de fase estacionaria.

La Tabla 11 muestra la variación de glucosa residual durante las

distintas fases de crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni ST y

Pediococcus pentosaceus 12 p en medio jugo de uva.

En mitad de fase exponencial de crecimiento los microorganismos

consumen aproximadamente 1 g/l de glucosa. El consumo del azúcar

incrementa a valores comprendidos entre 2,02 y 3,6 g/l al final del crecimiento

microbiano, menores que los determinados en medio MRS para ambas

bacterias. Posiblemente la utilización de otros azúcares, como fructosa,

normalmente presentes en el medio natural inhibe su consumo. Se ha

demostrado que algunas BL prefieren fructosa más que glucosa para crecer

(Gardner y col., 2001).

La disminución de pH inicial de los medios de cultivos (Fig. 6b) se

relaciona directamente con el consumo del carbohidrato .

- 52 -

Actividad β-glucosidasa y α-arabinofuranosidasa en Oenococcus

oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p

Tabla 12. Actividad específica -glucosidasa en suspensiones celulares de

Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p provenientes de medio

jugo de uva.

Actividad específica (nmoles/mg/h)

Microorganismo EnzimaMitad de fase

exponencial

Final de fase

exponencial

Fase

estacionaria

Oenococcus

oeni

ST

-glucosidasa 3770 2325 2282

-arabinofuranosidasa 1226 658 344

Pediococcus

pentosaceus

12p

-glucosidasa 2539 657 321

-arabinofuranosidasa 4086 99 ─

No se encuentra actividad enzimática en sobrenadantes de cultivos, ni

en extractos libres de células.

- 53 -

Se determina actividad -glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las

suspensiones celulares de ambas cepas con valores de 321 a 3770 y de 99 a

4086 nmoles/mg/h, respectivamente. Las actividades específicas enzimáticas

máximas se obtienen siempre en mitad de fase exponencial de crecimiento

(Tabla 12). Este resultado no coincide con aquellos obtenidos para la enzima

-arabinofuranosidasa en las suspensiones celulares provenientes de medios

MRS y MRS modificado, donde la actividad enzimática es máxima al final de

fase exponencial.

Las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p

presentan la máxima actividad específica -glucosidasa y -

arabinofuranosidasa, respectivamente (Tabla 12). En esta condición, las

actividades específicas -glucosidasa son menores que en las suspensiones

celulares provenientes de los medios MRS. Grimaldi y col., 2000 y 2005

demostraron en Oenococcus oeni el efecto inhibitorio de glucosa y fructosa

sobre la actividad de estas enzimas. Por otro lado la menor disposición de

nutrientes del medio natural con respecto al medio de laboratorio podría afectar

la producción de las enzimas y consecuentemente sus actividades. Similar

resultado fue descripto por McMahon y col (1999). No obstante, es importante

destacar que la cepa ST muestra considerables valores de actividad específica

β-glucosidasa.

La actividad específica -arabinofuranosidasa de la cepa 12p en medio

natural es mayor que en medio MRS modificado, demostrando que el jugo de

uva estimula la actividad enzimática.

- 54 -

Caracterización físico química

de las enzimas

- 55 -

Los microorganismos seleccionados se siembran y cosechan en

aquellas condiciones donde las actividades específicas son máximas. En

medio MRS y mitad de la fase exponencial para la caracterización de la enzima

-glucosidasa y en medio MRS modificado y final de la fase exponencial para

la caracterización de la actividad -arabinofuranosidasa.

Efecto de pH, temperatura y tiempo de incubación sobre la actividad β-

glucosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p.

Las actividades específicas -glucosidasa son máximas para ambas

cepas a 30ºC y a pH 5,1 y 6.5 para las cepas ST y 12p, respectivamente (Fig.

7a,b). Estos resultados coinciden con los valores de temperatura y pH óptimos

para sus crecimientos.

