ab¡& UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

* f - .

Casa ab¡& al tiemw

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DMSiON DE ClENClAS BlOLOOlCAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

ss CBS o771 95

LIC. JULIO DE IARA ISASSI COORDINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES PRESENTE.

Por medio de la presente se hace constar que el alumno cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servicio Social:

NOMBRE: SCHACK LEFO VlVlANE

MATR¡CULA: 90337505

LICENCIATURA: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

PROYECTO: CARACTERIZACIÓN DE PROTEINAS GLOBULARES POR DlCROlSMO CIRCULAR

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, a los siete dlas del mes de Diciembre de m l novecientos noventa y cinco.

Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

M. k~ c. ROSAURA GRETHYR &LU DIRECTORA

'LPO

UNDAD VTAPALAPA Av. Miohoacin y La Punaima Iztapalapa 09340 MLxico, D.F. A.P. 55535 Fax: (5) 61240-83 Tela. 724-46-81 y 85

i-

r L C a S s h J i ~

UNNERSlaAO AUTONOMA METROPOUTANA P

.... ’CBS r I

r-

L

F

L

r L c

r- ~

L

SERVICIO SOCIAL

“CARACTERIZACION DE PROTEINAS GLOBULARES POR

DICROISMO CIRCULAR”

J

’ALUMNO: VIVIANE M. SCHACK LEFO

1 INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

ASESOR: Dr. SALVADOR R. T E L L 0 SOLIS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

NOVIEMBRE 1995 J

8 UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purisima. Col. Vicantina, 09340 M6xiui. 6.F. Tel.: 724-4800 TELEFM (5) 612 0885

L

I

D E S C R I P C I ~ N DEL FENÓMENO DE DICROISMO CIRCULAR.

.." ?- Aíiri ciimido !a inayoria de 1'3s iiiitodos cspcctroscópicos ( infrarrojo,

resoriaiicia iiiagiiética nuclear, flitoresceiicia ) son particiilaniieiite sensibles a la i

coiiipocicióii atómica de los grupos qiiiiiiicos y Iejaiiaiiieiite afectado por el

arreglo geométrico de estos g ~ i p o s o la geometría de su entorno, la actividad

óptica espectroscópica es sensible de manera única a dichos aspectos

geométricos de la estructura inolecular. Por esta razón, la actividad óptica

espectroscópica es un nietodo espectral elegido para estudios de geometria

molecular.

La actividad óptica espectroscópica se inicia coli las mediciones de

dispersión de rotación óptica, este método espectral Iia sido sustituido en su

inayoria por un método más sensible y accesible: Dicroisino Circular (DC). El

eiiteiidiiiiieiito de la espectroscopia de DC requiere coiiociinieiitos de la energía

polarizada utilizada y de la naturaleza de su iiiteraccióii con la materia.

LUZ EN PLANO POLARIZADO

La energía luminosa se coiisidera que consiste de radiación que varía

periódicaiiieiite eii los campos eléctrico y inagiético, cuyo comportamiento es

descrito por las ecuacioiies de M a w ell para un cairipo electromagnético. Los

campos eltctrico y magnético de esta radiación electroinagietica oscilan en

ángulos Iiacia la derecha de uno y otro en un plano perpendicular a la dirección

de la propagación del rayo de luz.

La luz restringida a una sola longitud de onda o frecuencia se le llama . - monocroinática.

r-

L.

2

c

... -. .__ f-

L.

.̂ . c

c

.... P-

.... c

L..

P

b

P

L

v-

b.-

c

.... c

L

c

L

c

L

c

I,? ]LIZ eii ti11 plaiio polxizxlo cs liii. rrsttiiigida irioiiocroináticaineiite por lo

que el sector elictrico oscila cii iiiia y solaiiie:ite iiiia dirección (aziniut) en el

plaiio perpeiidici!lar a !a J i w x i O i i de propayciói i del rayo. El vector

magnético de la Iiiz e:i p!aiio polarizada eiitoiices oscilar$ eii el plano

niiitiiarneiite perpeiidicular n la direccióii de propagación del rayo de luz y del

azimut de oscilacióii del vector clictrico. Coiiveiicioiialineiite, la dirección Z es

tomada coino la direcccióii de pi’opagacióii de la luz, y el eje Y es tomado

coino el aziiiiut de oscilacióii del vector ekctrico creando el plano Y-Z que es

el plano eléctrico de polarizncióii. El ejc X es tomado como el azimut de

oscilación del sector imgii t ico Iiacieiido qiie el plano X-Z sea el de

polarizacióii iriagiética.

LUZ CIRCULARMENTE POLARIZADA

El ténniiio de ‘ h z circulanneiite polarizada.” es simplemente una

rzpreseiitacióii coiiveiiieiite de los modos de ondas vibratonas que son

producidas cuando las iiiteiisidades de los dos coiiipoiieiites superimpuestos de

la onda, qiie soli polarizados eii difereiites planos, se suman. La luz

circiilaniieiite polarizada es prodiicida ciiaiido de fonna selectiva es retardado

uno de los coinpoiieiitq y sea ciialqiiirra de los coinpoiieiietes polarizados X

o Y, de la luz en plano polarizado i i i i ciiarto J e loiigitiid de onda. La figura A

miiestra la resultaiite de l a Iiiz cii-ciilannriite polarizada cuando la componente

Y es retardada i i i i cuarto de loiigitiid de onda ( 90 grados) en relación con el

componeiite X. Ciiaiido es obser\.ado hacia abajo, eii la dirección de la

propagación (eje Z), los vectores elictricos resiiltaiites rotaii, al chocar el rayo

sobre iiii piiiito de obsenacióii, de manera circiilar, en el sentido de las

P

I I

L

I I

/ I I I

c

L"

c

.... c

L_

c

L

c .

L -

c

i-

c

L.

a) Radiación incidente polatizada en un plano

b) Radiacion que emerge de un medio con actividad 6ptica

. -̂

c

c

.?. C.

L.

L

r L

c

inanecillas del reh j alrededor del tjc Z. La figiira B muestra el vector eléctrico

einergeiite qiie rota Iiacia la izqiiiei.il;i n dos tieiiipos arbitrarios t i y tz.

DESCRIPCIÓN DEL FEIVÓAIENO DE DICROISRIO CIRCULAR

Los feiióineiios de Dicroisiiio Circiilar (DC) y Dispersión Optica Rotatoria

@OR) son causados por la respiicsta de tina siistancia “ópticamente activa’’ a

la radiacibii electroinagietica Eii geiieral, la radiación induce eii un medio

material uti inoiiieiito dipolar- eléctrico p y uti irioinento dipolar magnética M

que están dados por las eciiacioiies sigtiieiites.

