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ALTERACIONES MOLECULARES DE LA SEÑALIZACIÓN ESTROGÉNICA EN EL CÁNCER DE MAMA CON
RECEPTORES HORMONALES POSITIVOS
Laura Sánchez Tejada
ALTERACIONES MOLECULARES
DE LA SEÑALIZACIÓN ESTROGÉNICA
EN EL CÁNCER DE MAMA
CON RECEPTORES HORMONALES POSITIVOS
Laura Sánchez Tejada
Tesis Doctoral
Alicante, diciembre 2015
Departamento de Biotecnología
Facultad de Ciencias
Alteraciones moleculares de la señalización estrogénica
en el Cáncer de Mama con receptores hormonales positivos
Laura Sánchez Tejada
Tesis presentada para aspirar al grado de
DOCTOR O DOCTORA POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE
Doctorado en Biotecnología y Biomedicina
Dirigida por
Dr. F. Ignacio Aranda López
Dr. Francisco Ignacio Aranda López, Jefe del Servicio de Anatomía
Patológica del Hospital General Universitario de Alicante,
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Alteraciones moleculares de la señalización
estrogénica en el Cáncer de Mama con receptores hormonales
positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo mi
dirección en el Laboratorio de Genómica y Proteómica de la Unidad de
Investigación del Hospital General Universitario de Alicante, para
optar al grado de Doctora por la Universidad de Alicante.
Alicante a 10 de diciembre de 2015.
Fdo. Dr. F. Ignacio Aranda López
Dr. Joaquín De Juan Herrero, Catedrático de Biología Celular,
Especialista en Patología, Departamento de Biotecnología, Universidad
de Alicante,
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Alteraciones moleculares de la señalización
estrogénica en el Cáncer de Mama con receptores hormonales
positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo mi
tutela académica en el Laboratorio de Genómica y Proteómica de la
Unidad de Investigación del Hospital General Universitario de
Alicante, para optar al grado de Doctora por la Universidad de
Alicante.
Alicante a 10 de diciembre de 2015.
Fdo. Dr. Joaquín De Juan Herrero
Dr. José Miguel Sempere Ortells, Director del Departamento de
Biotecnología, Universidad de Alicante,
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Alteraciones moleculares de la señalización
estrogénica en el Cáncer de Mama con receptores hormonales
positivos” ha sido realizado por Dña. Laura Sánchez Tejada bajo la
inmediata dirección y supervisión del Dr. F. Ignacio Aranda López y
bajo tutela académica del Dr. Joaquín De Juan Herrero, y da su
conformidad para que sea presentada ante la comisión de doctorado.
Y para que conste a los efectos oportunos, firma el presente certificado,
a 10 de diciembre de 2015.
Fdo. Dr. José Miguel Sempere Ortells
Director del Departamento de Biotecnología.
Universidad de Alicante.
El presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado en el
Laboratorio de Genética de la Unidad de Investigación del Hospital
General Universitario de Alicante y financiado con los proyectos:
- Alteración de la vía PI3K-PTEN-AKT en el cáncer de mama con
receptores hormonales positivos: significado pronóstico y terapéutico.
FCVI-HGUA (PI-C/03); 2008-2009. IP: Dr. Ignacio Aranda López.
- Expresión de c-Src en carcinoma infiltrante de mama positivo para
receptores de estradiol. Significado pronóstico y terapéutico. FCVI-
HGUA (PC/04); 2009-2010. IP: Dr. Ignacio Aranda López.
- Caracterización de carcinomas infiltrantes de mama positivos para
receptores de estradiol en función de los patrones de expresión de
microRNAs asociados a la regulación del receptor de estrógenos.
Consejería de Educación (GV/2011/010); 2011-2012. IP: Dr. Francisco
Gutiérrez Aviñó.
“La paciencia es la fortaleza del débil
y la impaciencia, la debilidad del fuerte”
Kant
“Sobrestimamos el evento y subestimamos el proceso,
cada sueño realizado ocurrió gracias a la dedicación de un proceso”
John C. Maxwell
“Cuanto más dura es la batalla, más dulce es la victoria”
Bob Marley
AGRADECIMIENTOS
Son muchas las personas con las que me he cruzado en todo este camino de
aprendizaje y de crecimiento personal. Cuando llegué al HGUA no sabía bien quién era,
no era consciente de mis virtudes y ni mucho menos de mis defectos.
Durante estos años he intentado aprender de cada uno de vosotros y quedarme con
lo mejor. También he intentado dar lo mejor de mi misma y disfrutar de esta profesión
que, aunque a veces sea relegada a planos menos importantes, tanta falta hace a la
humanidad.
A Susana y a Gloria quiero agradecerles la oportunidad de empezar. La puerta de
entrada que muchos no encuentran nunca yo la encontré antes incluso de tener el título
provisional de la Licenciatura, y eso es de agradecer. También la exigencia de ambas,
porque me obligó a endurecerme y a entender que nada se consigue sin esfuerzo.
A Emi, no sé cuantas veces he ido a verte con la cara triste y he salido con una
sonrisa en la cara. Se te echa muchísimo de menos en la 6ª planta. No cambies nunca.
Ojalá hubiesen más personas como tú en este mundo.
A Nacho, mi director de tesis, al que considero mi mentor. La ciencia y la
medicina no podrían evolucionar sin gente como tú, que las vives con pasión y sacas
tiempo de donde no lo hay para poder continuar aportando tu granito de arena al
conocimiento de la patología humana. Siempre me apoyaste y me dejaste total libertad
para expresarme en mi trabajo. Nunca recibí de tu parte un no por respuesta. Siempre
motivador, siempre conciliador. Te doy las gracias por todo y te animo a que continúes
siendo ese ejemplo para los que vengan después de mí.
A los Doctores José Bañuls, Antonio Picó y Ruth Sánchez Ortiga. Desde vuestra
confianza en mi trabajo y el respeto que habéis mostrado a mi especialidad me habéis
empujado y animado a terminar esta “dichosa” tesis y a seguir creciendo personal y
profesionalmente. Todo en mí hacia vosotros es agradecimiento.
A mi compañera Lucía. Ha sido difícil para ambas pero siempre pensé que eras
una persona incansable, capaz de alcanzar todas tus metas con perseverancia y siendo la
mejor compañera que se puede tener. Con tus rarezas, nunca olvidaré las risas y los años
que compartimos. Quién me iba a decir que aquel día nos lo jugábamos casi todo... ya
me entiendes.
Al resto de compañeros de la Unidad de Investigación que pasaron durante esos
años por el grupo de mama, ya fuese para quedarse unos añitos o de paso: Adriana,
Mayte, Fran y Dani, Estela, Montse, Cristina, Laura, Ari, Eloy, Elena. Y aunque a todos
les debo algunas risas, sobre todo a Ari y a Fran, al que jamás olvidaré y al que siempre
estaré agradecida es a ti, Fer. Me has escuchado una y mil veces, hemos compartido
horas de laboratorio, de ordenador y de desayuno-comida-merienda que siempre
atesoraré en mis recuerdos.
A las chicas de Colon: de nuevo Lucía y Carla, Miriam, María, Eva, Cecilia y
Araceli. No creo que Rodrigo hubiese soñado jamás con conseguir reunir a personas tan
trabajadoras como vosotras. Sois geniales y siempre encuentro apoyo en vosotras.
Aguantáis mis malos momentos y compartimos los buenos. Ojala la vida os devuelva lo
que merecéis, que es mucho.
Al resto de compañeros de trabajo: Sandra, que siempre está disponible para
ayudar, Ana, Pura, Bea y las chicas del CIBER: empezando por Rocío y Paula, con las
que he compartido todo mi recorrido en el HGUA y terminando por Irma, Mónica, Bea,
Alba e Isabel.
Al Dr. Lluís Catasús por facilitarme las muestras control que hicieron posible que
realizase el análisis de las mutaciones hotspot del PI3KCA.
Al Servicio de Anatomía Patológica al completo, puesto que sin su trabajo habría
sido imposible realizar este estudio. Gracias por facilitarme todos los datos clínicos y
patológicos que he necesitado para elaborar mi tesis doctoral y gracias por la revisión de
los casos y la selección de las zonas de los bloques idóneas para la extracción de los
cilindros que he necesitado para realizar los análisis. En especial al Dr. Javier Seguí y a
Tania Muci.
A mis tíos Herta y Miguel, que siempre habéis estado ahí para mí, que nunca me
habéis negado nada, que me queréis más de lo que me merezco. Que nunca dudasteis
que lo conseguiría. Gracias, gracias y gracias.
A mis padres y hermanos. Os quiero con toda mi alma y soy quien soy gracias a
vosotros. No puedo entender mi mundo sin nuestras alegrías y tristezas. Mamá: nunca
dudes que te estoy agradecida por ser la madre que eres y más todavía por ser la mejor
yaya que podía soñar para mis hijos. Tu exigencia y tu empuje han hecho de mi quien
soy, ojalá mis hijos lleguen a enorgullecerse de mí la mitad que yo lo estoy de ti. Lucía:
qué sería mi vida sin ti. Gracias por tantos favores, por tantas tardes-noches, por estar
ahí y no saber decir que no, por todo. Papá, en especial esta tesis doctoral es para ti. Por
tantas horas en las que cuidaste de mi hija para que pudiese escribirla, por tantos
ánimos, por toda tu paciencia y tu impaciencia y porque te quiero y estoy orgullosa del
padre que me tocó.
A Lolo, a Sara y a Samuel: mis estrellas polares. Gracias por aceptar mi trabajo,
por vuestro apoyo incondicional, por creer en mí. Os debo pedir perdón por tantas horas
robadas. Sois mi razón para vivir, para intentar ser mejor cada día. Sólo espero que
lleguéis a estar orgullosos de mí, aunque sea la mitad de lo que yo lo estoy de vosotros.
ÍNDICE
ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE
RESUMEN............................................................................................................23
.
INTRODUCCIÓN
1. Epidemiología del cáncer de mama...................................................................25
2. Clasificación del cáncer de mama......................................................................27
2.1 Características del subtipo de cáncer de mama luminal.................................. 30
3. La señalización estrogénica................................................................................33
4. Vías de señalización y factores implicados en la regulación del ESR1.............40
4.1. La vía de señalización PI3K............................................................................40
4.2 El receptor tirosina-quinasa IGF1R.................................................................44
4.3 El receptor tirosina-quinasa EGFR..................................................................46
4.4 La tirosina-quinasa citosólica c-Src.................................................................47
4.5 El coactivador MED1.......................................................................................49
5. Los microARNs y su implicación en la señalización estrogénica.....................52
5.1.- Biogénesis y función de los microARNs.......................................................52
ÍNDICE
5.2.- Los microARNs en el cáncer mama y su relación con el ESR1....................55
5.3.- El pri-miR-17~92...........................................................................................57
5.4.- El miR-Let-7a................................................................................................60
5.5.- El miR-206.....................................................................................................61
5.6.- El miR-222.....................................................................................................62
5.7.- El miR-21.......................................................................................................63
6. Justificación.......................................................................................................65
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS..............................................................................67
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Diseño y muestreo..............................................................................................69
1.1 Criterios de inclusión........................................................................................70
1.2 Criterios de exclusión.......................................................................................70
1.3 Muestra.............................................................................................................70
2. Variables a estudio.............................................................................................71
2.1 Variable de identificación................................................................................71
2.2 Variables clínicas.............................................................................................71
2.3 Variables patológicas.......................................................................................71
2.4 Variables inmunohistoquímicas (IHQ)............................................................73
2.5 Variables moleculares......................................................................................74
2.5.1 Extracción de ADN..................................................................................74
2.5.2 Análisis de mutaciones “hotspot” en PI3KCA.........................................76
2.5.3 Extracción de ARN...................................................................................81
2.5.4 Retrotranscripción (RTPCR)...................................…….…..........…......82
2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de ARNm por qPCR.......................83
ÍNDICE
2.5.6 Extracción de microARNs........................................................................92
2.5.7 Retrotranscripción de los microARNs (RTPCR)....……...............…......93
2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de microARNs por qPCR...............94
3. Análisis estadístico.............................................................................................97
3.1 Etapa I: Estudios descriptivos..........................................................................97
3.2 Etapa II: Estudios de asociación entre variables.............................................98
3.3 Etapa III: Estudios de supervivencia...............................................................99
Apéndice: Protocolos...........................................................................................100
RESULTADOS
1. Análisis descriptivo de las variables clínico-patológicas.................................115
2. Análisis descriptivo de las variables moleculares............................................117
2.1 Mutaciones en el gen PI3KCA.......................................................................117
2.2 Expresión de ARNm de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1.....118
2.3 Expresión de los miRNAs Let-7a, miR-21, miR-206 y miR-222..................120
2.4 Expresión del pri-miR-17~92.........................................................................122
3.- Asociaciones entre las variables moleculares y las clínico-patológicas.........124
3.1 Asociaciones entre las mutaciones en el gen PI3KCA y las variables clínico-
patológicas............................................................................................................124
3.2 Asociaciones entre los niveles de expresión génicos y las variables clínico-
patológicas............................................................................................................125
ÍNDICE
3.3 Asociaciones entre los niveles de expresión de los miRNAs y las variables
clínico-patológicas...............................................................................................133
3.4 Asociaciones entre los niveles de expresión del pri-miR-17~92 y las variables
clínico-patológicas...............................................................................................137
4. Asociaciones entre las variables moleculares..................................................139
4.1 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
niveles de expresión de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1............139
4.2 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222..................................................140
4.3 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
niveles de expresión del pri-miR-17-92...............................................................142
4.4 Correlaciones entre las variables moleculares (niveles de expresión de los
genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1, del pri-miR-17~92 y de los miRNAs
Let-7a, miR-21, miR-206 y miR-222...................................................................143
5. Análisis de supervivencia.................................................................................144
5.1 Supervivencia Libre de Enfermedad (SLE).......................................144
5.1.1 Asociaciones con la recidiva tumoral..............................................144
5.1.2 SLE en función del tiempo de seguimiento.....................................146
5.2 Supervivencia Global (SG)............................................................................151
ÍNDICE
DISCUSIÓN........................................................................................................157
LIMITACIONES...............................................................................................177
CONCLUSIONES..............................................................................................179
REFERENCIAS.................................................................................................183
.
ÍNDICE
ÍÍÍnnndddiiiccceee dddeee tttaaabbblllaaasss
Tabla 1: Alteraciones directas e indirectas de la vía PI3K-PTEN-Akt descritas en el
cáncer de mama por subtipo molecular.
Tabla 2: Cebadores y sondas correspondientes a la discriminación alélica de cada uno
de los hotspots.
Tabla 3: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para la
cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados.
Tabla 4: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para la
cuantificación de los microARNs estudiados.
Tabla 5: Características clínico-patológicas de los tumores analizados.
Tabla 6: Expresión inmunohistoquímica de los marcadores Ki67, p53, RE, RPG y
BCL2.
Tabla 7: Distribución de los patrones de expresión génicos.
Tabla 8: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus valores
respecto de los valores normales.
Tabla 9: Distribución de los patrones de expresión de los miRNAs en función de la
existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 10: Clasificación de los niveles de expresión de los miRNAs en función de sus
valores respecto de los valores normales.
Tabla 11: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus valores
respecto de los valores normales.
Tabla 12: Valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre las variables
inmunohistoquímicas, para los distintos subtipos tumorales en función de la
existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 13: Correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en función
del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 14: Correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en función
del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 15: Asociación entre los niveles de expresión de c-Src y la metástasis en ganglios
en función del subtipo luminal.
ÍNDICE
Tabla 16: Correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en función
del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 17: Correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en función
del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 18: Correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en función
del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 19: Correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 20: Correlaciones entre el miR-21 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 21: Correlaciones entre el miR-206 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 22: Correlaciones entre el miR-222 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 23: Correlaciones entre el pri-miR-17~92 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 24: Expresión del ESR1 a nivel mensajero y proteína, en función del subtipo
tumoral y del dominio mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).
Tabla 25: Expresión del miR-Let-7a en función del subtipo tumoral y del dominio
mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).
Tabla 26: muestra los valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre
las variables moleculares, para los distintos subtipos tumorales en función de la
existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Tabla 27: Distribución de los datos de reaparición de la enfermedad en función del
subtipo y en la serie completa (N (%)).
Tabla 28: Variables con influencia en la SLE de la serie completa con dos seguimientos
distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada categoría con
su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-
Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.
Tabla 29: Variables con influencia en la SLE de los Luminales A con dos seguimientos
distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada categoría con
su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-
Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.
Tabla 30: Variables con influencia en la SLE de los luminales B con dos seguimientos
distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada categoría con
ÍNDICE
su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-
Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.
Tabla 31: Variables con influencia en la SG de la serie completa.
Tabla 32: Variables con influencia en la SG de los Luminales A.
Tabla 33: Variables con influencia en la SG de los luminales B.
ÍNDICE
ÍÍÍnnndddiiiccceee dddeee fffiiiggguuurrraaasss
Figura 1: Epidemiología mundial del cáncer de mama.
Figura 2: Mortalidad de mujeres por cáncer de mama entre los años 1981 y 2012 en
España.
Figura 3: Actividad del ESR1 por la vía clásica.
Figura 4: Estructura del ESR1.
Figura 5: Vías moleculares asociadas a la señalización alternativa del ESR1.
Figura 6: Cascada de señalización principal de la vía PI3K.
Figura 7: Biogénesis de los microARNs.
Figura 8: Publicaciones registradas en PubMed sobre la participación de los microRNAs
en el cáncer de mama.
Figura 9: (a) Representación esquemática del cluster miR-17~92 y sus clusters
parálogos: miR-106b~25 y miR-106a~363. (b) Los microARNs maduros
originados se engloban en 4 familias: miR-17, miR-18, miR-19 y miR-92.
Figura 10: Representación esquemática del bucle de regulación c-Myc-E2F-pri-miR-
17~92 y de las funciones de los microARNs maduros del cluster.
Figura 11: Representación de las 3 etapas de la técnica de genotipado o discriminación
alélica por sondas de hidrólisis.
Figura 12: Representación de los resultados de un estudio de genotipado con sondas de
hidrólisis TaqMan.
Figura 13: Representación de la reacción de PCR cuantitativa a tiempo real con sondas
de hidrólisis Taqman®.
Figura 14: Ejemplo de representación gráfica de los niveles de cuantificación relativa de
la expresión génica (RQ del inglés Relative Quantification) generada mediante el
método ddCt.
Figura 15: Bioanálisis de microARNs con el Bioanalizador 2100 de Agilent.
Figura 16: Amplificación y detección de los microARNs maduros.
Figura 17: Distribución de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA en función del
subtipo tumoral.
Figura 18: Distribución de los niveles de expresión génicos en función del subtipo
tumoral.
ÍNDICE
Figura19: Distribución de los niveles de expresión del miR-Let-7a en función del
subtipo tumoral y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Figura 20: Distribución de los niveles de expresión del miR-206 en función del subtipo
tumoral en los casos silvestres para el gen PI3KCA.
Figura 21: Distribución de los niveles de expresión del Pri-miR-17~92 en función del
subtipo tumoral.
Figura 22: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de EGFR en
función de sobreexpresión de p53≥15% de sus células (Prueba U de Mann-
Whitney) en los luminales B.
Figura 23: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión de c-Src en
función de la expresión inmunohistoquímica de receptores de progesterona de los
tumores (Prueba U de Mann-Whitney) en los luminales A.
Figura 24: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de ESR1
en función de la edad de los pacientes (Prueba U de Mann-Whitney) en los
luminales A.
Figura 25: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de ESR1
en función de la presencia de necrosis en el tumor (Prueba U de Mann-Whitney) en
los luminales B.
Figura 26: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión génica de MED1
en función de la bilateralidad del cáncer de mama (Prueba U de Mann-Whitney) en
los luminales B.
Figura 27: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del miR-222 en
función del grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por el tumor (Prueba
de Kruskal-Wallis).
Figura 28: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del pri-miR-
17~92 en función del desarrollo de metástasis ganglionar (Prueba U de Mann-
Whitney) en los luminales B.
Figura 29: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión de IGF1R en
función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA
(Prueba U de Mann-Whitney).
Figura 30: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-Let-7a
en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA y
del subtipo luminal (Prueba U de Mann-Whitney).
Figura 31: Comparativa de la distribución de los niveles de expresión del miR-222 en
función de la presencia de la mutación G1633A en el exón 9 del gen PI3KCA para
los luminales A (Prueba U de Mann-Whitney).
ÍNDICE
Figura 32: Curvas de Kaplan-Meier para la SLE en función del fenotipo.
Figura 33: Asociación del % de células inmunopositivas para BCL2 con el desarrollo de
metástasis en los luminales B (Prueba de Kruskal-Wallis).
Figura 34: Curvas de Kaplan-Meier para la SG en función del fenotipo.
23
RRREEESSSUUUMMMEEENNN
El carcinoma infiltrante de mama constituye una entidad biológicamente
heterogénea cuya subclasificación se ha establecido en base al estudio
inmunohistoquímico y molecular. Sin embargo, los criterios de subclasificación todavía
no están definidos para el subgrupo luminal, caracterizado por expresar receptores de
estrógenos (RE) y progesterona (RP). Los luminales representan el fenotipo
predominante (aproximadamente el 65% de los carcinomas infiltrantes de mama) y
presentan niveles de respuesta variable a hormonoterapia (tamoxifeno) y características
patológicas heterogéneas. La mayor actividad proliferativa, el nivel de positividad para
receptores hormonales, la expresión de p53 o la positividad para Her-2 se han señalado
como posibles factores relacionados con la respuesta a hormonoterapia y el pronóstico
de estos tumores, si bien, no han permitido establecer estrategias claras de tratamiento
entre los distintos subgrupos luminales. La determinación de factores moleculares que
permitan identificar a las pacientes con mayor riesgo dentro del grupo luminal es de
gran importancia ya que evitaría sobretratar a pacientes con tumores de buen pronóstico
y pobre respuesta a quimioterapia, susceptibles de recibir únicamente tratamiento
24
hormonal. Además, un mejor conocimiento de las vías implicadas en este grupo de
cáncer de mama abriría la posibilidad de describir nuevas dianas terapéuticas.
En la presente tesis doctoral se han estudiado 220 tumores de mama luminales en
los que se ha evaluado la presencia de mutaciones “hotspot” en PI3KCA por genotipado
con sondas de hidrólisis, y la expresión génica del ESR1, de los receptores tirosina-
quinasa IGF1R y EGFR, de la quinasa citosólica c-Src y del mediador MED1 y de
algunos de los microARNs relacionados con la señalización estrogénicas y más
señalados por su participación en las neoplasias humanas (pri-miR-17~92, miR-21,
miR-206, miR-222 y miR-Let-7a) por PCR cuantitativa a tiempo real. Se han estudiado
las alteraciones de estas variables moleculares, su convivencia y su relación con las
variables clínico-patológicas clásicas. Así mismo, se ha investigado el valor pronóstico
de estos factores moleculares frente a la supervivencia libre de enfermedad y a la
supervivencia global.
Aunque la única variable capaz de discriminar entre los subtipos luminales fue el
microARN Let-7a, se han observado distintas relaciones entre las variables
moleculares estudiadas en función del subtipo y sobre todo ha destacado la influencia
de la mutación de PI3K en estas relaciones. Nuestros resultados apuntan a que la
oncogénesis de los luminales A está dirigida por la señalización estrogénica, mientras
que otras vías con mayor potencial oncogénico intervienen en los luminales B, siendo
responsables de su peor pronóstico. El EGFR, el miR-222 y el miR-21 podrían ser útiles
marcadores pronóstico de estos tumores, si bien son necesarios más estudios sobre
series más amplias de Luminales B para establecer los parámetros útiles para el
seguimiento de estos pacientes.
INTRODUCCIÓN
25
IIINNNTTTRRROOODDDUUUCCCCCCIIIÓÓÓNNN
1. Epidemiología del cáncer de mama
La Organización Mundial de la Salud y su Agencia Internacional de Investigación
en Cáncer desarrollaron en 2008 el proyecto GLOBOCAN para proporcionar
estimaciones actuales de la incidencia, mortalidad y prevalencia, ajustados por años de
vida (DALY), de los principales tipos de cáncer a nivel mundial, regional y nacional,
para 184 países del mundo. Los últimos datos recogidos son del 2012. El proyecto cifra
en 14,1 millones de nuevos casos al año con 8,2 millones de muertes/año por causa
directa del cáncer y destaca que en 2012, 32,6 millones de personas en el mundo
luchaban contra esta enfermedad. La mayor incidencia la ostenta el cáncer de pulmón
(13%) seguido del cáncer de mama (11,9%), aunque esta situación cambia al
estandarizar los datos por edad, dando como resultado una tasa del 43,3% de cáncer de
mama que supera al resto de patologías oncológicas. El estudio prevé que el 42,1% de
INTRODUCCIÓN
26
los tumores desarrollados por mujeres de la Unión Europea en 5 años serán tumores
mamarios, con una mortalidad asociada del 16,3% (1-2).
Figura 1: Epidemiología del cáncer de mama en el sur de Europa. ASR: ratio
estandarizado con respecto a la edad, de nuevos casos o muertes por 100.000 personas
por año (de Age-Standardised Rate). Una tasa estandarizada por edad es la tasa que la
población tendría si tuviera una estructura de edad estándar. La normalización es
necesaria cuando se comparan varias poblaciones que difieren con respecto a la edad,
porque la edad tiene una gran influencia en el riesgo de cáncer. Tomada de: Ferlay J,
Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM,
Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality
Worldwide: IARC CancerBase No. 11 [Internet]. Lyon, France: International Agency
for Research on Cancer; 2013. Disponible en: http://globocan.iarc.fr el día 1/12/2015
(1-2).
En España, desde 1990 se ha implantado en todas nuestras Comunidades
Autónomas un programa de detección precoz del cáncer de mama coordinado y guiado,
INTRODUCCIÓN
27
que ha permitido conocer la epidemiología de la enfermedad en nuestra sociedad. Según
las últimas estimaciones, se diagnostican anualmente alrededor de 16000 casos nuevos
y, a pesar de los avances alcanzados en su diagnóstico y tratamiento, supone la primera
causa de mortalidad por cáncer en mujeres (3).
Figura 2: Mortalidad de mujeres por cáncer de mama entre los años 1981 y 2012
en España. Obtenido de la aplicación Ariadna de los Servidores interactivos de
información epidemiológica (Epibase) del Instituto de Salud Carlos III.
2. Clasificación del cáncer de mama
El carcinoma infiltrante de mama constituye una entidad biológicamente
heterogénea (4-5) que ha sido subclasificada tradicionalmente en función de las
características morfopatológicas de sus células y atendiendo a la expresión
inmunohistoquímica de citoqueratinas específicas de células luminales (CK8/18 y 19) o
bien de células basales (CK5/6). En 1987 se demostró la amplificación del gen Erb-B2
INTRODUCCIÓN
28
(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 o HER2) en el 30% de los tumores
mamarios y su implicación en el pronóstico de las pacientes (6). La clasificación
patológica introdujo entonces la expresión de receptores estrogénicos (RE), de
receptores de progesterona (RP) y de HER2 en los análisis de rutina y se consiguieron
mejoras respecto al tratamiento de estas pacientes. En el año 2000, el grupo de Charles
Perou analizó 42 muestras de mama (36 carcinomas ductales invasivos, 2 carcinomas
lobulillares, 1 carcinoma ductal in situ, 1 fibroadenoma y 3 muestras de mama normal)
con matrices o arrays de expresión, y en base al estudio de los distintos patrones de
expresión que observaron y sus características histopatológicas, propusieron análisis
concretos para poder discriminar el comportamiento de las distintas entidades que
conforman el cáncer de mama (7). Un año después ampliaron el estudio y realizaron los
análisis de supervivencia que dieron fe de las diferencias intrínsecas a los distintos
subtipos (8): un 55-65% corresponderían al tipo luminal, con expresión de receptores de
estradiol y/o progesterona (receptores hormonales positivos), susceptible de tratamiento
hormonal con o sin quimioterapia asociada. Proponían subdividir este grupo en otros
dos, luminal A y luminal B, con diferente pronóstico, y la posibilidad de ampliar a tres
sumando el luminal C (un subgrupo peor definido pero también con peor pronóstico por
reunir características de los tumores con receptores hormonales negativos). Un 15-20 %
de los casos se incluirían en el grupo Her-2 (con sobreexpresión y/o amplificación de
Her-2) (9-10), tratados con quimioterapia y Herceptin® y que cursarían con un
pronóstico intermedio. Un tercer grupo sería definido como triple negativo o basal
(TN/B) (RE/RP/Her-2 negativos), con peor pronóstico pero con mejor respuesta al
tratamiento quimioterápico (11-13). El último subtipo se bautizó como normal-like y
estaba definido por un patrón de expresión similar a la mama sana aunque
posteriormente se definieron como tumores de baja densidad celular ricos en estroma;
INTRODUCCIÓN
29
sin embargo otros autores han sugerido una posible contaminación de células de la
mama normal por lo que actualmente no se contempla en la clasificación (14). La
descripción de los subtipos moleculares fue rápidamente aplicada en la práctica clínica
gracias a la reproducción de la clasificación aplicando herramientas
inmunohistoquímicas (5, 8, 15-16). Sin embargo, la concordancia entre la clasificación
molecular y la basada en inmunohistoquímica no es absoluta, y los criterios de
subclasificación no están bien definidos (4-5, 11-12, 17-19), lo que ha determinado
problemas de reproducibilidad de resultados.
Si bien es cierto que la clasificación se ajusta a diferencias biológicas pero
también pronósticas de los tumores (8), existen tumores dentro de cada subtipo que
escapan a las características clínicas y pronósticas de su grupo, por lo que los
investigadores no han cesado en su intento de matizar la clasificación y mejorar la
caracterización del cáncer de mama. El equipo de Reis-Filho comparó en 2011 los
resultados obtenidos por distintas plataformas de análisis molecular con matrices de
expresión sobre la clasificación de 779 casos. No encontraron grandes diferencias en la
clasificación de los subtipos Her2 y TN; sin embargo, el grupo luminal concentró las
mayores diferencias en cuanto a la subclasificación de los tumores, lo que pone de
manifiesto la necesidad de profundizar en el conocimiento sobre las diferentes entidades
biológicas que agrupa (20). Este mismo equipo de investigadores ha comprobado
recientemente, mediante métodos de secuenciación masiva en paralelo, la notable
heterogeneidad de la enfermedad, destacando que los cánceres de mama RE-negativos y
los RE-positivos son enfermedades completamente diferentes a nivel molecular (21).
A lo largo de la última década se ha definido el fenotipo Claudin-Low, bautizado
así por su baja expresión de proteínas Claudina. Este subgrupo se caracteriza por una
expresión baja de los receptores hormonales y de HER-2, asemejándose al fenotipo
INTRODUCCIÓN
30
TN/B aunque sin sobreexpresar genes de proliferación, y cursa con un pronóstico
intermedio entre los subtipos HER-2 y TN/B. Particularmente, presentan características
de células progenitoras y una expresión alta de marcadores de transición epitelio-
mesenquimal y de angiogénesis (16).
2.1 Características del subtipo de cáncer de mama luminal
El grupo de pacientes con tumores positivos para receptores hormonales presenta
gran relevancia clínica ya que constituye el grupo más importante numéricamente (en
torno al 65%). Derivado de sus características morfopatológicas y su origen celular, se
ha bautizado como fenotipo luminal. Sin embargo, estos tumores presentan
características morfológicas y biológicas heterogéneas (22).