En Oenococcus oeni ST a pH 6,5 y 3,5 se producen pérdidas del 36,87 y

76,38 % de la actividad específica, respectivamente. Sin embargo, es

importante destacar que a pH ácidos no hay pérdida total de actividad y el valor

obtenido es significativo. En Pediococcus pentosaceus 12p a pH 3,5 la pérdida

de actividad específica corresponde al 68,74% (Fig. 7a). Se ha demostrado que

- 56 -

a

0

5000

10000

15000

20000

25000

O.o.ST P.p. 12p

Ac

t.e

sp

. (n

mo

les

/mg

/h)

■ 3,5, 37ªC,30min, ■ 5,1; 37ºC; 30 min ■ 6,5; 37ºC; 30 min

b

0

5000

10000

15000

20000

25000

O.o.ST P.p. 12p

Act

.esp

. (n

mo

les/

mg

/h)

■20ºC, pH 5,1; 30 min ■30ºC, pH 5,1; 30 min ■37ºC, pH 5,1; 30 min

c

0

5000

10000

15000

20000

25000

O.o.ST P.p. 12p

Ac

t.e

sp

.(n

mo

les

/mg

/h)

■30 min; 37ºC; pH5,1■ 60 min; 37ºC; pH5,1 ■120 min; 37ºC; pH5,1

el pH es un factor de inhibición sobre las actividades glicosidasas de las

levaduras (Rosi y col, 1994; Grimaldi y col.,2000).

A 20ºC se observa pérdida de actividad específica en la cepa ST

(aproximadamente del 36%). Sin embargo el valor obtenido continúa siendo

elevado (Fig. 7b).

- 57 -

Fig. 7. Efecto del pH (a), temperatura (b) y tiempo de incubación (c) sobre

las actividades específicas β-glucosidasa de Oenococcus oeni ST y

Pediococcus pentosaceus 12p.

La propiedad de la cepa ST de presentar actividad específica -

glucosidasa bajo las condiciones enológicas (pH bajo y 20ºC) es muy

significativa desde el punto de vista tecnológico.

El tiempo de incubación no afecta significativamente la actividad

enzimática en la cepa de Oennococcus oeni ST. En Pediococcus pentosaceus

12p incrementa proporcionalmente en función del tiempo de incubación (Fig.

7c).

Efecto del pH, temperatura y tiempo de incubación sobre la actividad -

arabinofuranosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus

12p.

Las actividades específicas -arabinofuranosidasa son

significativamente afectadas por pH. En Oenococcus oeni ST ésta es mayor a

pH 3,5 con respecto a valores superiores . En Pediococcus pentosaceus 12p

solo se detecta actividad -arabinofuranosidasa a pH 5,1 (Fig. 8a). Las

actividades específicas -arabinofuranosidasa son máximas a 30 y 37ºC para

las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p

respectivamente. A 20ºC desciende 41,9 y 70% en las cepas ST y 12p

respectivamentel. Sin embargo el valor obtenido para la cepa ST continúa

- 58 -

c

0

500

1000

1500

2000

2500

O.o.ST P.p. 12p

Ac

t. E

sp

. (n

mo

les

/mg

/h)

■30 min; 37ºC; pH5,1■ 60 min; 37ºC; pH5,1 ■120 min; 37ºC; pH5,1

■ 3,5, 37ªC,30min, ■ 5,1; 37ºC; 30 min ■ 6,5; 37ºC; 30 min

■20ºC, pH 5,1; 30 min ■30ºC, pH 5,1; 30 min ■37ºC, pH 5,1; 30 min

a

0

500

1000

1500

2000

2500

O.o. ST P.p. 12p

Ac

t.e

sp

. (n

mo

les

/mg

.h)

b

0

500

1000

1500

2000

2500

O.o. ST P.p. 12p

Ac

t.e

sp

. (n

mo

les

/mg

.h)

siendo significativo (Fig. 8b). En la cepa ST se observa pérdida total de

actividad -arabinofuranosidasa en 120 min de incubación (Fig. 8c).

Fig. 8. Efecto del pH (a), temperatura (b) y tiempo de incubación (c) sobre

la actividad -arabinofuranosidasa.