En las eciiacioiies aiiteriores N es el iiiiinero de sistemas o moléciials por

unidad de \oliiiiieii qiie coiistitii)eii el iiiedio, a y K son la polarizabilidad y la

susceptibilidad iiiapiética r’sspccti\ aineiite: el paráinetro p puede ser designado

como “parámetro óptico” ya que coiiio se verá inás adelante, de éste depende

la existeiicia de los Ilaiiiados ”feiióiiieiios ópticos” (DC y DOR). Los vectores

E ‘y B‘ son los vectores del caiiipo elcctrico efectivo y del campo magnetic0

efectivo de la radiación ( es decir, estos vectores son los que interaccionan a

nivel inicroscópico coil la iriol~ciilas de iiiedio inaterial ). Los vectores E’ y B‘

represeiitaii las derivadas parciales de E’ y B‘ coli respecto al tiempo. Sin

... P-

i-

P

L.

o-.

i

eiiib;irgo, Jccde iiii piiiito de \ i j i i i espcriiiiciital estainos interesados en los

caiiipos iiiacroscópicos proincdio (E Y B). Para iiiedios isotrópicos

gerieraliiieiite se Iia usado la relacioii electrosiática entre E' y E :

E'= SE (A.3)

s = ( 1 - 4nN aA) - ' doiide

Eii el caso qiic iios ocupa es coiiveiiieiite utilizar las ecuacioiies de Maxwell

para inedios inateriales eii l a fonna

doiide C es la velocidad de la luz eii el vncio. Usando las eciiacioiies A. 1, A.2,

A.3, A.4, A.5 y A.6 se obtieiie la c.ciiacioii siguieiite:

CI

F

L ..

en donde se Iia iisaio I J irlacibii V:<T'.UE=-V'E l a cual es válida cuaiido

VoE=O ( es decir, el proinedio dc la deiisidad de carga es igual a cero). Cuaiido

N = 9, la eciiacióii A.7 se rcdiice a la cciiacioii eii el vacío:

cuya soliicióii es

E = E~ exp(-ia( t - ,,c Y)]

donde z es la dirección de propagacióii y w es 2nv. En un medio inactivo

ópticamente (N * O J3 = O), la soliicióii de la eciiacióii A.7 es:

siendo q el íiidice de refraccioii , el cual está dado por

= [ 1 + 47rNSa/ I - 4ríN.Y~

(A. 1 O)

(A. 1 1)