El grupo de Perou subclasificó estos tumores en luminales A y B, diferenciando a
los tipo B por expresar niveles más altos de genes relacionados con la proliferación
como Ki67 (7-8). Aunque el marcador de proliferación Ki67 se incluye en la evaluación
del grado histológico y es, en gran medida, responsable de su valor pronóstico, la
evaluación de la expresión de Ki67 por inmunohistoquímica ha dado resultados
contradictorios y la comparación entre distintos estudios es complicada por la
variabilidad metodológica y por los puntos de corte aplicados para definir el subtipo
luminal B (23-25). En los últimos años se ha intentado hacer frente a estas limitaciones
y consensuar su utilización en el diagnóstico clínico de estos tumores (18, 26). En 2011,
en la reunión de expertos celebrada durante la XII Conferencia Internacional de Cáncer
de Mama de St Gallen (St Gallen International Expert Consensus on the Primary
Theraphy of Early Breast Cancer) se consideró que a pesar de la utilidad de las matrices
de expresión para la clasificación de esta neoplasia, actualmente no era posible hacer
INTRODUCCIÓN
31
frente al coste de la técnica para el diagnóstico clínico rutinario y propusieron como
método de clasificación el publicado por Cheang y su equipo en 2009 (18, 27),
basándose en la concordancia con la clasificación obtenida por el panel de 50 genes
(PAM50) propuesto por Parker y su grupo (28). Los luminales A quedarían, por tanto,
definidos por ser positivos para la expresión de RE y RP, negativos para HER2 y tener
un índice de Ki67 <14%, y los luminales B se diferenciarían por tener un índice de Ki67
≥14%. Sin embargo, el Grupo Internacional de Trabajo sobre Ki67 en Cáncer de Mama
(International Ki67 in Breast Cancer Working Group) definió en el 2010 la
metodología admitida para el análisis del marcador, pero destacó que, dadas las
limitaciones típicas de la técnica inmunohistoquímica (incluyendo la reproducibilidad
de la técnica, la interpretación subjetiva y la existencia de en torno a un 25% de falsos
negativos y positivos), la aplicación directa de los puntos de corte específicos para la
toma de decisiones debe ser considerada poco fiable a menos que los análisis se lleven a
cabo en un laboratorio altamente experimentado con sus propios datos de referencia
(26). Estas limitaciones fueron recientemente subrayadas de nuevo en la “14th St.
Gallen International Breast Cancer Conference” (29).
Hay que añadir que no sólo el nivel de proliferación aporta un valor pronóstico en
este tipo de tumores, sino que el p53 también ha demostrado contribuir a conocer el
pronóstico de estos (30). Los luminales A también tienen un bajo porcentaje de células
con sobreexpresión de p53 (8, 31), a diferencia de los luminales B, por lo que
Kobayashi, entre otros autores, propuso en 2013 incorporar esta alteración al panel
inmunohistoquímico de la subclasificación de los luminales (32-33). Este autor fija los
límites en un 10%, tanto para el p53 como para el índice Ki67, y propone que los
tumores que alcancen este nivel de positividad para alguna de las dos variables o para
ambas, se clasifiquen como luminales B.
INTRODUCCIÓN
32
Por otro lado, se ha propuesto en distintas ocasiones la ampliación del subgrupo
con el subtipo C, caracterizado por sobreexpresar también el receptor HER-2 (8).
Cheang extrae estos casos del subgrupo luminal y propone un nuevo grupo denominado
subtipo luminal-HER2-positivo (27). De cualquier forma, en la práctica clínica estos
tumores se consideran dentro del subtipo HER-2 por sus connotaciones pronósticas y de
tratamiento.
En cualquier caso, no se conocen los cambios biológicos asociados a las
características que presentan los tumores luminales de mal pronóstico ni pueden
explicarse sus respuestas terapéuticas en muchos casos, por lo que en los últimos años la
comunidad científica ha intentado responder a la necesidad de estudiar profundamente
los patrones biológicos que dirigen la oncogénesis y el desarrollo de estos tumores (34-
35). Los esfuerzos han sido dirigidos también a completar las estrategias de
diferenciación entre los subtipos luminales y predicción de su respuesta al tratamiento
(36).
El tratamiento de estos pacientes puede limitarse a hormonoterapia, sin embargo
en un 30-40% de los casos se produce progresión de la enfermedad con pobre respuesta
al tratamiento hormonal y necesidad de quimioterapia adyuvante con tasas de respuesta
clínica del 30-50% (13, 22). Deben existir mecanismos moleculares por los que algunos
tumores luminales escapan a la terapia hormonal o generan resistencia. Su
descubrimiento puede permitir identificar a las pacientes con mayor riesgo, susceptibles
de recibir terapias más específicas o al menos más agresivas, y al mismo tiempo evitar
el sobretratar a pacientes con tumores de buen pronóstico.
INTRODUCCIÓN
33
3. La señalización estrogénica
Además de su función principal en la reproducción, los estrógenos están presentes
en la regulación de los sistemas cardiovascular, esquelético, inmunitario y nervioso y
juegan un papel fundamental en enfermedades como la osteoporosis. En el epitelio
mamario tienen una función importante en el crecimiento, la diferenciación y la
proliferación, así como en la oncogénesis de sus neoplasias y la metástasis (37). Todas
estas funciones se efectúan, tanto a través de la acción de los estrógenos endógenos (E1
(estrona), E2 (17β-estradiol) y E3 (estriol)), como de diversas formas sintéticas. La
inhibición de su actividad ha sido la base del tratamiento de esta enfermedad durante
mucho tiempo. Su función está mediada por los receptores REα y REβ, predominando
el primero en el útero y la glándula mamaria, mientras que el segundo tiene un papel
importante en los sistemas nervioso central, cardiovascular y respiratorio así como en el
tracto urogenital y los huesos. Aunque la mayoría de los tumores de mama coexpresan
ambos receptores, el estradiol (E2) ejerce sus efectos proliferativos principalmente a
través del receptor nuclear REα o ESR1 (38-39).
La molécula del ESR1 se compone de tres dominios funcionales: el dominio N-
terminal AF1, responsable de la función transcripcional, el dominio de unión al ADN, y
el dominio de unión al ligando AF2 (40) (Figura 4). Las acciones del ESR1 pueden
dirigirse por dos vías distintas: la vía clásica o genómica, que se basa en su interacción
con el ADN, y la vía no genómica, basada en su interacción con otras proteínas y
factores de transcripción (41).
El E2, al ser una hormona esteroidea, puede atravesar la membrana plasmática de
la célula, con lo que los receptores no necesitan estar anclados a membrana para ser
ligados. La unión del ligando al ESR1 desencadena la activación de la vía clásica
(Figura 3). La máxima actividad transcripcional requiere la acción sinérgica del dominio
INTRODUCCIÓN
34
AF1 independiente del ligando y del dominio AF2 ligando-dependiente. Esta función
también depende de una serie de cofactores reguladores:
- los complejos de remodelación de la cromatina,
- los coactivadores: como miembros de la familia p160/SRC (del inglés Steroid
Receptor Coactivator) destacando el SRC1/NcoA1 (del inglés Nuclear Receptor
coActivator 1), el NcoA2, el NcoA3 (también conocido como AIB1), el CBP (del inglés
cAMP response element-binding (CREB) Binding Protein) y
- los correpresores (como NCoR (del inglés Nuclear Receptor co-Represor) y
MTA1 (del inglés Metastasis Associated-1) del ESR1.
Los coactivadores generalmente no se unen al ADN pero son reclutados a los
promotores de los genes diana a través de interacciones proteína-proteína con el ESR1.
Es el equilibrio relativo entre los receptores, los coactivadores y las proteínas
correpresoras el que determinará la capacidad de actuación del ESR1 por la vía clásica.
Los genes dependientes de estrógenos poseen en sus promotores sitios de unión
específicos conocidos como Elementos de Respuesta a Estrógenos o EREs (5’-
AGGTCAnnnTGACCT-3’) que son reconocidos por el ESR1 para promover su
transcripción (41). La identificación de los genes de respuesta a estrógenos se considera
un paso esencial para la comprensión de las funciones biológicas de la hormona y de los
mecanismos moleculares a través de los que ESR1 controla la expresión génica (42).
INTRODUCCIÓN
35
Figura 3: Actividad del ESR1 por la vía clásica. El ESR1 se encuentra en el
citoplasma en ausencia de estrógeno, ligado a la proteína de choque térmico 90 (HSP90)
(43). La unión del E2 desencadena la disociación de HSP90, su homodimerización y su
traslocación al núcleo. Una vez allí ejerce su función como receptor nuclear tipo I
uniéndose a los EREs (HRE en la figura, del inglés Hormone Response Element), y
recluta a otras proteínas coactivadoras como NCOA3 y a mediadores para activar la
transcripción del gen en cuestión. Imagen tomada de Interactions between the estrogen
receptor, its cofactors and microRNAs in breast cancer. McCafferty et al;Breast Cancer
Res Treat (2009) 116:425–432 (44).
La señalización no genómica a través de ESR1 la conduce el receptor localizado
en la membrana plasmática y en el citoplasma. Es una señalización de respuesta rápida
que utiliza las cascadas de señalización disponibles en la célula para obtener un efecto
inmediato. Así, activa la vía PI3K/Akt (fosfoinositol-3-quinasa/ serina-treonina quinasa
Akt) con efectos antiapoptóticos, promueve la activación de la vía de crecimiento de las
MAPK (del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase) mediante su interacción con
receptores tirosina-quinasas (RTKs) y regula otras vías de señalización o potencia estas
mismas a través de su interacción con otras proteínas quinasa citosólicas como c-Src,
INTRODUCCIÓN
36
PKA y PKC (45). Recientemente se ha demostrado la capacidad del ESR1 de activar la
transcripción de genes que no poseen EREs en su promotor, ampliando así su radio de
acción por mecanismos indirectos de los que hablaremos más adelante (46).
El ESR1 debe ser capaz, por tanto, de integrar múltiples señales procedentes tanto
de sus ligandos como de las principales vías de señalización intracelulares para poder
llevar a cabo sus funciones en el núcleo y el citoplasma. Por tanto, otro de los
mecanismos más estudiados es la sobreactivación del ESR1 a través de su fosforilación
por diversas quinasas implicadas en las vías de crecimiento (como algunas de las
MAPK, el AKT y el c-Src), intensificando la activación de la acción genómica y no
genómica de ESR1, tanto en presencia como en ausencia de ligando (Figura 5). Aunque
se han descrito numerosos sitios susceptibles de fosforilación, las serinas S118 y S167,
localizadas en la región AF1, parecen ser los nucleótidos con mayor influencia en la
actividad del receptor (Figura 4) (41, 47-49).
Figura 4: Estructura del ESR1. Se muestran los tres dominios que componen la
molécula, en los que se han marcado los sitios de fosforilación, así como las quinasas
propuestas como responsables.
La alteración del equilibrio de la señalización estrogénica en el cáncer de mama se
desarrolla a través de la afectación del ESR1 por múltiples mecanismos. A nivel génico,
INTRODUCCIÓN
37
se han descrito numerosos polimorfismos que podrían alterar su función y/o su
regulación (50). Otro mecanismo de alteración del ESR1 podría ser la sobreexpresión
génica derivada de la amplificación del gen ESR1, si bien esta posibilidad está muy
discutida (51-57). Las diferencias metodológicas y los criterios que definen la
amplificación génica podrían estar detrás de estas diferencias, por lo que son necesarios
más estudios sobre este capítulo de la regulación del ESR1. No obstante, la
sobreexpresión es la alteración descrita con mayor frecuencia, por lo que toma
protagonismo la vía de la regulación transcripcional del ESR1. Existen dos sitios
predominantes para la estimulación de la transcripción de ESR1: uno es el sitio P1
(aguas abajo del promotor), localizado en el nucleótido +1 relativo al sitio de inicio de
la transcripción, y el otro es el sitio P0 (aguas arriba del promotor), localizado a -3090
pb del sitio de inicio de la transcripción. Así, Hayashi y los suyos mostraron la
importancia del sitio P0 para los mecanismos de sobreexpresión en la regulación
específica de tumores (58), mientras que deGraffenried y su grupo demostraron que los
factores de transcripción Sp-1 y el USF-1 (del inglés Specific Protein 1 y Upstream
Stimulatory Factor 1 respectivamente) actúan sobre el sitio P1 para ejercer su actividad
promotora de la transcripción de ESR1 (59-60). Sin embargo los detalles del mecanismo
de sobreexpresión de ESR1 aún necesitan ser esclarecidos (42).
La regulación del ESR1 a nivel de proteína se ha estudiado desde el punto de vista
de su degradación, puesto que las funciones del receptor dependen del mantenimiento
de su concentración proteica. Si bien es cierto que el tratamiento de células de cáncer de
mama luminal con E2 resulta en la disminución de los niveles de proteína ESR1,
también se ha detectado una estimulación prolongada de la transcripción de genes de
respuesta a estrógenos en respuesta al bloqueo de la degradación inducida por ligando.
Los detalles de este mecanismo necesitan todavía ser aclarados (42).
INTRODUCCIÓN
38
En la última década, se ha observado un nuevo mecanismo de regulación del
ESR1 tanto a nivel de ARN mensajero como de proteínas. Se trata de la regulación por
microARNs. Estas moléculas de ARN de pequeño tamaño son parte esencial de
numerosos bucles regulatorios que tienen como protagonista al ESR1. Se trata del
mecanismo alternativo propuesto por el que el ESR1 es capaz de activar la transcripción
de genes que inicialmente no son de respuesta a estrógenos. Del mismo modo, esta
regulación también hace posible que genes de respuesta a estrógenos no varíen su
concentración proteínica a pesar de la activación de la señalización estrogénica (46).
Hoy en día son frecuentes los estudios que corroboran esta co-regulación entre los
microARNs y el ESR1 (41, 44, 46, 61-66). Abordaremos sus implicaciones en el
apartado correspondiente.
Figura 5: Vías moleculares asociadas a la señalización alternativa del ESR1.
Imagen modificada a partir de la Figura 1 de: Estrogen Regulation of MicroRNA
Expression. Klinge et al. Current Genomics (2009),10:169-183 (41). Modelo celular
INTRODUCCIÓN
39
que muestra la vía de señalización de ESR1 derivada de su estimulación en la
membrana plasmática y en el citoplasma por otras cascadas de señalización celulares.
Su interacción en la membrana plasmática con proteínas G, caveolina (Cav-1) y c-Src
estimula la vía de crecimiento MAPK y su interacción con PI3K estimula la vía
antiapoptótica PI3K/Akt. Estas vías se sobreestimulan indirectamente por su acción
sobre los RTK a través de c-Src y de su proteína colaboradora MNAR (del inglés
Modulator of Nongenomic Activity of ESR1). Los microARNs participan en esta
regulación bidireccionalmente. La fosforilación de ESR1 por quinasas como Akt y las
MAPK favorece su activación independiente de ligando y su entrada al núcleo, donde
actúa como receptor nuclear para promover la transcripción de los genes de respuesta a
estrógenos.
Hoy en día la terapia endocrina sobre los tumores luminales se basa en intentar
regular la señalización estrogénica por diversos métodos (67):
a) Castración ovárica: actuando directamente sobre la principal fuente fisiológica
productora de estrógenos. El método puede ser mediante ooforectomía quirúrgica,
radioterapia ovárica (ooforectomía actínica), o el uso de fármacos como
- análogos de LHRH (hormona liberadora de gonadotropina) o
- inhibidores de la aromatasa: dirigidos a la anulación de la síntesis estrogénica
mediante la inhibición del complejo enzimático del grupo p-450 que cataliza el paso de
andrógenos a estrógenos de origen extraovárico. Dentro del grupo de inhibidores de la
aromatasa encontramos los de estructura esteroidea que generan una unión irreversible
en el sustrato de ligazón (formestano y exemestano) y los de estructura no esteroidea
cuya unión es competitiva (aminoglutetimida, anastrozol, letrozol).
b) Moduladores selectivos de los receptores de estrógenos o SERMs (del inglés
Selective Estrogen Receptor Modulators): es el caso del tamoxifeno, que fue el primer
antiestrógeno con actividad antagonista en la mama y agonista parcial en hueso, hígado
y útero. Sin embargo se han observado casos de cáncer de mama en los que actúa como
agonista. El tamoxifeno posee una afinidad por el ESR1 muy baja, por lo que necesita
ser metabolizado por el hígado inicialmente para poder realizar su función. Sus
INTRODUCCIÓN
40
metabolitos compiten con el E2 por unirse al dominio AF2 del ESR1, bloqueando la
estimulación por su ligando natural y previniendo los cambios conformacionales que
posibilitan la función del ESR1 por la vía clásica.
c) Bloqueadores selectivos del receptor estrogénico (fulvestrant): es un
antiestrógeno puro y bloqueador selectivo del ESR1. Aún no está aprobado para
utilizarse como terapia adyuvante del cáncer de mama.
A pesar de ello en torno a un 30-40% de los casos cursa con pobre respuesta al
tratamiento hormonal, por lo que queda de manifiesto que en estos tumores la
activación de la señalización estrogénica se realiza a través de la regulación del ESR1
por otras vías de señalización celular que pueden, a su vez, estar alteradas (Figura 5).
4. Vías de señalización y factores implicados en la regulación del ESR1
4.1. La vía de señalización PI3K
Los fosfatidilinositoles destacaron ya en 1953 por su implicación en la
transducción de señales intracelulares. Las funciones de estos fosfolípidos en la célula
son muchas y dependen de la fosforilación de la molécula inicial de fosfatidilinositol
(PI), desencadenada por factores de crecimiento que activan a los receptores tirosina
quinasa (RTKs) y a los receptores de proteína G. Una primera fosforilación da lugar al
PI 4-fosfato o PIP, que es de nuevo fosforilado a PI 4, 5-bisfosfato o PIP2. Los
productos de su degradación, inositol 1, 4, 5-trisfosfato (IP3) y diacilglicerol, son los
responsables de la transducción de señales que desencadena la proliferación celular. El
IP3 es capaz de unirse a receptores del retículo endoplasmático activando la liberación
de Ca2+, y el diacilglicerol es el responsable de la activación de la serina/treonina
quinasa C (PKC), que, en presencia de altos niveles citosólicos de Ca2+, activa la vía
INTRODUCCIÓN
41
MAPK y, por otro lado, es capaz de activar al NF-κβ que migra hasta el núcleo y activa
la transcripción génica.
Sin embargo, una parte del PIP2 generado no es degradado, sino que la enzima
fosfatidilinositol 3’-quinasa (PI3K) es capaz de volver a fosforilarlo dando lugar al PI-
3,4,5-trifosfato o PIP3. Esta molécula actúa como ligando para reclutar la
serina/treonina quinasa Akt (c-Akt, también llamada proteína quinasa B o РKВ) a la
membrana plasmática. Al mismo tiempo, activa a las quinasas fosfoinosítido
dependientes 1 y 2 (PKD1/2) que fosforilan a Akt para activarlo. Esto deriva en la
fosforilación de las proteínas BAD у caspasa 9, inhibiendo su actividad apoptótica у
promoviendo, por tanto, la supervivencia celular. Akt también actúa activando al
complejo mTOR, a GSK-3 y a otras proteínas quinasa, así como a factores de
transcripción como NF-κβ, que amplifican su efecto antiapoptótico y afectan a otros
aspectos de la célula como la proliferación у la angiogénesis (Figura 6).
Figura 6: Cascada de señalización principal de la vía PI3K.
INTRODUCCIÓN
42
El mantenimiento del equilibrio de activación de esta vía recae, en gran medida,
sobre el gen supresor tumoral PTEN (del inglés Phosfatasa and Tensin Homolog). La
proteína codificada por este gen es una fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3-fosfatasa que
revierte la formación de PIP3 a PIP2, evitando la activación de la vía Akt y, por tanto,
sus efectos antiapoptóticos (68).
La enzima PI3K es una quinasa lipídica heterodimérica que contiene una
subunidad p110 catalítica y una subunidad p85 reguladora. Existen tres isoformas
homólogas p110α, p110β y p110δ codificadas por los genes PIK3CA, PIK3CB y
PIK3CD respectivamente, aunque en el tejido mamario sólo se expresan la isoforma
p110α y la p110β.
Si bien en las células normales la vía del PI3K-PTEN-Akt está bajo un estricto
control homeostático a través de distintos bucles regulatorios, en el cáncer de mama es
la vía más frecuentemente alterada (Tabla 1). Este desequilibrio de la vía suele
acontecer paralelamente por varias alteraciones a distintos niveles, aportando a la célula
ventajas oncogénicas por diferentes mecanismos. Así mismo, se han asociado las
mutaciones en PIK3CA con alteraciones de los RTKs, mientras que las alteraciones de
la isoforma p110β, que se activa principalmente en respuesta a los receptores acoplados
a proteína G, parece mediar en la tumorigénesis de células con alteraciones en PTEN
(69-70).
INTRODUCCIÓN
43
Gen
(Proteína) Alteración
Efecto en la
señalización
Frecuencia
Luminal
(RE+) HER2+
Basal
(TN)
ErbB2
(HER2)
Amplificación
génica /
sobreexpresión
Hiperactivación
de las vías
PI3K y MEK
10% 100% 0%
EGFR Amplificación 0, 8% de todos los casos
IGF1R Hiperactivación /
amplificación
génica
41-48% 18-64% 42%
FGFR1 Amplificación /
mutación activadora
8, 6-11,
6% 5, 4% 5, 6%
c-Src Sobreexpresión 50-57%
PIK3CA
(p110α/PI3K) Mutación activadora Hiperactivación
PI3K 28-47% 23-33% 8-25%
PIK3CB
(p110β/PI3K) Amplificación Desconocido 5% de todos los casos
PIK3R1
(p85α/PI3K)
Mutación
inactivadora
Hiperactivación
PI3K 2% de todos los casos
PTEN Mutación (pérdida
función) / represión
Hiperactivación
PI3K 29% 22% 67%
AKT1 Mutación activadora Hiperactivación
AKT
2, 6-3,
8% 0% 0%
AKT2 Amplificación Hiperactivación
AKT 2, 8% de todos los casos
PDK1 Amplificación o
sobreexpresión
Hiperactivación
PDK1/AKT 22% 22% 38%
Tabla 1: Alteraciones directas e indirectas de la vía PI3K-PTEN-Akt descritas en
el cáncer de mama por subtipo molecular. Modificada a partir de la Tabla 1 de:
Mutations in the phosphatidylinositol 3-kinase pathway: role in tumor progression and
therapeutic implications in breast cancer. Miller et al. Breast Cancer Research 2011,
13:224 (71).
Las mutaciones en el gen PIK3CA destacan por su frecuencia en el cáncer de
mama. Más del 80% de éstas afectan a los residuos E542K y E545K del exón 9, en el
dominio helical, y al residuo H1047R del exón 20, en el dominio quinasa (72-73). A
través de estudios in vitro y en ratones se ha observado que cualquiera de las tres
mutaciones confiere, aunque a través de distintos mecanismos, un incremento de la
INTRODUCCIÓN
44
actividad catalítica de la enzima (74-76). Sin embargo, la investigación en muestras
humanas ha asociado la existencia de mutaciones en PI3K con factores pronósticos
favorables y bajos niveles de activación de la vía (77-78), así como no se han
encontrado asociaciones con la respuesta a tamoxifeno (79). La heterogeneidad de las
series estudiadas y las diferentes metodologías empleadas pueden estar velando su
verdadero valor como factor pronóstico.
En el subtipo luminal, destaca la frecuencia con la que se describen alteraciones
en esta vía, quedando claro que la alteración de su actividad juega un papel central en la
oncogénesis de estos tumores. Cabe destacar la interacción de la vía con el ESR1 directa
e indirectamente (45, 70, 80-81). Como hemos visto en el apartado del ESR1, Akt es el
responsable de la fosforilación de la serina S167 del dominio AF1 de ESR1,
promoviendo su activación independiente de ligando (47), lo que podría explicar la
relevancia de esta vía en los luminales. Sin embargo, no se han estudiado en
profundidad las diferencias entre ambos subtipos de luminales y los pocos estudios
realizados apuntan a un mayor peso de la vía en el subgrupo B (80-81).
4.2. El receptor tirosina-quinasa IGF1R
El eje de señalización del factor de crecimiento IGF (del inglés Insulin-like
growth factor), juega un papel crítico en el crecimiento fisiológico y además es un
mediador bien caracterizado del fenotipo maligno (82-85). Existen 3 receptores tirosina
quinasa transmembrana responsables de la actividad de la vía: los receptores similares al
receptor insulínico tipo 1 o IGF1R (del inglés Insulin-like growth factor receptor), el
tipo 2 o IGF2R y el propio receptor de insulina (IR). Sin embargo, la función del IGF2R
no se relaciona con los otros dos y no se le conoce función de transducción de señales.
INTRODUCCIÓN
45
El IGFI es el ligando principal para el IGF1R, para el IR y para su heterodímero o HR
(del inglés Hybrid-Receptor) (82-83, 86-91). Al ligar a IGFI, el IGF1R se autofosforila
provocando una cambio conformacional que activa el dominio quinasa formando sitios
de unión para sus proteínas efectoras, entre las que destacan los substratos adaptadores
del IR (IRS-1 a IRS-4), la proteína del colágeno homóloga al Src (Shc, del inglés Src
Homologous Collagen) y la proteína 14-3-3 (86, 89). La actividad quinasa de IGF1R
intracelular está regulada por c-Src, integrinas, fosfatasas, como la proteína tirosina
fosfatasa 1B (PTP-1B), y la proteína RACK1 (del inglés Receptor for Activated C
Kinase 1), una proteína G responsable de regular la activación de la vía PI3K desde el
IGF1R. Por tanto, a través de múltiples efectores, el IGF1R es capaz de participar en
numerosas vías de señalización (87, 92).
Se ha demostrado que es necesaria la presencia del IGF1R funcional para que sea
posible la transformación a fenotipos malignos, el crecimiento celular y la supervivencia
tanto en estudios in vitro como in vivo (90, 93), por lo que se ha establecido como una
molécula importante en las etapas tempranas de la oncogénesis. Así mismo, sigue
participando en el progreso tumoral favoreciendo la supervivencia celular.
El IGF1R se encuentra sobreexpresado frecuentemente en las neoplasias humanas,
incluyendo el melanoma, el carcinoma de colon, páncreas, próstata, riñón y en los
tumores de mama (88). Esta alteración se ha vinculado a un mal pronóstico en algunos
tipos tumorales (94) y se ha demostrado que, en el modelo de cáncer en ratón RIP1-
TAG2, acelera el desarrollo de los tumores y los hace más invasivos, incrementando el
número de metástasis (95). También se ha asociado a la promoción de una combinación
de crecimiento celular y evasión de la apoptosis tal, que posibilita el crecimiento
independiente de anclaje y la supervivencia de las células (adaptaciones celulares
necesarias en el proceso de la metástasis) (85, 96-97).
INTRODUCCIÓN
46
En el cáncer de mama se ha descrito su sobreexpresión en aproximadamente un
60% de los casos (98-102). Se han propuesto otro tipo de alteraciones menos frecuentes,
como la existencia de polimorfismos (103) y la variación de otros componentes de la
vía IGF (104). Se han demostrado diferencias en función del subtipo tumoral (101), la
aparición de recidivas y el pronóstico (105) y otras características clínico-patológicas
(106). Paralelamente, se ha establecido una relación con el ESR1 y su señalización que
amplía su participación en la oncogénesis de los tumores luminales (98, 107-109), e
incluso se ha señalado su implicación en la respuesta a terapia (110) y a la adquisición
de resistencias (111-114).
4.3. El receptor tirosina quinasa EGFR
El receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGFR (del inglés Epidermal
Growth Factor Receptor) es un miembro de la familia de receptores ErbB, que incluye
además al ErbB2 (HER2/neu, sobreexpresado en un 30% de los tumores de mama), el
ErbB3 y el ErbB4. Se trata de receptores tirosina-quinasa transmembrana que son
expresados en la superficie de las células epiteliales para recibir señales de su entorno
en forma de factores de crecimiento y transducir la señal al interior de la célula. En
respuesta, el EGFR regula procesos importantes como la supervivencia celular, la
progresión del ciclo celular y la angiogénesis. Del mismo modo, también tiene un papel
fundamental en la oncogénesis, la progresión del cáncer y la adquisición de capacidades
invasivas.
El EGFR está alterado a distintos niveles en varias neoplasias. A nivel de
secuencia génica, se han caracterizado mutaciones en tumores de pulmón (115). El
polimorfismo 142285GA, que conduce a la sustitución de arginina por lisina en el
codón 521, afectando al subdominio extracelular IV (rs11543848, también conocido
INTRODUCCIÓN
47
como HER-1 R497K) ha sido descrito en distintos tipos de tumores malignos (116). Así
mismo, también se ha descrito la amplificación de EGFR y se ha propuesto como un
factor predictivo de la respuesta a la terapia (117). No obstante, la sobreexpresión del
EGFR es la alteración más habitual en los distintos tumores sólidos estudiados.
En el cáncer de mama la sobreexpresión de EGFR se ha vinculado a los subtipos
moleculares altamente agresivos como algunos HER2, TN/B y los tumores portadores
de la mutación en BRCA1 (118). Sin embargo, se ha demostrado que su carácter
oncogénico se obtiene de su coexistencia con otros oncogenes como el c-Src (119-121),
el IGF1R (108, 122-124) y el ESR1 (108, 125-127). Además, la expresión de EGFR
aumenta en los tumores resistentes a tamoxifeno (108, 112, 124, 126-127) y se ha
vinculado con la resistencia a terapias como el trastuzumab (113).
Dadas las diferentes respuestas a terapia de los luminales B, el EGFR podría estar
ejerciendo un papel distinto en la biología de estos tumores, ya fuese por sí solo o en
comunión con otras alteraciones que podrían explicar su comportamiento.
4.4. La tirosina-quinasa citosólica c-Src
La proteína pp60c-Src o c-Src es una tirosina quinasa citoplasmática de 60 kDa
codificada por el gen SRC, homólogo celular del oncogen viral v-Src. Esta enzima
participa en una gran variedad de cascadas de transducción de señales que influyen en la
proliferación, diferenciación, motilidad y supervivencia celular (37). Está
sobreexpresado en numerosas neoplasias humanas y se ha probado su interacción con la
vía PI3K-PTEN-AKT (128). Su activación proviene de los receptores de factores de
crecimiento como EGFR, HER-2, PDGFR (receptor de factor de crecimiento
plaquetario), FGFR (receptor del factor de crecimiento fibroblástico) y VEGFR
INTRODUCCIÓN
48
(receptor del factor de crecimiento vascular) (120, 128-129) o incluso directamente del
ESR1 (130). Ya en 1999, Castoria y colaboradores apuntaron a su función reguladora
no transcripcional en respuesta a estrógenos (131) y recientemente se ha vinculado con
el desarrollo de resistencia a trastuzumab (132). El c-Src también media la actividad
promovida por MUC1, una glicoproteína integral de membrana que está sobreexpresada
en el 90% de los tumores de mama, y que tiene como resultado la hiperactivación de las
vías PI3K y RAS-ERK (133). Los últimos hallazgos apuntan a que c-Src amplía su
efecto proliferativo fosforilando a p27 y, por tanto, reprimiendo su acción reguladora
sobre la ciclina E-Cdk2, lo que se traduce en la entrada de la célula en fase S (130).
Aunque algunos estudios en modelos celulares han demostrado una relación inversa
entre la expresión de c-Src y el ESR1 y que los inhibidores de c-Src parecen aumentar la
expresión de éste (134), también estudios in vitro han demostrado un aumento de
actividad de c-Src en líneas celulares de cáncer de mama luminales durante la
adquisición de resistencia a tamoxifeno (135) y su capacidad, en respuesta a señales del
EGFR, para potenciar la transcripción del ESR1 y del RP a través de la fosforilación de
la proteína WBP2 (ww-binding protein 2) (125). Por otra parte, se han desarrollado
herramientas terapéuticas que inhiben la actividad quinasa de c-Src con efectos en la
motilidad celular, en la dimerización Her2-EGFR y en la inhibición del desarrollo de
metástasis destructivas óseas (129, 136), demostrándose su ineludible función en la
adquisición de la capacidad invasiva junto con el EGFR (121). Estudios recientes han
demostrado aumento de expresión de c-Src en el 50-57% de los tumores luminales. Sin
embargo, esta sobreexpresión parece aportar a los tumores mayor sensibilidad al
tamoxifeno, presentando tasas menores de recaída y mayor supervivencia global (137).
A pesar de ser uno de los primeros proto-oncogenes descritos, sus mecanismos de
acción y las implicaciones clínicas de su expresión en el carcinoma de mama, y más
INTRODUCCIÓN
49
concretamente en el subtipo luminal, no están bien establecidos. Tampoco se conoce si
está implicado en las diferencias entre los luminales A y los luminales B.
4.5. El coactivador MED1
Otro de los posibles puntos de control sobre ESR1 es, precisamente, sobre su
actividad como factor de transcripción nuclear. Es en este aspecto donde destaca el
papel del Mediador o Med1. Este coactivador de la superfamilia de receptores nucleares
PPAR (de Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) fue descrito en 1995 por Lee,
al intentar elucidar los mecanismos por los que los receptores hormonales de tiroides
activaban la transcripción génica (138). Se trata de una proteína de 205 KDa capaz de
ejercer como puente de unión entre los receptores nucleares y el ADN en respuesta a
factores de transcripción dependientes de ligando, y de facilitar el reclutamiento de las
proteínas accesorias necesarias para formar el complejo transcripcional (139-142).
