ALTERACIÓN DE LAS VÍAS DE TRANPORTE DE MEMBRANAS POR PATÓGENOS VACUOLARES

Los fagocitos de mamíferos controlan eficazmente las infecciones bacterianas a través de la fagocitosis, proceso por el cual las partículas que se envuelven en la superficie celular son transportadas a los lisosomas para su destrucción.

Sin embargo, los patógenos intracelulares han desarrollado mecanismos para evitar este destino. Muchos patógenos bacterianos utilizan sistemas de secreción especializados para entregar a las células huésped proteínas que destruyen las vías de señalización que controlan el transporte de membrana. Estos efectores bacterianos modulan la función de las proteínas que regulan el transporte de membrana y alteran el contenido de fosfolípidos de las membranas. Esclarecer la función bioquímica de estos efectores ha proporcionado una mayor comprensión de cómo las bacterias controlan el transporte de membrana para crear un nicho de replicación en el huésped y proporcionan información sobre la regulación del transporte de membrana en las células eucariotas.

INTRODUCCIÓN

Cuando las células fagocíticas encuentran bacterias, ellas tienen la capacidad de fagocitarlas y transportarlos dentro de una vacuola llamada fagosoma, un compartimento que tiene similitudes con los endosomas tempranos y adquirirá secuencialmente proteínas del huésped que regulan la biogénesis y el transporte de este orgánulo. Rab5 es una GTPasa fundamental para las decisiones inmediatas de transporte de la membrana después de la fagocitosis. El Rab5 activado es reclutado en el fagosoma poco después de la fagocitosis y es necesario para la maduración del fagosoma a través de la contratación de un gran número de proteínas efectoras. Rab5 se sustituye por Rab7 en un proceso llamado conversión de Rab, que se requiere para la posterior fusión del fagosoma con los lisosomas para generar el fagolisosoma.

El fagolisosoma es ácido y enriquecido en proteasas, condiciones que promueven la degradación bacteriana. Las bacterias patógenas intracelulares han evolucionado diferentes estrategias para contrarrestar la vía endocítica y evitar ser degradadas en los lisosomas. Algunas bacterias, tales como Coxiella burnetii, son capaces de sobrevivir en un compartimento que se deriva de la fusión de la vacuola con los lisosomas.

Otras bacterias han adquirido mecanismos para escapar de la vía lisosomal. Shigella flexneri y Listeria monocytogenes escapan del fagosoma antes de su fusión con el lisosoma para alcanzar el citosol del hospedador, donde pueden replicar intracelularmente.

Muchas bacterias, como Salmonella enterica serovar Typhimurium o Legionella pneumophila, modifican de forma activa las vías de transporte vesicular del hospedero para evitar la fusión de la vacuola en la que residen con los lisosomas, un proceso que es necesario para la creación de un orgánulo especializado favorable para la replicación.

El estudio de los mecanismos utilizados por las bacterias patógenas para subvertir (ALTERAR) las vías del hospedero tiene dos objetivos principales. En primer lugar, la comprensión de cómo estas proteínas efectoras funcionan, proporciona información

importante sobre el mecanismo de infección de la célula huésped y podría conducir al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para tratar estos patógenos.

En segundo lugar, porque las bacterias interrumpen los procesos de eucariotas, por lo que ellas pueden ser utilizadas como herramientas para diseccionar las vías de eucariotas. Informes procedentes de estudios sobre muchos patógenos diferentes muestran que las vías de transporte vesicular son manipuladas de diversas maneras por bacterias intracelulares, y la comprensión de cómo las bacterias manipulan estas vías podría proporcionar una comprensión más profunda de la regulación homeostática de transporte de membrana en las células eucariotas.

Por lo tanto, esta revisión se centrará en las estrategias generales utilizadas por diferentes bacterias para crear un orgánulo especializado que promueve la supervivencia y la reproducción, con ejemplos concretos de caer en el amplio contexto de la manipulación patógena de la composición fosfoinositida de las membranas, la manipulación del citoesqueleto del hospedero, y la modulación de las pequeñas GTPasas.