c

b 6

.--..--- _L--

~~~,..* ~~ ~---- r-'

....

?- Ei tiniii,io que iiivoliicra ii K cs bastante iiiciicir que el correspondiente a u

por lo cii:il se acostiiiiibra igiial'ii~ el dciioiiiiiiadoi. de l a eciiacioii A. 1 1 a la

unidad, Eii el caso en que N=.O y p;.o podciiioj siipoiier qiie la eciiacióii A.7

tiene iiiiil solución de la foniia:

- F'

.- c

c

L.

r-

i.

i-

r

L._

c

(A.12)

Dicha siiposicióii conduce a la siguiente relacióii:

(A. 13)

Corno E es perpendicular a la dircccioii de propagacióa (V.E=O), su amplitud

puede escribirse coiiio E, = i El + j E2 y la eciiacióii A.12 se transforma en

donde Ii = 8 ; r N C ~ d c . El detenniiiaiite de este par de eciiacioiies homogéneas

debe ser cero, coli lo cual se tieiie qiie (17' - 17') ' - /1'17' = O . Con

una aprosiinacióii de primer orden en Ii se obtienen dos soluciones positivas

para : L

P-

i-

r- __

7

... .

cx

c

(A. 16)

Los valores de q+ y q- geiieraii a su vez dos solucioiies (tainbiéii coli tina

aproxiinacióii de priiner ordeii eii ii ) para el sisteina de ecuacioiies A.13 y

A.14: E2 = iEi y E2 = ¡El . Esto iiidica que eii iiii inedio Ópticaineiite activo se

propagaii dos fonnas de radiacióii que soli:

(A.17)

(A. 18)

Las ecuacioiies aiiteriores describeii oiidas electroinagiéticas de ainplitud

constaiite, pero que tieiieii iiiia trayectoria lielicoidal (las ecuacioiies Iiaii sido

derivadas para el vector E, pero puede deinostrarse que B tieiie uii

coinportaiiiieiito siinilar). E+ y E. se coiioceii coinúiiineiite como radiacióii

Y

~ A&-- , - ____._-.__- - ' L

r- circiilanneiite polrii-izada dcrwliii c irqiiici-cia respectivaineiite. En geiicral es

tin iiúiiiero coiiiplejo, por lo qiir 2s posiide sei- ibi i .. c

c

con estas relaciones las eciiacioiies A. 17 y A. I8 adquieren la forma -.

c

- r-

L_

r.

c-

c-

c

c

.-

r,.

(A.19)

(A.20)

Este resultado nos indica qiie eii titi iiiedio ópticaineiite activo, la radiación

polarizada eii iiii plano es resuelta en dos coinpoiieiites circulares que tieiieii

diferente velocidad de fase.

Después de viajar iiiia distancia "z" eii el inedio la diferencia de fase eiitre

E+ y E. es (mZlic)*(ii - '-ii-'). Poi- ejeiiiplo, si eii tin inedio i p i ~ .

tendretrios el feiióiiieiio de destrorotacióii del plano de polarizacióii. En la

figura 15.a liemos representado esqiieináticaiiieiite el Iiaz incidente (E)

polarizado en el plano "XZ ' ( la direccióii de propagación, "Z", es

perpeiidiciilar y hacia afuera del plano del papel) eii fiiiición de sus dos vectores

- P circu1;ircs. Eri I;r tigira I5,b i-ep~eseii~~~iiios la i-adiacióii que emerge del inedio

(para el caso ipi1.). Coiiio la fase E+ es iiiayor que la de E., se puede apreciar .._ c ..- en la figlira que el plano de polarizacióii Iia rotado tin ángulo . El vrilor de es

r- conocido coino “rotación óptica” y , en tinidades de radiaiies por unidad de L longitud del inedio, esta dado por la eciiacióii r- L

(A.2 I )

donde b’es la parte real de p. El feiióiiieiio de Dispersión Óptica rotatoria

coiistittiye siinpleineiite la mriacióii de en fiiiicióii de la longitud de onda de la

radiación.

En las ecuacioiies A.19 y A.20 se observas que la ainpiitud de los vectores

E+ y E- tainbieii depende de 2. Coino la intensidad de la radiación es

proporcional a (E)’ tenemos qiiz:

O0

I ,== I , esp (-?O~’’Z/C}

I. = I, esp {-2c~)q“z,k]

(A.22)

(A.23)

I O

-.. . __I

y por taiito los cocticiciitcs di. cxtiiiciijii corres-poiidicntes serán E*=(~u/c) rlr .

La diferencia eiitre estos dos coeticieiites es conocida como dicroisino circular

y está dada por

(A.24)

Esto quiere decir que en tin medio ópticamente activo los coinponentes

circulares de la radiación polarizada en tin plaiio tendrán diferente velocidad de

fase y diferente estiiicióii ( SI la loiigitiid de onda corresponde a una zona de

absorción del inedio). Coino resiiltado teiieinos que la radiación transmitida se

encuentra polarizada elipticaiiieiitc, como se iliistra esqueináticamente en la

figura A y B.

De los resiiltatios del trataiiiieiito anterior se observa qiie los fenómenos

ópticos (DC >. D o n ) depeiideii dcl valor de E . Es posible deiiiostrar qiie el

d o r de este paráiiietro est5 relacionado coli los inoineiitm de transición

eléctrico, < ~ i I p in> , y inagnético,<: illirilin> , de las inoléculas del sistema. Esta

relación se conoce coino la eciiaciun de Rosenfeld.

c

r-

.- c-

L_

-- , _____I --

&ride .cilI y < n i ; son dos cstx1,)s cic la iiiol2ciila con eiiergia E,, y E,,,

respectivaniente. Los v e c k x s li y iii represciitaii los operadores de los

momeiitos eléctrico y inagiiitico. Mediaiiic el LISO de la Teoría de bmipos se ha

dzmostrado que el prodiicto tieiie valor cero para moléciilas o croinóforos que

poseen centro de iiiversióii, plaiios de ieflesibii, o ciialqiiier otro tipo de eje de

rotoreflesióii. Desde Iiiego, ciialqiiier iiiolticiila que posea algiiiia de las

operaciones de siinetria iiieiicioiiadas ai-ri'ua iio presentara ninguno de los

fenómenos Ópticos y será desigiada coirio Ópticaineiite activa.

DICROISMO CIRCULAR

El Dicroisino Circtilar (DC) y la Dispersioii óptica rotatoria (DOR) son dos

fenómeiios que se eiiciieiitraii iiiterrelacioiiados y qtie soii utilizados para inedir

la actividad óptica de irioléciilas asiinétricas en solución. La DOR es la

habilidad de. la inolecula de rotar eii el plano de Iiiz linealineiite polarizada

coinó iiiia fiiiicióii de la loiigitiid de oiida. DC proporcioiia iiifonnacióii con

rescpecto a la absorcióii desigual de liiz circtilaniieiite polarizada, taiito a la

izquierda coino a la derecha., por iiioleciilas opticaiiieiite activas.

Debido a qiie hoy eii dia coiitairios coil iiistriiineiitos de alta precision, el DC

se ha establecido coino iiiia téciiica estaiidar para inedir la actividad óptica de

lac proteiiias.

Las sefialss de DC se observan eii las iiiisiiias regiones espectrales doiide se

encuentran las bandas de absorcióii de tin coiiipiiesto eii particular . Estas

P

-_I-- - c

.". . c

- r-

r--

i

r-

c..

c,

r-

c.

seiin1t.s wii pi-opoi.cioii;ii!rij pii. l o b r-cspc'cti\.os griipos croiiioforos o sii

ainbieiite iiioleciilar el cita¡ es :ij¡iiicii.¡cü.

Lab baiidas de DC cie las pi.orciii;is octirr-cii eii dos regioiies espectrales. Eii

el ultravioleta Icjaiio o rcgióii aiiiida ( 170-750 iiiii) las cual se eiicueiitra

dominada por coiitr-ibucioiies de eiilaccs peptídicos; la otra región correspoiide

al ultravioleta cercano (250-300 iiiii) c u ! ~ baiidas soil origiiiadas por

aminoácidos aroiriáticos. Adciiiis, uiiioiies disiilfiiro dan lugar a pequeíias

baiidas de DC alrededor de 250 iiiii. Ainbas regioiies espectrales proporcionkn

iiifonnacióii de diferente tipo coil respecto a la estructura de las proteíiias.

Las bandas de DC eii la regioii aiiiida coiitieiieii iiifonnación respecto a los