A pesar del gran número de coactivadores de la transcripción descritos, MED1 ha
destacado por su papel en la regulación de p53 (143-144). En la célula fisiológica
MED1 es capaz de interactuar con el gen supresor de tumores a través de su dominio C-
terminal para actuar como cofactor de la activación de la transcripción sobre el
promotor de genes como BAX, o de la represión sobre los promotores de genes como
p21/Waf1 o IGFBP3. Sin embargo, al mismo tiempo regula la entrada en apoptosis
dependiente de p53, al promover la expresión de MDM2 y, como consecuencia, la
degradación de p53 en los proteosomas (145) y al actuar directamente sobre el promotor
de p53 para inhibir su transcripción (146). En las células tumorales, en cambio, las
mutaciones en p53 alteran esta interacción, de modo que MED1 deja de promover la
transcripción de MDM2 y de inhibir al promotor de p53. Como consecuencia se
INTRODUCCIÓN
50
produce una sobreexpresión del gen, que unida a la disminución de su proteolisis
dependiente de MDM2, resulta en altos niveles de la proteína p53 mutada (144, 146).
La regulación que realiza el MED1 sobre los promotores de MDM2 y p53 es
independiente de ambas moléculas y no está demostrado quién la dirige. En 2002, Misra
demostró que MED1 tenía sitios de fosforilación para las quinasas A y C (PKA y PKC)
y para las MAPK y propuso esta vía como la responsable de la regulación de su
actividad (147); unos años después, Pandey apuntó que ERK (la quinasa regulada por
señales extracelulares de la vía MAPK) fosforilaba a MED1 en los residuos T1032 y
T1457, sobre todo durante la fase G2-M del ciclo celular, promoviendo su entrada al
nucleolo y, por tanto, su actividad (148).
Dadas las diferencias en los niveles inmunohistoquímicos de p53 entre los
luminales A y los B, puede que MED1 esté jugando distintos roles en su biología.
Recientes estudios proponen a MED1 como el responsable de los altos niveles de
AURKA en las células tumorales. Esta serina/treonina quinasa, sobreexpresada en
varios tipos de cáncer, regula la función del centrosoma durante la fase M (149); se ha
propuesto como un marcador de proliferación mucho más sólido que el Ki67 y como un
posible marcador para la subclasificación de los luminales B (150), mostrándose como
un buen marcador pronóstico en los tumores de mama sin ganglios afectos (N0) (151).
En 1998, Yuan y su grupo demostraron que MED1 también mediaba la actividad
de otros receptores nucleares como el receptor de la vitamina D y el ESR1 de forma
dependiente de ligando (142). Sin embargo, meses más tarde Zhu y su equipo
demostraron, in vitro, que, aunque la asociación MED1-ESR1 se intensificaba en
presencia de E2, también existía en ausencia de éste e incluso en presencia del
antiestrógeno tamoxifeno (152). Detectaron, además, la sobreexpresión del mediador en
INTRODUCCIÓN
51
aproximadamente un 50% de los tumores primarios y las líneas celulares de cáncer de
mama estudiadas, y su amplificación génica en aproximadamente el 24% de los tumores
primarios y el 30% de las líneas celulares (152). Desde entonces, otros autores han
demostrado que el ESR1 depende del MED1 para ejercer su actividad transcripcional in
vitro (153-154) y Jiang y su equipo desarrollaron un modelo de ratón para demostrar in
vivo el papel ineludible que juega MED1 en la función del ESR1 como factor de
transcripción durante el desarrollo mamario y la diferenciación de las células luminales
(155). Estos hallazgos apuntan hacia la existencia de diversas rutas de sobreexpresión
del MED1 en el cáncer de mama y a su relevancia en la oncogénesis de los tumores
luminales. En los últimos años se ha retomado la importancia del MED1 en el cáncer de
mama y se ha propuesto como un peldaño fundamental en la progresión del tumor hacia
la resistencia a tamoxifeno. En 2012, Cui ha aportado estudios in vitro que demuestran
que en respuesta a tamoxifeno puede promoverse la activación de MED1 por
fosforilación, ya sea a través de HER2 o por la vía EGFR-ESR1. Este hecho origina su
entrada al núcleo y la activación de la transcripción de genes dependientes de
estrógenos, explicando el crecimiento tumoral en pacientes tratados con este fármaco
(156). Aunque queda claro que MED1 interviene en la regulación de la transcripción
dependiente de estrógenos y puede tener un papel importante en la biología de los
tumores de mama luminales, no hay estudios que aclaren su comportamiento y/o sus
alteraciones en series de muestras humanas.
INTRODUCCIÓN
52
5. Los microARNs y su implicación en la señalización estrogénica
5.1. Biogénesis y función de los microARNs
En 1993, Lee y sus colaboradores describieron la existencia de unas moléculas de
ARN de pequeño tamaño que interferían en la regulación génica post-transcripcional de
la biología del gusano Caenorhabditis elegans (157). Los microARNs (o miRNAs, del
inglés micro-ribonucleic acid) son un componente fundamental de los mecanismos de
regulación génica. Se trata de un gran grupo de ARNs de pequeño tamaño (21-22
nucleótidos) que no codifican proteínas (158-159).
La mayoría de los microARNs (alrededor de un 37%) son transcritos por la ARN
polimerasa II en forma de una molécula conocida como microARN primario o pri-
microARN. Esta molécula consta de entre unos cientos y miles de nucleótidos unidos a
una molécula de CAP (7-metil-guanosina) en 5’ y poliadenilado en 3’, de forma similar
a los ARN mensajeros (160-162). El pri-microARN, permanece en el núcleo para ser
procesado en transcritos más cortos de aproximadamente 70 nucleótidos, conocidos
como microARNs precursores o pre-microARNs, por un complejo proteínico específico
que lidera la enzima ARNasa III Drosha. Todos los microARNs maduros originados a
partir del mismo pri-micro-ARN policistrónico se consideran componentes de un
cluster (163). Los clusters de microARNs están muy conservados entre las distintas
especies, sugiriendo una presión evolutiva para mantener su organización, quizás por las
importantes funciones reguladoras que ejercen.
Otros microARNs, conocidos como miRtrones, se encuentran codificados en el
interior de intrones génicos, se transcriben con el gen que les acoge y se liberan en el
núcleo en forma de pre-microARNs durante el proceso de splicing de su mensajero
INTRODUCCIÓN
53
(164). Por último, un pequeño porcentaje de estas moléculas están codificadas entre
secuencias repetitivas en el ADN y son transcritos independientemente a pre-
microARNs por la enzima ARN polimerasa III (165).
El transportador específico Exportin-5 es el encargado de trasladar los pre-micro-
ARNs al citoplasma (166). Una vez allí son recibidos por la enzima ARNasa Dizer, que
vuelve a procesarlos dando como resultado pequeñas cadenas de doble hebra de 20-22
nucleótidos de ARN (167). Éstas se incorporan entonces al complejo-RISC, formado
por varias enzimas (168), donde una de las dos hebras suele ser degradada y la otra, que
es el miRNA maduro, ayudado por la enzima catalítica del complejo-RISC AGO2, ya
puede ejercer su función reguladora sobre la traducción de sus genes diana (167, 169-
171) (Figura 7).
La función reguladora de los microARNs puede estar dirigida hacia la inhibición
de la traducción del mensajero mediante la unión a su región 3’UTR, o bien a marcar la
molécula para que sea degradada (159, 172-173). De cualquiera de las formas, el
resultado es una disminución de la cantidad de proteína del gen diana en cuestión. La
interacción con el gen diana se basa en la complementariedad incompleta de la
secuencia de los nucleótidos 2 a 7 del miRNA con la región 3’UTR del mensajero (159,
172-173). Esta secuencia se conoce con el nombre de “secuencia semilla” (o SS, del
inglés Seed Sequence). La SS no es específica de cada microARN, sino que se repite en
todos los miRNAs de una misma familia que cooperan en la regulación de sus genes
diana (174). Por tanto, cada gen diana es objeto de regulación de múltiples miRNAs y
cada miRNA posee múltiples genes diana, lo que incrementa exponencialmente la
capacidad reguladora de estas moléculas.
INTRODUCCIÓN
54
Actualmente hay descritos 1881 precursores y 2661 microARNs maduros en el
ser humano (datos extraídos el 31 de octubre de 2015 del registro MiRBase (175-179)).
Figura 7: Biogénesis de los microARNs. Imagen modificada a partir de la figura 1
de Sotiropoulou et al. Emerging roles of microARNs as molecular switches in the
integrated circuit of the cancer cell. RNA (2009), 15:1443-1461(180).
Los miRNAs actúan como reguladores de la expresión génica durante el
desarrollo y la diferenciación. Además, participan coordinados con los factores
transcripcionales c-Myc, E2F y p53, y regulan a elementos tan importantes como las
ciclinas en el control del ciclo celular. En general, a través de la regulación de sus
dianas génicas, controlan las rutas de señalización celular (181-183).
La alteración de sus patrones de expresión se ha vinculado a procesos como la
inflamación, la respuesta al estrés celular, la apoptosis y la invasión, lo que les ha dado
un papel fundamental en la oncogénesis y la progresión del cáncer (159, 180-182, 184-
187).
INTRODUCCIÓN
55
5.2. Los microARNs en el cáncer de mama y su relación con el ESR1
En el cáncer de mama se han documentado alteraciones en los patrones de
expresión de numerosos miRNAs que deben estar participando en la oncogénesis de
estos tumores (188-189).
Las alteraciones descritas se han vinculado a aspectos tan variados como la
susceptibilidad al cáncer de mama (190), el fenotipo tumoral (61, 63, 191), los estadíos
tumorales (185, 192-193), la agresividad tumoral, la metástasis ganglionar (194-195) y
la recidiva local o a distancia (196). En los últimos años se ha incrementado
notablemente la publicación de hallazgos que ponen de manifiesto la participación de
estas moléculas en el cáncer de mama (Figura 8).
Figura 8: Publicaciones registradas en PubMed sobre la participación de los
microRNAs en el cáncer de mama. Datos tomados de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/resultsbyyear el 31 de octubre de 2015.
INTRODUCCIÓN
56
En los últimos años se discute su validez como marcadores de metástasis (197).
Así mismo, se han señalado como posibles marcadores para la selección de terapias
individualizadas (198), al verse implicados en los mecanismos de respuesta a fármacos,
como es el caso del miR-21 y el alcaloide matrina (199), del miR- let-7a y el
antidiabético metformina (200) o del miR-let-7f y el inhibidor de aromatasa letrozol
(201). Paralelamente también participan en la adquisición de resistencia a fármacos
(202) como paclitaxel (203-204), tamoxifeno (205-209), taxol (210) o fulvestrant (211).
Incluso se han relacionado con la respuesta a radioterapia (212).
Recientemente, se han demostrado cambios en sus concentraciones circulantes,
proponiéndose su utilización como marcadores tumorales (213-214), incluso
específicamente en tumores luminales tempranos (215-216).
Tal como introdujimos en el apartado correspondiente, el ESR1 se ha visto
inmerso en la regulación de varios microARNs, de forma que es capaz de favorecer
directamente la transcripción de algunos y reprimir la expresión de otros a través de la
regulación de sus proteínas reguladoras. Paralelamente, también él mismo se ve
sometido a la regulación de estas moléculas, estableciéndose una red de señalización
pro- y antiestrogénica que puede derivar en su estimulación o su represión en función de
las señales que reciba la célula y de las vías de señalización activas (41, 44, 46, 64, 217-
220). Incluso se ha señalado su participación en la regulación de las proteínas
implicadas en la biogénesis y en la función de los miRNAs (221).
En nuestro estudio hemos seleccionado un conjunto de 4 miRNAs y 1 pri-
microARN cuya alteración ha sido previamente descrita en el cáncer de mama, por su
relación con el ESR1 y su participación en las vías de señalización exploradas.
INTRODUCCIÓN
57
5.3. El pri-miR-17~92
El pri-miRNA-17~92 codifica uno de los clusters policistrónicos de miRNAs
mejor caracterizado. Está codificado en el cromosoma 13 y los miRNAs maduros que
comprende son el miR-17, el miR-18a, el miR-19a, el miR-20a, el miR-19b-1 y el miR-
92a. A pesar de estar altamente conservado en todos los vertebrados, durante su
evolución temprana se originaron dos anomalías cromosómicas que afectaron a este
cluster: una duplicación de la región implicada, que dio lugar al cluster parálogo miR-
106b~25 (localizado en el humano en el cromosoma 7, dentro del intrón 13º del gen
MCM7), y otra duplicación/deleción que dio lugar al cluster parálogo miR-106a~363
(localizado en el humano en el cromosoma X) (Figura 9).
Figura 9: (a) Representación esquemática del cluster miR-17~92 y sus clusters
parálogos: miR-106b~25 y miR-106a~363. (b) Los microARNs maduros originados se
engloban en 4 familias: miR-17, miR-18, miR-19 y miR-92. Imagen tomada de: The
microRNA-17-92 family of microRNA clusters in development and disease. Concepcion
et al. Cancer J. 2012;18(3):262-267 (222).
INTRODUCCIÓN
58
La regulación de la transcripción del pri-miR-17~92 es estrógeno-dependiente,
coordinada por el ESR1 (64, 217), a través de la actividad de c-Myc sobre el locus
c13orf25 en el cromosoma 13q31. 3, si bien se ha señalado que los factores de
transcripción de la familia E2F también pueden unirse a su promotor (183) de forma
dependiente de p53 (223). Sin embargo, se ha descubierto que miR-17 y miR-20 son
capaces de reprimir la traducción de E2F1, por lo que se propone como un bucle
regulador en la señalización de la vía c-Myc-E2F (223-225).
Aunque los genes diana del cluster no están bien definidos, tratándose en la
mayoría de los casos de estudios in silico, se ha demostrado el papel regulador de sus
funciones en múltiples aspectos de la biología celular, no obstante existe una gran
controversia sobre si su actividad se ajusta a un perfil pro-oncogénico o supresor de
tumores (225-227).
No son pocos los estudios que apuntan al posible carácter supresor tumoral de
algunos de sus microARNs maduros, como el miR-18a, que reprime la traducción de K-
ras (228) y de ESR1 (218), o el miR-17 y el miR-20, que reprimen la traducción de la
ciclina D1 (229), de E2F1 (183) y de AIB1 (230). Sin embargo, se ha demostrado que
también son capaces de promover la oncogénesis en muchos de sus aspectos más
importantes (Figura 10) (231-233), incluyendo la apoptosis (el miR-19 reprime la
expresión de PTEN), la proliferación (miR-17 y miR-20a actúan sobre los inhibidores
del ciclo p21 y p57) y la angiogénesis (controlando la expresión de factores
antiangiogénicos como el TSP-1 y el CTGF, ejercida por el miR-18a y el miR-19
respectivamente) (222, 227, 231, 234-239).
El papel de este grupo de miRNAs en cáncer de mama es igualmente
controvertido y sus niveles de expresión se han visto tanto disminuidos como
INTRODUCCIÓN
59
aumentados en esta neoplasia. Kim y su grupo, han demostrado recientemente que el
pri-mir-17~92 puede jugar un papel oncogénico en el cáncer de mama a través de la
represión del represor transcripcional ZBTB4, cuya expresión se ha correlacionado con
la supervivencia libre de enfermedad (240). Yu destacó en líneas celulares de esta
neoplasia la regulación ejercida por el miR-17 y el miR-20 sobre la ciclina D1 (229) y
también se demostró que el miR-17 conseguía la disminución del crecimiento
dependiente de estrógenos a través de la represión de AIB1, un oncogen frecuentemente
sobreexpresado en cáncer de mama que actúa como coactivador del ESR1 en su
actividad como factor de transcripción (44, 230). Sin embargo, la gran mayoría de los
estudios realizados se han centrado en líneas celulares, habiéndose realizado muy pocos
estudios en muestras humanas, y no se conoce su comportamiento en función del
subtipo tumoral.
Figura 10: Representación esquemática del bucle de regulación c-Myc-E2F-pri-
miR-17~92 y de las funciones de los microARNs maduros del cluster. Imagen
modificada a partir la Figura 2 de: The microRNA-17-92 family of microRNA clusters in
development and disease. Concepcion et al. Cancer J. 2012;18 (3):262-267 (222).
INTRODUCCIÓN
60
5.4. El miR-Let-7a
El micro-ARN-Let-7a también participa en la regulación de la expresión de c-Myc
y por tanto, indirectamente, en la del pri-miR-17~92 (241). Los microARNs de esta
familia se caracterizaron inicialmente como genes supresores de tumor en cáncer de
pulmón, por regular la expresión del proto-oncogen RAS (242). Recientemente se han
demostrado sus múltiples funciones anti-oncogénicas en líneas celulares, reprimiendo
tanto la supervivencia celular, como la invasión y la adhesión celular (243). También se
ha caracterizado su función reguladora sobre la expresión de la interleucina 6 (IL6), por
lo que al inhibirse el miR-Let-7, su expresión aumenta y con ella la expresión del NFκβ
y la activación, a través de STAT3, de la inflamación asociada al tumor (244-245). En
líneas celulares de mama se ha observado la implicación del miR-Let-7a en la
incapacitación de las células para la migración y la invasión a través de la represión del
receptor de quimiocinas C-C tipo 7 (CCR7), que actúa en la adquisición de las
capacidades quimiotácticas de las células metastásicas y está sobreexpresado en tumores
de mama (246), y sobre BACH1, que induce la expresión de metaloproteinasa 1
(MMP1), osteopontina (OPN) y el receptor C-X-C de quimiocinas tipo 4 (CXCR4),
todos ellos involucrados en la metástasis ósea. En los últimos año se ha descrito incluso
la importancia de esta familia en el mantenimiento de las células progenitoras de cáncer
de mama, en las que los miR-Let-7 se mostraron reprimidos y esto propiciaba la
sobreexpresión de Ras, y consecuentemente la activación de p-Ras y p-ERK (247).
La represión que parece sufrir esta familia de miRNAs parece estar regulada
desde múltiples vías y por distintos mecanismos. Recientemente, se ha descrito en
líneas celulares de mama la existencia del polimorfismo rs7963551, localizado en la
secuencia de unión del miR-Let-7, que lo incapacita para su función represiva sobre
genes como RAD52, proteína reparadora de la doble hélice que tiene un papel
INTRODUCCIÓN
61
fundamental en la recombinación génica y se ha visto involucrada en la adquisición de
resistencia a radioterapia (190). También en tumores mamarios, se ha descrito
recientemente la disminución del número de copias del microARN-Let-7a-2 (248). En
el año 2007 se demostró la regulación de esta familia de microARNs por c-Src en
respuesta a estrógenos, a través de la proteína Lin28 (203, 244-245, 249), y es
precisamente la inhibición de esta vía el mecanismo propuesto por el que las células
responden al inhibidor de la proteína quinasa Raf (RKIP) (250). Asimismo, se proponen
mecanismos de regulación epigenéticos, como el miR-107 (251) o incluso la metilación
de su promotor (252-253), observada en el 45% de los casos esporádicos de cáncer de
mama, mientras que parece sobreexpresarse en el 64% de los casos de cáncer de mama
familiar (254). Además, se ha explicado la respuesta de líneas celulares de cáncer de
mama a metformina por su capacidad de sobreexpresar el miR-Let-7a (200). De
cualquier modo, su importancia en el cáncer de mama parece clara (255) y es destacable
su posible función en los tumores luminales, pues se ha señalado su implicación en la
respuesta a tamoxifeno por mediar la represión de la señalización del ESR1 (66, 209).
5.5. El miR-206
Otro de los microARNs caracterizados por jugar un papel anti-oncogénico es el
miR-206, destacado en distintas neoplasias por su papel proapoptótico y antimetastásico
y su posible aplicación terapéutica (256-258). La relación del miR-206 con el ESR1 es
compleja y bidireccional. El miR-206 reprime la expresión del ESR1 uniéndose a dos
sitios específicos de la región 3’UTR de su ARN mensajero (hERα1 y hERα2) (63, 259-
260), así como de sus coactivadores SRC-1, SRC-3 y GATA-3 (260) e inhibe la
proliferación dependiente de la señalización estrogénica en líneas celulares (261). Al
mismo tiempo, el ESR1 inhibe la transcripción del miR-206 (259-260). Se le ha
INTRODUCCIÓN
62
identificado como responsable del cambio de fenotipo luminal A a TN/B de la línea
celular de mama MCF-7 en respuesta a la señalización del EGFR (262), y a través de la
represión de los mensajeros de los coactivadores de la señalización estrogénica SRC1,
SRC3 y GATA3, así como del oncogen Ciclina D1 (263) y el marcador asociado a
estimulación con estrógenos PFKFB3 (264). Sin embargo, todos los que han estudiado
la interrelación entre ESR1 y el miR-206 en muestras de tumores de mama humanos se
han centrado en las diferencias del fenotipo ER (+) respecto al fenotipo ER (-). Las
implicaciones que pudiese tener esta co-regulación dentro del subtipo luminal podrían
ayudar a entender los distintos comportamientos de estos tumores.
5.6. El miR-222
El miR-222, sin embargo, ha destacado por sus funciones pro-oncogénicas. Así,
es capaz promover la progresión del ciclo celular reprimiendo la expresión de su
inhibidor p27 (206, 265-268). El miR-222 también participa como factor anti-
apoptótico al ser responsable de promover la degradación del ARNm de PTEN,
disminuyendo la concentración de la molécula y, por consiguiente, su traducción a
proteína, promoviendo así la sobreactivación de la vía PI3K (212, 269-272).
Igualmente, inhibe la traducción del inhibidor de metaloproteinasas 3 (TIMP3 del inglés
Tissue Inhibitor Metalloproteinasa 3) (269, 273-274) y de RECK (275), inhibidor de la
secreción de las MMP-9 y 2 y de su función, facilitando la adquisición de fenotipos
invasivos y habiéndose relacionado directamente con la respuesta a tamoxifeno (276).
La regulación de este microARN oncogénico se ha asignado a oncogenes como KRAS
(277) o MET (269) y a la vía ERK (278). Además se ha señalado como uno de los
responsables del fenotipo agresivo de los tumores de mama TN/B (279-280), y de la
adquisición de resistencias frente a fulvestrant (211) y tamoxifeno (206, 208, 281). Se
INTRODUCCIÓN
63
ha descrito la sobreexpresión del miR-222 en carcinomas ductales invasivos y en líneas
celulares resistentes a tamoxifeno (208, 282-283). Se ha demostrado que es capaz de
inhibir la traducción del ESR1 (62, 208) y modular a su represor N-COR (44), y que, al
mismo tiempo, el ESR1 reprime su expresión (62). La alteración de este bucle auto-
regulado por otros factores podría estar involucrada en las diferencias entre los
luminales A y los luminales B.
5.7. El miR-21
Otro de los microARNs más estudiados es el miR-21 (284). Se ha focalizado su
importancia en su capacidad represiva sobre PTEN (285-286), pero posee otros genes
diana como el ligando de los receptores NOTCH, JAG1 (287), la tropomiosina 1
(TPM1), el supresor de metástasis Maspin, el pro-apoptótico PDCD4 (288), el gen
supresor tumoral RHOB (289) y, compartiendo diana con el miR-222, el TIMP3(290).
Li y su grupo han demostrado en la línea celular de cáncer de mama MCF-7, que la
función anticancerígena del alcaloide matrine se consigue a través de la represión del
miR-21, que tiene como consecuencia el aumento de las proteínas p21, p27 y PTEN,
recuperando el control del ciclo celular y de la apoptosis (199). Han y sus
colaboradores, también apuntan a la acción represiva del miR-21 sobre PTEN como la
responsable de la transición epitelio-mesenquimal y de la desdiferenciación a células
progenitoras cancerígenas (CSC o cancer stem cell) de las líneas celulares de cáncer de
mama MDA-MB-231 (291) y MCF-7 (292-293). Sin embargo, el papel de este
microARN es controvertido debido a que también es capaz de inhibir la traducción de
oncogenes como el E2F2 y el c-Myc (amplificado en aproximadamente un 40% de los
tumores de mama y responsable de la regulación de la expresión de microRNAs como
el cluster miR-17~92) (46, 294).
INTRODUCCIÓN
64
La participación de este microARN en el cáncer de mama se ha documentado con
numerosos estudios sobre líneas celulares, vinculándose a la pérdida de expresión de
PTEN, así como en tumores de mama, en los que se ha asociado a metástasis linfática,
baja supervivencia y estadio tumoral avanzado e incluso a valores de Ki67>10% (195,
295). Sus niveles se han mostrado tanto sobreexpresados (46, 191) como inhibidos
(296). Se ha señalado su participación en la adquisición de resistencia a la doxorubicina
(297) y a trastuzumab (298) a través de su regulación sobre PTEN, y se ha propuesto el
uso de inhibidores específicos en terapia combinada con taxol como una alternativa
terapéutica que incrementa el éxito del quimioterápico (210). Sin embargo, se ha
observado su sobreexpresión en respuesta al arresto del ciclo celular promovido por el
fitoquímico 3, 3’-diindolylmetano (DIM) (299) y al tratamiento con el ácido holo-trans-
retinoico (300). Así mismo, se está valorando la utilidad diagnóstica de la cuantificación
de sus niveles circulantes (213-216, 301). Algunos autores han descrito su represión
derivada del tratamiento con E2 (64, 296), mientras que no se ha conseguido con el
tratamiento con tamoxifeno, lo que indica que la transcripción del miR-21 está regulada
por el ESR1 (46, 64, 287, 296). Sin embargo, Bhat-Nakshatri y su grupo demostraron
que el ESR1 podía sobreexpresar o reprimir el miR-21 en función del estado de
activación de Akt (46). Este miRNA está reprimido en líneas celulares de tumor de
mama resistentes a tamoxifeno (44, 206), mientras que aumenta en pacientes tratados
con este inhibidor del ESR1 y está sobreexpresado en la línea celular de mama tumoral
MCF-7 (64). También se ha demostrado una mayor expresión del miR-21, entre otros
miRNAs, en casos con tumores bilaterales (302) e incluso se ha descrito su
participación en la resistencia a la radioterapia (303). Sin embargo, no se ha estudiado
su comportamiento específicamente en el subtipo luminal.
INTRODUCCIÓN
65
6. Justificación
Los carcinomas infiltrantes de mama con receptores hormonales positivos
constituyen un grupo heterogéneo, con pronóstico en general más favorable y respuesta
variable a tratamiento hormonal (fenotipos luminal A y B). Sin embargo, existe un
subgrupo que presenta peor pronóstico y peor control de la enfermedad con tratamiento
hormonal, por lo que se hace necesaria la quimioterapia adyuvante.
Con este estudio pretendemos evaluar en el subtipo luminal la implicación de
alteraciones moleculares descritas frecuentemente en el cáncer de mama y su
interacción con la señalización estrogénica. Así pues, hemos analizado en una serie de
tumores luminales las alteraciones moleculares destacadas en los RTK, la vía PI3K, la
quinasa c-Src y el mediador de la transcripción MED1, así como los patrones de
expresión de microARNs seleccionados por su relación con el ESR1 y su implicación
en la regulación de las vías moleculares exploradas.
Pretendemos aportar nuevos datos sobre la implicación de estos marcadores
moleculares en las diferencias entre los luminales A y los luminales B, así como su
aplicación como factores pronósticos para estos tipos de tumores mamarios.
INTRODUCCIÓN
66
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
67
HHHIIIPPPÓÓÓTTTEEESSSIIISSS
Los factores moleculares efectores de las vías celulares reguladas por la acción
estrogénica, participan en mayor o menor grado en la oncogénesis de los tumores
luminales de mama. Además, estos factores se alterarásn en función de las
características del tumo, afectando a sus características patológicas y a su
comportamiento clínico. Como los microARNs muestran distintos comportamientos en
función del tipo celular y su contexto, su coexistencia con otras alteraciones analizadas
también podría condicionar sus patrones de regulación y por tanto sus funciones en la
célula tumoral.
Esta información, en combinación con otros criterios como la proliferación
celular y el estado de p53 contribuirá a identificar grupos con mayor riesgo a recidivar o
supervivencia libre de enfermedad menor, en los que sería necesaria la aplicación de
alternativas terapéuticas más agresivas y seguimientos clínicos más estrictos.
68
OOOBBBJJJEEETTTIIIVVVOOOSSS
Objetivos Principales
1.- Analizar la participación de un panel de genes y microARNs asociados a la
señalización estrogénica en los carcinomas infiltrantes de mama con fenotipo
luminal.
2.- Comparar el panel en función de que el fenotipo sea luminal A o B.
3.- Investigar el valor pronóstico de estos factores moleculares frente a la
supervivencia libre de enfermedad y su validez en función del tiempo de
seguimiento
Objetivos Secundarios
a) Determinar la frecuencia de las mutaciones “hotspot” en el gen PI3KCA en
nuestra serie.
b) Describir las alteraciones en los niveles de expresión de los receptores tirosina-
quinasa IGF1R y EGFR, de la quinasa citosólica c-Src y del mediador MED1, en
relación con las características clínico-patológicas de nuestra serie y en función
del subtipo luminal.
c) Describir las alteraciones en el patrón de expresión de los miRNAs relacionados
con el receptor de estrógenos ESR1, en relación con las características clínico-
patológicas de nuestra serie y en función del subtipo luminal.
d) Estudiar las asociaciones entre las alteraciones descritas en los objetivos
secundarios a-c, en relación con las características clínico-patológicas de nuestra
serie y en función del subtipo luminal.
e) Evaluar el significado pronóstico de estas alteraciones y su valor en la
identificación de grupos de riesgo en función del tiempo de seguimiento.
MATERIAL Y MÉTODOS
69
MMMAAATTTEEERRRIIIAAALLL YYY MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
1. Diseño y muestreo
El presente proyecto se realizó en plena colaboración con el Servicio de Anatomía
Patológica (SAP) del Hospital General Universitario de Alicante (HGUA). Dadas las
características del estudio, fue diseñado como un estudio transversal retrospectivo. Los
casos fueron seleccionados de la base de datos de cáncer de mama del SAP sobre
pacientes intervenidos en el HGUA entre el año 2000 y 2006. Así mismo se
seleccionaron 10 pacientes de cirugía de reducción mamaria sin patología previa para la
obtención de tejido normal que pudiese ser utilizado para la obtención de los valores de
referencia de las variables moleculares.
A pesar de que todos los diagnósticos eran anteriores a la publicación de la Ley
14/2007, de 3 de julio, de Investigación biomédica, el Biobanco del HGUA solicitó al
Comité de Ética (CEIC) de nuestra institución la exención de consentimiento informado
para este grupo de pacientes, que fue concedido con fecha 9 de junio de 2010.
Todos aquellos datos que podían comprometer la confidencialidad de las
pacientes incluidas en el estudio fueron eliminados por el patólogo responsable tras
obtener el listado de pacientes. Además, la utilización de dichas muestras para el
MATERIAL Y MÉTODOS
70
presente estudio no modificó de ninguna manera la actitud terapéutica hacia las
pacientes.
Las muestras tumorales y sanas fueron obtenidas de bloques de tejido fijado en
formalina al 10% e incluido en parafina (FFPE) según la metodología de rutina en el
SAP.
1.1 Criterios de inclusión
- carcinomas infiltrantes de mama
- expresión inmunohistoquímica positiva para receptores de estrógenos y
progesterona
- expresión inmunohistoquímica negativa para Her-2 o no confirmada por los
estudios de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) o cromogénica (CISH).
1.2 Criterios de exclusión
- pacientes de sexo masculino
- pacientes con subtipos histológicos especiales (poco frecuentes, como los de
células en anillo de sello, los adenoides quísticos, cribiformes...)
- pacientes que hayan recibido tratamiento neoadyuvante
- tejido insuficiente que impida obtener cilindros para la obtención del material
genético
- muestras que no cumpliesen los mínimos de cantidad y calidad del material
genético extraído.
1.3 Muestra
Se seleccionaron 240 casos que cumplían los criterios de inclusión y exclusión.
De ellos se perdieron 20 casos por problemas de cantidad o de calidad del ADN y/o del
ARN, alcanzando una muestra final de 220 casos.