SUBVERSIÓN FOSFOINOSITIDA POR PATÓGENOS VACUOLARES

La subversión de lípidos por patógenos se está convirtiendo en un proceso crítico para la infección microbiana. Las bacterias son capaces de subvertir los lípidos del host para el metabolismo o para la formación de las vacuolas en las que residen. En muchos patógenos, las proteínas efectoras que pueden detectar los lípidos del host y modificar los componentes fosfoinositidos en las membranas se están encontrando por el papel crítico que juegan en el control de transporte vesicular en la célula.

El Fosfatidilinositol (PI) y los fosfatos (PIP) tienen funciones importantes en la regulación de las vías implicadas en la transducción de señales y en el transporte vesicular. El anillo de PIP fosfoinositol puede ser fosforilado de forma reversible en las posiciones 3, 4, y 5, pudiendo generar hasta siete especies diferentes de PIP. Las firmas de PIP en la membrana median el reclutamiento de proteínas por orgánulos específicos que regulan el transporte vesicular. Quinasas y fosfatasas específicas actúan en conjunto para regular ajustadamente el estado de fosforilación de los PIP, por lo que la regulación de la localización de estas enzimas es crítico para controlar el transporte vesicular en la célula. Los agentes patógenos han desarrollado mecanismos para modificar las firmas de membrana, tanto directa como indirectamente, mediante el control del estado de fosforilación de PIPs en las vacuolas en el que residen, lo cual es crítico para modular el transporte de este orgánulo -ocupado por el patógeno-.

Las especies PI(4,5)P2 y PI(3,4,5)P3 se encuentran principalmente en la membrana plasmática y son críticos para el reclutamiento de la maquinaria celular importante para la fagocitosis (Figura 1 A). Una vez que los fagosomas se han formado, las principales especies de PIP que se encuentran en el orgánulo son PI3P. Las proteínas que contienen motivos de reconocimiento PI3P son reclutados para el endosoma, induciendo la maduración de las etapas finales endosomales y fagolisosómico. Las bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para manipular los niveles de PI3P en las vacuolas de membranas. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tiene como objetivo disminuir el nivel de PI3P en la vacuola para prevenir la maduración de la fagosoma en una etapa temprana en el transporte endocítico, mientras que S. typhimurium aumenta los niveles de PI3P en la vacuola para estimular la biogénesis de un compartimento único con propiedades de endosomas tardíos.

Agotamiento PI3P por Mtb

Mtb sobrevive en células huésped por retrasar la maduración fagosoma en una etapa temprana (Fig. 1B) . Las vacuolas que contienen Mtb se enriquecen de Rab5 pero en gran medida desprovisto de Rab7 , lo que sugiere que la maduración endocítica de este compartimento se estancó poco después de la fusión con los endosomas tempranos en la célula ( Vía et al . , 1997 ) . Los mecanismos por los cuales Mtb controla el transporte de membrana parecen ser diversos y aún no se entienden completamente. Muchos factores bacterianos, proteínas , así como lípidos , se han asociado con el deterioro de la vacuola para madurar. Curiosamente, además de la presencia de Rab5 , se demostró la presencia de los efectores EEA1 de Rab5. Tanto las proteínas reguladoras de unión PI3P, fallan a acumularse en las vacuolas contenidas de Mtb ( MCV ) y que la ausencia de estos factores afecta la maduración endocítica de esta vacuola . Sabiendo que PI3P es importante para la localización de proteínas implicadas en la maduración de los compartimentos endosomales, se demostró que los niveles de PI3P en vacuolas que contienen de Mtb en vivo fueron reducidos en comparación con vacuolas que contienen perlas o bacterias muertas, lo que indica que Mtb puede prevenir activamente la adquisición o agotar PI3P de la vacuola en el que reside.