enlaces peptidicos y las estructiira seciiiidaria de la proteína y son

frecueiiteiiieiite ultilizadas pnra inoiiitorear los cainbios en la estructura

secuiidaria duraiite el curso de las traiisicioiies estnictiirales. En particular, la a-

hélice iniiestra uii fuerte y característico espectro de DC en la región del

ultravioleta Iejaiio. La coiitribucioii espectral de otros eleineiitos de la

estructura seciiiidaria no se eiiciieiitraii taii defiiiidos.

Las bandas de DC eii el iiltravioleta cercano se observan cuan las cadenas

aroináticas laterales soli iiiiiiovilizadas eii uiia proteíaii doblada y soli

transferidas a t in aiiibieiite asiiiihico. El DC de residuos aroináticos es ilitiy

peqiietio debido a l a auseiicia de estr-iictiiras ordenadas, coino por ejemplo,

peptidos cortos. La setial, iiiagiiitud y longitud de onda de las bandas de DC de

coiiipuestos ai'oiháticos no se piiedeii predecir, depeiideii del ainbieiite

electrónico y estructural de los croiiióforos iiiinovilizados. Por lo taiito, los

picos iiidi\.idriales en el iiiiiy coiiiplejo espectro de DC en el UV-cercaiio de

una proteiiia, iisualiiieiite iio se debcii n la traiisicióii de las cadenas laterales de

ainiiioácidos específicos

r-

P-

i.

.-I

L

r-

...

C'

.. . Ff

....

P.

L

r' .. ,- .. -

c

L .

c ., c

..-

r-

._ r"

..

Y-

&...

r-

.. ~

[>c cii:iiqiiicr iiiaiiera, el espccttv de DC cii cI UV-cercaiio, represeiita iiii

criterio altainciite especifico para el estado i ia t iw de iiiia proteiiia.

Coi:cltiyciicio, podeiiios decir de la [&mica di: DC es iriiiy í i t i l para

inoiiitorcar la tniisicióii estriictiiríil de protciiias

MEDII)/l DEL DICROSIhlO CIRCULAR

Geiieralineiite, la difereiicia eii absorbaiicia entre la luz circularmente

polarizada, derecha e izquierda, de uiia iiiiiestra dc proteiiia es estreinadaineiite

pequeiia. Eii I J regióii del iiltravioleta lejaiio se eiicueiitra eii un rango de

unidades de absorbaiicia entre 104y eii iriiiestras que presentan un total de

absorbaiicia de aprosiiriadaiiieiite I .O. Esto requiere que inenos del 0.1% de la

seiial de absorbancia sea inedida eii foima adecuada y sea reproducible. Por lo

tanto, iiistruinciitos altaineiite seiisibles soil iiececarios y es necesario que la

inuestra se prepare coli cuidado.

Instrumentos.

Espectropolaríiiietros de DC inodei-iios iitiliznii t in inodulador fotoeléctrico de

alta freciieiicia para generar alteiiiadaineiite las dos coinpoiieiites de la liiz

circulanneiite polarizada Depeiidieiido del iiistiiiineiito . la seiial puede ser

2 Tabada ya sea directaiiieiite c a n o \ilia difereiicia de absorbancia, o corno

elipticidad, expresada eii iniligrados.

El iiistniineiito de DC o p m de iiiaiiera siiiiilar a i i i i espectrofotóinetro qiie

registra la absorbancia de t i i i solo ra)'o. Uii coiiipoiieiicte adecuado para la

calibración del iiistriiiiieiiteo es el :icicto d- I O-caiiiforsiilfóiiico.

I4

L..

r-

r-

..

...

c ,

L., .

D&iJo a qiie I;is baiidas dc DC‘ %)i1 gciicrnliiiciitc iiiiiy pqiieiias se requiere

uria graii estabilidad, eii c i i d o < I l ; i sciial di: DC se refiere. Dicha estabilidad

se deteniiiiiri iitilizaiido ti113 soliicitiii bl:iiico e11 la regióii, loiigitiid dc d a , de

iiiteres por tiii detcrmiiiado periodo c k tieiiipo.La desviación eii l a dirección de

la sena1 dcbe ser iiieiior de 0.5-1 iiidegh. . .La liiiea base del espectro de la

mayor parte de los iiistrtiiiieiitus de DC piiede ser ajustada inaiiiialiiieiite o

electrónicaineiite

Las celdas que se iitilizaii para iiiedir DC deben de ser de cuarzo fusionado,

especiíicaiiieiite elaboradas para DC; iio debeii de ser birefiirigeiites. Para qiie

maiitengaii iiii biieii coiitrol de temperatura, debeii de utilizarse celdas

eiicliaqiictadas .

Los solveiites que se iitiliceii para preparar las muestras deben de ciiinplir

coil ciertas características. La coiitribiicióii de los buffers o sales a la

absorbaiicia total de la muestra debeii ser lo iiieiior posible. La inagiitiid del

DC \‘a a depeiider de la coiiceiitracióii de proteha, la cual, por lo tanto, debe

coiitribiiir eii graii parte a que la deiisidad óptica total de la muestra sea lo más

alta posible. Para inedicioiies eii la regióii del UV-lejaiio altas coiiceiitracioiies

de proteiiia debeii de utilizarse para iiiiiiiiiiizar la coiitribiicióii del solveiite a la

absorbaiicia i0t:il.

Pasteur, Vaiit Hotf y Le Be1 desan-ollaroii los priiicipios que los qtiíiiiicos

inodenios coiisideraii coiiio reqiieriiiiieiitos para qiie uiia inoléclila posea

“actividad óptica”, esto es, para qiie haga girar el plaiio de l a liiz polarizada.

Un coinpiiesto es ópticaiiieiite activo eii soliicióii, ciiaiido su estnictiira no

puede hacerse coiiicidir coli la de sii iiiiageii reflejada, es decir, ciiaiido el

Coinpiiesto iio posee ii i i plaiio o iiii ceiitro de siiiietria. Si iiii átoino de carbono

tetrakdrico está iiiiido a cuatro =riipos siistitiiyciites difereiites, se dice que es

c-

L.

r-

i..

c

c c_

c-

c_

r-

& _

c

L.

r-

_.

r- . .. C."

\-.

r-

C..

c

asiinetrico y prodiice ui;a ncti\.idiid olitica, n iiiciios qiie la iiioleciila coiiteiiga

tiii sqiiiido atoiiio de carboiio asiiiii'ti-ico siiiiilar coil los inisiiios siistituyeiites.

Por ejemplo, el icido iiiesotai~tirico y o t r a coinpuestos iiieso 110 soli

ópticaineiite activos. Eii el caso de iiiiiclios coiiipiiestos no plaiiares, tales coino

los compuestos espiro, alileiiicos y nlgiiiii>s bifeiiilos siistittiidos, piiedcii

presentarse estriictiiras asiiiiétricas coil acti\.idad optica, sin que exista un

átoino de carboiio asiiiiétrico eii la iiioléciila. Eii la misma foiina, la actividad

óptica no está limitada a los átoinos de carboiio, siiio que puede ocumr en

ciialqiiier coinpiiesto tridiiiieiisioiinl asiiiiitrico.

Algiiiias sustaiicias solo esliibeii actividad óptica eii el estado sólido

cristaliiio, Eii los cristales iio ciibico, esisteii ciiaiido ineiios dos direccioiies

primarias eii el tristal que iniiestraii diferentes distribuciones espaciales de los

átoinos y, por lo tanto, difereiites caiiipos de fuerza. La radiacióii se traiismite a

velocidades desigiiales eii las diferentes direccioiies. A estos cristales de les

llama cristales aiiisotrópicos y Iiaceii girar el plano de la iiiz polarizada.

APLICACIONES DE LA DISPEIISIÓS ROTATORIA ÓPTICA Y DEL

DICROISIIlO CIRCULAR.

Las priiicipales aplicacioiies de la dispersióii rotatoria óptica y del dicroísino

circular se eiiciieiiti'aii cii el irea de la detenniiiacióii de estnictiiras de

sustaiicias ópticaineiite activas. tales coiiio ainiiioácidos, polipéptidos y

proteiiias, esteroides, aiitibióticos, terpeiios y coiiiplejos de metal -ligando.

Miiclias de las aplicacioiies iiiodenias soil de iiatiiraleza empírica y dependen