- 59 -

En conclusión, los resultados demuestran que Oenococcus oeni ST

presenta actividades específicas β-glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las

condiciones de temperatura y pH empleadas en la elaboración del vino.

Específicamente la enzima -arabinofuranosidasa incrementa su actividad a

pH 3,5 con respecto a valores superiores.

Efecto de etanol sobre las actividades β-glucosidasa y α-

arabinofuranosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus

pentosaceus 12p.

A pH 5,1 y 20°C, en la cepa Oenococcus oeni ST las actividades

específicas -glucosidasa y -arabinofuranosidasa se reducen 78% y 82%,

respectivamente en presencia de 8% de etanol. Cuando la concentración de

etanol incrementa al 12% no se observan modificaciones significativas (Fig.

9a,b) y se determinan valores de actividad específica de 2296 y 225

nmoles/mg.h para -D-glucosidasa y -arabinofuranosidasa, respectivamente.

Similar resultado fue demostrado en una cepa comercial de Oenococcus oeni

por Barbagallo y col., (2004). El etanol actúa como inhibidor de las enzimas

glicosídicas (Sánchez-Torres y col., 1998; Grimaldi y col., 2000; Spagna y col.,

2002).

- 60 -

a

0

100

200

300

O.o. ST P.p.12p

Ac

t.e

sp

. Re

lati

va %

b

0

100

200

300

400

500

600

700

O.o. ST P.p.12p

Ac

t.e

sp

. Re

lati

va %

■sin etanol; ■ 8% etanol; ■12% etanol

Fig. 9. Efecto de la adición de 8 y 12% de etanol sobre la actividad β-

glucosidasa (a) y -arabinofuranosidasa (b) en Oenococcus oeni ST y

Pediococcus pentosaceus 12p.

Mezcla de reacción, pH 5,1 se incuba a 20ºC 30 minutos.

La cepa 12p de Pediococcus pentosaceus presenta resultados

diferentes. La adición de 8 o 12% de etanol a la mezcla de reacción aumenta

significativamente las actividades glicosídicas a pH 5,1 y 20°C. En presencia

de la mayor concentración de alcohol, las actividades específicas -D-

glucosidasa y -arabinofuranosidasa aumentan 2,5 y 7 veces, respectivamente

(Fig. 9a,b). Pemberton y col. (1980) demostraron que el etanol incrementa la

velocidad de reacción al actuar como aceptor de un intermediario glicosílico

clave (glicosil-catión. Esta propiedad se relaciona con el mayor carácter

nucleofílico del alcohol que del agua. La concentración de etanol no modifica

significativamente los resultados obtenidos (Fig. 9a,b), contrariamente a lo

determinado por Williams (1993), Grimaldi y col. (2000, 2005a y 2005b).

- 61 -

Los resultados demuestran que el etanol influye estimulando o

disminuyendo las actividades glicosidasas según el microorganismo en estudio

y que su efecto no es dependiente de la concentración empleada.

En Pediococcus pentosaceus 12p las actividades enzimáticas

específicas incrementan significativamente, indicando que esta cepa aumenta

las potencialidades para hidrolizar compuestos glicoconjugados en medios

alcohólicos.

- 62 -

CONCLUSIONES

- 63 -

En vino artesanal sin filtrar ni clarificar se determina el mayor

número de microorganismos aislados y se identifican cepas pertenecientes

a la especie Oenococcus oeni y al género Pediococcus.

Se detecta actividad -glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las

suspensiones celulares de las bacterias lácticas analizados. Las actividades

específicas -glucosidasa son superiores a las actividades específicas -

arabinofuranosidasa.

Las actividades específicas varían en función de la especie, fase de

crecimiento y composición del medio de cultivo.

Las máximas actividades específicas -glucosidasa corresponden a

células de Oenococcus oeni provenientes de medio MRS y cosechadas en

mitad de fase exponencial de crecimiento.

Las máximas actividades específicas -arabinofuranosidasa

corresponden a células de Pediococcus pentosaceus provenientes de medio

jugo de uva y cosechadas a mitad de fase exponencial de crecimiento.