Dos estrategias complementarias parecen ser utilizadas por Mtb para reducir los niveles PI3P sobre la MCV. La micobacteria, derivada del lípido manosa - capsulado lipoarabinomanano- (ManLAM ) detiene la maduración de la MCV por un mecanismo que implica la supresión de la PI3 quinasa hVPS34 , la quinasa implicada en la producción de PI3P en los endosomas tempranos. ManLAM suprime hVPS34 al interferir con los flujos de Ca2 + , que inducen una cascada de señalización que activa hVPS34 ( y por lo tanto la producción PI3P ) en la membrana fagosoma. Sin embargo, el aumento de Ca2 + a nivel intracelular de la célula no es suficiente para restablecer el nivel PI3P en el fagosoma, lo que sugiere que Mtb tiene actividades adicionales que suprimen la maduración endosomal. SAPM es una fosfatasa producida por Mtb que puede desfosforilar PI3P in vitro. SAPM es secretada por Mtb y es suficiente para bloquear la fusión endosoma fagosoma-tardío in vitro en un mecanismo de PI3P - dependiente. El consumo de fosfato por una proteína bacteriana entonces puede representar otro mecanismo utilizado por Mtb para disminuir los niveles PI3P en la vacuola.

Es intrigante que la Mtb vacuola recluta vesículas endosomal tempranas mientras que bloquea la fusión con endosomas tardíos y lisosomas. Mtb produce un lípido superficie llamada manósido PI (PIM) que es muy similar a los PIP. PIM se ha demostrado que induce la fusión de la fagosoma con los endosomas tempranos in vitro e in vivo (Vergne et al., 2004), y se cree que la fusión estimulado-PIM de los endosomas tempranos ayuda a mantener la integridad vacuola para equilibrar las actividades inhibidoras que previenen la adquisición de membranas adicionales a través de la fusión con endosomas tardíos y lisosomas.

Aunque la proteína SAPM es secretada por Mtb, y los lípidos ManLAM y PIM han sido reportados por cruzar la membrana de la vacuola (Beatty et al., 2000), el cómo estos productos ejercen su función en la cara citosólica de la membrana de la vacuola no queda claro. Otra posibilidad es que SAPM y los lípidos ManLAM y PIM alteren las propiedades biofísicas de la membrana de la vacuola de la cara luminal del compartimiento.

Metabolismo de PI por la proteína S. Typhimurium SopB.

S. typhimurium también es capaz de subvertir el tráfico normal hacia el compartimiento de fagolisosoma, a pesar de que un estudio indica al menos una fusión parcial con lisosomas. Efectores entregados por dos islas de patogenicidad codificados T3SSs diferentes son fundamentales para el desarrollo de la vacuola contenida de S. typhimurium ( SCV ) y para la creación de un orgánulo que permita la supervivencia intracelular.

SopB es un efector T3SS con homología con las fosfatasas de inositol eucariotas y ha demostrado tener una actividad de la fosfatasa contra diferentes PIP in vitro ( Norris et al . , 1998 ) . Las vacuolas que contienen S. typhimurium adquieren PI3P muy rápidamente después de la fagocitosis, y PI3P permanece asociado con la vacuola durante un período prolongado (Fig. 1 C ) . En contraste , una cepa SopB reside en una vacuola que contiene PI3P sólo transitoriamente ( Hernández et al . , 2004 ) . SopB parece suficiente para generar PI3P en vacuolas , dado que la expresión de la proteína SopB en células de mamífero inducirá la formación de grandes vesículas macropinocíticas en el que PI3P está presente ( Hernández et al . , 2004 ) .