del coiiociiiiieiito del coiiipoitaiiiieiito de coinpiiestos similares a los

iiivestigados. Siii eiiibargo, se esistcii n l y i a s reglas generales.

I6

. .-

L..

-..

c.

b..

C'

L<

1.0s niiiiiioricidos alifiiicos ediibcii ti i i cfdcto Cotton iiiiiy especial, cuyo

sitio izfleja la estereoqiiíiiiica eii el ctiitro asiiiiitrico. Los a-ainiiioicidos de

coiifigiracióii levógira iiitiestraii iiii efecto Cciioii positivo alrededor de 2 15

nm, inieiitras que, los eiiaiitióiiiei'os destiógiros tieiieii iiii efecto Cotton

negativo. En los polipéptidos, es posiblc. estiliiar el porcentaje de estnicttira

helicoidal a por iiiedio de inedicioiies de la dispersión rotatoria óptica.

En los esteroides, las iiiiioiies anulares cis y /ratis produecen diversos tipos

de curvas de dispersión rotatoria y óptica. Eii iiiia de las fonnas, la rotacion

especifica aiiiiieiita al disiniiiiiir la loiigitiid de onda, Iiasta que alcanza un

máxiino y coiiiieiiza a iiivei-tirse ( c i i i u positiva), y eii la otra, la rotacióii

específica disiniiiiiye al reducir la longitud de onda Iiasta alcanzar el valle e

invertirse (curva negativa). L a localizacióii de los p i p o s carboiiilo en los

esteroides Frecueiiteineiite piiede quedar liiiiitada a iiiias pocas posibilidades

observando el signo de la curva del efecto Cotton y la longitud de onda y la

rotación específica del pico del valle.

Los estudios teóricos de la absorcióii de energía radiante en los cromóforos

distribuidos asiiiiétricaineiite alredzdor de tiiia iiioléciila han conducido a la

llamada regla de los "octaiites".

E L POL.4Rl>IETRO

El polai'iiiietro coiisistz de las siyiziitcs paiíes bisicas:

1 .- Una fiieiite de luz

2.- Uii polarizador

3.- Un analizador

4.- Un círculo gadiiado para inedii' el p a d o de rotación.

5 . - Tubos para iiitiestra.

17

L.

r-

L

Escepto eii los iiistriiiiietitos iiias seiicillos, tainbiéii se iiicliiye iii1 aparato

de peiiiiiiibra. Algiiiios polni-iiiietros piiedeii estar eqiiipados coil fotoceldas u

otros dispositivos para la iiiedicióii de la iiiteiisidad de la luz que einerge del

iiistniineiito, aiiiiqiie la iiiayoria de los polariinetros están disefiados para

observacióii visiial.

Las fuentes de luz in i s coiniiiies para la polarhetría soil las Iáinparas de

vapor de sodio y las lainparas de vapor de inerciirio. La lámpara de sodio emite

Iiiz de loiigitiides de oiida de 5 890.

I X

P"

.._

DICROISNIO CIRCULAR EY PROTElN.4S Y POLIPÉPTIDOS.

.. P

Ci

r-

L-

iiifonnacióii coiisiderable referente a la estructura de proteínas en disolución

piiede obteiierse a partir de la inedida de su actividad optica. La gai i asimetría

de las iiioleciilas de proteiiia cs rcspoiisable de las seiiales que esliibeii los

métodos iiitenelacioiiados de Dispersióii Óptica Rotatoria (Om) y de

Dici'oísiiio Circiilar (DC). Dispersión óptica rotatoria (Om) es la medida, en

fuiicióii.de la loiigitiid de onda, de la habilidad de una itiolécula de rotar el

plano de l a luz liiiealineiite polarizada; Dicroísiiio Circular (DC) evalua de

manera siiniiar l a absorción irregiilar de la liiz circiilanneiite polarizada a la

derecha y a la izqiiiei.da.

Aiiiiqiie todos los ainiiioácidos excepto la gliciiia contienen por lo ineiios un

átoiiio de carbono asiiiiétrico (la coiifigiiracióii L o D), la mayoría de los

ariiiiioácidos iniiestraii sólo peqiieiias bandas de ORD y DC. Es la

coiiforiiiacióii de l a proteíiia, es decir, el acoinodo asiinétrico y periódico de las

unidades del péptido eii cl espacio, lo que da lugar a los espectros

característicos de ORD y DC.

Eli aiios reckiites el aiiálisis por difraccióii de rayos X a llevado a coinpletar

el iiiapeo ds In coliiiniia \.ei-tebral del p2ptido. así coino, las posiciones de las

cadeiias laterales de la lisoziiiia,(' 'algiiiias otras eiiziinas,"' así coino proteínas

en el estado sólido. T2ciiicas iiiievas coino la difiaccióii de iieiitroiies y la

resoiiaiicia inagiética de alta resoliiciúii Iinii generado iiifonnacion respecto a

los átoinos de hidrógeno eii las proteínas; esto se eiicuentra más allá de las

-resoliicióii del aiiálisis coil rayos X. ORD y CD son técnicas que carecen de la

capacidad de deteniiiiiar de iiiaiiei'a exacta la ectnictura, lo cual es posible coil ."_ r-

L

c

20

r.

-.

c

L

c

c

r-

- F-'

r.

c.

r.

i _

,"~. c..

c

i. .

L ..

r..

i-

r-

.. - P

.. c

L. .

r-

los rr:;todos inc'iicluiiados ¿iiiici-ioi.iii~iite, :;in eiiibargo tienen ia veiitaja de que

Lmo se piiede aprosiiiiar ripidaiiiciite a los porcentajes de coiifonnacióii

presente en disoluciones diliiidiis de pi'otdiiia. Una inuestra de proteína de

menos de O . 1 ing geiieraiiiii-iite es suficiente para una detenninación con DC ti

ORD.

Para estudios referentes n la estriictiira de polipéptidos sintéticos,

macroinoliculas que generaliiieiite exhiben una coiifonnacióii repetitiva regular,

ORD y CD pueden ser excelentes. ORD y DC son herramientas espectralts

rniiy sensibles y pueden ser de utilidad en el estudio de reacciones que

iiivoliicran cambios en la actividad óptica. Asi, son excelentes para medir en

polipéptidos desiiatiiralizacióii de proteínas y transiciones Iielicoidales.

También pueden ser utilizados para medir la iiiteraccióii de enzima y sustrato,

inhibidores y coeiiziinas, así coni0 la iiiiióii de ioiies inetálicos y tintas a

proteínas y polipéptidos.

En 1963 t in capitiilo respecto al ORD de proteinas fiié escrito por Fasinan,

en es2 t i m p o , debido a las liinitacioiies iiisti-iiineiitales, las mayor parte de los

estiidios de proteinas con ORD iiivoliicrabaii medidas en un rango de longitud

de onda siiperior a los 240 ni11 y el análisis de los datos se llevaba a cabo coil

las ecuacioiies de Driide y Moffit. El estudio del efecto Cotton derivado

directaineiite de la transición de péptidos asiinétricos croinóforos fiie solaineiite

el inicio. En los aiios sigiieiites, dos tipos de mejoras eii los

espectropoláriineti-os, re\.oliicioiiaroii Ins medidas de propiedades ópticas

rotatorias de las proteinas, causando una proliferación en la investigación de

proteínas y polipéptidos. El priiner avance fiié desarrollado en iiistmmentos

cornerciales, pennitieiido las inedicioiies de ORD de nitiiia en un rango

espectral dz 185-600 iiin, incluyendo los efectos Cotton provenieiites de

., F

..

21

-.. c

I-- ---

péptidos croiiiillim~s. El sc iy ida y iiiis iitil di. los a\mces fiie el de el

espectrofotóinetro de DC capaz de operar en el iiiisino rango espectral. Las

ventajas de DC sobre ORD para estudios coiiforniacioiiales de las proteínas

son: (1 ) cada transición electróiiica óp!icaiiieiite activa proporciona solo una

banda de DC en lugar de Ins seiiales positi\,as y negativas como en ORD y las

bandas son resiieltas y asiyiiadas iiiiis fiiciliiieiite ; (2) DC a diferencia de