MATERIAL Y MÉTODOS
71
2. Variables a estudio
2.1 Variable de identificación
Las muestras fueron anonimizadas asignándoles el código generado
automáticamente por el programa Access (Microsoft Office 97-03) al incluirlas en el
cuaderno de recogida de datos del proyecto.
2.2 Variables clínicas
Fueron obtenidas de la base de datos del SAP y de la historia clínica de los
pacientes.
- Edad al diagnóstico (años): categorizada en <50 vs ≥50 años.
- Periodo Libre de Enfermedad (PLE): meses a partir de la cirugía curativa hasta
la detección del primer episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la
paciente. Se evaluó en dos variables separadas:
* PLEc: meses a partir de la cirugía curativa hasta la detección del primer
episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la paciente, teniendo en cuenta
un periodo máximo 60 meses (5 años).
* PLEl: meses a partir de la cirugía curativa hasta la detección del primer
episodio de recidiva o, en su defecto, hasta el éxitus de la paciente, teniendo en cuenta
el tiempo de seguimiento completo.
- Supervivencia global (SG): meses a partir de la cirugía curativa hasta el éxitus
de la paciente.
2.3 Variables patológicas
Todas fueron obtenidas de la base de datos del SAP.
MATERIAL Y MÉTODOS
72
- Tamaño máximo del componente infiltrante en mm (TT): categorizada en ≤20 vs
>20 mm.
- Tipo histológico (OMS 2003): Carcinoma Ductal Infiltrante (CDI NOS),
Carcinoma Lobulillar Infiltrante (CLI).
- Fenotipo: Luminal A (LA) o Luminal B (LB). En el presente estudio hemos
tomado como referencia los marcadores Ki67 y p53, pero tomando como puntos de
corte aquellos que en la práctica clínica de nuestro hospital han demostrado aproximar
más la clasificación luminal a las curvas de supervivencia establecidas (8). De esta
forma, se clasifican como tumores luminales B aquellos con una expresión
inmunohistoquímica nuclear de Ki67≥15% y/o una expresión inmunohistoquímica
nuclear de p53 ≥15% (304).
- Grado de diferenciación nuclear (Nottingham/Tenovus Primary Breast Cancer
Study). La modificación Nottingham del índice de Scarff-Bloom-Richardson incluye 3
categorías:
Tumores bien diferenciados (grado I).
Tumores moderadamente diferenciados (grado II).
Tumores pobremente diferenciados (grado III).
- Necrosis tumoral (si, no).
- Invasión linfovascular (presencia de células tumorales en espacios
endotelizados) (si, no).
- Infiltración de piel (si, no).
- Estado ganglionar (EG):
MATERIAL Y MÉTODOS
73
Ganglios analizados
Ganglios afectos: se categorizó en los grados N.
Metástasis en ganglios (si, no).
2.4 Variables inmunohistoquímicas (IHQ)
La valoración inmunohistoquímica se realizó en microscopio óptico de
multiobservación. Se cuantificaron al menos 1000 células por dos observadores de
forma independiente y el resultado se expresó en porcentaje de células tumorales
positivas. Se cuantificó la cifra media de los dos observadores. En caso de discrepancia
mayor al 10% se reevaluó.
- Porcentaje de células tumorales positivas para receptores de estradiol (RE).
- Porcentaje de células tumorales positivas para receptores de progesterona (RP).
- Actividad proliferativa y ciclo celular: Evaluación IHQ de la proliferación
celular (Ki67, clon MIB1, Dako); se consideró actividad proliferativa alta cuando el
porcentaje de células positivas para Ki67 fue ≥15%.
- Expresión IHQ de p53 (clon D07, Dako): evaluación IHQ de la positividad
nuclear. Se consideró afectación de la función de p53 alta cuando el porcentaje de
células positivas para p53 fue ≥15%.
MATERIAL Y MÉTODOS
74
2.5 Variables moleculares
Las variables moleculares analizadas fueron:
Presencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
Patrones de expresión génica de los genes MED1, IGF1R, EGFR, ESR1 y c-Src.
Patrón de expresión del microARN primario pri-miR-17~92.
Patrones de expresión de los microARNs miR-let-7-a, miR-21, miR-206, miR-
222.
2.5.1 Extracción de ADN
Se seleccionaron 2 cilindros de bloques de tejido parafinado de distintas zonas del
tumor, con una celularidad tumoral superior al 30%. Los cilindros fueron
microdisecados manualmente y posteriormente deparafinados con xilol y rehidratados
(Protocolo 1). El tejido recuperado se sometió primero a una homogeneización
mecánica en frío (nitrógeno líquido) con pistilos y posteriormente a una
homogeneización enzimática con proteinasa K en un tampón de lisis celular (Qiagen)
(Protocolo 2).
Tras someter el homogeneizado a 90ºC durante 1 hora para revertir los
entrecruzamientos provocados por la fijación en formalina, que podrían disminuir la
eficiencia de la extracción, se procedió a la extracción de ADN en un kit basado en
columnas con membranas de sílice (QiaAmp de Qiagen). Este método se basa en la
adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo
condiciones nativas, el ADN está recubierto de una capa hidratante de moléculas de
agua que mantienen su solubilidad en soluciones acuosas. Con la adición de iones
caotrópicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa
MATERIAL Y MÉTODOS
75
hidratante, creándose un entorno hidrofóbico alrededor del ADN. Bajo estas
condiciones hidrofóbicas, el ADN se une a la membrana de sílice de la columna,
mientras que el ARN, las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes eluyen de la
columna al centrifugar (Protocolo 3).
Una vez extraído el ADN fue cuantificado y evaluado en el Nanodrop 1000
(Thermo Scientific). Este espectrofotómetro es capaz de cuantificar ácidos nucleicos y
proteínas con 1µL de muestra. Ésta se pipetea en el extremo de un cable de fibra óptica
(pedestal inferior). Un segundo cable de fibra óptica (pedestal superior) se pone
entonces en contacto con la muestra de líquido haciendo que el líquido, por la tensión
superficial, forme una columna que comunica ambos extremos de fibra óptica. La
columna se modifica para que mida 1 mm y 0,2 mm de alto, longitudes a las que se
realizan medidas de la absorbancia de la muestra. Una lámpara de flash de xenón
pulsado proporciona la fuente de luz y el espectrómetro utiliza una matriz lineal CCD
para analizar la luz después de pasar a través de la muestra. Se tomó la concentración en
ng/µL basada en la absorbancia a 260nm. El software utiliza la Ley de Beer para
calcularla. Además se utilizaron los ratios 260/280 y 260/230 para valorar la
contaminación por proteínas (280 nm) y otros contaminantes como las sales de guanidio
presentes en los reactivos de lavado (230 nm). Los ratios aceptados siempre fueron
iguales o superiores a 1,8.
Las muestras de ADN fueron modificadas para que su concentración rondase los
80-120 ng/µL. Aquellas con una concentración mayor fueron diluidas. Aquellas con una
concentración mayor de 50 ng/µL pero menor de 80 ng/µL fueron concentradas en el
SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de agua calculado en
función de su cantidad total de ng de ADN. Para algunos de los casos con muestras de
ADN con una concentración menor de 50 ng/µL fue posible la obtención de más
MATERIAL Y MÉTODOS
76
material para una nueva extracción. Para aquellos en los que no fue posible obtener más
material se realizó una amplificación global del ADN genómico utilizando el kit
específico para muestras parafinadas RepliG FFPE (Qiagen). Este método está basado
en la tecnología Whole Genome Amplification, una amplificación de larga duración que
utiliza una polimerasa que actúa a 37ºC y es capaz de polimerizar fragmentos de más de
2 Kb. Para poder utilizar ADN procedente de muestras FFPE es necesario el ligamiento
previo de los fragmentos de ADN (Protocolo 4). Una vez amplificado el ADN fue
reevaluado en el Nanodrop 1000. Los casos en los que la calidad o la cantidad del ADN
no fueron suficientes fueron excluidos del estudio.
2.5.2 Análisis de mutaciones “hotspot” en PI3KCA
Se realizó el análisis de 3 mutaciones hotspot, seleccionadas de la literatura por su
alta frecuencia en cáncer de mama y sus connotaciones biológicas, correspondientes a
los dominios accesorio (helical) y catalítico (quinasa), localizadas:
en el exón 9:
- Mutación G1624A (E542K)
- Mutación G1633A (E545K)
en el exón 20 la mutación A3140G (H1047R).
La tecnología seleccionada para el análisis fue la amplificación por PCR a tiempo
real (qPCR). Este tipo de PCR consiste en incluir un fluoróforo para poder seguir la
evolución de la amplificación en el transcurso de los ciclos de reacción. Una de las
estrategias posibles consiste en la adición a la mezcla de reacción de un oligonucleótido
de unos 8 pb conocido como sonda, que es complementario a la zona central del
amplicón. La sonda tiene unido en su extremo 5’ un fluoróforo y en su extremo 3’ un
quencher (molécula capaz de absorber la energía del fluoróforo en su estado excitado,
MATERIAL Y MÉTODOS
77
devolviéndolo a su estado fundamental, y liberar la energía en forma de calor) del tipo
no fluorescente (Non Fluorescent Quencher o NFQ) y unido al NFQ una molécula
MGB®, compuesto que se intercala en el surco pequeño de la doble hebra que forma el
ADN y la sonda durante la etapa de hibridación de la PCR aumentando la temperatura
de fusión y la eficiencia de la reacción. De esta forma, mientras la sonda está intacta e
hibridada al ADN no puede existir emisión de fluorescencia. Durante la etapa de
elongación de la hebra copia, la polimerasa, al alcanzar la doble hebra generada a partir
de la hibridación de la sonda, corta ésta nucleótido a nucleótido con su actividad 5’-
exonucleasa para poder continuar con la polimerización. En este momento el fluoróforo
es liberado y se aparta del quencher por difusión en la mezcla de reacción, de forma que
comienza a emitir fluorescencia, que es captada por el sistema y plasmada en el
software en forma de gráfica (∆FR versus ciclo de amplificación).
La metodología utilizada para el análisis molecular fue el genotipado o
discriminación alélica mediante sondas de hidrólisis Taqman® MGB. Esta tecnología
consiste en la realización de la qPCR de la región que contiene la mutación en presencia
de 2 sondas, una complementaria para cada alelo, marcadas con fluoróforos distintos. El
fluoróforo con que marcamos la sonda complementaria al alelo mutante fue FAM™,
seleccionado por su alta intensidad de fluorescencia, y el fluoróforo con que marcamos
la sonda complementaria al alelo silvestre fue VIC® (Figura 11). Los cebadores y
sondas diseñados para cada hotspot se recogen en la Tabla 2. Las qPCR fueron
realizadas para cada muestra problema por duplicado en un Real Time PCR System
7500 Fast (Applied Biosystems) según el Protocolo 5. En todas las placas se incluyeron
diversos controles:
- un control negativo para descartar posibles contaminaciones de las mezclas de
reacción,
MATERIAL Y MÉTODOS
78
- un control positivo homozigoto silvestre, para lo que se utilizó ADN genómico
humano comercial (Roche),
- un control positivo heterozigoto para cada hotspot, para lo que se utilizaron
muestras previamente secuenciadas que fueron cedidas por el Dr. Lluís Catasus
(Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona).
Figura 11: Representación de las 3 etapas de la técnica de genotipado o
discriminación alélica por sondas de hidrólisis. Imagen tomada de Applied Biosystems.
En la etapa 1 el ADN molde se desnaturaliza para que, en la etapa 2, los cebadores y la
sonda complementaria hibriden con sus respectivas secuencias. Durante la etapa 3 se
produce la polimerización de la hebra copia del ADN y por consiguiente la
fragmentación de la sonda hibridada y la emisión de la fluorescencia correspondiente.
MATERIAL Y MÉTODOS
79
Hotspot Cebadores
G1624A F:5’-TGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA-3’
R:5’-CCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTC-3’
G1633A F: 5’-CAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTC-3’
R: 5’-TTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGAA-3’
A3140G F: 5’-GCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCA-3’
R: 5’-GAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC-3’
Hotspot Sonda Alelo Silvestre (VIC®) Sonda Alelo Mutante (FAM™)
G1624A 5’-TCCTCTCTCTGAAATC-3’ 5’-CCTCTCTCTAAAATC-3’
G1633A 5’-AAATCACTGAGCAGGAGA-3’ 5’-AAATCACTAAGCAGGAGAA-3’
A3140G 5’-ATGATGCACATCATGGT-3’ 5’-TGATGCACGTCATGGT-3’
Tabla 2: Cebadores y sondas correspondientes a la discriminación alélica de cada
uno de los hotspots. El diseño se llevó a cabo utilizando el programa Primer Express
(Applied Biosystems). Se seleccionaron los mejores cebadores en función de su
localización respecto del hotspot, de su secuencia y contenido en GC, su temperatura de
fusión y con nula o baja tendencia a la formación de dímeros de cebadores y estructuras
secundarias, para asegurar la mejor eficiencia de la reacción. En cada caso, una vez
seleccionados los cebadores y establecido el amplicón, se seleccionó la sonda de forma
que el hotspot estuviese contenido en su tramo medio y que no tuviese secuencias
proclives a hibridar con alguno de los cebadores o consigo misma. Se testearon todos
los oligonucleótidos en el programa en red Basic Local Alignment Search Tool (BLAST,
del Nacional Center Biotechnology Information) para descartar posibles
amplificaciones inespecíficas. Del mismo modo, se descartó la amplificación de las
regiones altamente homólogas al exón 9 contenidas en los pseudogenes descritos del
gen PI3KCA (gi 28913054 y gi 5931525).
MATERIAL Y MÉTODOS
80
La interpretación de los resultados se realizó con el Software SDS (Applied
Biosystems). La técnica de genotipado se basa en el estudio de las fluorescencias
generadas a tiempo final de la qPCR, es decir, en la etapa plateau. En este punto se
analiza la generación de fluorescencia por uno de los dos o por ambos fluoróforos.
Normalmente se utilizan gráficos de que enfrentan la fluorescencia generada por
cada uno de los fluoróforos en cada eje, representándose cada muestra en función de los
valores para cada uno de ellos (Figura 12).
Figura 12: Representación de los resultados de un estudio de genotipado con
sondas de hidrólisis Taqman®. Se distinguen cuatro cuadrantes en el gráfico:
- cuadrante negativo (X): es el cuadrante donde se sitúan los controles negativos,
puesto que no poseen ninguna de sus secuencias.
- cuadrante homozigoto silvestre (AA): en este cuadrante toda la fluorescencia es
generada por Vic y por tanto en estas muestras sólo existe la secuencia silvestre. En este
cuadrante deben situarse los controles de ADN genómico humano normal (Roche).
- cuadrante homozigoto mutante (GG): en este cuadrante toda la fluorescencia es
generada por Fam® y por tanto en estas muestras sólo existe la secuencia mutante.
MATERIAL Y MÉTODOS
81
- cuadrante heterozigoto (AG): en este cuadrante se detectan fluorescencias de
ambas moléculas. A medida en que aumenta el número de células del tumor que porte la
mutación en heterozigosis, la representación de la muestra está más centrada en el
gráfico, puesto que un heterocigoto 100% tiene la misma intensidad de fluorescencia
para cada una de las moléculas. En este cuadrante deben situarse los controles positivos
de heterozigosis.
2.5.3 Extracción de ARN
Se extrajeron 2 cilindros de zonas con una celularidad tumoral superior al 30%,
seleccionadas de distintas zonas del tumor incluido en bloques de tejido parafinado en el
caso de las muestras problema y 2 cilindros de bloques de tejido parafinado en el caso
de las muestras sanas de referencia. Los cilindros fueron microdisecados manualmente y
posteriormente desparafinados con xilol y rehidratados (Protocolo 1). El tejido
recuperado se sometió primero a una homogeneización mecánica en frío (nitrógeno
líquido) con pistilos y posteriormente a una homogeneización enzimática con proteinasa
K en un tampón de lisis celular (Qiagen) (Protocolo 2).
Tras someter el homogeneizado a 80ºC durante 15 minutos exactos para revertir al
menos en parte los entrecruzamientos provocados por la fijación en formalina, que
podrían disminuir la eficiencia de la extracción, se procedió a la extracción de ARN en
un kit basado en columnas con membranas de sílice que utiliza una tecnología similar al
utilizado para la extracción de ADN (RNeasy Formalin Parafin de Qiagen) (Protocolo
6).
Una vez extraído el ARN fue cuantificado y evaluado en el Nanodrop 1000. Los
ratios aceptados siempre fueron iguales o superiores a 1,8. Los casos en los que la
calidad o la cantidad del ARN no fueron suficientes fueron excluidos del estudio.
MATERIAL Y MÉTODOS
82
2.5.4 Retrotranscripción (RTPCR)
Inmediatamente después de su análisis, las muestras de ARN fueron modificadas
para que su concentración rondase los 100 ng/μL. Aquellas con una concentración
mayor fueron diluidas. Aquellas con una concentración menor fueron concentradas en el
SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de agua calculado en
función de su cantidad total de ng de ARN.
La RTPCR es una PCR en la que participa una enzima polimerasa derivada de
retrovirus y capaz de generar hebras copia de ADN tomando como molde cadenas de
ARN. Dada la alta inestabilidad del ARN, la disponibilidad de este ADN
complementario (ADNc) supuso un salto cualitativo en las posibilidades de análisis de
los perfiles de expresión génica, puesto que esta molécula sí puede ser sometida a ciclos
de amplificación y otras técnicas que no habrían podido desarrollarse sobre la molécula
de ARN original.
Se retrotranscribió 1 μg de ARN de cada muestra con el kit Quantitect Reverse
Transcription Kit (Qiagen), que incluye un tratamiento capaz de eliminar el ADN
genómico que pueda quedar en la muestra. Para ello se siguieron las instrucciones del
fabricante (Protocolo 7).
Una vez retrotranscrito, el ADNc fue diluido 1:5 para evitar que los componentes
de la reacción de RTPCR mermasen la eficiencia de la reacción de qPCR.
MATERIAL Y MÉTODOS
83
2.5.5 Análisis de los niveles de expresión de ARNm por qPCR
La tecnología seleccionada para el análisis fue, de nuevo, la qPCR aunque en esta
ocasión la cuantificación debe realizarse durante la fase exponencial de la reacción,
puesto que proporciona los datos más precisos para la cuantificación. Para poder
realizar las mediciones en la fase exponencial, se calculan dos valores:
• Umbral: El nivel de intensidad de fluorescencia mínima generada por la reacción
al que se considera fruto de la amplificación específica y no ruido de fondo o
amplificaciones inespecíficas derivadas del exceso inicial de reactivos presentes en la
mezcla de reacción. Debe definirse por encima del ruido de fondo y siempre al principio
de la fase exponencial.
• Ct (Cycle threshold): Es el ciclo de la reacción de qPCR en el que la muestra
alcanza el umbral. Su valor es inversamente proporcional a la cantidad de copias del
ARNm diana iniciales, puesto que cuantas más copias iniciales haya en la muestra
menos ciclos de amplificación se necesitan para alcanzar la intensidad de fluorescencia
umbral y viceversa.
La tecnología fluorescente utilizada también fueron las sondas de hidrólisis
Taqman® MGB (Figura 13). A diferencia de la técnica diseñada para el genotipado, en
esta ocasión sólo existe en la reacción una sonda marcada con el fluoróforo FAM™ en
5’ y con un complejo NFQ-MGB en 3’. Al conjunto de los cebadores específicos para la
amplificación del ARNm en cuestión y la sonda complementaria al centro de este
amplicón, se le conoce como ensayo. Los ensayos fueron seleccionados del panel de
ensayos disponibles en Applied Biosystems en función de los siguientes criterios:
MATERIAL Y MÉTODOS
84
- Que el ensayo amplifique el mayor número de secuencias posibles (RefSeq) del
ARNm en cuestión.
- Un tamaño de amplicón de entre 60 y 90 pb: el límite inferior es prudente a la
hora de asegurar la especificidad de la amplificación y la disponibilidad de suficiente
secuencia para la selección de una sonda que cumpla todas las características buscadas.
El límite superior es debido a la procedencia de nuestras muestras de material FFPE.
Dada la gran degradación a la que ha sido expuesto el ARN de nuestras muestras la
selección de amplicones más largos disminuiría el número de moléculas íntegras para
amplificar.
- Que en el diseño del ensayo la sonda incluya en su secuencia parte de 2 exones.
Esto asegura que no sea posible la detección de la amplificación de ADN genómico.
Los ensayos seleccionados y sus características se recogen en la Tabla 3.
MATERIAL Y MÉTODOS
85
Figura 13: Representación de la reacción de PCR cuantitativa a tiempo real con
sondas de hidrólisis Taqman®. Imagen tomada de “Introduction to Quantitative PCR.
Methods and Applications Guide” Agilent Technologies, 2010. En la fase de
hibridación los cebadores y la sonda hibridan con sus secuencias complementarias.
Durante la fase de polimerización la polimerasa se encuentra con la sonda y escinde
nucleótido a nucleótido para poder continuar con su labor. Como resultado el fluoróforo
se separa del quencher y comienza la emisión de fluorescencia.
MATERIAL Y MÉTODOS
86
GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN
EGFR Hs01076091_m1 NM_005228.3
CCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCC
CGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAA
TTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACA
MED1 Hs01062349_m1 NM_004774.3
TGGTCAGCTGTTTGGAGACATTGCAG
AAGGCTCTCAAAGTAACATCTTTACCA
GCAATGACTGATCGT
FOXA1 Hs00270129_m1 AK313785.1
ACCAGCGACTGGAACAGCTACTACGCA
GACACGCAGGAGGCCTACTCCTCCGTCC
CGGTCAGCAACATGAACTC
IGF1R Hs00951562_m1 NM_000875.3
TGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTC
AAAATCGGAGATTTTGGTATGACGCGA
GATATCTATGAGACAGACTATTACCGG
c-Src Hs01062585_m1 NM_004383.2
GACGAGGAGGTGTACTTTGAGAACCTC
ATGCAGCTGGTGGAGCACTACACCTCA
GACGCAGATGGACTCTGTACGCGC
Tabla 3: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para
la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se indican: el nombre
del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención de la información
referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón comprende la secuencia
incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra molde (5’3’).
MATERIAL Y MÉTODOS
87
GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN
ESR1 Hs01046818_m1 NM_000125.3
CCCAGCTCCTCCTCATCCTC
TCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAA
GGCATGGAGCATCTGTACAG
PUM1 Hs00982765_m1 NM_014676.2
TTTGGACAAGGTCTGGCAGCAGGCA
TGCCAGGTTATCCGGTGTTGGCTCC
TGCTGCTTACTATGACCA
GUSB Hs99999908_m1 NM_000181.3
TCATTTGGAATTTTGCCGATTTCATGAC
TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGGG
GAATAAAAAGGGGATCTTCACTCGGC
Tabla 3 (Continuación): Información sobre los ensayos prediseñados de Applied
Biosystems para la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se
indican: el nombre del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención
de la información referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón
comprende la secuencia incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra
molde (5’3’).
Las qPCR fueron realizadas por duplicado según el Protocolo 8 en un Real Time
PCR System 7500 Fast (Applied Biosystems). Se seleccionaron los genes endógenos
GUSB y PUM1 a partir de la literatura, por su expresión altamente estable en el tejido
mamario tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. El análisis de estos genes
sirve para poder normalizar la expresión de los genes diana, de forma que el resultado se
independiza de variables como la cantidad de ARN total puesto en la reacción, que
podrían llevar a error a la hora de comparar entre distintas muestras.
MATERIAL Y MÉTODOS
88
A pesar de que los ensayos Taqman® de Applied Biosystems están probados y
garantizan una eficiencia del 100%±10%, dada la procedencia de nuestras muestras de
ARN y la gran exposición a la degradación que han sufrido durante el tratamiento
FFPE, se realizó la puesta a punto de los ensayos escogidos (Protocolo 8A). A partir de
mezclar 500 ng de ADNc de 10 muestras de tejido FFPE extraído y retrotranscrito
siguiendo los mismos protocolos se creó una muestra estándar de concentración
conocida que representaba todas las condiciones presentes en nuestras muestras
problema. Se realizaron 6 diluciones seriadas de esta muestra estándar que fueron
analizadas con cada uno de los ensayos. Con los resultados obtenidos se realizaron las
curvas patrón necesarias para el cálculo de la eficiencia de amplificación de los ensayos
seleccionados siguiendo las instrucciones del manual Amplification Efficiency of
Taqman® Gene Expression Assays de Applied Biosystems. La eficiencia de los ensayos
de los genes endógenos y los genes diana fueron similares (con una diferencia inferior al
10%): los valores de R2 para todas las curvas de calibración generadas fueron
superiores a 0,99 y todas las eficiencias de ensayos Taqman® fueron superiores al 90%.
Se cumplieron, por tanto, todas las condiciones exigibles para poder realizar el análisis
según el Método ddCt (User Bulletin #2, Applied Biosystems; (305)). Este método
consiste en una cuantificación relativa de los genes diana (306). El Ct de cada muestra
para el gen diana se normaliza con el Ct de la misma para el gen endógeno, dando como
resultado el valor dCt. En un segundo análisis se enfrentan los dCt de las muestras
problema con el dCt de la muestra de referencia o calibrador, dando como resultado el
valor ddCt. Para obtener el valor de cuantificación relativa (RQ) se debe aplicar este
valor a la fórmula RQ=2^-ddCt, lo que nos da los valores de cambio relativo, medidos
en unidades de fold change (FC).
MATERIAL Y MÉTODOS
89
Se realizaron controles RT-minus para cada ensayo tomando como muestra ADN
humano total comercial (Roche®) para garantizar que no se detectaba la amplificación
de ADN genómico. Se analizó un control negativo de cada serie de retrotranscripciones
realizadas para descartar contaminaciones en este paso. Así mismo se incluyeron otros
controles en cada placa de qPCR:
- controles negativos para cada ensayo para descartar la contaminación de las
mezclas de reacción de qPCR,
- un control positivo tomando como muestra ARN total humano de mama
comercial (Human Breast Total RNA, Ambion®) para descartar que la eficiencia de la
qPCR variase entre placas.
Las muestras sanas fueron evaluadas por separado siguiendo estrictamente los
mismos protocolos que las muestras problema. Una vez comprobado que las diferencias
estadísticas entre ellas no eran significativas, se unieron formando un pool que fue
analizado del mismo modo para obtener los valores de referencia para cada gen,
constituyendo el calibrador en nuestro método ddCt.
Se realizó el análisis de la fluorescencia final generada para cada muestra
mediante el software SDS y en caso de que la desviación estándar obtenida entre los
duplicados fuese mayor de 0,35 se reanalizó la muestra. Se evaluaron los controles de
forma que:
- para los controles negativos sólo se aceptaron resultados de “no amplificación”
(Undeterminate),
MATERIAL Y MÉTODOS
90
- se analizaron los distintos análisis en cada placa del control positivo,
descartándose desviaciones estándar superiores a 1 Ct entre las distintas mediciones de
cada ensayo.
Una vez hechos los experimentos para todas las muestras y el calibrador, y
evaluados todos los controles, se realizó un estudio que incluía todos los experimentos
en el que se establecieron las líneas basales y las fluorescencias umbrales para cada gen.
Los resultados se corrigieron en función de las eficiencias calculadas previamente para
cada ensayo. Se definieron como controles endógenos los genes PUM1 y GUSB y como
muestra de referencia el calibrador. El software corrige las fluorescencias generadas en
función de la eficiencia dada para cada ensayo y aporta un dato de Ct para cada pocillo.
Realiza los cálculos referidos al método ddCt con el Ct medio de los duplicados y
aporta los datos de RQ y un intervalo de confianza del 95% (RQmin-RQmax). Los
datos de RQ se representan en un gráfico de barras tomando la expresión del calibrador
como valor 1 (Figura 14).
Los niveles de RQ expresados en valores de FC, representan el cambio de
expresión sufrido en una muestra patológica frente a los niveles considerados como
fisiológicos (RQ=1FC). De esta forma, se considera que valores de RQ ≤0,5 FC indican
una represión de la transcripción del gen en cuestión, mientras que valores de RQ ≥2FC
indican una sobreexpresión génica. Sin embargo, hay que tener en cuenta que no
siempre estas alteraciones en los niveles de expresión génica, es decir, de transcripción
a ARNm, se ven trasladados al nivel de proteína, ya sea por factores reguladores
postranscripcionales como la acción de los microARNs, por la estabilidad de las
moléculas de ARN, intrínseca a su propia naturaleza y a su secuencia, o por factores
reguladores de la traducción y modificaciones postraduccionales que determinan en
gran medida los valores finales de proteína funcional. En base a estas consideraciones,
MATERIAL Y MÉTODOS
91
las variables moleculares de expresión génica fueron categorizadas como expresión
reprimida (RQ≤0,5FC), similar a la fisiológica (0,5FC<RQ<1,5FC) o sobreexpresión
(RQ≥1,5FC). Estos son los rangos que actualmente se consideran en la práctica de la
genética clínica. Sin embargo, para facilitar el análisis estadístico, en algunos análisis
estas 3 categorías se agruparon en 2, de forma que hablamos de sobreexpresión frente a
normal o reprimido o bien de represión frente a normal o sobreexpresado en función de
las características del gen en cuestión.
Figura 14: Ejemplo de representación gráfica de los niveles de cuantificación
relativa de la expresión génica (RQ del inglés Relative Quantification) generada
mediante el método ddCt. El calibrador de mama normal (CMN) establece el nivel de
expresión normal correspondiéndose con un RQ=1. En comparación con él, se
relativizan las expresiones génicas del resto de muestras (NTC= “not template control”
o control negativo).
MATERIAL Y MÉTODOS
92
2.5.6 Extracción de microARNs
Se extrajeron 2 cilindros de zonas con una celularidad tumoral superior al 30%,
seleccionadas de distintas zonas del tumor incluido en bloques de tejido parafinado en el
caso de las muestras problema y 2 cilindros de bloques de tejido parafinado en el caso
de las muestras sanas de referencia. Los cilindros fueron microdisecados manualmente y
posteriormente procesados con un kit basado en columnas con membranas de sílice que
utiliza una tecnología similar al utilizado para la extracción de ADN y ARN pero está
diseñado especialmente para la extracción de ARN total, es decir, incluidos los pre, pri
y microARNs. Este protocolo incluye una metodología de desparafinación y
homogeneización del tejido alternativa (Protocolo 9).
Una vez extraído, el ARN total fue sometido a bioanálisis con chips Small RNA
Assay en el Bioanalizador 2100 (Agilent Technologies) (Figura 15). Este instrumento
utiliza la tecnología de microfluidos para analizar la calidad y la cantidad de la muestra
de ARN total. El conjunto de moléculas de la muestra se marca con fluoróforos
inespecíficos y se somete a un campo eléctrico en el interior de un sistema de
microcanales rellenos de un polímero específico para su separación. Como resultado las
moléculas que conforman la muestra se separan y se genera un electroforegrama en el
que las moléculas están ordenadas según su tamaño. El sistema analiza en paralelo una
muestra patrón que permite identificar los tamaños de las moléculas de la muestra.
Además, en cada carga se introduce un marcador ligado a un fluoróforo distintivo que
consiste en dos moléculas de tamaños extremos y concentración conocida, permitiendo
calcular la concentración de cada uno de los picos de fluorescencia generados por cada
grupo de moléculas en la muestra (Protocolo 10).
MATERIAL Y MÉTODOS
93
Figura 15: Bioanálisis de microARNs con el Bioanalizador 2100 de Agilent.
Imagen del chip específico para el análisis de microRNAs y electroforegrama de
ejemplo donde se enmarca la zona del electroforegrama correspondiente a los
microARNs.
Los casos en los que la calidad o la cantidad del ARN no fueron suficientes fueron
excluidos del estudio.
2.5.7 Retrotranscripción (RTPCR)
Inmediatamente después de su análisis, las muestras de ARN total fueron
modificadas para que su concentración rondase los 100 ng/μL. Aquellas con una
concentración mayor fueron diluidas. Aquellas con una concentración menor fueron
concentradas en el SpeedVak (60ºC durante 1 hora) y resuspendidas en un volumen de
agua calculado en función de su cantidad total de ng de ARN.