Las actividades específicas -glucosidasa y -arabinofuranosidasa

son máximas a 30ºC y significativas a 20ºC, temperatura normalmente

empleada en vinificación.

- 64 -

Las actividades especificas -glucosidasa son máximas a pH óptimos

de crecimientos en ambos microorganismos. En Oenococcus oeni ST

continúa siendo significativa a pH 3,5.

La actividad específica -arabinofuranosidasa es máxima a pH 3,5 en

Oenococcus oeni. En Pediococcus pentosaceus 12p sólo se detecta ésta

actividad a pH 5,1.

Los resultados demuestran que en las condiciones de pH y

temperatura empleadas durante la vinificación la cepa de Oenococcus oeni

ST presenta las mayores potencialidades para producir compuestos de

aromas a partir de precursores glicoconjugados.

En presencia de etanol incrementan las actividades enzimáticas

específicas de Pediococcus pentosaceus 12p. Este resultado demuestra la

propiedad beneficiosa de este microorganismo para hidrolizar compuestos

glicosilados en medios alcohólicos como el vino.

- 65 -

Los resultados preliminares obtenidos durante este trabajo de Tesina son

importantes para una primera selección de BL aisladas de vinos argentinos con

potencialidad para producir compuestos que optimicen el aroma del producto

final a partir de precursores glicoconjugados, normalmente presentes en el

medio natural.

Dado el valor tecnológico de la investigación realizada y sus posibilidades de

aplicación, es importante continuar las investigaciones determinando las

actividades enzimáticas en medio vino con el fin de establecer sus influencias

sobre el aroma y color del producto final.

Además, es necesario que en la selección de cepas para conducir

fermentaciones específicas, se incorpore la capacidad de aportar compuestos

de aroma como criterio adicional de óptimas condiciones tecnológicas.

- 66 -

Bibliografía

- 67 -

Axelsson, L., (1998). Lactic acid bacteria: classification and physiology.

In Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects, 1-72. 2nd ed.

Marcel Dekker, Inc, New York.

Barbagallo, R. N., Spagna G., Palmeri R., y Torriani S., (2004).

Assessment of ß-glucosidase activity in selected wild strains of Oenococcus

oeni for malolactic fermentation. Enzyme Microbiology Technology 34,292-296.

Bartowsky , E., Costello, P., y Henschke, P., (2002a). Management of

malolactic fermentation-wine flavor manipulation. Aust. N. Z. Grapegrower

Winemaker 461a. 7-8, 10-12.

Bartowsky , E., Francis, I.L., bellon, J.R., y Henschke, P.A., (2002b). Is

buttery aroma perception in wines predictable from diacetyl concentration ?

Aust. Journal Grape Wine Res. 8, 180-185.

Bartowsky, E., y Henschke, P., (2004). The 'buttery' attribute of wine--

diacetyl--desirability, spoilage and beyond. Review. International Journal of

Food Microbiology 96(3), 235-52.

Bertrand, A., (1981). Formation des substances volatiles au cours de la

fermentation alcoolique. Incidence sur la qualité du vin. In Colloque Soc. Fr.

Microbiol.: Reims, France; pp 251-267.

- 68 -

Boido, E., Lloret, A., Medina, K., Carrau, F., y Dellacasa, E., (2002).

Effect of -glycosidase activity of Oenococcus oeni on the glycosilated flavor

precursors of Tannat wine during malolactic fermentation. J. Agric. Food chem.

50, 2344-2349.

Boulanger, R., Chassagne, D., y Crouzet, J., (1999). Free and bound

flavour components of amazonian fruits. 1: Bacuri. Flavour Fragr. J. 14,

303_/311.

Bradford, MM., (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation

of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Analytical Biochemistry. 72, 248-254.

Cordonnier, R., y Bayonove, C., (1974) Mise en evidence dans la baie

de raisin, variété Muscat d’Alexandrie, de monoterpénes liés revelables par une

ou plusieurs encimes du fruti. C.R. Acad. Sci. Paris, Ser. D. 278, 3387-3390.