ORD, las bandas soli de una aiiclio dcfíiiido y. por lo tanto, el espectro de DC

no contiene contribuciones de transiciones qiie tengan lugar fuera del rango

espectal establecido. Por estas razoncs la inayor parte de las investigaciones de

proteínas se llevan a cabo con DC en lugar de ORD desde los inicios de 1968.

Otro avance importante fiié el desciibriinieiito de la conformación p Iiidrosoluble de la poli-L liciiia al calentarla. Por lo tanto , la contribución de las

foniias p así como las a-lielicoidales y estructuras al azar a la coiifonnación de

las proteínas en disolución puede ser considerada. Esto hizo posible analizar

coil espectros de DC y ORD la mezcla de las tres estructuras antes

mencionadas utilizando polipéptidos sintéticos, poli-L-Lisina como modelo.

Estos métodos parecían ser tina aprosiiiiacióii iitil a la coiifonnacióii de

proteínas altamente estriicttiradas. Siii eiiibargo, problemas que no se Iian

resuelto en la iiiterpretacióii sui-geii de la elección del modelo estnictura, la

contribución de ci-oiiióforos acti\.os que no son péptidos y el efecto de la

dispersión de la luz.

Sin embargo, la iiitrepretacióii de un espectro de DC no es sencilla.

.. ..

Tres iiistwiieiitos coiricricalcs, el Car!. el .!risco y el Jouaii, soii capaces de

generar espectros de alta resoliicibii de DC ii ORD con relativamente bajos

riivclcs de ruido de Iiasta IS5 iiiii y se piiedeii utilizar para el estudio de

proteinas.

I . Espectropolarinietro coil registro Caiy 60 con accesorios para DC 6001 y el

dicróinetro circiilar Cary 6 I . Los iiistriiiiieiitos Cary utilizan un prisina doble

nioiiocroinático, uiia celda Faraday para iiiodiilación rotacional del rayo de luz,

prismas Rochoii para el poiarizador y el analizador , y celda Pockels como

inodiiiador de DC y plato de iiii cuaito de onda. Una descripción del

polaríinetro en el modo ORD ya ha sido proporcionado; la operación y

presicióii del Caiy 60 y 6 I coiiio iiii iiistriiiiieiito de DC son muy similares. Los

datos son reproducibles deiitro de 0.001" de rotación (ORD) o elipticidad (DC)

y densidades.ópticas de 5 2 iisiialineiite piiedeii ser toleradas. El nivel de niido

es -de 0.0005" de rotación o eiipticidad bajo condiciones de absorbancia

peqiiefia a b 2 2 0 iiin, y se incrementa Iiasta 0.005" para una muestra de

proteína de absorbaiicia -2 a 190 i i i i i . El espectro es registrado en un rollo

coiitiiiiio de papel para g~aficar.

7. Diirnini-Jasco modelo 5-20 DC .Este iiisti'iiineiito ha sido coiisiderableineiite

mejorado sobre el modelo Jasco 5, y su fiiiicioiiaiiiieiito es ahora similar al del

Cary GO/GI. Un avance iiiiportaiite es que la línea base ahora puede ser de

puntos multiples. Una posible desventaja es la gáfica preiinpresa. El

instrumento Jasco difiere del Caiy en qiie no utiliza el efecto Faraday, y en

medir directamente DC en absorbancia dicróica diferencial

( A[.- All) en lugar de eii elipticidad.

I- .

3. Dicrógrafo de Roiissei-Joiiaii [IC iiio~ido I I Este iiistniineiito es similar al

Jotiaii previaineiite descrito, pero recieiiteiiieiite inodificado para medir el

espectro de DC, coino (AI~-AI<) Iiacia abajo hasta 185 nin. Aún no ha sido

exteiisaineiite iitilizado para proteiiias y polipeptidos. De cualquier modo, los

datos obtsiiidos del ;iistniiiieiito Joiiaii eii algunos laboratorios Europeos son de

buena calidad coil respecto al nivel de riiido.

4. Espectropolariinetro Beiidiu-Ericssoii Polariinatic 62 con registro. El Bendix

es capaz de Iiacer medidas precisas de ORD solo a longitudes de onda mayores

a 220 tiin y es, por lo tanto, iio i n i i v i i t i l para croinóforos de péptidoc.

i ) CALIBRACIÓ,,\'

La absoltita presicióii de ciiaiqiiier inedida cuantitativa depende de la

estaiidarizacióii del método. Es fricil verificar la calibración de instrumentos de

ORD: valores de rotacióii especifica ( a varias ioiigitiides de onda de 250 a 589

t i i n ) de iiiia soliicióii a 0.25°,ó de sacarosa p e d e ser comparada con valores en

la literatura. Si es iiecesario el polariiiieti'o piiede ser recalibrado.

De ciialqtiier inaiiera, iioy eii dia iio hay iiii estaiidar de DC accesible con la

pureza coiisisteiite .de la sacarosa. El coiiipuesto cointiiiineiite utilizado para

calibrar espectropolaríinetros de DC es el ácido(+) d-IO-cainforsulfónico al

O . 1% eii soiiicióii aciiosa, lo qiie iiiiisstra tina aiiiplia baiida de elipticidad a 290

iiin. Pero el ácido(+) d- I O-caiiiforsiilfóiiico fonna tin hidrato conteniendo

aprosiinadaineiite 7% de agua bajo coiidicioiies iioiinaies de laboratorio, por lo

que el peso piiede iio ser tina inedida exacta de coiiceiitracióii. Además,

r^ imptireas aiiiarilkis fiicruii Ii~1l~icl:is C I I algiiiios lotes de p d o reactivo I_.

c

L

P-

L .

P

I

L.

c

r-

L

(Eastmaii Kodalij del aciclo(f) J- I O-caiiiforsiilfóiiico. El ácido puede ser

piiriticacio por recristalizncióii a paitir de ácido acético, seguido de m a

sublimacióii al vacío, secado a SO" a l vacío y alinaceiiainieiito en un desecador.

Entonces es adecuado como tin estaiidar de DC inediaiite lo cual la señal gana

ajuste controlando la magnitud de la setial de DC observada en un instrumento

puede ser inaiiipiilada

El valor exacto del pico de elipticidad iiiolecular, [0?90] del ácido (+)d-10-

camforsiilfóiiico no es conocido coli cciteza, parcialiiieiite debido a problemas

de iiiipiireza. Afoitiiiiadaiiieiite, el valor de puede ser calculado por

medio de la traiisfonnacióii de Kroiiig-Krainer, de los datos exactos de ORD sobre l a inisma muestra del iícido(+)d- 1 O-cainforsiilfóiiico obtenida en un

polaríinetro bien calibrado. Para que este cálculo sea válido la muestra no debe

contener impurezas ópticaiiieiite activas aunque peqiieiias cantidades de agua

son tolerables. Uiia inaiiera siiiiple de obtener uii valor absoluto de DC para

una solución acuosa rotacioiialineiite pura de ácido(+) d- IO-camforsulfónico

estandar es utilizaiido las relaciones calciiladas de Cassiin y Yang del pico de

elipticidad iiiolecular al pico >. iiiiiiiiiio de rotacióii inolecular: [8:90]![M]30ú =

1.76 y [?.l]:-!, = -1.37.P~ ejziiiplo. iiiia iiiiiestra seca y purificada de

ácido(+) d- 1 O-cainfarsiilfóiiico geiieró iiiedidad de rotacióii de = +4480

y [MI170 = - 5700, 'de donde [O]:t)io eq!iivale al promedio de 4480 x 1.76= 7880

y - 5700 s -1.37 = 7500, o [e]?,,, = 7840 (coi-respoiidieiite a A E L - ~ = 2.37). La

mabmitiid resultante [ O ] 1 , , , puede etitoiices ser utilizada para calibrar el

espectropolaríinetro, auiiqiie la iiiiiestra de ácido(+) d-l O-cainforsulfóiiico

puede coiiteiier algo de agua.

r -

*. .

ii) DISOLlJCIOivES P

L

P

I.

Las condiciones del disolveiite, la coiiceiitracióri de proteína y la longitud de

paso óptico eii la celda debeii ser elegidas de tal inaiiera que la disolución