MATERIAL Y MÉTODOS
94
Para el análisis del pri-miR-17~92, se retrotranscribió 1 μg de ARN de cada
muestra con el kit Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen) (Protocolo 7). Una
vez retrotranscrito, el ADNc fue diluido 1:5 para evitar que los componentes de la
reacción de RTPCR mermasen la eficiencia de la reacción de qPCR. El protocolo de
análisis qPCR utilizado fue el mismo que para los ARNm (Protocolo 8).
Para el análisis de los microARNs la RTPCR se realiza con un pool formado por
cebadores específicos para cada uno de los microARNs a concentraciones iguales y el
kit Taqman® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)
(Protocolo 11). Estos cebadores vienen diseñados por Applied Biosystems en relación
con el ensayo que se utiliza para la cuantificación.
2.5.8 Análisis de los niveles de expresión de microARNs por qPCR
La metodología empleada para la cuantificación de los niveles de expresión de los
microARNs fue la misma que se utilizó para los ARNm.
Los ensayos Taqman® para microARNs detectan una nueva diana específica de la
secuencia formada por un bucle derivado del cebador de retrotranscripción (Stem-loop)
para poder amplificar los microARNs maduros a pesar de su corta longitud. El cebador
se extiende en el extremo 3' de la secuencia complementaria al microARN diana para
poder ofrecer una secuencia sobre la que diseñar un ensayo Taqman® tradicional.
Además, esto confiere una ventaja clave de estos ensayos: la detección altamente
específica de los microARNs maduros biológicamente activos (Figura 16). La longitud
del Pri-miR-17~92, sin embargo, permite la retrotranscripción ordinaria con cebadores
al azar y el diseño directo de un ensayo Taqman® tradicional. Los ensayos fueron
seleccionados del panel de ensayos disponibles en Applied Biosystems siguiendo sus
recomendaciones (Tabla 4).
MATERIAL Y MÉTODOS
95
Figura 16: Amplificación y detección de los microARNs maduros. Imagen
tomada de “Product Bulletin: Taqman® MicroRNA Assays” Life Technologies, 2011.
Muestra la estrategia desarrollada para poder amplificar y detectar secuencias de tan
pequeño tamaño como los microARNs maduros. El cebador de RTPCR es
complementario a la secuencia del microARN en su extremo 5’ mientras que en su
extremo 3’ su secuencia se alarga formando un bucle conocido como stem-loop. Tras la
RTPCR específica la secuencia stem-loop es utilizada para poder diseñar el cebador
mientras que la sonda sigue hibridando con la secuencia específica del microARN.
MATERIAL Y MÉTODOS
96
miR Ensayo miRBase Amplicón con Stem-Loop
hsa
-let
-7a
000377 MIMAT0000062
GGGUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
UGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUA
ACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCU
hsa
-miR
-20
6
000510 MIMAT0000462
UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAU
CCCCAUAUGGAUUACUUUGCUAUGGAAUG
UAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG
hsa
-miR
-21
000397 MIMAT0000076
UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGA
UGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGC
AACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA
hsa
-miR
-222
0002097 MIMAT0004569
GCUGCUGGAAGGUGUAGGUACCCUCAA
UGGCUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCUGUC
UUUCGUAAUCAGCAGCUACAUCUGGCUA
CUGGGUCUCUGAUGGCAUCUUCUAGCU
RN
U43
001095 NR_002439 GAACTTATTGACGGGCGGACAGAAAC
TGTGTGCTGATTGTCACGTTCTGATT
U5
4
001210 AB061842 TGGCGATGAGGAGGTACCTATTGTGTTGAGTA
ACGGTGATAATTTTATACGCTATTCTGAGCC
Tabla 4: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems
para la cuantificación de los microARNs estudiados. Se indican: el nombre del ensayo
escogido, la secuencia tomada como referencia para el diseño del ensayo (176-178) y
el amplicón con el stem-loop utilizado para su detección.
MATERIAL Y MÉTODOS
97
miR Ensayo miRBase Amplicón con Stem-Loop
Pri-miR-17~92
Hs0
32
95
90
1_
pri
MI0000071
GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUG
CAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUACUGCAGU
GAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC
Tabla 4 (continuación): Información sobre los ensayos prediseñados de Applied
Biosystems para la cuantificación de los microARNs estudiados. Se indican: el nombre
del ensayo escogido, la secuencia tomada como referencia para el diseño del ensayo
(176-178) y el amplicón con el stem-loop utilizado para su detección.
Se realizaron los mismos estudios y se incluyeron los mismos tipos de controles
que en el caso de los ARNm. Así mismo, el análisis de los resultados fue similar,
basado en el método ddCt.
3. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 15 y la significación
estadística se estableció cuando p<0,05. Los análisis estadísticos se repitieron en
función del fenotipo y de la detección de mutaciones en el gen PI3K.
3.1 Etapa I: Estudios descriptivos
3.1.1 Variables clínico-patológicas
Se realizó una descripción fenotípica de la población en función de las variables
clínico-patológicas. Para describir las variables cualitativas se utilizaron las frecuencias
relativas en porcentajes. Para las cuantitativas se realizó el Test de Kolmogorov–
Smirnov para conocer su distribución. La edad y el tamaño tumoral, así como las
variables inmunohistoquímicas resultaron ser no paramétricas por lo que para
MATERIAL Y MÉTODOS
98
describirlas se utilizaron las medianas y los percentiles 25 y 75. Una vez categorizadas
en función del criterio establecido para cada una de ellas, se utilizaron sus frecuencias
relativas en porcentajes.
3.1.2 Variables moleculares
Para describir la existencia de mutaciones en el gen PI3K se utilizó la frecuencia
relativa en porcentajes.
Se realizó el Test de Kolmogorov–Smirnov para conocer la distribución de las
variables moleculares cuantitativas. Todas resultaron ser no paramétricas, por lo que se
describieron con la mediana y los percentiles 25 y 75. Una vez categorizadas en
expresión reprimida, normal o sobreexpresada se utilizaron las frecuencias relativas en
porcentajes.
3.2 Etapa II: Estudio de asociación entre variables:
- Se analizó la existencia de asociaciones entre las variables patológicas y las
variables moleculares con los test U. de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis en función de
las categorías de la variable patológica.
- Para los estudios de asociación entre las variables moleculares entre ellas
mismas y frente a las variables clínico-patológicas cuantitativas, se utilizó la
Correlación de Spearman.
- Se estratificaron las variables cuantitativas en variables cualitativas tal y como se
ha descrito anteriormente. Las asociaciones de las variables moleculares categorizadas
entre ellas mismas y con el resto de variables clínico-patológicas se analizaron mediante
tablas de contingencia. Se leyó la prueba de Chi cuadrado de Pearson o el Test Exacto
de Fisher (en caso de que el número total de casos fuese menor de 20 o la frecuencia
MATERIAL Y MÉTODOS
99
mínima esperada menor de 5). También se obtuvo, siempre que el número de categorías
lo permitió, la odds ratio y su intervalo de confianza del 95%.
3.3 Etapa III: Estudios de supervivencia
- Se estudió la reaparición de la enfermedad (recidiva y/o metástasis) y su
asociación a las variables clínico-patológicas y moleculares, en la serie completa y en
función del subtipo, con tablas de contingencia o los test de Mann-Whitney y Kruskal-
Wallis siguiendo los criterios de las Etapas I y II.
- Para determinar el valor pronóstico de cada una de las variables con respecto a la
SLE y la SG se realizó un estudio univariado aplicándose el método de Kaplan-Meier,
siendo las diferencias entre las curvas evaluadas con el test log-rank. Se obtuvo el riesgo
o Hazard Ratio con la Regresión de Cox.
- Con los resultados significativos que cumplieron los criterios de factor de
confusión se realizó el análisis multivariante con el modelo de regresión de Cox.
- Para evaluar la influencia del tiempo de seguimiento sobre los resultados, se
repitieron los análisis de SLE con tiempo de seguimiento máximo de 60 meses y con un
tiempo de seguimiento máximo de 185 meses. El corte de 60 meses de tiempo de
seguimiento ha sido seleccionado por ser el corte destacado en los paneles moleculares
con valor pronóstico en la “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference”
(29).
APÉNDICE: Protocolos
100
Protocolo 1:
Recuperación de tejido parafinado
1. Volcar los cilindros en la tapa del Éppendorf y cortar muy fino con bisturí.
Devolver al mismo Éppendorf.
2. Desparafinación:
1. Añadir 900 μL de xilol (extracción de la parafina).Vórtex.
2. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb
3. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
4. Añadir 900 μL de xilol (extracción de la parafina).Vórtex.
5. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb
6. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
7. Añadir 900 μL etanol absoluto (extracción del xilol residual).Vórtex.
8. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb
9. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
10. Añadir 900 μL de etanol absoluto (extracción del xilol residual).Vórtex.
11. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb
12. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
13. Incubar con el tubo abierto a 37ºC; 10-15min hasta secar.
Protocolo 2:
Disgregación y homogenización del tejido tumoral
1. Resuspender el pellet en 180 μL de Buffer ATL del kit de Qiagen.
2. Añadir 20-30 μL de PROTEINASA K (10 mg/ml) en función de la cantidad y el
grado de disgregación del tejido. Vórtex y pulso. Comprobar que los volúmenes
de todos los tubos son iguales.
3. Incubar a 56ºC durante toda la noche en agitación a 900 rpm.
4. Si es necesario por la mañana añadir otros 10-20 μL de Proteinasa K e incubar
hasta que NO se observen restos de tejido).
Protocolo 3:
Extracción de ADN con kit de Qiagen.
1. RECUPERACIÓN: Incubar durante 1h a 90ºC.
2. PREPARACIÓN: Añadir 200 μL de Buffer AL. Vórtex. Incubar 70ºC; 10 min.
3. Añadir 200 μL de Etanol Absoluto. Vórtex. Importante: Siempre hay que
mantener los volúmenes de AL y etanol iguales, si no es así, no se precipitará
bien el ADN y se perderá.
4. UNIÓN A MEMBRANA: Transferir la muestra a la columna (previamente
numerada). En el tubo poner nombre de la muestra y TP (Tubo de
Precipitación).Centrifugar: 8000 rpm; 1 min.
5. LAVADOS: Transferir la columna a un tubo nuevo marcado. Guardar el tubo de
precipitación en nevera hasta comprobar que la extracción ha sido satisfactoria.
Añadir 500 μL de Buffer AW1. Centrifugar: 8000 rpm; 1 min.
6. Desechar el eluido y secar un poco el tubo porque lo reutilizamos. Añadir 500
μL de Buffer AW2. Centrifugar: 14000 rpm; 3 min.
APÉNDICE: Protocolos
101
7. ELUCIÓN: Desechar el eluido y cambiar a un tubo lo-bind de 1.5mL (rotulado).
Añadir 200 μL de Agua GBM. Incubar Tª ambiente 10 min. Centrifugar: 9000
rpm; 3 min; ¡Con tapa hacia centro del rotor! Desechar columna y almacenar
los Éppendorf rotulados a –20ºC.
Nota: Antes de usar por primera vez los Buffers AW1 y AW2 se tienen que añadir 30
mL de EtOH 100% y homogeneizar porque vienen concentrados. Marcar fecha de
reconstitución.
Una vez extraído, el ADN debe cuantificarse en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific).
Se recogerán los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260. Una
vez comprobada la extracción de ADN se tirarán los tubos de lisis y los de
precipitación. Las cubetas se lavarán en lejía y en agua destilada, se dejarán secar y se
guardarán.
Los ADN cuantificados deben homogeneizarse en concentración a un rango de 60-120
ng/µL para asegurar que las eficiencias en el análisis posterior sean similares entre las
distintas muestras. Para ello se establecen 3 vías posibles:
- cuando la concentración es mayor de 120 ng/µL se diluirá a una concentración de 100
ng/µL.
- cuando la concentración es menor de 60 ng/µL se evaporará hasta conseguir una
concentración de 100 ng/µL.
- cuando la concentración esté entre 10 y 60 ng/µL se preamplificará con el kit RepliG
FFPE de Qiagen (Protocolo 4).
Protocolo 4:
Preamplificación del genoma completo con kit RepliG FFPE de Qiagen.
Son necesarios mínimo10 ng de ADN genómico aunque si la calidad del ADN es buena
puede hacerse a partir de 1 ng.
Antes de empezar:
- Descongelar los reactivos a Tª ambiente excepto la polimerasa (a 0ºC).
- Hacer cálculos para:
o Buffer N1 (cantidades para 15 o 7 reacciones)
Stop Solution 8μL
H2O 72μL
o Buffer D1 (cantidades para 15 o 7 reacciones)
Buffer DLB 5μL
H2O 35μL
o Mix (en función de la cantidad de ADN molde)
o Mix de ligación
- Numerar Éppendorf de 0.2 mL.
- Reconstituir buffer DLB añadiéndole 500 μL de H2O de GBM.
- Vórtex y pulso a todos los reactivos.
- Poner el termomixer a 30ºC.
- Preparar los Buffers D1 y N1.
APÉNDICE: Protocolos
102
- Preparar el mix de ligación con: tampón de ligación, ligasa y enzima FFPE en
ratio 1/1/8 y por este orden, calculando para el número de muestras.
NOTA cada 10 μL de ADN necesitarán otros 10 μL de mix de ligación.
- LIGACIÓN: incubar a 24ºC durante 30 minutos. Parar la reacción
incubando a 95ºC durante 5 minutos y enfriar en hielo.
En función de la cantidad de ADN de la que vas a partir las cantidades serán las de la
columna de la izquierda o la de la derecha:
1. Añadir 2.5μL del ADN molde muy
bien homogeneizado por vórtex.
1. Añadir 5μL del ADN molde muy
bien homogeneizado por vórtex.
2. Añadir 2.5μL del buffer D1.
Vórtex y pulso.
2. Añadir 2.5μL del buffer D1.
Vórtex y pulso.
3. Incubar 3 minutos a Tª ambiente 3. Incubar 3 minutos a Tª ambiente
4. Añadir 5μL del buffer N1. Vórtex
y pulso.
5. Preparar el MIX:
N= reacciones + 0.5
Buffer Repli-g Midi Reaction 29μL
H2O 10μL
Polimerasa 1μL
6. Añadir 40 μL Mix
7. Incubar a 30ºC de 8 a 16 h
4. Añadir 10μL del buffer N1. Vórtex
y pulso.
5. Preparar el MIX:
N= reacciones + 0.5
Buffer Repli-g Midi Reaction 29μL
Polimerasa 1μL
6. Añadir 30 μL Mix
7. Incubar a 30ºC de 8 a 16 h
8. Sacar las muestras y subir la Tª 65ºC. Cuando la alcance incubar durante 3
minutos. Almacenar a -20ºC
NOTAS:
Es muy importante apuntar las fechas de reconstitución y preparación de buffers porque:
D1 y N1 pueden usarse hasta 3 meses tras su preparación.
Buffer DLB puede usarse hasta 6 meses tras reconstituirlo.
Una vez preamplificado el ADN deberá ser de nuevo analizado en el Nanodrop y su
concentración será ajustada a un rango de 60-120 ng/µL.
Protocolo 5
Genotipado por PCR cuantitativa con sondas de hidrólisis
- Las sondas de hidrólisis se ajustarán a 100 µM y los cebadores se ajustarán a 10
nmoles.
- Se prepara un master-mix en función del número de muestras (n), teniendo en cuenta
que la n estará compuesta por:
- las muestras problema,
- 1 control negativo (sólo mix),
- 1 control heterocigoto positivo (de una mezcla de muestras que ya se sabe que
están mutadas),
APÉNDICE: Protocolos
103
- 1 control homozigoto silvestre (ADN total humano de Roche);
Se tendrá en cuenta que siempre se realizará por duplicado (N= nx2).
TaqMan® Genotyping Master Mix (Applied Biosystemns) 10 µL
Primer Forward (10mM) 1.8 µL
Primer Reverse (10mM) 1.8 µL
Sonda silvestre (VIC) (100 µM) 0.5 µL
Sonda mutada (FAM) (100 µM) 0.5 µL
H2O - GBM 1.4 µL
- Una vez preparado se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de
centrífuga.
- Se reparten 16 µL de master-mix por cada pocillo de 0,1 mL de la placa de 96.
- Se añade el ADN correspondiente a cada pocillo:
ADN ajustado 60-120 ng/µL 4 µL
____________
Volumen total de reacción = 20 µL
Aunque el genotipado con sondas de hidrólisis TaqMan necesita únicamente 10 ng de
ADN para asegurar eficiencias máximas, como se trata de muestras FFPE, tenemos que
tener en cuenta que gran parte del ADN no será productivo porque estará dañado. Así
que tras realizar la puesta a punto correspondiente se observó que una concentración
mínima de 60 y máxima de 120 ng/µL garantizaba una eficiencia de la reacción máxima
con este tipo de muestras, puesto que aportaba suficiente ADN molde productivo. Para
la puesta a punto se siguieron las indicaciones de ADN “Genotyping from Human FFPE
Samples, Reliable and Reproducible” de Applied Bosystems.
- Se tapa la placa con una cubierta óptica y se le da un pulso de centrífuga. Se introduce
en el 7500fast Real Time PCR System de AB.
- Se programa el análisis (7500 Software v 2.0.5): se selecciona 7500Fast, Genotyping,
Taqman, Standard. Se registra la placa tal cual se ha preparado, asignando a cada
pocillo el número de muestra problema o si es control negativo, control heterocigoto o
control homozigoto silvestre. En el run-method, se comprueba que el volumen final es
20 µL y se programa:
Pre-PCR read 1 minuto 60ºC
Desnaturalización 10 minutos 95ºC
Amplificación 45 ciclos x 15´´ a 92º
90´´ a 60º
Post-PCR read 1 minuto 60ºC
En los experimentos de genotipado, que son a punto final, la diferencia en la
fluorescencia generada por el fluoróforo se calcula entre la lectura pre-PCR y la lectura
post-PCR. Así pues, ΔRn se calcula como:
ΔRn = Rn (lectura post-PCR) - Rn (lectura pre-PCR),
Dónde Rn = fluorescencia generada por cada fluoróforo normalizado con ROX.
APÉNDICE: Protocolos
104
Protocolo 6
Extracción de ARN desde cilindros FFPE con kit de Qiagen
Preparación:
Preparar todos los reactivos, gradillas, tubos… que se van a usar.
Preparar los bastones de digestión mecánica si no lo están:
Limpiarlos con etOH70%.
Incubar con ARNasa-Away durante al menos 30 minutos.
Enjuagar con H2O-GBM y EtOH100%-ARN. Dejar secar.
Limpiar todo el material y las superficies que vayan a estar en contacto con las muestras
con etanol 70%. Ponerlo en tratamiento con ARNasa Away durante al menos 30
minutos.
Comprobar que el reactivo RPE está reconstituido. Si no lo está, añadir 44 mL de Etanol
absoluto por cada 11 mL de RPE.
Poner el termomixer a 55ºC y el termobloque a 80ºC.
1.- Desparafinación:
14. Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Rascar la gradilla
con precaución de que el tubo no se abra.
15. Centrifugar: 2min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
16. Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Rascar la gradilla
con precaución de que el tubo no se abra.
17. Centrifugar: 5min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
18. Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la
gradilla con precaución de que el tubo no se abra.
19. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
20. Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la
gradilla con precaución de que el tubo no se abra.
21. Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
22. Dar un pulso y repasar con pipeta el sobrenadante que pueda quedar.
23. Dejar secar con el tubo abierto dentro de la campana.
2.- Homogeneización del tejido:
24. Traspasar los cilindros de tejido a epp libres de ARNasas previamente
identificados.
25. (Uno a uno) sumergir en el N2 sujetándolo por la tapa abierta hasta que
deje de hervir.
26. Machacar el tejido congelado con uno de los bastones hasta disgregar lo
máximo el tejido. Si es necesario, volver a congelar cuantas veces se
necesite conforme se vaya descongelando por el rozamiento.
27. Repetir el proceso con cada caso.
28. Resuspender el pellet disgregado en 150μL de Buffer PKB.
29. Añadir 30μL de PROTEINASA K (10 mg/ml) homogeneizada por
inversión y mezclar por pipeteo.
30. Dar un pulso e incubar a 55ºC en agitación a 900 rpm en el termomixer.
El tiempo de incubación variará en función de la cantidad y el grado de
disgregación del tejido entre 30 minutos y toda la noche. Si es necesario
se puede añadir otros 20-30μL de Proteinasa K. En cualquier caso
siempre se tendrá que incubar hasta que NO se observen restos de tejido.
APÉNDICE: Protocolos
105
31. Incubar durante 15 minutos exactos a 80ºC sin cambio gradual de Tª
(para revertir los entrecruzamientos provocados por la fijación con
formalina).
3.- Extracción y Purificación:
Preparar e identificar las columnas y los tubos del kit necesarios.
Dar un pulso. Añadir 320μL de Buffer RBC y mezclar muy bien por
pipeteo. Transferir todo a la columna azul.
Centrifugar durante 30 segundos a más de 10000 rpm.
Descartar el filtro.
Añadir 720μL de etOH100%-ARN y mezclar muy bien por pipeteo.
Transferir inmediatamente 700μL de la muestra a la columna rosa. Si se ha
formado algún tipo de precipitado también debe transferirse.
Cerrar rápidamente la columna y centrifugar durante 15 segundos a más de
10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar lo que sea posible el tubo.
Transferir el resto de la muestra y repetir la operación.
1º Lavado: añadir 500μL de Buffer RPE. Cerrar rápidamente y centrifugar a
más de 10000 rpm durante 15 segundos. Desechar el eluido y limpiar el
tubo lo que sea posible.
2º Lavado: añadir 500μL de Buffer RPE. Cerrar rápidamente y centrifugar a
más de 10000 rpm durante 2 minutos. Desechar el eluido y limpiar el tubo
lo que sea posible.
Desechar el tubo y pasar la columna a uno nuevo. Con la columna abierta,
centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima. Colocar las tapas en
sentido contrario a la del giro del rotor para evitar que se rompan.
o ¡¡Es muy importante que durante los lavados el filtro de la
columna no toque jamás el eluido!!
4.- Elución:
Identificar los Éppendorf de elución del kit y pipetear en el fondo 2,5μL de
Inhibidor de ARNasas 20U/μL.
Traspasar las columnas y añadir en el centro de la membrana 24,5μL de agua de
GBM. Incubar durante 15 minutos a TA.
Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto.
El volumen muerto de la columna es de 2μL, por lo que eluirán
22,5, que añadidos al Inhibidor harán un volumen total de 25μL.
Cuantificamos el ARN en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Se recogerán
los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260.
Si no se va a realizar inmediatamente la retrotranscripción se almacenarán las
muestras a –80ºC.
APÉNDICE: Protocolos
106
Protocolo 7
Retrotranscripción de ARN con Quantitect Reverse transcription Kit de Qiagen
Este protocolo incluye un paso de eliminación del ADN genómico. Todo el proceso se
realizará en hielo.
- se calcula la cantidad necesaria de cada muestra para obtener 1 µg de ARN y se pasa a
tubos Éppendorf de 0,2 µL rotulados previamente. Se completa el volumen de ARN con
H2O-GBM hasta 12 µL en función de cada caso. Añadimos 2 µL de gDNA wipeout
Buffer 7x a cada tubo. Incubamos a 42ºC durante 2 minutos exactos y pasamos a hielo
inmediatamente para cortar la reacción.
- En función del número de muestras, que se calculará teniendo en cuenta el número de
muestras problema, las mamas normales que formarán el calibrador, más un control
negativo y un control de ARN de mama comercial, se prepara el master-mix:
Buffer de retrotranscripción 5x 4 µL
RT primer mix (con oligonucleótidos cebadores) 1 µL
Transcriptasa 1 µL
- Se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de centrífuga. Se reparten 6
µL de master-mix por tubo de retrotranscripción (lo que suponen 20 µL totales).
- Termociclado: Retrotranscripción 15 minutos 42ºC
Parado de la reacción 3 minutos 95ºC
Para disminuir la concentración de los reactivos excedentes de la reacción de
retrotranscripción y que éstos no interfieran en la reacción de qPCR, se diluyen los
ADNcopia (ADNc) 1:5 (80 µL de H2O-GBM), con lo que obtenemos de cada muestra
retrotranscrita 100 µL finales con una concentración de ADNc de 10 ng/µL. Los ADNc
se almacenan a -20ºC hasta su cuantificación.
Protocolo 8
Cuantificación de la expresión génica por qPCR a tiempo real con sondas Taqman
Protocolo 8A.-Puesta a punto de un estudio de expresión
Selección de los ensayos para los genes de interés:
TaqMan® Gene Expression Assays https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=601267
AB diseña distintos ensayos a lo largo de todo el gen y el investigador decide cual es el
que le interesa teniendo en cuenta que queremos amplificar ADNc y no ADNg. Por
tanto, hay que seleccionar el ensayo en función de:
- Los exones que codifique.
- Procurar que codifique parte de 1 exón y parte del contiguo para evitar que hibride el
ADNg.
APÉNDICE: Protocolos
107
- Estudiar los posibles genes homólogos y/o pseudogenes para evitar la amplificación de
sus secuencias que puedan falsear los resultados dando falsos positivos.
- El tamaño del amplicón: debe estar entre 60–100 pb, preferentemente entre 60-80 pb si
trabajamos con tejido FFPE, pues su ARNm estará mucho más dañado.
Estudiar la bibliografía relacionada para escoger al menos 2 endógenos o
realizar una placa de endógenos de AB para seleccionar los más estables en nuestras
muestras. Buscar los ensayos para éstos:
TaqMan® Endogenous Controls https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602765
Para comprobar que los endógenos son estables en las muestras haremos un estudio de
estabilidad:
- cuantificaremos unas 5 muestras en el Bioanalizador.
- haremos diluciones para llevar todas las muestras a la misma concentración.
- Q-PCR Los Ct deben ser los mismos para todas las muestras.
Para escoger el endógeno al que finalmente referiremos los resultados debemos
controlar:
- que la correlación entre todos los endógenos sea buena (Rango de Correlación de
Spearman: r ≈1 con p<0.5)
- que es estable en nuestras muestras
- que la diferencia de Cts entre el endógeno y el gen diana no sea muy grande para
asegurar que la eficiencia de la reacción es similar entre ellos.
- que cumpla los criterios de eficiencia de la QPCR (Bulletin 2, AB: Apéndice 1).
Controles:
Controles comerciales: es aconsejable poner como mínimo 2. Pueden ser del mismo
tejido en estudio (1 patológico y otro normal) o bien de otros tejidos. Nos sirven para
valorar la eficacia de la RT-PCR y de la Q-PCR. Su dCt no debe variar más de dCt ±
0.2 desv. Deben incluirse en todas las RT-PCR en una concentración de máximo 10
ng/µL, así como en todas las placas, para valorar las diferencias de eficacia de un
análisis a otro. Si no cumplen los criterios no se podrán validar los resultados de las
muestras vinculadas a esa RT/QPCR.
Control negativo de la RT-PCR (RTC-): para valorar contaminaciones durante la RT-
PCR. Debe hacerse con cada nueva RT-PCR y analizarse al menos una vez en QPCR
(mix + C-). Si da positivo no pueden validarse los resultados de ninguna muestra de esa
tanda de RT-PCR.
Control negativo de la qPCR o “No Template Control” (NTC): para valorar
contaminaciones en el mix de Q-PCR. Debe estar en todas las placas. Sólo contendrá
mix de qPCR y agua.
RT minus: para asegurar que las sondas no hibridan con DNA genómico. Consiste en
analizar en las primeras placas muestras de RNA sin pasar por la retrotranscripción. El
resultado debe ser negativo preferiblemente, si no es así indica que el/ ensayo está
APÉNDICE: Protocolos
108
detectando ADNg. Se acepta hasta un 5% de ADNg detectado porque se entiende que
no afecta al resultado final de expresión.
Elección del calibrador:
El calibrador es el valor de referencia a la hora de valorar los resultados. Puede ser un
RNA comercial o bien RNA extraído a partir de muestras propias, debe escogerse en
función del interés.
En caso de muestras propias el calibrador puede ser:
- un pool de muestras sanas que servirán de referencia a todas las muestras
tumorales.
- De cada paciente se toma la muestra tumoral (problema) y muestra sana
(calibrador individual) que puede ser tejido adyacente al tumor o no.
En caso de elegir el pool de muestras sanas debemos primero analizar las muestras por
separado para asegurarnos que no son demasiado discordantes. Una vez hecho esto las
mezclaremos a partes iguales y analizaremos el pool para comprobar que los resultados
prácticos no varían demasiado con respecto a la media aritmética de los dCt
individuales.
Valoración de la reproducibilidad de la Q-PCR:
Diluimos los controles con un Fd = 1/100 y los analizamos en tres placas distintas. Las
desviaciones de las tres medidas de cada control y de cada control diluido 1/100 no
deben ser >0,33.
Estudio de eficacia de la qPCR y cumplimiento de los criterios de uso del
método ddCt:
Para asegurar la eficiencia de nuestros ensayos hacemos una placa con diluciones de un
control comercial, la concentración de la disolución madre debe ser de ≈10 ng/µL. Lo
ideal es hacer unas 8 diluciones con Fd ¼ y otras 2 con Fd 1/100.
(Utilizar el archivo Excel Puesta a Punto Estudio de Expresión que está en la carpeta
“Protocolos” del directorio de la Unidad de Investigación)
1º) Rellenamos la tabla de Excel para eficiencia y hacemos la recta.
Se debe cumplir que la pendiente del endógeno y del target IGF1R sean aproximadas,
con una desviación típica <0.1. Esto indica que las eficiencias para E y T son similares
y por lo tanto puede llevarse a cabo el estudio de la eficiencia relativa.
2º) Rellenamos la tabla de Excel para eficiencia relativa y hacemos la recta.
Se debe cumplir que la pendiente de la Eficiencia Relativa debe ser menor de 0,1,
validando el experimento para poder utilizar el método del ΔΔCt.
APÉNDICE: Protocolos
109
Protocolo 8B.- Protocolo de qPCR
Antes de comenzar el estudio deben hacerse los cálculos de material necesario.
Para igualar al máximo posible las condiciones de estudio entre las distintas muestras,
todos los reactivos de la qPCR se homogeneizarán entre los del mismo tipo pero distinto
kit y se alicuotarán. Esto evitará variaciones en la qPCR por cambios en los kits.
Además se hará un mix general por cada ensayo para todo el estudio a ser posible. Los
mix se prepararán en la campana con la luz apagada. Deberán almacenarse en oscuridad
y a 4ºC correctamente identificados y con la fecha de preparación. Todos los reactivos
deben atemperarse previamente, homogeneizarse y dar un spin a los ensayos. La
proporción por muestra es, para un volumen final de 12 µL, en principio:
TaqMan Gene Expression Master Mix 2X 6,25 µL
TaqMan Assay 20X 0,625 µL
H2O-GBM 3,125 µL
Añadiremos de 2 µL del ADNc obtenido de la RT-PCR (20 ng totales).
Cada placa tendrá que llevar:
- Controles + comerciales,
- Calibrador (pool),
- Controles - : NTC y cuando corresponda, el RTC-,
- Muestras problema.
Se analizarán en la misma placa tanto los endógenos como los genes diana. Todos ellos
se harán por duplicado.
Protocolo 9
Extracción de ARN total con el RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit de
Ambion
Preparación:
Preparar los bastones de digestión mecánica si no lo están:
Limpiarlos con etOH70%.
Incubar con ARNasaAway durante al menos 30 minutos.
Enjuagar con H2O-GBM y EtOH100%-ARN. Dejar secar.
Preparar y limpiar todos los reactivos, gradillas, tubos… que se van a usar: limpiar todo
el material y las superficies que vayan a estar en contacto con las muestras con etanol
70%. Ponerlo en tratamiento con ARNasa Away durante al menos 30 minutos.
Comprobar que los reactivos de lavado están reconstituidos.
Preparar mezcla de Isolation Additive y EtOH100%RNA: 240 μL de Isolation Additive
y 550 μL de EtOH100%RNA por cada muestra.
Preparar mezcla de tratamiento DNasa: 6 μL de DNase Buffer 10X, 4 μL de DNase y 50
μL de H2O-GBM por muestra.
Poner el termomixer a 50ºC y el termobloque a 80ºC.