Davis, C.R., Wibowo, D., Fleet, G.H., y Lee, T.H., (1988). Properties of

wine lactic acid bacteria: their potencial enological significance. American

Journal of Enology and Viticulture 39, 137-142.

de Man, J.C., Rogosa, M.A., y Sharpe, M.E., (1960). A medium for the

cultivation of lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135.

- 69 -

de Revel, G., Bertrand, A., y Lonvaud-Funel, A., (1989). Synthèse des

substances acétoïniques par Leuconostoc oenos. Réduction du diacétyle.

Connaiss. Vigne Vin, 23 (1), 39-45.

de Revel, G., Martin, N., Prips-Nicolau, L., Lonvaud-Funel, A. y Bertrand,

A., (1999). Contribution to the knowledge of malolactic fermentation influence

on wine aroma. J. Agric. Food Chem. 47, 4003-4008.

Dicks, L.M.T., Dellaglio, F., y Collins, M.D., (1995). Proposal to

reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni. International Journal of

Systematic Bacteriology, 45, 395-397.

D’Incecco, N., Bartowsky, E., Kassara, S., Lante, A., Spettoli, P., y

Henschke, P., (2004). Release of glycosidically bound flavour compounds of

Chardonnay by Oenococcus oeni during malolactic fermentation. Food

Microbiology, 21, 257-265.

Fugelsang, K.C., (1997). Wine Microbiology. Chapman and Hall, New

York.

Gardner, N. J., Savard, T., Obermeier, P., Caldwell, G. y Champagne, C.

P. (2001). Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid

fermentation of carrot, cabbage, and onion vegetable mixtures. International

Journal of Food Microbiology, 64, 261-275.

- 70 -

Garvie, E.I., (1986a). Genus Pediococcus, In Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology, 2, 9th edition Sneath, P. H. A. 1075-1079. Mair:

Sharpe and Holt.

Garvie, E.I., (1986b). Genus Leuconostoc. In Bergey`s Manual of

Systematic Bacteriology, 2, 9th edition editorial Sneath, P.H.A., 1071-1075.

Baltimore: Williams and Wilkins.

Gibson, T., y Abdel- Malek, Y., (1945). The formation of carbon dioxide

by lactic acid bacteria and Bacillus licheniformis and a cultural method of

detecting the process. Journal of Dairy Research ,14, 35-44.

Grimaldi, A., McLean H., y Jiranek V., (2000) Identification and partial

characterization of glycosidic activities of the commericial strains of the lactic

acid bacterium, Oenococcus oeni. Am J Enol Vitic 51(4):362-369.

Grimaldi, A., Bartowsky, E. and Jiranek, V., (2005a) A survey of

glycosidase activities of commercial wine strains of Oenococcus oeni. Int J

Food Microbiol (in press).

Grimaldi, A., Bartowsky, E., y Jiranek, V., (2005b). Screening of

Lactobacillus spp. and Pediococcus spp. for glycosidase activities that are

important in oenology. J. Appl. Microbiol. 99 (5): 1061-1069.

- 71 -

Gueguen, Y., Chemardin, P., Pien, S., Arnaud, A., y Galzy, P., (1997).

Enhancement of aromatic quality of Muscat wine by the use of immobilized β-

glucosidase. J Biotech 55:151-156.

Gunata, Z. Y., Bitteur, S., Brillouet, J.-M., Bayonove, C. L., y

Chardonnier, R. E., (1988). Sequential enzymatic hydrolysis of potentially

aromatic glysocides from grapes. Cabyhydr. Res. 134:139-149.

Gunata, Y.Z., Bayonove, C.L., Baumes, R.L., y Cordonnier, R.E., (1985).

The aroma of grapes: 1. Extraction and determination of free and glycosidically

bound fractions of some grapes aroma components. J. Chromatogr. 331, 83-90.

Henick-Kling, T., (1995). Control of malo-lactic fermentation in wine:

energetics, flavour modification and methods of starter cultura preparation. J.

Appl. Bacterial. Symp. Suppl., 79, 29S-37S.