El mecanismo de la producción PI3P por SopB está claro. Se ha sugerido que PI3P resulta de la actividad de la fosfatasa de SopB en PI (3,5 ) P2 y PI ( 3,4,5 ) P3 . Sin embargo , también se ha demostrado que la generación de PI3P en el SCV es sensible a la wortmanina , que bloquea la actividad quinasa PI3P del host , lo que sugiere PI3P origina a partir de la fosforilación de acogida de PI . Esto puede indicar que SopB recluta indirectamente la PI3P quinasa hVPS34 en el SCV ( Mallo et al . , 2008 ) , tal vez mediante la creación de firmas PIP que mejoran el reclutamiento de los reguladores hVPS34 , incluyendo Rab5 . Los datos recientes pueden dar una idea de por qué la generación PI3P beneficiaría maduración del SCV. Clasificación nexin 1 ( Bujny et al. , 2008 ) y la clasificación nexin 3 ( Braun et al. , 2010 ) es reclutado a la SCV en un PI3P - y de manera SopB dependiente (Fig. 1 C). Se requiere que estos reguladores del host de transporte de membrana para la replicación normal del S. Typhimurium en las células. También se ha demostrado que se requiere el reclutamiento de los PtdIns ( 5 ) quinasa PIKfyve , un efector de PI3P , a la SCV para la formación de la SCV ( Kerr et al . , 2010 ) . Por último, se ha sugerido que el cambio en la carga electrostática en la superficie de la SCV resultante de actividades mediadas por SopB podría ser suficiente para alterar el reclutamiento de efectores específicos ( Bakowski et al 2010 ).

Las actividades de SopB también ayudan en el proceso de absorción de S. typhimurium por las células no fagocíticas. Curiosamente, SopB posee múltiples sitios de ubiquitinación, y un estudio reciente indica que el estado de la ubiquitinación de la proteína permite que la proteína tenga funciones distintas al afectar la localización de SopB a las membranas (Patel et al., 2009). La ubiquitinación de SopB ha demostrado ser importante para la localización de la proteína a la SCV y para promover el reclutamiento de Rab5 a la vacuola, pero la ubiquitinación de SopB no parece ser necesario para las actividades que promueven la entrada de bacterias. Por lo tanto, este efector S. typhimurium utiliza la maquinaria de modificación postraduccional de acogida para regular espacialmente funciones que afectan a los diferentes procesos de la célula huésped.

LA SUBVERSIÓN DEL CITOESQUELETO POR PATÓGENOS VACUOLAR

Lo central para la mayoría de los procesos de transporte de membrana son el movimiento de vesículas y túbulos lo largo de la actina y microtúbulos del citoesqueleto. En la actualidad hay varios ejemplos documentados en los que las bacterias patógenas se dirigen el citoesqueleto para modular la biogénesis vacuola y mantener un orgánulo que apoya su supervivencia intracelular. Estas estrategias incluyen el control sobre los procesos de acogida que son fundamentales para el montaje de redes citoesqueleto y la modulación de las proteínas motoras que transportan la carga a lo largo de estas estructuras.

En ciertas células huésped, las vacuolas que contienen S. typhimurium mostrarán largos túbulos de membrana llamados filamentos inducidos por S. typhimurium (FIS Fig. 2 ; García - del Portillo et al , 1993 . ) . Aunque varios efectores S. typhimurium T3SS están presentes en los SIF, un efector llamada SIFA es necesario para la formación de estas estructuras. Se encontró que la proteína SIFA interactúa directamente con la proteína humana SKIP, que es una proteína de acogida que se une a la proteína motora quinesina - 1. SKIP parece funcionar como un enlazador que regula la quinesina - 1 en el aparato de Golgi y finales de endosomal y compartimentos lisosomales. Estudios estructurales han demostrado que SIFA también tiene un dominio que media las interacciones con las GTPasas de la familia Rho , y esta interacción puede activar estas proteínas mediante la estimulación del intercambio de GDP por GTP ( Ohlson et al . , 2008 ) . Por lo tanto, SIFA puede generar filamentos de membrana mediante la coordinación de ambas dinámicas y el transporte de las membranas del citoesqueleto por proteínas motoras de acogida a lo largo de estas estructuras, lo que podría dar una idea de cómo las proteínas del huésped controlan los procesos de transporte vesicular que involucran túbulos de membrana.