APÉNDICE: Protocolos
110
1. Volcar los cilindros en la tapa del Éppendorf y cortar muy fino con
bisturí. Devolver al mismo Éppendorf. Traspasar los cilindros de tejido a
epp libres de ARNasas previamente identificados. Uno a uno sumergir en
el N2 sujetándolo por la tapa abierta hasta que deje de hervir. Machacar
el tejido congelado con uno de los bastones hasta disgregar lo máximo el
tejido. Si es necesario, volver a congelar cuantas veces se necesite
conforme se vaya descongelando por el rozamiento. Repetir el proceso
con cada caso.
2. Desparafinación:
Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Incubar a 50ºC durante 3
min.
Centrifugar: 2 min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
Añadir 1mL de xilol-ARN (extracción de la parafina). Incubar a 50ºC durante 3
min.
Centrifugar: 2min; Vmáx; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la gradilla
con precaución de que el tubo no se abra.
Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
Añadir 1mL etOH100%-ARN (extracción del xilol residual). Rascar la gradilla
con precaución de que el tubo no se abra.
Centrifugar: Vmáx; 5min; Tª amb. Desechar el sobrenadante por pipeteo.
Secar en Speed-Vac (limpio y tratado) con tubo abierto a 40ºC durante 40
minutos.
3. Homogenización del tejido:
Añadir 200 μL de buffer de digestión y 4 μL de Proteasa del kit homogeneizada
por inversión.
Hacemos pasar el tejido en homogenización por aguja de insulina las veces
necesarias hasta que no se detecten grumos de tejido.
Dar un pulso e incubar a 50ºC durante 15 minutos. El tiempo de incubación
variará en función de la cantidad y el grado de disgregación del tejido. Podemos
añadir otros 4 μL de Proteasa del kit homogeneizada por inversión, volver a
pasar por aguja de insulina e incubar otros 15 minutos aquellas muestras que no
alcancen la homogeneización requerida. NO deben observarse restos de tejido al
finalizar esta etapa.
Incubar a 80ºC durante otros 15 minutos máximo nos ayudará a revertir
los entrecruzamientos provocados por la fijación con formalina.
4. Extracción y Purificación:
Preparar e identificar las columnas y los tubos del kit necesarios.
Dar un pulso a las muestras homogenizadas. Añadir 480μL de la mezcla de
Isolation Additive+EtOH100% y mezclar muy bien con vórtex.
Añadir 1100μL de EtOH100%-ARN y mezclar muy bien con vórtex.
Transferir inmediatamente 700μL de la muestra a la columna. Si se ha formado
algún tipo de precipitado también debe transferirse.
Cerrar rápidamente la columna y centrifugar durante 30 segundos a 10000 rpm.
Desechar el eluido y limpiar lo que sea posible el tubo.
APÉNDICE: Protocolos
111
Transferir el resto de la muestra y repetir la operación.
1º Lavado: añadir 700μL de Buffer de lavado BW1. Cerrar rápidamente y
centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que
sea posible.
2º Lavado: añadir 500μL de Buffer de lavado BW2. Cerrar rápidamente y
centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que
sea posible.
Desechar el tubo y pasar la columna a uno nuevo. Añadir DNasa mix e incubar
durante 30 minutos.
1º Lavado: añadir 700μL de Buffer de lavado BW1. Cerrar rápidamente y
centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que
sea posible.
2º Lavado: añadir 500μL de Buffer de lavado BW2. Cerrar rápidamente y
centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que
sea posible.
3º Lavado: añadir 500μL de Buffer de lavado BW2. Cerrar rápidamente y
centrifugar 30 segundos a 10000 rpm. Desechar el eluido y limpiar el tubo lo que
sea posible.
Con la columna abierta, centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima.
Colocar las tapas en sentido contrario a la del giro del rotor para evitar que se
rompan.
o ¡¡Es muy importante que durante los lavados el filtro de la columna no
toque jamás el eluido!!
5. Elución:
Identificar los Éppendorf de elución del kit y pipetear en el fondo 3 μL de
Inhibidor de ARNasas 20U/μL.
Traspasar las columnas y añadir en el centro de la membrana 30 μL de Elution
solution. Incubar 1 minuto a Tª amb.
Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto.
Añadir en el centro de la membrana otros 30 μL de Elution solution. Incubar 1
minuto a Tª amb.
Centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto.
El volumen muerto de la columna es de 2μL, por lo que eluirán 28 μL
cada vez, que añadidos al Inhibidor harán un volumen total de 59 μL.
Cuantificamos el ARN en el Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Se recogerán
los datos de concentración (ng/µL) y los ratios 280/260 y 230/260.
Si no se va a realizar inmediatamente el bioanálisis y la retrotranscripción se
almacenarán las muestras a –80ºC.
APÉNDICE: Protocolos
112
Protocolo 10
Bioanálisis de microARNs
Consideraciones previas:
- Todos los reactivos deben conservarse a 4º, sino se degradan.
- Proteger los reactivos que lleven dye de la luz.
- Sacar los reactivos de la nevera 30´antes.
- Proteger mixes con dye de la luz.
- Insertar pipeta al fondo del pocillo.
- Usar nueva jeringa y limpiador de electrodos en cada kit. Cambiar el sello de la base
específico para miRNAs.
- Colocar la base en C y el émbolo de la jeringa en la posición más baja.
- Poner chips a analizar siempre dentro de los 5 min posteriores a su preparación.
- No tocar el Bioanalizador mientras está analizando.
Preparar el Gel-Dye Mix.
1- Permitir que el gel dye y el matrix gel se equilibren a Tª ambiente.
2- Pasar el matrix gel por el filtro: centrifugar a 12000 rpm durante 15 minutos.
3- Vórtex de 10’’ a gel dye y pulso de centrífuga.
4- En un Éppendorf de 0,5 mL, mezclar 2 μL de gel dye por cada 40 μL de matrix
gel.
5- Mezclar por inversión y chasquear hasta que esté totalmente homogéneo.
6- Centrifugar 10´ a 12000 rpm y al sacarlo protegerlo de la luz.
Preparar CHIP
1- El gel ya preparado se saca 30’ antes de su uso.
2- Añadimos 9 μL de gel en G grande.
3- Presionar jeringuilla hasta que haga clic.
4- Esperar 1’ exacto.
5- Llevar jeringa hasta 1 ml.
6- Abrir CHIP y poner 9 μL en pocillo de ambas G pequeñas.
7- Pipetear 9 µl de Small RNA Condition (blanco) en el pocillo CS.
8- Pipetear 5 µl de marcador (verde) en 11 muestras y ladder. No dejar ningún
pocillo vacio.
9- Pipetear 1 µl de Small RNA ladder (amarillo) en escalera.
10- Pipetear 1 µl de cada muestra de RNA total o agua.
11- Vórtex 1’ exacto (2400 rpm).
12- Poner CHIP en Bioanalizador, seleccionar el kit Small RNA y Start Run.
APÉNDICE: Protocolos
113
Protocolo 11
Retrotrancripción de los microARNs
Todo el proceso se realizará en hielo. Atemperar los reactivos y las muestras en hielo.
- Se prepara el pool de cebadores RT de cada miRNA. Este primer específico viene
junto con el ensayo TaqMan de cada miRNA. Para preparar 1 mL de pool a 1x de cada
primer, añadimos 10 µL de cada primer homogeneizado y el resto de buffer TE hasta
los 1000 µL.
- se calcula la cantidad necesaria de cada muestra para obtener 1 µg de ARN total y se
pasa a tubos Éppendorf de 0,2 µL rotulados previamente. Se completa el volumen de
ARN con H2O-GBM hasta 3 µL en función de cada caso.
- En función del número de muestras, que se calculará teniendo en cuenta el número de
muestras problema, las mamas normales que formarán el calibrador, más un control
negativo y un control de ARN TOTAL de mama comercial, se prepara el master-mix:
RT Primer pool 6 µL
Buffer de retrotranscripción 1,5 µL
dNTPs 0,3 µL
H2O-GBM 1,2 µL
Transcriptasa 3 µL
- Se mezcla el master-mix por inversión y se le da un pulso de centrífuga. Se reparten 12
µL de master-mix por tubo de retrotranscripción (lo que suponen 15 µL totales).
- Termociclado: Activación de la RTasa 30 minutos 16ºC
Retrotranscripción 30 minutos 42ºC
Parado de la reacción 5 minutos 85ºC hielo
Para disminuir la concentración de los reactivos excedentes de la reacción de
retrotranscripción y que éstos no interfieran en la reacción de qPCR, se diluyen los
ADNcopia (ADNc) 1:5 (60 µL de H2O-GBM), con lo que obtenemos de cada muestra
retrotranscrita 75 µL finales con una concentración de ADNc de 13,3 ng/µL que
podremos traducir a miRNAs en función del resultado del bioanálisis. Los ADNc se
almacenan a -20ºC hasta su cuantificación.
114
RESULTADOS
115
RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS
La serie estudiada incluye 220 tumores de mama no consecutivos, que cumplían
los criterios de inclusión y exclusión y cuyos datos de seguimiento clínico fueron
recogidos hasta el 5 de noviembre de 2015.
1. Análisis descriptivo de las variables clínico-patológicas
La mediana de la edad de las pacientes en el momento del diagnóstico fue de 60
(49-73) años, predominando las de ≥50 años (75%; 165/220). En el 96,8% (209/216) de
los casos el crecimiento tumoral fue unilateral.
El tamaño tumoral máximo se determinó en la pieza quirúrgica y mostró unas
cifras de 18(14-25) mm, siendo un 58% ≤20 mm (127/220). El grado de diferenciación
tumoral más frecuente fue el grado II (46%; 100/220). En el 40,4% (86/213) se observó
invasión vascular, siendo focal en el 63% de los casos (54/86). Sin embargo, sólo se
detectaron focos de necrosis en el 15,6% de los tumores (33/211).
RESULTADOS
116
Se estudiaron una media de 15,54±6,25 ganglios por paciente. Sólo se encontró
positividad en el 37,4% (76/203) de los casos, 75% de los cuales tuvo un máximo de 3
ganglios afectados (57/76).
Pacientes (n) Porcentaje (%)
Edad
<50 años
≥50 años
165
55
75
25
Bilateralidad
Unilateral
Bilateral
209
7
96,8
3,2
Tamaño
≤20 mm
>20 mm
127
93
58
42
Grado Diferenciación
I
II
III
43
100
77
19,5
45,5
35
Invasión vascular
Ausente
Presente
127
86
59,6
40,4
Necrosis
Ausente
Presente
178
33
84,4
15,6
Metástasis ganglionar
Negativo
Positivo
127
76
62,6
37,4
Status ganglionar (N)
N0
N1 (1-3)
N2 (3-10)
N3 (>10)
127
57
16
3
62,6
28,1
7,9
1,5
Fenotipo
Luminal A
Luminal B
139
81
63,2
36,8
Tabla 5: Características clínico-patológicas de los tumores analizados.
RESULTADOS
117
Se realizó la clasificación tumoral en función del estudio inmunohistoquímico de
la expresión del RE, RPG, Ki67 y p53. El fenotipo luminal subtipo A, caracterizado por
una expresión de Ki67 y p53 <15%, quedó representado por un 63,2% de los casos
(139/220), mientras que el 36,8% (81/220) representaba al fenotipo luminal subtipo B,
caracterizado por una expresión de Ki67 y/o p53 ≥15%. La expresión
inmunohistoquímica de las proteínas Ki67, RE, RPG, p53 y BCL2 se muestra en la
Tabla 6.
Todos Luminales A luminales B
Variable N Me(p25-p75) N Me(p25-p75) N Me(p25-p75)
Ki67 220 10(6-20) 139 8(5-10) 81 22(20-27)
P53 219 1(0-3) 138 1(0-2) 81 2(0-9)
RE 220 80(40-90) 139 80(50-90) 81 80(40-90)
RPG 220 70(16-90) 139 70(15-90) 81 70(20-90)
BCL2 219 80(30-99) 139 80(40-100) 80 70(20-99)
Tabla 6: Expresión inmunohistoquímica de los marcadores Ki67, p53, RE, RPG
y BCL2.
2. Análisis descriptivo de las variables moleculares
2.1 Mutaciones en el gen PI3KCA
Se detectaron mutaciones en el gen PI3KCA en el 30,6% (57/186) de las
pacientes, localizándose en el 52,6% (30/57) de los casos en el dominio quinasa (exón
20, cambio de residuo H1047R, mutación A3114G). En el 45,6% (26/57) de los casos
mutados se afectó el dominio helical (exón 9), siendo más frecuentes las mutaciones en
el residuo E545 (mutación G1633A), el 28,1% (16/57), que en el residuo E542
RESULTADOS
118
(mutación G1624A), presente tan sólo en el 19,3% (11/57). Sólo se detectó una paciente
doble mutante (1,8%), que tenía las mutaciones A3140G y la G1624A, afectándose
tanto el dominio quinasa como el helical.
Figura 17: Distribuciones de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA en
función del subtipo tumoral. Las etiquetas numéricas indican frecuencia relativa en %.
Las diferencias entre los dos subtipos no fueron significativas.
2.2 Expresión de ARNm de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y
MED1
Los niveles de expresión relativos fueron analizados con el método ddCt y por
tanto se muestran en valores de Fold Change (FC). Las distribuciones de las variables
de expresión génica se muestran en la Tabla 7. No se han extraído del análisis los casos
mutados en PI3K porque las variaciones fueron despreciables.
Variable N Me(p25-p75)
IGF1R 132 4,68(2,61-8,46)
EGFR 120 0,10(0,05-0,22)
c-Src 132 1,23(0,78-1,83)
ESR1 120 1,63(0,61-2,59)
MED1 132 0,50(0,29-0,84)
Tabla 7.- Distribuciones de los patrones de expresión génicos (FC).
RESULTADOS
119
Figura 18: Distribuciones de los niveles de expresión génicos en función del
subtipo tumoral (FC). Las diferencias entre los dos subtipos no fueron significativas
para ninguno de los genes.
LUMINAL BLUMINAL A
IGF
1R (F
C)
20
15
10
5
0
LUMINAL BLUMINAL A
EG
FR (F
C)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
LUMINAL BLUMINAL A
cSR
C (
FC
)
9
6
3
0
LUMINAL BLUMINAL A
ESR
1 (F
C)
12
9
6
3
0
LUMINAL BLUMINAL A
ME
D1
(FC
)
4
3
2
1
0
4,49(2,79-8,63) 4,50(2,36-6,59) 0,09(0,05-0,21) 0,11(0,05-0,26)
1,31(0,83-1,82) 1,26(0,76-2,06)
1,67(0,59-2,74) 1,60(0,66-2,48) 0,44(0,27-0,73) 0,46(0,28-0,87)
RESULTADOS
120
Para facilitar el análisis estadístico, los niveles de expresión génica se
categorizaron en reprimido, normal y sobreexpresado (Tabla 8).
TODOS Luminales A luminales B
Variable N % N % N %
IGF1R 132 80 52
SE
N
REP
91
38
3
68,9
28,8
2,3
58
21
1
72,5
26,3
1,3
33
17
2
63,5
32,7
3,8
EGFR 120 75 45
SE
N
REP
2
8
110
1,7
6,7
91,7
1
4
70
1,3
5,3
93,3
1
4
40
2,2
8,9
88,9
c-Src 132 80 52
SE
N
REP
27
90
15
20,5
68,2
11,4
15
57
8
18,8
71,3
10,0
12
33
7
23,1
63,5
13,5
ESR1 120 75 45
SE
N
REP
47
49
24
39,2
40,8
20,0
30
29
16
40,0
38,7
21,3
17
20
8
37,8
44,4
17,8
MED1 132 80 52
SE
N
REP
7
59
66
5,3
44,7
50,0
5
35
40
6,3
43,8
50,0
2
24
26
3,8
46,2
50,0
Tabla 8: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus
valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos luminales no
fueron significativas. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.
2.3 Expresión de los miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222
Los niveles de expresión relativos de los miRNAs fueron analizados también con
el método ddCt y por tanto se muestran en valores de FC. Las distribuciones de las
variables de miRNAs se muestran en la Tabla 9. Se han diferenciado los casos no
mutados de los casos mutados porque se han encontrado diferencias que lo justifican,
aunque ninguna de ellas alcanza la significancia estadística. El único miRNA capaz de
RESULTADOS
121
discriminar entre los subtipos luminales fue el miR-Let-7a (Figura 19), aunque el miR-
206 también mostró una tendencia en los casos silvestres (Figura 20).
Casos No Mutados Casos Mutados
Variable N Me(p25-p75) N Me(p25-p75)
Let-7a 25 0,39(0,28-0,55) 18 0,30(0,22-0,94)
miR-21 25 0,55(0,26-0,81) 18 0,83(0,26-1,08)
miR-206 25 1,41(0,70-5,12) 18 2,92(0,87-4,84)
miR-222 25 0,41(0,25-0,68) 18 0,52(0,25-0,97)
Tabla 9: Distribuciones de los patrones de expresión de los miRNAs en función
de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA (FC).
Figura19: Distribuciones de los niveles de expresión del miR-Let-7a en función
del subtipo tumoral y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA (FC). En ambos
casos la variación entre los subtipos fue significativa.
Figura 20: Distribuciones de los niveles de expresión del miR-206 en función del
subtipo tumoral en los casos silvestres para el gen PI3KCA. La variación entre los
subtipos mostró una tendencia a la significancia estadística.
RESULTADOS
122
Los criterios de categorización de los miRNAs fueron los mismos que en el caso
de los niveles de la expresión génica (Tabla 10).
Todos Luminales A luminales B
Variable N % N % N %
Let-7-a 58 25 33
SE
N
REP
2
22
34
3,4
37,9
58,6
0
10
15
0,0
40,0
60,0
2
12
19
6,1
36,4
57,6
miR-21 58 25 33
SE
N
REP
5
27
26
8,6
46,6
44,8
1
14
10
4,0
56,0
40,0
4
13
16
12,1
39,4
48,5
miR-206 58 25 33
SE
N
REP
27
25
6
46,6
43,1
10,3
10
12
3
40,0
48,0
12,0
17
13
3
51,5
39,4
9,1
miR-222 58 25 33
SE
N
REP
6
17
35
10,3
29,3
60,3
1
8
16
4,0
32,0
64,0
5
9
19
15,2
27,3
57,6
Tabla 10: Clasificación de los niveles de expresión de los miRNAs en función de
sus valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos
luminales no fueron significativas. Se han considerado tanto los casos mutados como
los silvestres para el gen PI3KCA. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.
2.4 Expresión del Pri-miR-17~92.
El pri-miR-17~92 fue analizado en 50 casos, expresándose según la distribución
0,75 (0,31-4,65) en todos los casos (Figura 21). No se distinguió en función de la
existencia de mutaciones porque no se encontraron diferencias significativas y el
tamaño de la muestra se veía muy resentido.
RESULTADOS
123
Figura 21: Distribuciones de los niveles de expresión del Pri-miR-17~92 en
función del subtipo tumoral. La diferencia entre los dos subtipos no fue significativa.
Los niveles de expresión del pri-miR-17~92 relativos fueron igualmente
analizados con el método ddCt y por tanto la expresión en valores de FC y su
tratamiento fueron los mismos que los utilizados en los casos anteriores (Tabla 11).
Todos
Luminales A luminales B
N % N % N %
50 23 27
SE
N
REP
17
13
20
34,0
26,0
40,0
7
7
9
30,4
30,4
39,1
10
6
11
37,1
22,2
40,7
Tabla 11: Clasificación de los niveles de expresión génica en función de sus
valores respecto de los valores normales. Las diferencias entre los subtipos luminales no
fueron significativas. SE: sobreexpresado, N: normal, REP: reprimido.
LUMINAL BLUMINAL A
Pri
-miR
-17~
92 (F
C)
15
10
5
0
0,89(0,31-3,19) 0,67(0,32-6,59)
RESULTADOS
124
3. Asociación entre las variables moleculares y las clínico-patológicas
3.1 Asociación entre la mutación en el gen PI3KCA y las variables
clínico-patológicas
En la serie completa no se encontraron asociaciones significativas entre la
existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y las variables clínico-patológicas. No
obstante, las correlaciones entre las variables inmunohistoquímicas variaron en función
de la presencia de mutaciones y del fenotipo tumoral (Tabla 12).
CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS MUTADOS
RE RPG BCL-2 Ki67 p53
RE
1,000
0,382*
0,376
0,041
0,442 0,337*
0,281
0,064
-0,134
LA
LB
RE
RPG LA
LB
0,178
0,158 1,000
0,263
0,414
0,175
-0,291
0,187
-0,462
LA
LB
RPG
BCL-2 LA
LB 0,355***
0,573***
0,348***
0,118 1,000
0,075
-0,232
-0,211
-0,313
LA
LB
BCL-2
Ki67 LA
LB
0,069
0,059
-0,058
0,192
-0,044
0,079 1,000
0,119
-0,150
LA
LB
Ki67
p53 LA
LB
0,123
-0,028
0,180
-0,193 0,219*
-0,100
-0,069
-0,237 1,000
p53
RE RPG BCL-2 Ki67 p53
CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS SILVESTRES
Tabla 12: Valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre las variables
inmunohistoquímicas, para los distintos subtipos tumorales en función de la existencia de
mutaciones en el gen PI3KCA. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral).
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
RESULTADOS
125
Dado que no se encontraron diferencias entre la existencia de mutaciones en el
gen PI3KCA y las variables clínico-patológicas, se tuvieron en cuenta todos los casos
para el análisis del resto de variables moleculares frente a las variables clínico-
patológicas para asegurar el tamaño muestral, a excepción del estudio de correlaciones
frente a las variables inmunohistoquímicas por su carácter cuantitativo.
3.2 Asociación entre los niveles de expresión génicos y las variables
clínico-patológicas
El gen IGF1R reveló un comportamiento distinto en función del subtipo. En el
caso de los luminales A, se observó una tendencia a la asociación negativa entre la
sobreexpresión de IGF1R y la metástasis en ganglios: se sobreexpresó en el 82,2% de
las pacientes sin metástasis ganglionar frente al 64,3% de las pacientes con metástasis
en ganglios, actuando como un factor protector (OR= 0,389(0,131-1,154), p= 0,084).
No se encontró esta asociación en los luminales B, aunque si se asoció a diámetros
<20mm: sobreexpresaron el IGF1R el 47,8% de los tumores con diámetros ≥20mm
frente al 75,9% de los tumores con diámetros <20 mm (OR: 0,292 (0,090-0,949), p=
0,037). Además, los luminales B con un grado de diferenciación de Nottingham bajo
tendían a sobreexpresar IGF1R (p= 0,067).
Las correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en los
distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 13.
RESULTADOS
126
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,072 0,110 0,127 0,276
RPG -0,007 0,077 0,544* -0,006
BCL-2 0,105 -0,135 -0,127 -0,517
Ki67 0,232 -0,197 0,093 0,488
p53 -0,180 0,173 -0,473* -0,012
Tabla 13: Correlaciones entre el IGF1R y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1 y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
En los luminales A, la presencia de expresión del gen EGFR mostró una fuerte
tendencia a la asociación con un grado de diferenciación de Nottingham III,
expresándose en el 20% de estos tumores mientras que sólo se expresó en el 3,3% de los
tumores con grados I y II (OR= 7,25 (1,09-48,19), p= 0,059). Además, la
sobreexpresión de EGFR se asoció a un incremento del riesgo 34 (9-133) veces superior
de sufrir afectación de más de 3 ganglios que los tumores con valores normales o
reprimidos (p= 0,043). Asimismo, los tumores de pacientes jóvenes (<50 años)
mostraron una expresión mayor de EGFR (0,23 (0,10-0,34) vs 0,08 (0,04-0,16),
p=0,003). En los luminales B, los tumores con sobreexpresión inmunohistoquímica de
p53 en al menos el 15% de sus células mostraron una expresión mucho mayor (Figura
22). Además, la expresión de EGFR≥ p75 mostró una tendencia a la asociación con la
RESULTADOS
127
invasión linfovascular en estos tumores, que alcanzó un OR= 2,571 (1,441-4,589)
(p=0,090).
Figura 22: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de
EGFR en función de sobreexpresión de p53≥15% de sus células (Prueba U de Mann-
Whitney) en los luminales B.
Las correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en los
distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 14:
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,224 -0,340 -0,231 0,037
RPG 0,108 0,093 -0,357 -0,585
BCL-2 0,134 0,232 -0,183 0,130
Ki67 -0,001 -0,281 -0,297 -0,031
p53 0,041 0,232 0,577** 0,381
Tabla 14: Correlaciones entre el EGFR y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1 y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
<15%>=15%
EG
FR1
(FC
)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
p=0,055
RESULTADOS
128
La sobreexpresión del gen c-Src en los luminales A se comportó como un factor
protector frente a la metástasis ganglionar: sólo un 3,6% de los tumores con metástasis
ganglionar lo sobreexpresaron frente al 24,4% de los tumores sin metástasis (OR= 0,114
(0,014-0,943) (p= 0,023) (Tabla 14). Sin embargo, los tumores con niveles de expresión
inmunohistoquímica de progesterona <10% mostraron niveles de expresión de c-Src
mayores (Figura 23).
Figura 23: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de c-Src
en función de la expresión inmunohistoquímica de receptores de progesterona de los
tumores (Prueba U de Mann-Whitney) en los luminales A.
Por el contrario, en los luminales B, la sobreexpresión del gen c-Src se comportó
como un factor de riesgo de desarrollar metástasis ganglionar con un OR= 4,650 (1,125-
19,212) (p= 0,052) (Tabla 15). Al mismo tiempo, la represión del gen c-Src mostró una
tendencia a la asociación con la necrosis tumoral, que a pesar de no alcanzar la
significancia estadística (p= 0,060), suponía un riesgo 5,190 (0,980-27,450) veces
superior. Además, los tumores con una expresión inmunohistoquímica baja del RE
mostraron una sobreexpresión del gen c-Src (OR= 5,00 (2,87-8,70); p= 0,050).
1,16 (0,82-1,66)
1,66 (1,22-3,07)
p=0,052
≥10% <10%
RESULTADOS
129
Met
ást
asi
s en
Gan
gli
os
Luminales A
N SE (%) NoRep (%) p
Sí 28 3,6 96,4
0,023
No 45 24,4 75,6
luminales B
N SE (%) NoRep (%) p
Sí 14 42,9 57,1
0,052
No 36 13,9 86,1
Tabla 15: Asociación entre los niveles de expresión de c-Src y la metástasis en
ganglios en función del subtipo luminal. SE: sobreexpresado, NoRep: normal o
reprimido.
Las correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en los
distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 16.
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,183 -0,118 -0,464* 0,092
RPG -0,020 -0,219 -0,006 0,080
BCL-2 -0,080 -0,018 -0,385 -0,511
Ki67 0,243 -0,112 0,110 0,152
p53 -0,164 -0,179 0,114 -0,123
Tabla 16: Correlaciones entre el c-Src y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1 y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
RESULTADOS
130
Respecto a los niveles de expresión génica del ESR1, en los luminales A el 90%
de los casos con sobreexpresión de ESR1 fueron pacientes de ≥ 50 años (OR= 4,50
(1,17-17,26); p= 0,020) siendo en general mayor el nivel de expresión en este grupo
(Figura 24).
Figura 24: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión génica
de ESR1 en función de la edad de las pacientes en los luminales A (Prueba U de Mann-
Whitney).
Sin embargo, en los luminales B, la asociación entre la expresión génica del ESR1
y la edad de las pacientes no alcanzó la significancia estadística, aunque sí se mantuvo
una diferencia suficiente para mostrar una tendencia clara hacia la sobreexpresión en las
pacientes de ≥ 50 años (1,81 (0,96-2,58) vs 0,76 (0,33-2,03); p= 0,066). Por otro lado, la
presencia de expresión del gen se asoció a tumores con un diámetro máximo >20 mm
(OR: 8,24 (0,92-73,79); p= 0,051) y se evidenció asociado a la presencia de necrosis
tumoral (Figura 25).
RESULTADOS
131
Figura 25: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión génica
de ESR1 en función de la presencia de necrosis en el tumor en los luminales B (Prueba
U de Mann-Whitney).
Las correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en los
distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 17.
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE 0,007 0,508* 0,215 0,337
RPG 0,079 0,313 0,008 0,203
BCL-2 -0,138 0,114 0,091 0,080
Ki67 0,019 -0,019 0,347 -0,067
p53 -0,135 -0,122 -0,029 -0,468
Tabla 17: Correlaciones entre el ESR1 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
RESULTADOS
132
Los niveles de expresión del gen MED1 no revelaron asociaciones significativas
con las variables clínico-patológicas en el caso de los luminales A. En los luminales B,
sin embargo, el 88,5% de las pacientes con ≥ 50 años tenían reprimida la expresión del
gen (OR= 5,62 (1,34-2,56); p= 0,012). Contrariamente, las pacientes con tumores
bilaterales mostraron niveles de expresión mucho mayores (Figura 26). Las
correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en los distintos
grupos de tumores se muestran en la Tabla 18.
Figura 26: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión génica
de MED1 en función de la bilateralidad del cáncer de mama en los luminales B (Prueba
U de Mann-Whitney).
RESULTADOS
133
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,099 -0,109 0,120 -0,141
RPG -0,054 -0,166 0,530* 0,031
BCL-2 -0,023 -0,155 -0,027 0,160
Ki67 0,013 0,207 0,210 0,037
p53 -0,191 0,079 0,100 -0,345
Tabla 18: Correlaciones entre el MED1 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
3.3 Asociación entre los niveles de expresión de los miRNAs y las
variables clínico-patológicas (VCP)
En los luminales A, no se observaron asociaciones entre la expresión del miR-Let-
7a y las VCP. En los luminales B se observó una asociación con la represión del miR-
Let-7a y el grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por los tumores (Prueba
de Kruskal-Wallis, p= 0,043) que se consolidó al observar que el 73,7% de los tumores
con un grado de diferenciación alto (grado III) tenían reprimido el miR-Let-7a (OR=
5,040 (1,129-22,496); p= 0,029). Las correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables
inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 19.
RESULTADOS
134
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,195 -0,154 -0,182 0,170
RPG 0,074 0,346 0,041 0,630
BCL-2 0,280 -0,133 0,362 0,786*
Ki67 -0,562* -0,402 -0,228 -0,030
p53 -0,193 -0,185 -0,223 -0,726*
Tabla 19: Correlaciones entre el miR-Let-7a y las variables inmunohistoquímicas
en función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1 y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
Respecto al miR-21, sólo se observó que en el grupo de luminales B, los tumores
con un grado de diferenciación alto (grado III) tenían asociados niveles de expresión
menores al 3º cuartil (RQ= 0,22 FC), lo que supuso una asociación muy cercana a la
significación estadística (p= 0,057) que conllevaba un incremento del riesgo de 5,333
(1,058-26,898). Las correlaciones entre el miR-21 y las variables inmunohistoquímicas
en los distintos grupos de tumores se muestran en la Tabla 20.
RESULTADOS
135
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,017 -0,432 -0,391 0,356
RPG 0,031 0,068 0,156 0,525
BCL-2 -0,023 0,064 0,047 0,638
Ki67 -0,428 -0,295 0,060 0,143
p53 -0,101 0,362 0,047 -0,765*
Tabla 20: Correlaciones entre el miR-21 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
No se encontraron asociaciones significativas entre los niveles de expresión del
miR-206 y las variables clínico-patológicas en ninguno de los dos subtipos luminales.
Las correlaciones frente a las variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de
tumores se muestran en la Tabla 21.
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,066 -0,698* -0,009 0,576
RPG -0,142 -0,370 0,165 0,220
BCL-2 -0,007 0,051 0,317 0,800**
Ki67 -0,204 -0,153 0,317 0,454
p53 -0,332 -0,255 0,131 -0,403
Tabla 21: Correlaciones entre el miR-206 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
RESULTADOS
136
En cuanto al miR-222, en los luminales B, se observó una tendencia a la
asociación inversa con el grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por los
tumores (Prueba de Kruskal-Wallis, p= 0,086) (Figura 27) que se consolidó al observar
que el 27,3% de los tumores con niveles de expresión superiores al 3º cuartil (RQ= 0,84
FC) tenían un grado de diferenciación bajo (grado I) mientras que el 100% de los
tumores que no alcanzaron este nivel de expresión desarrollaban grados más avanzados
(II o III) (OR= 3,750 (2,072-6,788); p= 0,030). Las correlaciones entre el miR-222 y las
variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores se muestran en la
Tabla 22.
Figura 27: Comparativa de la Distribuciones de los niveles de expresión del miR-
222 en función del grado de diferenciación de Nottingham alcanzado por el tumor
(Prueba de Kruskal-Wallis).