Henick-Kling, T., (1993). Malolactic fermentation. In: Wine Microbiology

and biotechnology ed. Fleet, G.pp. 289-326. Chur, Switzerland: Harwood

Academic Publishers.

Jackson, R.S., (1994). Wine Science: Principles and Applications. AP.

NY, NY.

- 72 -

Krammer, G., Winterhalter, P., Schwab, M., y Schreier, P., (1991).

Glycosidically bound aroma compounds in the fruits of Prunus species: Apricot

(P. armeniaca , L.), peach (P.persica , L.), Yellow plum (P. domestica , L. ssp.

Syriaca). J. Agric. Food Chem. 39, 778-/781

Laurent, M.H., Henick-Kling, T., y Acree, T.E., (1994). Changes in the

aroma and odor of chardonnay wine due to malolactic fermentation. Vitic. Enol.

Sci. 49, 3-10.

Liu, S.Q., (2002). Malolactic fermentation in wine: beyond

deacidification. Journal of Applied Microbiology 92, 589–601.

Maicas S., Gil J.V., Pardo I., y Ferrer S., (1999). Improvement of volatile

composition of wine by controlled addition of malolactic bacteria. Food research

International, 32, 491-496.

Manca de Nadra, M.C., Arena M.E., y Saguir F.M., (2003). Nutritional

requirements and amino acids utilization by lactic acid bacteria from wine. A

short review. J. Food Agric. & Env., 1 (3&4), 76-79. (3). WFL Publisher. Science

and Technology. CIUNT: Res. N°537/01.

Manca de Nadra, M.C. y Strasser de Saad, A.M. (1987). Evolution of

lactic acid bacteria during the different stages of vinification of Cafayate

(Argentina) wine. . Microbiology-Aliments-Nutrition, 5, 235-240.

- 73 -

Mansfield, A.K., Zoecklein, B.W., y Whiton, R.S., (2002). Quantification

of glycosidase activity in selected strains of Brettanomyces bruxellensis and

Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Viticult. 53:303-307.

Marinos, V.A., Tate, M.E., y Williams, P.J., (1994). Protocol for FAB

MS/MS characterization of terpene disaccharides of wine. J. Agric. Food

Chem., 42, 2486-2492.

Martley, F.G., Jayashankar, S.R., y Lawrence, R.C., (1970). An improved

agar medium for the detection of proteolytic organisms in total bacterial counts.

Journal of Applied Bacteriology, 33, 363-370.

McMahon, H., Zoecklein, B.W., Fugelsang, K.C., y Jasinski, Y., (1999).

Quantification of glycosidase activities in selected yeast and lactic acid bacteria.

J. Ind. Microbiol. Biotech. 23,198– 203.

Pardo, I., y M. Zuniga, (1992). Lactic Acid Bacteria in Spanish red rose

and white musts and wines under cellar conditions. J Food Sci 57(2), 392-395.

Pemberton, M.S., Brown, R.D., y Emert, G.H., (1980). The role of _-

glucosidase in the bioconversion of cellulose. Can J Chem Eng58, 723–9.

Pilatte, E., y Prahl, C., (1997) Biological deacidification of acid grape

varieties by inoculation on must with a freeze-dried culture of Lactobacillus

plantarum. Am J Enol Viticult 48, 386.

- 74 -

Rosi, I., Vinella, M., y Domizio, P., (1994). Characterization of β-

glucosidase activity in yeasts of oenological origin. J Appl Bact 77,519-527.

Sanchez-Torres, P., Gonzalez-Candelas, L., y Ramon, D., (1998).

Heterologous expression of a Candida molischiana anthocyanin-hglucosidase

in a wine yeast strain. J. Agric. Food Chem. 46, 354– 360.

Saguir F. M. y Manca de Nadra M. C., (1997).Growth and metabolism of

Leuconostoc oenos in synthetic media. Microbiology-Aliments-Nutrition, 15,

131-138.

Saguir F. M. y Manca de Nadra M. C., (2002).Effect of L-malic and citric

acids metabolism on the essential amino acid requirements for Oenococcus

oeni growth. J. Appl. Microb., , 93, 295-301.