pennaiiezca relativamente traiisparciite eii la región de la longitud de onda de

riiiestro interés ( deiisidad óptica por debajo de 2 en la mayoría de los casos),

pero también que esté presente stificieiite soluto para registrar una rotación 'o

elipticidad fácilineiite inedibles c'oii tiiia seiial alta en ruido.

L a primera coiisideracióii es iitilizar t i n disolvente que transmita suficiente

luz. El agua es el disolvente más tisiial para estudios espectrales de proteínas y

polipéptidos. Los regiiladoras de Tris y acetatos, eii coiiceiitración moderada,

pueden ser utilizados a 1,2700 iiiii, pero más lejos en el iiltravioleta no hay u11

regulador adecuado para absorbaiicia baja. Sales de cloruro y perclorato

puedeii ser utilizadas hasta el limite espectral mas bajo de instrumentación para

maiiteiier la fiierza ióiiica deseada, pero la mayoría de las sales comunes,

iiicliiyeiido los cloruros, Iiidrósidos y fosfatos, deben de evitarse en el

ultravioleta lejano. Miiclios disolveiites orgánicos eii los cuales a lp i ias

proteiiias y polipéptidos soil solubles, coiiio In diinetil fonnainida y el dimetil

sulfósido, iio soil adecuados para estudios rotacionales a hc%0 run a menos

que las celdas utilizadas teiigaii itiia loiigitiid de trayectoria extremadamente

delgada. Hay iii i iiiiiriero de disolveiites de proteína de suficiente transpareiicia,

por ejemplo, el trifluoroetaiiol, Iiesafluoroisopropaiiol, triinetil fosfato y ácido

inetaiiosiilfóiiico. L a adicióii de ciialqiiier disolveiite orgánico, así coino

cualquier caiiibio de pH y teiiiperattira, piiedeii afectar l a conformación de la

proteína y debe ser utilizado con precaiicibii.

c

..

.-.

P-

i_

F-

c

c

L_

e-

-_-

L a sigiiieiite coiisideracióii cs 1;i coiiceiitracitii de la iiiiiestra. Para estudios

de proteiiias y polipéptidos eii tl i-aiigo espectral de 185-240 iiin, disoluciones

coiiceiitradas de 0.01-0 1?ó, coli DC iiicdido eii celdas de longitud de

trayectoria de O . 1-1 inm, iiswiliiieiite resulta en datos que inuestran un buen

coinproiiiiso entre una seiial suficiente y una adecuada iiiteiisidad luininosa.

Una absorbancia de 0.7 geiieraliiieiite es óptiiiia. Experiinentos cercanos al

ultravioleta (la240 nin) usiialiiieiite requieren mayores concentraciones y/o

celdas más largas. Puede ser iiecesario variar la concentración y/o longitud de

la trayectoria duraiite el esperiiiieiito de iiiaiiera que sea posible medir

exactamente cada una de las baiidas de DC y ORD de interés. En circunstancia

de uiia fuerza rotatoria baja ó iina baja iiiteiisidad de luz, o si hay sospecha de

agregacióii, es tina buena práctica toinar medidas a diferentes concentraciones

(ó longitudes de paso óptico), coiiio tina prueba para los aparatos.

Las disoluciones que se vaii a iiiedir deben de filtrarse ( filtros Millipore son

iitiles) o centrifiigarse para reinovei' el iiiaterial en siispeiisióii.

Las concentraciones de las iniiestras deben de conocerse con exactitud para

poder calcular elipticidades o i-otacioiies inolares o residuales. El peso medido

de la iniiestra no es suficieiite para detenniiiar la concentración, ya que la

iiiayoría de las proteínas y polipiptidoc retieiieii t in poco de agua aíiii después

del secado a vacío con iiioderadas teiiipti'atiii'as. Eiitoiices, la concentración de

la disolución iitilitada para DC debe ser aiializada ( después de la filtración).

Para inuclias proteiiias, valores de coeficientes de extinción para cadenas

laterales aromáticas son conocidos; eii estos casos, l a concentración puede

obteiierse por una siinple deteniiiiiacióii de densidad óptica. Para todas las

proteínas y polipéptidos, el aiidisis Nessler iiiicro-Kjeldalil para nitrógeno total

puede ser utilizado; de cualquier inaiiera para obtener la concentración en

r. teniiiiios de residuos peptidicos por litro, la coiiiposicióii de ainiiioácidos debe

ser coiiocida. Adicioiialiiieiite,eiis~~~os coloriiiiétiicos coino Biuret, Lortry o

niiiliidriiia piiedeii ser utilizados, pero para resiiltados exactos cada initodo

debe ser estandarizado coli la proteiiia que se va a inedir.

- . P - r-

.. iii) CELDAS.

Solo celdas circulares de ctiarzo fiiiidido deben ser utilizadas para DC.

Dichas celdas se eiiciieiitraii eii wia graii \ariedad de longitudes de adaptación

y adaptaciones especiales (coiiio por ejeiiiplo eiicliaqiietadas con agua) y deben

ser probadas para birrefriiigeiicia. Para longitudes de trayectoria de 1 inin o

menos, celdas de doble cuello soli recoineiidadas porque son relativamente

fáciles de llenar y liinpiar.

iv) MEDIDAS

La inayoria de los polariiiietros que hoy eii día se usan pueden ahora ser

ajustados para generar tina linea base plana (para iiii disolvente dado en una

celda dada). La necesidad de toiiiar blniicos de aire freciieiiteineiite, se aplica a

DC. Eii DC la sehal de las iiiedidas de la iiiiiestra debeii coincidir con la linea

base del disolvente en las regioiies espectrales doiido 110 hay absorción; si no es

asi, puede ser qiie la celda iio se eiictit'iitr? eii la posicióii correcta.

Algiiiios iiistruiiieiitos piiedeii ser equipados coli portaceldas de muestra

inodificados para pennitir l a inedicióii directa de DC por diferencia. Estos

métodos eiiviielveii coinpeiisacióii para los artefactos, pero pueden ser títiles

para el aiiálicis de peqiiehos caiiibios eii la coiifonnacióii de proteínas, coino

28

r-

_-

F piiede ocurrir por l a tiiiióii de siistratos, iiiliibidc>res y coeiiziinas. La misma

infoniiacióii puede ser obteiiida iiidirectaiiieiite, por ejelnplo, por la resta de los

espectros liidepeiidieiiteiiieiite deteiiiiiiiados de eiiiiina e iiiliibidor del medido

por DC del complejo eiiziiria-iiiliibidor bajo las inisina condiciones.

..- P

- r-

L La inayoria de los iiistriiiiieiitos tieiieii tennostáto para que las medidas se

piiedaii llevar a cabo a teiiiperatiii-a coiistaiite ( usualineiite cerca de los 25"). f-

c

-" c

c

....

c

L

r-

..-

c

L

L_

c

L

c

c

L

c

Temperaturas iiiiiestra entre los -30" a 100" piiedeii obtenerse por medio de un

tennostato de baiio circulaiite conectado a la celda para muestra enchaqueatada

o para portaceldas Iiuecos. El caleiitaiiiieiito y eiifriainieirto eléctricos también

puede ser utilizado. Es iiecesario iiioiiitorear la temperatura de la muestra

durante los esperiineiitos que iiivoliicreii caleiitainieiito y eiifnamiento.

v) CALCULOS

La gráfica que trace ciialqiieir espectro de DC contiene un ruido

sigiiificaiite, el cual iisalineiite se proiiiedia a "ojo". Si el espectro ha sido

registrado lo siificieiiteineiite leiito, esto no presenta problema.

Alteniativaineiite, si soli accesibles accesorios digitales la curva de DC (un

registro de uii solo espectro) piiede ser suavizada por computadora. Esta