RESULTADOS
137
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE -0,339 -0,590 0,140 0,492
RPG -0,126 0,270 0,037 0,458
BCL-2 0,453 0,300 0,096 0,860**
Ki67 0,300 -0,804** 0,161 0,277
p53 0,101 0,026 -0,290 -0,698*
Tabla 22: Correlaciones entre el miR-222 y las variables inmunohistoquímicas en
función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA. Se
indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones con una p<0,1y
señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
3.4 Asociación entre los niveles de expresión del pri-miR-17~92 y las
variables clínico-patológicas
El pri-miR-17~92 mostró, en los luminales A, una tendencia a la asociación con el
tamaño tumoral, de forma que la sobreexpresión del pri-miR-17~92 se comportaba
como un factor protector frente a diámetros ≥ 20 mm (OR= 0,100 (0,010-1,045); p=
0,069). En los luminales B, por el contrario, niveles de expresión mayores del pri-miR-
17~92 se asociaron a la metástasis ganglionar (Figura 28). Las correlaciones entre el
pri-miR-17~92 y las variables inmunohistoquímicas en los distintos grupos de tumores
se muestran en la Tabla 23.
RESULTADOS
138
Figura 28: Comparativa de la Distribuciones de los niveles de expresión del pri-
miR-17~92 en función del desarrollo de metástasis ganglionar (Prueba U de Mann-
Whitney) en los luminales B.
Luminales A luminales B
Silvestres Mutados Silvestres Mutados
RE 0,254 -0,102 -0,090 -0,185
RPG 0,161 0,177 -0,036 -0,500
BCL-2 0,120 0,430 0,382 -0,430
Ki67 0,404 -0,017 -0,214 -0,036
p53 0,084 0,113 0,236 0,891**
Tabla 23: Correlaciones entre el pri-miR-17~92 y las variables
inmunohistoquímicas en función del subtipo luminal y de la existencia de mutaciones
en el gen PI3KCA. Se indican los valores Rho. En negrita marcadas las correlaciones
con una p<0,1 y señalados con * las p significativas. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
RESULTADOS
139
4. Asociaciones entre las variables moleculares
4.1 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
niveles de expresión de los genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1
Los mutantes del gen PI3KCA, de ambos subtipos, expresaron el EGFR en un
14,3% de los casos, mientras que el 97,1% de los tumores silvestres reprimieron este
gen (OR= 5,58 (0,96-32,46); p= 0,053). Por el contrario, los niveles de IGF1R tendieron
a ser más bajos que en los tumores silvestres. Concretamente, la presencia de mutación
en el hotspot A3140G (exón 20) se asoció a la represión de IGF1R en un 13,3% de los
mutantes frente a su expresión en el 98,8% de los silvestres (OR= 12,77 (1,08-151,06);
p= 0,059). En los luminales A, las mutaciones en el exón 9 se comportaron como factor
de protección frente a la sobreexpresión de IGF1R puesto que sólo el 40% de los que
tenían afectado el dominio helical sobreexpresaron el gen, frente al 77,6% de los casos
silvestres (OR= 0,19 (0,05-0,79); p= 0,023). En particular, los niveles de expresión de
IGF1R se redujeron a la mitad en los mutantes G1624A (Figura 29).
Figura 29: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión de
IGF1R en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA
(Prueba U de Mann-Whitney).
RESULTADOS
140
En el caso de la expresión génica del ESR1, encontramos diferencias en función
del dominio afectado por la mutación y del subtipo luminal, aunque no se trasladaron a
la expresión proteica (% de células positivas por inmunohistoquímica) (Tabla 24).
Dominio Helical
p (
fen
oti
po
s)
Dominio Quinasa
p (
fen
oti
po
s)
p (
dom
inio
s)
ARNm
Luminales A 2,08 (0,87-5,46)
ns
0,30 (0,03-0,82)
0,032
0,010
luminales B 2,81 (0,70-5,82) 1,58 (0,96-2,17) ns
% IHQ
Luminales A 85 (50-93)
ns
60 (10-90)
ns
ns
luminales B 56 (35-83) 85 (49-93) ns
Tabla 24: Expresión del ESR1 a nivel mensajero y proteína (ER), en función del
subtipo tumoral y del dominio mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).
4.2 Asociaciones entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222
Los patrones de expresión de algunos miRNAs también fueron diferentes en
función del dominio afectado por la mutación y/o del subtipo luminal.
La presencia de mutaciones en el dominio helical se relacionó con la
sobreexpresión del miR-21 puesto que esta situación se dio en el 27,3% de los casos
portadores mientras que el 96,9% de los casos silvestres mostraron una expresión
normal o reprimida del miRNA en cuestión (OR= 11,31 (1,06-127,24); p= 0,045).
El miR-Let-7a mostró patrones muy diferenciados (Tabla 25) destacando las
diferencias para los portadores de mutaciones en el residuo E542 (Figura 30).
RESULTADOS
141
Concretamente, en los luminales B, los casos con mutaciones en el dominio helical
presentaron expresión del miR-Let-7a en el 75% de los casos, mientras que se encontró
reprimido en todos los casos mutados en el dominio quinasa (OR: 0,167 (0,028-0,997);
p= 0,048) y en el 87,5% de los casos silvestres (OR: 21,00 (1,40-314,04); p= 0,032).
Dominio Helical
E542
Dominio Helical
E545
Dominio Quinasa
H3140
Luminales A 0,30 (0,29-0,30) 0,62 (0,34-1,31) 1,29 (1,22- 1,36)
luminales B 0,93 (0,53-1,33) 0,37 (0,11-0,62) 0,17 (0,14-0,23)
p 0,076 ns 0,053
Tabla 25: Expresión del miR-Let-7a en función del subtipo tumoral y del dominio
mutado de PI3K (Prueba U de Mann-Whitney).
Figura 30: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-
Let-7a en función de la presencia de la mutación G1624A en el exón 9 del gen PI3KCA
y del subtipo luminal (Prueba U de Mann-Whitney).
RESULTADOS
142
En lo que respecta a la mutación G1633A, se encontró una asociación
significativa con la expresión del miR-222 en los luminales A (Figura 31).
Figura 31: Comparativa de las distribuciones de los niveles de expresión del miR-
222 en función de la presencia de la mutación G1633A en el exón 9 del gen PI3KCA
para los luminales A (Prueba U de Mann-Whitney).
4.3 Asociación entre la existencia de mutaciones en el gen PI3KCA y los
niveles de expresión del pri-miR-17~92
Los mutantes del gen PI3KCA expresaron el pri-miR-17~92 en un 87,5% de los
casos mientras que el 47,4% de los silvestres reprimieron su expresión (OR= 6,30 (1,11-
35,67); p= 0,027). La expresión del pri-microARN destacó principalmente en los
mutantes del dominio quinasa, puesto que se expresó en el 100% de los casos mientras
que el 40,7% de los casos no portadores lo reprimieron (OR= 1,69 (1,23-2,31); p=
0,037).
RESULTADOS
143
4.4 Correlaciones entre las variables moleculares (niveles de expresión de los
genes IGF1R, EGFR, c-Src, ESR1 y MED1, del pri-miR-17~92 y de los
miRNAs Let-7-a, miR-21, miR-206 y miR-222)
Para poder valorar la existencia de correlaciones entre los distintos genes, pri-
miRNA y miRNAs estudiados se realizó el Test de Correlación de Spearman (Tabla 26).
CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS MUTADOS
IGF1R EGFR1 c-Src ESR1 MED1 Pri-miR Let7-a miR-21 miR-206 miR-222
IGF1R LA
LB 1,000
-0,204
0,250
-0,040
0,794**
-0,085
-0,067
0,179
0,370
-0,107
0,286
0,393
-0,075
0,500
-0,150
-0,357
-0,200 0,679
-0,233
LA
LB
IGF1R
EGFR1 LA
LB 0,048
-0,314 1,000
-0,009
0,146
-0,110
-0,012
0,157
0,500
0,417
0,536
0,503
0,063
0,095
-0,176 0,952***
-0,042
0,048
-0,159
LA
LB
EGFR1
c-Src LA
LB 0,538***
0,112
0,028
0,074 1,000
0,124
0,042 0,506*
0,152 -0,643
0,071 -0,536
0,017
0,036
0,100
-0,536
-0,433
-0,217
0,000
LA
LB
c-Src
ESR1 LA
LB 0,119
0,077
-0,217
-0,255
-0,176
-0,078 1,000
-0,256
0,139 -0,667*
0,714
-0,240
0,176
0,095
0,433 -0,810*
-0,183
0,238
0,100
LA
LB
ESR1
MED1 LA
LB 0,371**
0,197
-0,033
0,242
0,368**
0,233
0,325*
-0,003 1,000
-0,222
-0,357
-0,556
0,452
-0,148
0,117
0,500
-0,150
-0,357
-0,200
LA
LB
MED1
Pri-miR-
17~92 LA
LB 0,597*
-0,607 0,670*
-0,306
0,150
-0,714
0,060
-0,500
-0,032
-0,357 1,000
0,036
-0,714
0,310
-0,750*
0,381
-0,107
0,214
-0,571
LA
LB
Pri-miR-
17~92
Let7-a LA
LB -0,014
0,286
0,159
0,365
0,008
0,511
-0,286
-0,188
0,118
0,310
-0,035
-0,306 1,000
0,353
0,820**
0,385
0,636
0,487
0,854**
LA
LB
Let7-a
miR-21 LA
LB -0,033
0,345
-0,077
0,471
0,292
0,588
-0,317
0,030
-0,289
0,491
-0,354
-0,393
0,381
0,838*** 1,000
0,276
0,483 0,693*
0,817**
LA
LB
miR-21
miR-206 LA
LB 0,079
0,080
0,233
-0,214
0,396
-0,103
-0,196
-0,127
0,016
0,115
0,109
0,571
0,491
0,260 0,642*
0,364 1,000
0,151
0,883**
LA
LB
miR-206
miR-222 LA
LB 0,567*
0,389
0,207
0,193
0,402
0,091
-0,015
0,012
0,195
-0,035
0,434
-0,414
0,263
0,642*
0,183
0,661*
0,559*
0,606* 1,000
LA
LB
miR-222
IGF1R EGFR1 c-Src ESR1 MED1 Pri-miR Let7-a miR-21 miR-206 miR-222
CORRELACIONES ENTRE LOS CASOS SILVESTRES
Tabla 26: muestra los valores de Rho de Spearman y su significancia estadística entre
las variables moleculares, para los distintos subtipos tumorales en función de la existencia de
mutaciones en el gen PI3KCA. *** La correlación es significativa al nivel 0,001 (bilateral)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
RESULTADOS
144
* La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).
5. Análisis de Supervivencia
5.1 Supervivencia Libre de Enfermedad
5.1.1 Asociaciones con la recidiva tumoral
El tiempo de seguimiento medio fue de 128 (93-148) meses con un mínimo de 16
y un máximo de 185 meses. Se obtuvieron datos de seguimiento del 91,4% (201/220) de
las pacientes. En cuanto a las metástasis, el 61,5% fueron óseas, el 19,2 hepáticas y el
19,3% restante afectaron a otros órganos diversos. La forma de reaparición de la
enfermedad no se diferenció en función del fenotipo (tabla 27), aunque sí el tiempo que
tardó en reaparecer, definido como la SLE (figura 32).
Fenotipo
(N total)
Luminales A
(125)
luminales B
(76)
Todos
(201)
Recidiva local 11 (8,8%) 13 (17,1%) 24 (12%)
Metástasis 14 (11,2%) 6 (7,9%) 20 (10%)
Recidiva + metástasis 4 (3,2%) 2 (2,6%) 6 (3%)
Libre de enfermedad 96 (76,8%) 55 (72,4) 151 (75,1%)
Tabla 27: Distribuciones de los datos de reaparición de la enfermedad en función del
subtipo y en la serie completa (N (%)), p > 0,05.
Luminal A: 170 (163-177)
Luminal B: 142 (131-152)
Test Log Rank, p=0,025
Hazard ratio (HR)= 2,28 (1,09-4,78)
RESULTADOS
145
Figura 32: Curvas de Kaplan-Meier para la SLE en función del fenotipo.
Se estudió la existencia de asociaciones entre la reaparición de la enfermedad y las
características clínico-patológicas y moleculares analizadas.
En la serie completa, la afectación de más de 3 ganglios mostró una fuerte
asociación con la reaparición metastásica de la enfermedad. 6/26 (23%) pacientes con
más de 3 ganglios afectados al diagnóstico desarrollaron metástasis a distancia, lo que
ocurrió sólo en 10/162 (6,2%) pacientes con 3 o menos ganglios afectos, suponiendo un
riesgo 4,56 (1,50-13,90) veces mayor (p= 0,012).
La inmunotinción positiva ≥10% de RE demostró ser un factor protector frente a
la reaparición de la enfermedad. 7/12 (58,3%) de las pacientes con RE<10% recidivaron
mientras que sólo lo hicieron 40/183 (21,9%) de las pacientes con RE≥10% (OR: 0,2
(0,06-0,66), p= 0,009).
Del mismo modo, la inmunotinción positiva del RPG mostró una clara tendencia a
actuar como factor protector frente a la recidiva. 12/32 (37,5%) de las pacientes con
RPG <10% recidivaron mientras que sólo lo hicieron 35/163 (21,5%) de las pacientes
con RPG≥10% (OR: 0,46 (0,20-1,02), p= 0,053).
En los luminales A el riesgo de reaparición de la enfermedad aumento 3,294 veces
(0,916-11,843) cuando el tumor tenía la mutación G1633A (5/11 (45,5%) de los
mutados sufrieron recidiva frente a sólo 21/104 (20,2%) de los silvestres) (p= 0,057).
En este subtipo también fue determinante el porcentaje de células que sobreexpresaron
inmunohistoquímicamente el RE, puesto que sólo 21/111 (18,9%) de las pacientes con
RE≥10% presentó recidiva de la enfermedad frente a 5/8 (62,5%) de las pacientes con
RE<10%. Así pues, un RE≥10% se consolidó como un factor protector frente a la
reaparición de la enfermedad (OR: 0,14 (0,03-0,63), p= 0,012).
RESULTADOS
146
En los luminales B el porcentaje de células con inmunotinción positiva para BCL2
se asoció al desarrollo de metástasis (figura 33).
Figura 33: Asociación del % de células inmunopositivas para BCL2 con el
desarrollo de metástasis en los luminales B (Prueba de Kruskal-Wallis).
Además, en este fenotipo, la sobreexpresión del miR-222 por encima del 3º cuartil
supuso un incremento de 7,60 veces (1,07-54,09) el riesgo de desarrollar recidiva local
puesto que sólo 2/21 (9,5%) de las pacientes con una expresión del miR-222 < 3º cuartil
presentaron recidiva de la enfermedad frente a 4/9 (44,4%) de las pacientes con una
expresión del miR-222 ≥ 3º cuartil (p=0,049).
5.1.2 SLE en función del tiempo de seguimiento
Para evaluar la influencia del tiempo de seguimiento de las pacientes sobre las
variables que en principio están asociadas a una disminución de la SLE, se realizó el
análisis de supervivencia por duplicado: tomando como tiempo máximo de seguimiento
60 meses, que representa un tiempo de seguimiento medio de un buen número de series
publicadas, con el tiempo máximo de seguimiento real (185 meses máximo). Las
RESULTADOS
147
diferencias entre las variables que resultaron significativas a corto y largo plazo de
seguimiento se muestran en las Tabla 28, 29 y 30.
Todos
N
SLE
60 meses
p
Log Rank
N
SLE
185 meses
p
Log Rank
Fenotipo
Luminal A
Luminal B
123
74
59 (58-60)
57 (55-59)
0,007
125
75
170 (163-177)
142(131-152)
0,025
HR= 3,819 (1,327-10,993) HR= 2,278 (1,085-4,782)
Bilateralidad
Bilateral
Unilateral
7
186
48 (36-59)
59 (58-60)
0,000
7
189
72(42-102)
169(163-176)
0,000
HR= 14,251 (5,548-36,606) HR= 14,251 (5,548-36,606)
Ki67
≥15%
<15%
72
119
57(55-59)
59(58-60)
0,001
73
121
141(130-152)
173(166-179)
0,007
HR= 2,303 (0,989-5,863) HR= 2,790 (1,286-6,054)
p53
≥20%
<20%
8
182
57(52-62)
58(58-59)
0,545
8
185
125(90-161)
166(160-163)
0,030
RE
<10%
≥10%
12
179
56(47-64)
59(58-60)
0,736
12
182
130(97-162)
167(160-174)
0,016
HR= 0,293 (0,101-0,847)
RPG
<10%
≥10%
32
159
57(53-60)
59(58-60)
0,197
32
162
143(126-161)
168(162-175)
0,011
HR= 0,354 (0,154-0,817)
EGFR
Sobreexpresado
Normal o reprimido
2
104
49(33-64)
58(57-60)
0,007
2
104
58(32-84)
162(152-171)
0,008
HR= 15,217 (1,717-134,876) HR= 9,987 (1,217-81,960)
EGFR
Expresado
Reprimido
9
97
55(50-61)
58(57-60)
0,060
9
97
110(80-140)
163(153-173)
0,022
Tabla 28: Variables con influencia en la SLE de la serie completa con dos
seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por categoría, media de
supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), y valor p del test
de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR) para las
variables independientes.
RESULTADOS
148
Todos
N
SLE
60 meses
p
Log Rank
N
SLE
185 meses
p
Log Rank
Pri-miR-17~92
≥p75
<p75
11
33
56(51-61)
59(58-61)
0,020
11
33
119(88-151)
158(146-170)
0,106
Let7a
Sobreexpresado
Normal o reprimido
2
49
51(37-64)
59(58-60)
0,027
2
49
75(28-121)
155(144-167)
0,030
miR-222
Sobreexpresado
Normal o reprimido
6
45
53(45-61)
59(58-60)
0,009
6
45
109(70-148)
157(147-168)
0,036
miR-206
≥p75
<p75
13
38
56(52-61)
59(58-61)
0,025
13
38
131(104-157)
160(149-171)
0,171
Tabla 28 (continuación): Variables con influencia en la SLE de la serie
completa con dos seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por
categoría, media de supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-
Meier), y valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor
de Hazard Ratio (HR) para las variables independientes.
El análisis de las variables asociadas a la SLE a corto plazo señaló como
posibles factores de confusión a la expresión de EGFR, el pri-miR-17~92 y los miRNAs
Let-7a, miR-222 y miR-206. El análisis multivariante ratificó su condición de variables
codependientes (p>0,05).
El análisis de las variables asociadas a la SLE a largo plazo señaló como
posibles factores de confusión a p53 (que el análisis multivariante identificó como
dependiente de Ki67) y a la expresión de EGFR y la sobreexpresión de los miRNAs
Let-7a y miR-222, que el análisis multivariante ratificó como variables codependientes
(p>0,05).
RESULTADOS
149
Luminales A
N
SLE
60 meses
p
Log Rank
N
SLE
185 meses
p
Log Rank
Bilateralidad
Bilateral
Unilateral
3
118
41(19-64)
59 (58-60)
0,000
3
120
73(6-140)
173(167-180)
0,000
HR= 11,001 (1,274-94,954) HR= 13,450 (2,880-62,821)
RE
<10%
≥10%
8
109
No
valorable
0,666
8
111
134(99-170)
174(168-181)
0,006
HR= 0,196 (0,054-0,713)
RPG
<10%
≥10%
19
98
56(52-61)
60(59-60)
0,017
19
100
148(127-169)
176(170-182)
0,002
HR= 0,154 (0,046-0,510) HR= 0,194 (0,062-0,609)
Mutación G1633A
Mutado
Silvestre
11
102
57(52-62)
59(57-60)
0,434
11
104
152(135-170)
172(165-180)
0,067
HR = 3,151 (0,862-11,514)
c-Src
Sobreexpresado
Normal o reprimido
13
59
58(55-61)
59(57-61)
0,514
13
59
131(111-151)
173(164-182)
0,014
MED1
Sobreexpresado
Normal o reprimido
6
67
54(43-65)
59(58-61)
0,065
5
67
156(135-176)
171(162-180)
0,149
HR= 2,991 (0,627-14,280)
MED1
Normal o Sobreexp
Reprimido
35
37
59(56-61)
59(57-61)
0,626
35
37
177 (165-188)
154(143-164)
0,067
Tabla 29: Variables con influencia en la SLE de los Luminales A con dos
seguimientos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos por categoría, media de
supervivencia e intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), y valor p del
test de comparación entre las curvas Log Rank. Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR)
para las variables independientes.
El análisis de las variables asociadas a la SLE a largo plazo señaló como
posibles factores de confusión a la expresión de MED1 y la sobreexpresión de c-Src. El
RESULTADOS
150
análisis multivariante ratificó su condición de variables codependientes (p>0,05). No se
encontraron factores de confusión en la SLE a corto plazo.
Luminales B
N
SLE
60 meses
p
Log Rank
N
SLE
185 meses
p
Log Rank
Bilateralidad
Bilateral
Unilateral
4
68
53 (44-61)
58 (56-60)
0,021
4
69
71(54-89)
149(139-159)
0,000
HR= 10,586 (3,054-36,694) HR= 10,586 (3,054-36,694)
EGFR
Expresado
Reprimido
5
34
52(43-61)
58(56-61)
0,021
5
34
87(53-120)
143(130-156)
0,114
Pri-miR-17~92
≥p75
<p75
7
17
No
Valorable
0,006
7
17
111(69-153)
144(128-160)
0,182
Let7a
Sobreexpresado
Normal o reprimido
2
27
51(37-64)
59(57-61)
0,054
2
27
75(28-121)
143(129-157)
0,094
miR-21
Expresado
Reprimido
15
14
No
Valorable
0,058
15
14
124(96-152)
154(143-165) 0,047
HR= 6,673 (0,773-57,584) HR= 6,673 (0,773-57,584)
miR-222
Sobreexpresado
Normal o reprimido
5
24
52(43-61)
60(59-60)
0,008
5
24
102(58-146)
147(135-159)
0,040
HR= 5,560 (0,894-34,572)
miR-206
≥p75
<p75
10
19
No
Valorable
0,014
10
19
122(89-155)
146(135-156)
0,105
Tabla 30: Variables con influencia en la SLE de los luminales B con dos
seguimientos distintos (60 y 185 meses). Se muestra el número de casos para cada
categoría con su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de
Kaplan-Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank.
Se aporta el valor de Hazard Ratio (HR) para las variables independientes.
El análisis de las variables asociadas a la SLE a corto plazo señaló como
posibles factores de confusión a la expresión de EGFR, el pri-miR-17~92 y los miRNAs
Let-7a, miR-222 y miR-206. El análisis multivariante ratificó su condición de variables
codependientes (p>0,05). No se encontraron factores de confusión en la SLE a largo
plazo.
RESULTADOS
151
5.2 Supervivencia Global
Durante el seguimiento se perdieron 29 pacientes y se informaron éxitus del 25%
(47/191) de las pacientes. En nuestra serie no encontramos diferencias en la SG en
función del fenotipo (Figura 34).
Figura 34: Curvas de Kaplan-Meier para la SG en función del fenotipo.
A continuación se describen las variables que demostraron influencia sobre la SG
en la serie completa (tabla 31) y en función del subtipo (tablas 32 y 33).
Luminal A: 161 (153-169)
Luminal B: 151 (140-162)
Test Log Rank, p=0,644
HR= 0,87 (0,48-1,57)
RESULTADOS
152
TODOS N Media IC (95%) p
Log Rank
Edad
≥50 años
<50 años
140
51
151
179
143-159
172-186
0,000
HR= 6,205 (1,926-19,995)
Bilateralidad
Bilateral
Unilateral
5
182
117
161
87-146
154-167
0,066
HR= 2,853 (0,883-9,217)
Tamaño
>20 mm
≤20 mm
79
112
147
167
135-159
160-174
0,005
HR= 2,271 (1,268-4,068)
Ganglios afectos
> 3
≤ 3
15
164
132
162
104-161
156-169
0,083
HR= 2,104 (0,887-4,990)
miR-222
Sobreexpresado
Normal o reprimido
6
45
98
149
62-134
137-160
0,032
HR= 3,746 (1,021-13,750)
Tabla 31: Variables con influencia en la SG de la serie completa. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de
confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de
comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los
criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
RESULTADOS
153
Luminales A N Madia IC (95%) p
Log Rank
Edad
≥50 años
<50 años
90
29
153
182
144-163
175-188
0,004
HR= 10,596 (1,441-77,912)
Bilateralidad
Unilateral
Bilateral
3
114
103
163
63-144
155-171
0,040
HR= 4,038 (0,951-17,137)
Metástasis ganglionar
Positivo
Negativo
41
70
152
168
137-167
160-176
0,045
HR= 2,155 (0,997-4,661)
IGF1R
Sobreexpresado
Normal o reprimido
50
21
168
142
158-178
121-163
0,065
HR= 0,419 (0,162-1,087)
Tabla 32: Variables con influencia en la SG de los Luminales A. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de
confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de
comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los
criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
RESULTADOS
154
luminales B N Madia IC (95%) p
Log Rank
Edad
<50 años
≥50 años
50
22
137
168
124-150
155-181
0,045
HR= 4,005 (0,920-17,441)
Tamaño
>20 mm
≤20 mm
34
38
135
148
116-154
140-156
0,015
HR=3,350 (1,193-9,407)
Mutación PI3K G1633A
Mutado
Silvestre
3
48
110
152
80-141
138-166
0,088
HR= 3,484 (0,757-16,032)
miR-222
Sobreexpresado
Normal o reprimido
5
24
89
146
50-128
135-158
0,006
HR= 6,466 (1,415-29,542)
miR-21
Normal
Reprimido
12
13
107
150
86-129
137-163
0,017
HR= 3,045 (0,612-15,161)
Tabla 33: Variables con influencia en la SG de los luminales B. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de
confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de
comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los
criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
155
156
DISCUSIÓN
157
DDDIIISSSCCCUUUSSSIIIÓÓÓNNN
Las distintas entidades biológicas que integran el cáncer de mama y sus
implicaciones moleculares, se han convertido en el centro de la investigación sobre esta
neoplasia durante la última década (7-8, 16, 307). Sin embargo, tal y como vuelve a
remarcarse en la reciente “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference” (29),
la aplicación de los resultados moleculares al diagnóstico clínico no se termina de
conseguir y sigue siendo una prioridad aumentar el conocimiento sobre la
heterogeneidad molecular de esta neoplasia, que permita identificar a los pacientes más
adecuados para la terapia sistémica adyuvante. Los criterios histológicos y clínicos
disponibles no logran discriminar a aquellos pacientes, que por su bajo riesgo de recaída
y su baja respuesta esperada, no deberían ser sobretratados y por tanto expuestos a
experimentar los efectos secundarios del tratamiento sin que éste vaya a derivar en
algún beneficio (308). Este problema destaca en los pacientes con tumores luminales,
puesto que existen claras evidencias de la convivencia de distintos subgrupos dentro de
esta clasificación, que radican en distintos pronósticos y distintas respuestas al
tratamiento (309-312).
La proliferación en el cáncer de mama luminal tiene su eje principal en la
hiperactivación de la señalización estrogénica, mediada principalmente por su receptor
DISCUSIÓN
158
α o ESR1. Sin embargo, su actividad no siempre discurre por la vía de señalización por
ligando sino que también es posible a través de su relación con otras proteínas (42). Tal
es el caso de los receptores tirosina-quinasa (RTKs) para el factor de crecimiento
epitelial (EGFR) y para el factor de crecimiento similar a insulina (IGF1R) y de la
quinasa citosólica c-Src, que participan en la estimulación del ESR1 a través de la
señalización de las vías de crecimiento MAPK y antiapoptótica PI3K (126). Una vez
activado, el ESR1 sólo necesita entrar en el núcleo para, con la ayuda del mediador
MED1 y sus coactivadores específicos, ejercer su función como receptor nuclear
promoviendo la transcripción de genes que favorecerán el desarrollo tumoral (153). A
este sistema de regulación de la señalización estrogénica hay que sumarle el papel de los
microARNs, moduladores selectivos de cada uno de los participantes y de las vías de
señalización principales que aportan un nuevo enfoque a la biología de estos tumores
(41, 44, 217).
En el presente estudio, se ha evaluado un panel de genes y microARNs asociados
a la señalización estrogénica en una serie de 220 tumores luminales, con la pretensión
de conocer mejor su implicación en el comportamiento de estos tumores y estudiar
cómo afectan en conjunto a su biopatología. En nuestra serie todos los tumores han
mostrado al menos una alteración en las vías de señalización y otra alteración en los
perfiles de expresión de los miRNAs. Se han detectado grandes diferencias que nos han
llevado a considerar oportuna la evaluación de nuestra serie clasificando a los tumores
en función de su fenotipo y de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
DISCUSIÓN
159
Luminales A silvestres
En los luminales A silvestres cabe destacar el papel del IGF1R. En general, la
sobreexpresión de IGF1R por sí sola parece comportarse como un factor de buen
pronóstico, en consonancia con los resultados de otros autores (102, 313), e incluso
parece asociarse independientemente a tasas mejores de supervivencia global (tabla 32:
168 (158-178) vs 142 (121-163) meses, p(Log Rank)= 0,065; HR (Cox)= 0,419 (0,162-
1,087)).
El comportamiento mostrado por el EGFR es totalmente contrario al del IGF1R.
En los luminales A, encontramos una asociación con tumores de alto grado de
diferenciación, en consonancia con los resultados obtenidos por Gallardo en su serie de
tumores HER-2 (113), a lo que hay que sumar un incremento del riesgo de metástasis
ganglionar en un grado ≥N2 y una mayor presencia en tumores de mujeres jóvenes que
afianza más todavía su potencia como marcador de mal pronóstico en estos tumores. Sin
embargo sus niveles de expresión suelen ser bajos y no se sobreexpresó en ninguno de
los tumores luminales A silvestres, primando además su represión en este subtipo
(98,5%). Por lo que entendemos que su participación en la oncogénesis de estos tumores
es mínima.
El papel del c-Src en este subgrupo es más complicado y parece modificarse en
función de otros factores. La sobreexpresión del c-Src se muestra como un factor de
protección frente a la metástasis ganglionar (tabla 15) en estos tumores, de acuerdo con
otros autores (137). Sin embargo, la sobreexpresión de c-Src disminuye la SLE a largo
plazo (tabla 29) y los tumores luminales A que expresan RPG al menos en el 10% de
sus células, que suelen tener buen pronóstico y en nuestra serie han demostrado valores
mejores de SLE a corto y largo plazo en estos tumores (tabla 29), expresan menos c-Src
DISCUSIÓN
160
que los tumores que expresan RPG en menos del 10% de sus células (figura 23). El c-
Src puede actuar sobre muchas de las vías celulares en función de la señalización que
reciba. Se ha demostrado que c-Src puede ser activado por el RE (a través de su
dominio SH2) y por RPG (a través de su dominio SH3) (314), por lo que es posible que
al aumentar la cantidad de RPG compita con el RE por la unión con el c-Src y
modifique su actitud.
El MED1, no se relaciona con ninguna de las variables clínico-patológicas en
estos tumores. Sin embargo su sobreexpresión tiende a asociarse a una SLE menor a
corto plazo y, de forma codependiente con el c-Src, también a largo plazo (tabla 29). En
este sentido, ya otros autores han demostrado que está implicado en la reaparición de la
enfermedad en los tumores dependientes de la señalización estrogénica (315) e incluso
que es necesario para la adquisición de resistencia tanto a fulvestrant (316) como a
tamoxifeno (317).
Estos tres factores (IGF1R, cSRC y MED1) aparecen correlacionados con la
expresión génica de ESR1 (tabla 26) en los luminales A silvestres, por lo que
consideramos que estarían respondiendo a la señalización estrogénica en los luminales
A. Entendemos que el ESR1, en su faceta de factor de transcripción, y ayudado en sus
funciones por el MED1 (155), estaría promoviendo la transcripción del IGF1R y el c-
Src (318), que a su vez protenciarían esta misma vía y otras (como la PI3K y la MAPK)
para evadir la apoptosis y mantener el crecimiento tumoral. Sin embargo estos
mecanismos oncogénicos sólo permitirían un crecimiento del tumor a ritmos lentos,
explicando el buen pronóstico de estos tumores y su mayor SLE (figura 32).