Schwab, W., Mahr, C.W., y Schreier, P., (1989). Studies on the

enzymatic hydrolysis of bound aroma components from Carica papaya fruit. J.

Agric Food Chem. 37, 1009_/1012.

Sefton, M.A., (1998). Hydrolytically-released volatile secondary

metabolites from a juice sample of Vitis vinifera grape cvs Merlot and Cabernet

Sauvignon. Aust J Grape Wine Res 4: 30-38.

Simpson, W.J., y Taguchi, H., (1995). The genus Pediococcus, with

notes on the genera Tetratogenococcus and Aerococcus, In The Genera of

- 75 -

Lactic Acid Bacteria, 125-172. Chapman & Hall, London. B.J.B. Wood and W.H.

Holzapfel.

Spagna, G., Barbagallo, R.N., Greco, E., Manenti, I., y Pifferi, P.G.,

(2002). A mixture of purified glycosidases from Aspergillus niger for oenological

application immobilised by inclusion in chitosangels. Enzyme Microb. Technol.

30, 80– 89.

Strasser de Saad, A.M. y Manca de Nadra, M.C., (1987) Isolation and

identification of the lactic acid bacteria from Cafayate (Argentina) wines.

Microbiogy-Aliments-Nutrition, 5, 45-49.

Tajchakavit, S., Ramaswamy, H.S., y Fustier, P., (1998). Enhanced

destruction of spoilage microorganisms in apple juice during continuous flow

microwave heating. Food Research International 31(10) : 713-722.

Vasserot, Y., Christiaens, H., Chemardin, P., Arnaud, A., y Galzy, P.

(1989) Purification and properties of a β-glucosidase of Hanseniaspora vineae

Van der Walt and Tscheuschner with the view to its utilization in fruit aroma

liberation. J Appl Bacteriol;66:271–9.

Wibowo, D., Eschenbruch, R., Davis, C.R., Fleet, G.H., y Lee, T.H.

(1985) Occurrence and growth of lactic acid bacteria in wine: a review. Am J

Enol Viticult 36, 302–313.

- 76 -

Williams, P.J., (1993). Hydrolytic flavor release in fruit and wines through

hydrolysis of nonvolatile precursors. Flavour science- Sensible principles and

techniques; Acree, T.E, Teranishi, R., Eds.: American Chemical society:

Washington DC.

Williams, P.J. y Francis, I. L., (1996). Sensory analysis and quantitative

determination of grape glycosides: The contribution of these data to

winemaking and viticulture. In: American Chemical Society pp 124-133.

Williams, P.J., Strauss C.R., y Wilson B., (1982a). Use of C18 reversed-

phase liquid chromatography for the isolation of monoterpene glycosides and

norisoprenoïd precursors from grape juice and wines. J. of Chromatography,

235, 471-480.

Williams, P.J., Strauss, C.R., Wilson, B., y Massy-Westropp, R., (1982b).

Studies on the hydrolysis of Vitis Vinifera monoterpene precursor compounds

and model monoterpene -D-glucosides rationalizing the monoterpene

composition on grapes. J. Agric. Food Chem., 30, 1219-1223.

Wilson, B., Strauss, C.R., y Wiliams, P.J., (1986). The distribution of free

and glycosically-bound monoterpenes among skin, juice, and pulp fractions of

some white grape varieties. Am J Enol and Vitic 37:107-111.

Winterhalter, P., y Skouroumounis, G. K., (1997). Glycoconjugated

aroma compounds: occurrence, role and biotechnological transformation.

- 77 -

Advances in Biochemical Engineering Biotechnology; Sheper, T., Ed.; Springer:

Germany, pp 73-105.

Wirth, J., Guo, W., Baumes, R., y Gunata, Z., (2001). Volatile

compounds released by enzymatic hydrolysis of glycoconjugates of leaves and

grape berries from Vitis vinifera muscat of Alexandria and Shiraz cultivars. J.

Agric. Food Chem. 49, 2917_/2923

Saque citas de introducción de aislamiento

- 78 -

- 79 -