Un segundo efector T3SS llamada PipB2 también se encontró que era importante para la generación de los FIS durante la infección, como un mutante de S. typhimurium deficiente para PipB2 se encontró a ocupar vacuolas con más cortos FIS ( Knödler y Steele - Mortimer , 2005 ) . PipB2 también interactúa con kinesin- 1 puede participar en la contratación de este motor a la SCV. Por lo tanto, se piensa que SIFA y PipB2 ayudar en el posicionamiento de la SCV y pueden regular el transporte de membranas entre el SCV y orgánulos de host mediante el control espacialmente la actividad de quinesina - 1 y la modulación de la dinámica del citoesqueleto mediante la regulación de las funciones de Rho GTPasa . Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la dinámica de SIF son probablemente más complejo como experimentos genéticos indican de que varios otros efectores están implicados en la biogénesis de SCV y transporte. Además de la caracterización de los efectores S. Typhimurium y sus objetivos en las células eucariotas podría entonces conducir a una mejor comprensión de transporte de membrana citoesqueleto impulsada específica en eucariotas.

La mayoría de las bacterias se inactivan cuando son fagocitadas por macrófagos y leucocitos polimorfonucleares. Sin embargo, muchos microorganismos han desarrollado estrategias para sobrevivir y replicarse en estas células. Algunos usan los mecanismos fagocíticos preexistentes para su internalización, como Mycobacterium sp. y Legionella pneumophila, que se unen a fragmentos C3b del complemento lo que favorecen su captación por las células fagocíticas.

Una vez dentro de la vacuola fagocítica, algunos patógenos disuelven la membrana vacuolar y acceden al citoplasma celular rico en nutrientes, evadiendo los mecanismos bactericidas del fagocito; por ejemplo Shigella flexneri, algunas Rocketsias y L. monocytogenes; ésta última produce una hemolisina (listeriolisina O) que forma poros en la membrana del fagosoma. Otros microorganismos como Mycobacterium y Legionella, son capaces de inhibir la actividad bactericida de los fagocitos impidiendo la fusión del fagolisosoma (impiden la acidificación del fagosoma) y algunos como Coxiella burnetti, sobreviven a los agentes bactericidas liberados en el fagolisosoma (incluso requieren de factores allí presentes como señales que disparan su multiplicación intracelular).

Mtb y S. Typhimurium manipulan el destino de su vacuola través de la modificación del metabolismo phosphoinositide . ( A) fagosoma ofa maduración normal contiene bacterias no patógenas . Después de la fagocitosis , bacterias residen en una vacuola que muestra similitudes con los endosomas tempranos , en particular la presentación de la pequeña GTPasa Rab5 . Rab5 recluta la PI3 quinasa hVPS34 que produce PI3P en la superficie del fagosoma . Se requerirá la presencia de PI3P para la maduración del fagosoma a fagolisosoma por la contratación de un subconjunto de proteínas , incluyendo EEA1 . (B ) Mtb crea un nicho de replicación mediante la manipulación del metabolismo PI3P . Bloques de Mtb la activación de hVPS34 en su vacuola por ManLAM , impidiendo de este modo la producción PI3P . El mecanismo para este bloque implica la inhibición de aumento de Ca2 + , que es necesaria para la activación hVPS34 a través de una cascada que implica la calmodulina . Por otra parte, Mtb segrega SAPM , una fosfatasa que podrían estar involucrados en el ozono de la vacuola de cualquier PI3P residual. Por último , Mtb puede ampliar su vacuola por el reclutamiento de vesículas endosoma . Este reclutamiento se podría lograr por el PIM de lípidos de Mtb , un análogo de fosfoinositida . (C ) El efector S. Typhimurium T4SS

SopB genera PI3P en la membrana de la vacuola . Un posible mecanismo para el enriquecimiento PI3P a la temprana S. Typhimurium vacuola es una modulación indirecta de contratación hVPS34 por SopB . Esto da como resultado una presencia prolongada y una mayor de PI3P en la superficie vacuola . La presencia de una alta cantidad de PI3P induce posterior contratación de las proteínas PI3P vinculantes , incluyendo SNX1 , SNX3 y PIKfyve , que fueron demostrado ser necesarios para la maduración de la vacuola S. Typhimurium que contienen ( SCV) .

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