Por otro lado, el IGF1R también se correlaciona en este grupo de tumores con el
pri-miR-17~92 (Tabla 26), que a pesar de sus posibilidades oncogénicas parece
DISCUSIÓN
161
vinculado a su buen pronóstico, tendiendo a sobreexpresarse en los tumores <20 mm.
En línea con la explicación que dábamos antes, la actividad transcripcional del ESR1
debería ser responsable de la estimulación de la expresión del cluster a través de la
actividad de c-Myc y E2F1 (64, 217), y de hecho encontramos que aparece una
correlación positiva con el nivel de expresión inmunohistoquímica del ESR1
únicamente en este grupo (Tabla 23), y entendemos que no se alcanza la significancia
estadística por el tamaño de nuestra muestra. Sin embargo, el pri-miR-17~92 también
muestra una gran correlación con el EGFR (Tabla 26), que es la única de las
alteraciones que hemos encontrado asociada a mal pronóstico en los luminales A
silvestres. Es posible que el cluster esté jugando un doble papel en estos tumores,
regulando su desarrollo a nivel transcripcional y participando en la dirección de la
actividad de sus vías. Uno de sus principales genes diana, más concretamente del miR-
17 y del miR-20, es el ZBTB4, cuya expresión se ha correlacionado con el aumento de
la supervivencia libre de enfermedad en tumores de mama (240). Esta proteína de unión
al DNA se ha caracterizado como uno de los principales represores transcripcionales del
factor Sp1, con la consiguiente represión de los oncogenes Sp1-dependientes (240,
319), grupo que incluye tanto al ESR1 (59-60) como al EGFR y otros genes muy
involucrados en el cáncer de mama como el BCL-2, la ciclina D1 y el VEGFR (240,
319), por lo que la expresión del pri-miR-17~92 estaría desregulando al Sp1 y
promoviendo la expresión de estos genes. Por otro lado, el cluster consta de miRNAs
capaces de inhibir la traducción de ESR1 (320) como el miR-18a (218) y de miRNAs
capaces de reprimir su función como receptor nuclear a través de la represión de su
coactivador AIB1, como el miR-17 (230). Hay que tener en cuenta que los niveles de
expresión del pri-miR-17~92 no dependen tanto del nivel de transcripción como del
nivel de procesamiento postranscripcional del pri-microARN para dar lugar a sus
DISCUSIÓN
162
microRNAs maduros, efectores finales del cluster. Se ha demostrado que la regulación
postranscripcional depende de la estructura terciaria de este cluster y provoca una
expresión diferencial de los miRNAs maduros (321), y que además, la selección de
genes dianas es dosis-dependiente (322). Así pues, entendemos que los mecanismos que
están regulando la expresión de este cluster de miRNAs y los que determinan el papel
que juegan en estos tumores podrían ser definitivos en su oncogénesis, pero para
conocerlos sería necesario analizar los niveles finales de cada uno de sus miRNAs
maduros e incluso estudios funcionales en líneas celulares y en cultivos de tumores
primarios que representaran los distintos escenarios en los que participan.
El otro miRNA que aparece correlacionado con el IGF1R es el miR-222 (tabla
26). Este hallazgo es inesperado por el carácter altamente oncogénico de este miRNA y
por su correlación negativa con la expresión inmunohistoquímica del ESR1 (tabla 22),
que si bien no alcanza la significancia estadística, corrobora los resultados publicados
por otros autores (62, 208). No hemos encontrado literatura que pueda ayudarnos a
explicar la interacción entre el IGF1R y el miR-222. Es posible que el miR-222, por su
función represiva sobre el ESR1 (62, 208), sea capaz de frenar la actividad proliferativa
derivada de la señalización estrogénica en estos tumores y por eso se correlacione
también negativamente con el Ki67 (r= -0,428, tabla 22). Además, encontramos que
este miRNA se correlaciona con el miR-206 y éste a su vez con el miR-21 (tabla 26),
por lo que es posible que exista un eje de regulación común para todos ellos.
El miR-Let-7a fue el único miRNA capaz de discriminar entre los subtipos
luminal A y B. En los luminales A silvestres se correlacionó negativamente con el Ki67,
por lo que nuestros resultados demuestran el carácter antiproliferativo de este miRNA,
que, de acuerdo con otros autores podría derivarse de su acción represora sobre la vía
DISCUSIÓN
163
cMYC-ESR1 o bien sobre Ras y la vía de las MAPK, en respuesta a la señalización
estrogénica (46).
Luminales B silvestres
En los luminales B silvestres, el IGF1R vuelve a comportarse como un factor de
buen pronóstico, de forma que se correlaciona inversamente con p53 (tabla 13) y su
sobreexpresión se asocia a tumores menores de 20 mm y de bajo grado de
diferenciación de Nottingham. Sin embargo, el resto de genes estudiados parecen
asociarse al mal pronóstico de estos tumores.
Por el contrario, el EGFR parece tener más peso en la regulación de la biología de
los luminales B, en los que su expresión por encima del percentil p75 supone un riesgo
34 (2-182) veces mayor de sobreexpresar p53 (p= 0,041) (figura 22), y además se
correlacionan con un r=0,577 (tabla 14). La asociación entre el p53 alterado y la
sobreexpresión de EGFR ya fue descrita en una serie de tumores de mama TN por el
grupo de Shapira, que propuso que el mecanismo por el que se da esta asociación es que
p53 mutante se une a la proteína p63, inhibiendo su función reguladora sobre el EGFR
(323). Sin embargo, esta asociación implica un aumento del reciclaje endosomal del
EGFR a nivel de proteína y la correlación que nosotros encontramos es a nivel
transcripcional, por lo que diferentes mecanismos deben estar colaborando a distintos
niveles. No obstante, llama la atención el rango de valores de expresión relativa del
EGFR, que si bien podría estar provocado por el calibrador de nuestra serie, Gee y su
grupo ya destacaron que los niveles de expresión del EGFR eran muy bajos en
comparación con otros RTK como el HER-2 y el IGF1R, por lo que eran necesarios
“análisis inmunohistoquímicos de alta sensibilidad”, y que precisamente esto podría
DISCUSIÓN
164
estar detrás de los diferentes resultados obtenidos en series equivalentes de tumores de
mama (108). En nuestra serie la sola presencia de expresión del EGFR es suficiente para
influir en la SLE (tablas 28 y 30) y en la SG (tabla 31), por lo que es posible que, tal y
como señalaba Shapira, el aumento de actividad del EGFR no venga derivado de un
incremento de su transcripción sino de una hiperactividad del RTK provocada por una
disminución del reciclaje endosomal o por alguna alteración constitutiva del propio
receptor. En este sentido, sería interesante estudiar la existencia de SNP o mutaciones
en el EGFR en una muestra de tumores de mama de fenotipo luminal B, o incluso
estudiar los cambios conformacionales del receptor, para esclarecer los mecanismos de
su hiperactivación.
El c-Src se comporta, en estos tumores, como un factor de riesgo para la
metástasis ganglionar (tabla 15), de forma totalmente contraria al grupo de luminales A,
y se correlaciona inversamente con la expresión del BCL-2 (tabla 16: r= -0,385),
considerado tradicionalmente como un factor de buen pronóstico del cáncer de mama.
También se correlaciona negativamente con la expresión inmunohistoquímica del ESR1
(tabla 16: r= -0,464), que puede explicarse con los resultados de algunos estudios en
modelos celulares que han comprobado la capacidad de c-Src de promover la proteolisis
del ESR1 dependiente del sistema ubiquitina/proteosoma (134).
Según nuestros resultados, en los luminales B, las células tumorales habrían
desregulado nuevas vías oncogénicas, por lo que la señalización en respuesta a E2
perdería su papel central. Como consecuencia el IGF1R, aunque continuaría estando
sobreexpresado, perdería importancia en la biología del tumor y el c-Src actuaría en
respuesta a señales de otros marcadores como el EGFR. Esta hipótesis ayudaría a
explicar los resultados discordantes en líneas de cáncer de mama respecto a la relación
DISCUSIÓN
165
entre c-Src y ESR1 (125, 134) puesto que en función de la señalización que reciba, esta
quinasa favorecerá unas u otras vías celulares.
En los luminales B, el coactivador de la transcripción MED1 se sobreexpresó 3,46
FC en los tumores bilaterales (figura 26), criterio de peor pronóstico en nuestra serie, y
se reprimió en las pacientes de edad avanzada. Consideramos que actúa como un
marcador de mal pronóstico en este grupo, en el que además, pierde la correlación con
el ESR1. En línea con nuestra hipótesis, el MED1 estaría colaborando en los luminales
B con otras vías distintas de la estrogénica, posiblemente con la vía MAPK, tal y como
señalan algunos autores (147-148). Este marcador tiene especial relevancia en los
tumores con sobreexpresión de p53. El MED1 participa en la entrada en apoptosis
dependiente de p53, al promover la expresión de MDM2 y, como consecuencia, la
degradación de p53 en los proteosomas (145) y al actuar directamente sobre el promotor
de p53 para inhibir su transcripción (146). En las células tumorales con mutaciones en
p53, como el 17,3% de los luminales B de nuestra serie, los cambios derivados de la
alteración de la secuencia de p53 alteran esta interacción, de modo que MED1 deja de
promover la transcripción de MDM2 y de inhibir al promotor de p53. Como
consecuencia se produce una sobreexpresión del gen, que unida a la disminución de su
proteolisis dependiente de MDM2, resulta en altos niveles de la proteína p53 mutada
(144, 146).
Los tumores luminales B con metástasis ganglionar mostraron niveles del pri-
miR-17~92 unas 4 veces mayores (figura 28), por lo que entendemos que tiene un papel
oncogénico en este subgrupo. El carácter oncogénico del cluster 17~92 en estos tumores
podría también derivar de la pérdida de función de p53 asociado a este grupo de
tumores. Se ha demostrado en células de cáncer de mama que el p53 es capaz de regular
a este cluster y sus dos clusters parálogos a través de la represión que ejerce sobre E2F1
DISCUSIÓN
166
(223). Esto implica que ante la mutación de p53, con la consiguiente pérdida de sus
funciones reguladoras, el E2F1 aumentaría y en respuesta a su señal aumentaría también
la expresión del pri-miR-17~92, lo que podría derivar en una actividad distinta de sus
miRNAs que la que mostraba bajo señalización estrogénica, ya que como hemos
explicado antes, la selección de los genes dianas del cluster parece ser dosis-
dependiente (322).
Tumores Luminales Mutados en PI3KCA
En nuestra serie las mutaciones en el gen PI3KCA se han descrito con una
frecuencia similar a la descrita por otros autores (71), predominando la mutación del
dominio quinasa, con un 52,6 % de los casos mutados. Las alteraciones en este exón
han sido vinculadas a tumores luminales con buen pronóstico, relacionándose con una
actividad baja de mTORC1 y una buena tasa de respuesta a la monoterapia con
tamoxifeno (324). El 77,4% de los tumores portadores de esta mutación de nuestra serie
son del subtipo A. Sin embargo nosotros también encontramos una asociación de esta
mutación con la afectación de ganglios en este subtipo (p=0,022) pues los dos casos con
más de 10 ganglios afectados portan la mutación, aunque para poder dar validez a este
resultado necesitaríamos un mayor número de casos del grupo N3.
Hay que tener en cuenta además, que en todos los tumores concurren otras
alteraciones, lo que podría estar afectando al significado pronóstico de las mutaciones:
el 88,5% tienen más de una alteración extra de las vías de señalización y el 11,5%
restante tiene alterado el EGFR; además el 77,8% presentan varios de los patrones de
expresión de los miRNAs estudiados alterados. En general, los mutantes del gen
PI3KCA expresaron el EGFR con una frecuencia muy superior a los tumores silvestres,
DISCUSIÓN
167
hallazgo que ha sido descrito previamente en una serie de tumores del subtipo Her2 por
Gallardo (113). Esta asociación puede explicarse gracias a los experimentos realizados
por Gustin y su equipo, sobre la línea de células epiteliales de mama MCF-10A
sometida a mutación dirigida con vectores, para crear clones portadores de las
mutaciones E545K o H1047R (325). Ellos observan que las células mutadas no
necesitan la presencia de EGF en el medio para crecer pero que, sin embargo, incluso a
bajas concentraciones de este ligando, responden mucho antes que las células no
mutadas activando las vías mTOR y ERK, lo que interpretan como un aumento de
eficiencia de la señalización de EGFR cuando PI3KCA está mutado. En base a esto la
concurrencia de una sobreexpresión del receptor con mutaciones en el gen PI3KCA
estaría aportando a la célula tumoral grandes ventajas oncogénicas. Al revisar el
comportamiento de los tumores de nuestra serie con ambas características, hemos
encontrado que el 75% son pacientes jóvenes (Test exacto de Fisher, p= 0,040) y que
además muestran valores de c-Src menores y valores de miR-206 mayores que el resto
de los tumores (Prueba de U de Mann Whitney, p= 0,039 y p= 0,028 respectivamente;
resultados no mostrados). En cualquier caso, sería interesante realizar estudios en series
más grandes de tumores con estas características dirigidos a entender el proceso por el
que las células mutadas consiguen aumentar la expresión del receptor, para entender
mejor sus implicaciones y para poder evaluar su influencia en la respuesta a terapias
específicas, la SLE y la SG.
En contraste, el IGF1R se expresa siempre menos en los mutantes que en los
silvestres. Esto podría explicarse en sincronía con la presencia del EGFR, pues estos
tumores ya no necesitarían al IGF1R para activar la señalización intracelular.
De forma similar al EGFR, en nuestra serie los tumores mutantes expresan el pri-
miR-17~92 mucho más que los tumores silvestres, lo que les aporta nuevas
DISCUSIÓN
168
posibilidades oncogénicas, aunque también puede estar condicionando la actividad del
ESR1. Destaca sobre todo la expresión del cluster en el 100% de los portadores de
mutación en el dominio quinasa, que se reprimió en el 40,7% de los casos silvestres en
A3140G (OR: 1,69 (1,23-2,31) p=0,037). Sabemos que al menos 2 de los miRNAs del
cluster, el miR-17-5p y el miR-19, tienen entre sus secuencias diana a PTEN (236, 326-
327), lo que implicaría una posible cooperación en la hiperactivación de la vía PI3K. Es
posible que estos mutantes sufran una hiperactivación de la vía c-myc/E2F1 que
explicaría el incremento de la presencia del cluster, que como ya hemos discutido
previamente, se encuentra bajo regulación de estos oncogenes (328).
La presencia de mutaciones en nuestra serie afecta también enormemente al
comportamiento a nivel génico y de proteína del ESR1. Las variaciones en los patrones
de correlación encontrados entre las variables inmunohistoquímicas en función de la
presencia de mutaciones y del subtipo luminal (tabla 12), concretamente el cambio que
muestra el RE en los luminales A. En los tumores silvestres encontramos una
correlación con el BCL-2 propia de los tumores con buen pronóstico y una correlación
de este último con el p53, coherente en respuesta a la necesidad de la célula de mantener
el equilibrio apoptótico. Sin embargo esta correlación se pierde en los mutados y
aparecen nuevas correlaciones frente al RPG y a Ki67. Entendemos que puede ser el
resultado de un incremento de la actividad transcripcional del ESR1, que aumenta su
correlación con su nivel proteico (RE) del r=0,007 a r=0,508 en los casos mutados
(tabla 17), lo que podría estar detrás de un aumento de expresión de los genes de
respuesta a estrógenos como el PR, y en consecuencia un incremento de la actividad
proliferativa (señalizado por un aumento de correlación entre el RE y Ki67 de r= 0,069
en los luminales A silvestres a r=0,337 (p<0,01) en los luminales A mutados). Estos
resultados podrían ayudar a confirmar los hallazgos del grupo de Pavlenko, que
DISCUSIÓN
169
vinculan la disminución del BCL-2 con un incremento de la proliferación tumoral y
destacan su importancia en el grupo de luminales A (329). Si evaluamos también las
correlaciones del ESR1 a nivel de mensajero (tabla 17), encontramos que la correlación
entre la cantidad de mensajero y de proteína sólo es significativa en los luminales A
mutados, lo que implica que en los otros 3 grupos de tumores (luminales A silvestres y
luminales B silvestres y mutados) y sobre todo en el grupo de luminales A silvestres
deben existir reguladores postranscripcionales del ESR1 que están alterando sus niveles
de traducción o bien sus niveles de degradación tanto a nivel de mensajero como
proteico.
Debemos destacar también la influencia de las mutaciones en PI3KCA sobre la
correlación que encontramos entre el c-Src y el miR-Let-7a, que destaca por las grandes
diferencias entre un subtipo y otro y la presencia de mutaciones (r= 0,008 y r= 0,511
para luminales silvestres A y B respectivamente vs r= -0,536 y r= 0,017 para luminales
mutados A y B respectivamente; tabla 26). En el año 2007 se demostró la regulación de
esta familia de microARNs por c-Src en respuesta a estrógenos, a través de la proteína
Lin28. Esta proteína de unión a ARN se sobreexpresa por la acción promotora de la
transcripción de NFκβ en respuesta a la señalización de c-Src (245) y es capaz de
impedir la maduración del miR-Let-7a y otros miRNAs de la misma familia (203, 244),
al mismo tiempo que promueve la expresión de p21 y del retinoblastoma (Rb), ambos
implicados en el control del ciclo celular (249), y sorprendentemente, también es capaz
de aumentar la traducción de IGF-II (330). Esto podría ayudar a entender la asociación
del c-Src a un buen comportamiento de los luminales A, puesto que aunque el miR-Let-
7a es en principio un miRNA supresor de tumores, las funciones del p21 y del Rb son
fundamentales para el control proliferativo de la célula, y explicaría la correlación
negativa encontrada entre el miR-Let-7a y Ki67 en estos tumores. Sin embargo
DISCUSIÓN
170
volvemos a tener problemas para explicar las diferencias halladas entre los subtipos en
base a la literatura existente, aunque por nuestros resultados se puede hipotetizar que en
los luminales B, o bien el c-Src pierde el control del Lin28, o bien este último el del
miR-Let-7a. El estudio de la expresión del Lin28 en ambos subtipos podría ayudarnos a
entenderlo.
Importancia del dominio afectado por las mutaciones
Aunque la frecuencia de las mutaciones en el dominio helical cambia ligeramente
en función del subtipo luminal, las variaciones entre subtipos no son significativas. Sin
embargo, sí que existen diferencias en cuanto al perfil de expresión génica en cada caso.
Este hecho ya fue observado por el grupo de Loi, que fue capaz de identificar distintos
patrones de expresión génica en función de la existencia de mutaciones en el gen
PI3KCA (324). Nosotros proponemos que, además, estos patrones estarían
influenciados en función del subtipo tumoral y del dominio afectado, y que también
tendrían asociados perfiles concretos de expresión de miRNAs que tendrían un papel
central en su regulación.
El dominio afectado ha demostrado una implicación en la expresión de ESR1 en
nuestra serie. En los luminales A encontramos grandes diferencias (p= 0,010), que no
encontramos en los luminales B (tabla 24). Sin embargo, si valoramos la relación frente
a la cantidad de proteína ESR1 (% de células positivas por IHQª), observamos que en
los luminales B mutantes del dominio helical la relación es mucho menor. Con los
luminales A mutantes del dominio quinasa ocurre exactamente lo contrario, que una
expresión muy baja del mensajero da lugar a una cantidad de proteína mucho mayor de
la esperada. Esto podría ser un reflejo de la existencia de reguladores transcripcionales y
DISCUSIÓN
171
postranscripcionales del ESR1 que están actuando en los tumores mutados. En este
sentido, los mutantes del dominio helical con fenotipo luminal B tienden a expresar
hasta 3 veces más el miR-Let-7a que los mutantes con fenotipo luminal A (p= 0,076) y
además en los luminales B se expresa en el 75% de los mutantes del dominio helical
mientras que se reprime en todos los mutantes del dominio quinasa y en un 87,5% de
los tumores silvestres (p= 0,032). Dado que este miRNA inhibe la traducción del ESR1
uniéndose a la región 3’UTR de su mensajero (66), podría ser el responsable de la
regulación postranscripcional en el caso de los luminales B. Sin embargo, en el caso de
los luminales A, la represión de la expresión de ESR1 se da a nivel transcripcional por
lo que deben haber otros reguladores implicados, como podrían ser los miRNAs del
cluster miR-17~92, puesto que en los tumores luminales A mutados la expresión del pri-
microARN se correlaciona inversamente con el ESR1 (r= -0,667; p= 0,05; Tabla 26) y
se ha demostrado que los miRNAs del cluster miR-18a y miR-19a regulan directamente
a ESR1 (320), y el miR-17 regula su función transcripcional a través de la represión de
su coactivador AIB1 (44, 230).
Nuestros resultados también nos permiten proponer al miR-222 como regulador
de la expresión de ESR1 (62, 208). En nuestra serie este miRNA es sobreexpresado en
los luminales A con mutaciones en el residuo E545, lo que podría explicar porqué los
mutantes en el dominio helical de este fenotipo expresan la misma cantidad de proteína
ESR1 que los mutantes en el dominio quinasa con fenotipo luminal B, teniendo una
expresión relativa mayor. Además también este miRNA tiene entre sus dianas a PTEN
(212, 269-272), lo que colaboraría con la sobreactivación de la vía PI3K.
Los portadores de mutaciones en el dominio helical sobreexpresan el miR-21
(OR= 11,31 (1,06-127,24); p= 0,045). Este hallazgo tiene especial relevancia porque el
miR-21 también regula la expresión de PTEN y podría suponer una colaboración entre
DISCUSIÓN
172
este miRNA, el miR-17-5p, el miR-19 y el miR-222 para contribuir a una mayor
sobreactivación de la vía PI3K en estos tumores a través de la represión del gen
supresor tumoral. La sobreexpresión del miR-21 puede estar conectada a la
sobreexpresión de ESR1 en estos tumores (64). Sin embargo, deben existir otros
mecanismos que estimulen su expresión, puesto que el ESR1 en presencia de Akt
sobreactivado, sólo interacciona con un sitio del promotor del miR-21 (46). De hecho
nuestros resultados nos permiten proponer de nuevo la regulación del miR-Let-7a como
posible colaborador a este hecho. Uno de los genes diana de este miRNA es la IL-6, a
través de la cual regula la vía IL-6/NFκβ/STAT3 (206, 244-245). Dado que el miR-21
tiene un sitio de regulación para el STAT3 en su promotor (331-332), la represión del
miR-Let-7a en los luminales A es otra posible explicación a la sobreexpresión del miR-
21 en estos tumores.
En cuanto al valor pronóstico de las mutaciones, nuestros resultados indican que
también difieren en función del residuo y del dominio al que afecten. Así, hemos
detectado que la mutación el riesgo de recidivar para los luminales A mutantes del
dominio helical G1633A es 3,29 veces mayor (p= 0,057), tendiendo a relacionarse con
una disminución de la SLE de los luminales A a largo plazo (HR= 3,151 (0,862-
11,514); p= 0,067). Además, en los luminales B, esta misma mutación muestra una
tendencia a la asociación con la disminución en la SG (HR= 3,484 (0,757-16,032);
p=0,088). Estos resultados concuerdan con los hallazgos del grupo de Barbareschi, que
estudian una serie de 45 tumores (21 casos con mutaciones en el dominio quinasa y 24
casos en el dominio helical) y encuentran que las mutaciones en este último representan
un riesgo de recidiva y de muerte casi el doble del riesgo que representa la presencia de
metástasis en ganglios (333). Para explicar sus resultados Barbareschi se basa en el
DISCUSIÓN
173
hecho de que las mutaciones en los residuos E542 y E545 afectan a la función
reguladora de la subunidad p85 sobre la subunidad p110 de la enzima PI3K, lo que
supone que además de que la enzima está sobreactivada no pueda ser inhibida, si a esto
añadimos la represión de PTEN ejercida por el miR-21 en estos tumores podemos
concluir que la hiperactivación de la vía será mucho mayor que en el caso de los
mutantes del dominio quinasa, que mantienen su susceptibilidad a la inhibición y, en
principio, la regulación de PTEN intactas (334). Aunque los estudios in vitro e in vivo
sugieren que ambos tipos de mutaciones incrementan la actividad de la vía, estos
hallazgos podrían indicar diferentes efectos biológicos en función del dominio afectado
que podrían ser relevantes en cuanto al enfoque terapéutico. De cualquier forma, lo que
trasciende de nuestros resultados es que las mutaciones en el dominio helical tienen
muchas más consecuencias para el comportamiento de los tumores luminales A que las
mutaciones en el dominio quinasa, y que la participación de los microARNs en la
regulación de este tipo de tumores es posiblemente la causa de la controversia de estas
mutaciones entre las distintas series estudiadas. Con respecto a los luminales B, destaca
en este sentido el miR-Let-7a, que se expresa en el 75% de los mutados en el dominio
helical mientras que se reprime en todos los mutantes del dominio quinasa. Sería
interesante realizar estudios funcionales sobre tumores primarios de cáncer de mama
con ambos fenotipos con moléculas siARN o anti-miR, que demostrasen hasta qué
punto estos microARNs son responsables de la biología de estos tumores. En cualquier
caso, en vista de los resultados encontrados en nuestra serie, y en consonancia con otros
autores (71, 113, 325), las implicaciones de las mutaciones en el gen PI3KCA no
pueden evaluarse en solitario puesto que hemos demostrado que otras alteraciones
concurren con ellas y modifican sus consecuencias para el desarrollo del tumor. Parece
necesaria la repetición de estos análisis en series mayores, dado que debido a la
DISCUSIÓN
174
frecuencia de las mutaciones, no hemos podido evaluar bien su influencia en función del
subtipo y del dominio mutado en la SLE y la SG, aunque parece probable que existan
diferencias a tener en cuenta.
Influencia del tiempo de seguimiento en la elección de criterios de SLE
En la “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference” (29), el panel de
expertos consideró pertinente diferenciar los paneles de marcadores moleculares
capaces de discriminar entre SLE a corto y largo plazo de seguimiento con un punto de
corte de 5 años. Dadas las posibilidades de nuestra serie, hemos considerado interesante
estudiar estas diferencias en nuestro estudio.
En la serie completa (tabla 28), el p53≥20%, el RE≥10% y el RPG≥10% muestran
una asociación independiente con la SLE únicamente a largo plazo. Sucede lo contrario
con el miR-206, aunque la asociación de este con la SLE a corto plazo resulta ser
dependiente de la expresión de EGFR.
En el grupo de luminales A, el RE≥10% vuelve a mostrar una asociación
independiente con la SLE únicamente a largo plazo, acompañado de otros criterios
como la presencia de la mutación G1633A, la sobreexpresión del c-Src y la presencia de
expresión de MED1 (estos últimos de forma codependiente).
En los luminales B, sin embargo, muchos de los marcadores estudiados sólo
tienen influencia en la SLE a corto plazo (expresión de EGFR, sobreexpresión ≥p75 del
miR-206 y del pri-miR-17~92 y sobreexpresión del miR-Let-7a). No obstante, en este
grupo los marcadores miR-21 y miR-222 mantuvieron su influencia sobre la SLE tanto
a corto como a largo plazo.
DISCUSIÓN
175
Estas diferencias corroboran la necesidad de discriminación temporal de los
marcadores moleculares realizada por el comité de expertos de la “14th St. Gallen
International Breast Cancer Conference”.
DISCUSIÓN
176
177
LLLIIIMMMIIITTTAAACCCIIIOOONNNEEESSS
El estudio realizado puede presentar algunas limitaciones, que quedan recogidas
en los siguientes apartados:
1. La clasificación de los tumores luminales se estableció, tal y como se
explica en la página 73, en base a los criterios aconsejados en la 13th St Gallen
International Breast Cancer Conference, ajustando los valores de Ki67 y p53 a los de
nuestro propio hospital. Sin embargo, en la 14th St Gallen International Breast Cancer
Conference de agosto de 2015, el panel de expertos volvió a considerar insuficientes
estos parámetros para poder diferenciar correctamente entre estos subtipos. Una
mayoría del panel de expertos estaba dispuesto a aceptar un valor umbral de Ki-67 en el
rango de 20 - 29% para distinguir el subtipo luminal B, aunque alrededor de una quinta
parte consideró que Ki67 no era un buen criterio y que podría ser sustituido por el uso
conjunto de múltiples marcadores moleculares. Así pues, es posible que nuestros
resultados estén sesgados por los criterios que hemos utilizado para diferenciar entre
ambos subtipos (Ki67 y/o p53≥15%).
2. Para poder establecer con rigor los mecanismos de regulación génica es
preciso contar con experimentos en cultivos celulares en los que realizar estudios de
transfección, sobreexpresión y silenciamiento de genes o incluso trasladar esta
experimentación a modelos animales. Sin embargo, el presente trabajo se ha centrado en
la cuantificación de los niveles de expresión. Aunque las relaciones entre los factores
moleculares estudiados ya han sido previamente probadas y publicadas, sería necesario
comprobar nuestros resultados a un nivel experimental y no sólo observacional.
178
4. El tamaño muestral del subtipo luminal B puede condicionar que no se
encuentren asociaciones estadísticamente significativas y sólo se observen tendencias a
la asociación entre algunas de las variables estudiadas.
5. Para poder certificar la influencia de las mutaciones en el gen PI3KCA
en el resto de variables moleculares y, en general, en el comportamiento de los tumores,
sería aconsejable la realización de experimentos con mutagénesis dirigida y la
repetición de estos estudios en series humanas más largas con cada mutación.
6. En este estudio no se ha evaluado la terapia adyuvante recibida por las
pacientes. Sería muy interesante recoger el tipo de terapia administrada, así como la
dosis y la duración total del tratamiento, con el fin de estudiar su influencia en el PLE y
la SG en combinación con los factores moleculares analizados. Del mismo modo,
podrían buscarse entre estos factores aquellos que pudiesen haber tenido un papel
decisorio en la respuesta a la terapia adyuvante recibida.
179
CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSIIIOOONNNEEESSS
1. El único marcador molecular estudiado capaz de discriminar entre los subtipos
luminales A y luminales B en nuestra serie fue el miR-Let-7a.
2. La oncogénesis de los tumores luminales A parece estar dirigida por la vía de la
señalización estrogénica, que contribuye al mantenimiento de las células
tumorales aunque con un crecimiento lento que explica su habitual buen
pronóstico. Siempre y cuando otras vías de señalización no se hayan visto
alteradas, la hormonoterapia debe ser suficiente para tratar este tipo de tumores.
3. Los tumores luminales B, han sufrido alteraciones que relegan la vía estrogénica a
un segundo plano y progresan a través de la activación de otras vías con mayor
potencial oncogénico, lo que explica su menor supervivencia libre de enfermedad
y la necesidad de terapias más agresivas. En estos tumores, la participación de los
microARNs es mayor.
4. La influencia de las mutaciones en el gen PI3KCA sobre la biopatología del
cáncer de mama depende del dominio afectado y del fenotipo tumoral.
5. La concurrencia de varias alteraciones moleculares modifica el comportamiento
de los tumores luminales A y B, por lo que sería necesario establecer paneles
moleculares que permitiesen predecir con mayor rigor su pronóstico y la
180
individualización del tratamiento, así como marcar el seguimiento clínico
necesario para estos pacientes.
6. Los marcadores pronósticos de supervivencia libre de enfermedad parecen ser
útiles durante un tiempo de seguimiento concreto, dependiendo probablemente de
la progresión del tumor y la adquisición de nuevas alteraciones moleculares que
sustituyen a las que participaron en etapas más tempranas de la oncogénesis. Por
tanto es necesario testar su validez en distintos tiempos de seguimiento antes de
emplearlos como marcadores pronósticos aplicados a la práctica clínica.
7. El EGFR, aunque se sobreexpresa con una baja frecuencia, podría ser un potente
marcador de pronóstico para los tumores de mama luminales. Su participación en
la oncogénesis de los luminales B está en estrecha relación con la existencia de
mutaciones en el p53 que provocan su sobreexpresión. Son necesarios estudios
que clarifiquen las alteraciones responsables de la hiperactivación de este receptor
tirosina-quinasa en estos tumores.
8. Los microARNs miR-222 y miR-21 han demostrado en nuestra serie una
clara influencia sobre el pronóstico de los luminales B, asociándose a tiempos
menores tanto de supervivencia libre de enfermedad como de supervivencia
global, por lo que podemos sugerir su utilidad como marcadores pronósticos de
estos tumores.
181
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