técnica mejora l a presicióii de los datos reduciendo el niido. Adicioiialmente,

una Coinputadora .de Proiiiedios Traiisieiites (CAT) puede ser utilizada para

incrementar la resolucióii a travSs de registros repetitivos. Este método es

particulaniieiite Uti1 eii los casos eii los que la fiierza rotacional es pequeña,

coino por ejemplo, con L-triptofaiio.

Las Iíiieas base de niido proiiiedio (para la inisina celda, solvente y rango de

sensibilidad) debe eiitoiices ser restada del espectro de la muestra a cada

29

loiigitiid de oiida de iiiteris, y lii dilrreiicia eii la grafica iniiltiplicada por l a

seiisibilidad del iiistruiiiciito El resultado para DC, depeiidieiido del

instniinento, es observado ya sca t'ii grados de elipticidad e eii absorbaiicia

dicroica circiilar difereiicial, (AL,- Ai(), eii iiiiidades de absorbaiicia. Los

cálculos que s ipe i i coiivierteii estos datos en iiiedidas cuaiititativas de rotación

o DC.

vi) D I S P E R S I ~ N ÓPTICA ROTA TORM.

La actividad óptica geiieraliiieiite es repoitada eii ténniiios de rotación molar

(M) ( para sustancias de bajo peso inolecular coino los derivados de

ainiiioácidos) y de residiio de i'otacióii (in)(Macroinoléculas). Los residuos de

rotacióii daii iiiia iiidicaciori de la actividad óptica de tina unidad de péptido

cromóforo simple eii tina cadeiia de polipéptidos o proteínas. La rotación

específica a iiiia loiigitiid de onda tija, [u];., es Uti1 principalineiite coino criterio

de pureza, para coiiiparar con literatiira aiiterior y para el cálculo de puntos

Driide.

I . Rofncióti c.\pcc$7ca. L a actividad óptica es definida en ténniiios de la

rotacióii especifica.[u];.:

donde T = a l a teiiipterattii'a; h = loiigitiid de oiida; sobs= rotación observada en

gados;(disolucióii iiieiios el blaiico de solvente); 1 = recorrido óptico de la

c-

celda en decímetros; c = coiiceiitrncióii eii gaiiios por 100 ml. Para películas, c

= concentracióii en gramos/ tin'.

2 . Rotación Molar. Para sustancia de bajo peso molecular [MIA se define

como:

donde MW = niasa inolectilar del soluto.

3 . Rotación Residtiaf. Para la coinparación de rotaciones de proteínas,

oligopéptidos y polipéptidos, que difieren grandemente en pesos moleculares,

una unidad inás significativa, la inedia de rotación residual, es utilizada:

MR W 1 O0

[It,] =--[a],

donde hfRW = inasa residual inedio de la unidad repetitiva. Las unidades

fisicas para (in) (así como para (M) y estas cantidades reducidas al vacío) son

grado centímetro cuadrado por deciiiiol. La iiiiidad inolecular repetitiva para las

proteínas es el residuo de ainiiioácido, por lo que el masa del residuo es la

suma de los inasas atómicos eii la iiiiidad -[C(=O)-CHR-"1- La MRW de

polipéptidos siiitéticos y proteínas de coinposicióii conocida pueden ser

calculados. La MRW para un gran pipo de proteínas es aproximadamente

31

-...

115, y este valor p e d e ser utilizado para propósitos coinparativos cuaiido la

exacta composición de aiiiiiioacidos es desconocida.

Uiia eciiacióii coiiveiiieiite para el cálciio de [in], cuando la coiiceiitración

del residuo inolar, c' (moles de residuo péptico/litro), se conoce que es:

ah x IO

I x c ' [ni] =

donde los deinás síinbolos ya Iiaii sido definidos anteriormente.

4. Rotaciotics tiiolcircs retiiicitltrs y rcsirlirnles. El poder rotatorio óptico

depende del iiidice de refraccióii del iiiedio. Entonces, para comparar

rotaciones observadas eii iiiia variedad de disolveiites, las rotacioiies son

reducidas al valor que teiidriaii al vacío,por medio del factor de correccion de

Loreiitz, 3/(ii2 + 2), doiide ti es el íiidice refractivo del solvente a una longitud

de oiida R . Valores de ti y de 31(ii2 + 2) para inuclios solventes ha sido

tabulado, y métodos para iriedir 17 Iiaii sido dados. Por ejemplo, valores de

3/(ii2 + 2) para agua soli 0.77 a 250 11111, 0.76 a 220 iiin, y 0.74 a 195 iun. La

rotación residual inedia redticida, [iii'], a iiiia loiigitud de onda h incorpora la

corrección del iiidice refractivo de la sigiiieiite inaiiera:

Uiia espresióii siinilar puede ser escrita para [M'], la rotación inolar

reducida, por la sustitiicióii del iriasa iiiolecular, MW, para masa residual.

32

. .- L.

r-'

-.

r- ._ .

r.

L

r

...

P

.... c

... c

C .

P-

c

c-

c

L

c

L-

r-

L..

r-

..-

c

.... r- !...

? L..

P

L..

~.

5. Eciincioncs dc I h d e )I A tofii//.

El inétodo inás iiifonnativo para el aiiálisis de datos de ORD, en estudios

recientes, es presentar las gáficas de dispersión ([M'] ó [m'] contra A), y

obtener los paráinetros característicos (posicióiies y magnitudes) para los

efectos Cotton que resulteii de la absorción eii el ultravioleta de péptidos y

cadenas laterales. No obstante, antes de que los estudios de ORD en el

ultravioleta fueraii factibles, fiieroii muy utilizadas las ecuaciones de Drude y

especialineiite l a de Moffitt para el análisis de proteínas con ORD. La

aplicación de estas ecuacioiies al estudio de proteínas, y los métodos gráficos

utilizados para la reducción de datos (iiicluyeiido ejemplos de cálculos) han

sido extensamente discutidos. Los cálculos de Mofitt ocasionalineiite soii

utilizados. ,

Muy breveiiieiite, l a ecuación de Dnide, que describe al ORD en

regiones espectrales lejos de las bandas de absorción ópticamente activas, es:

donde k es coiistaiite, y i., la ioiigitiid de onda inedia de la traiisición

electrónica ópticamente actka.

La eciiacióii de.Moffitt, desarrollada para polipéptidos sintéticos, es:

donde no. bo y ;lo soii constantes. Ciiaiido2.0 es tomada coli un valor de 2 12 nin,

bo tiene un valor de -630 para polipéptidos con tina conformación totalmente

11- !~:ICI:I 1;i ~i.i.c.cl~;i u-liciic~,;dni >. t iwe iiii \Ax cit. ccro p x n cspiralcs al azar; en

este caso !I,, para iiiia protciiia piit'dr: ser utilizado coiiio iiiia iiiedida de su

coiiteiiido Iidicoidd, si es libre dc. ciialqiiier estructura beta.

b

F

-_

r-

L-

vii) DíCROiSd\íO CIRCL'LA R

Los datos en DC soli rcpoitados ya sea coino [e], la molaridad o la

elipticidad residual, o coino (EL- E¡<), la inolaridad diferencial del coeficiente de

extinción del DC. Ambas inedidias son proporcionales: [ 8 ] = 3 3 0 0 ( ~ ~ - ~ ~ ) .

La fiierza rotacioiial, R k , de la cual tiiia banda de absorción ópticamente activa

es alriiiias <_ veces calculada, proporcionó qiie las bandas experimentales de DC

piiedeii ser resueltas. Un Resolvedor Ciiivo du Poiit 310 es titi1 para éste

propósito. No Iiay ningiiii inftodo de análisis feiioineiiológico de DC

coinparabla a las ecuacioiies de Driidz y Moffitt.

L.

r' I . lilipllci~iud h t0lOi~ o l~c.viti1tnl. [O] c. La elipticidad iiiolai. (para iiioiéciilas peqiieiias) o la elipticidad media

residtial (para proteiiias o polipiptidos) se define coino: P

L..

#.- donde A = loiigitiid de olida; Q , h , = elipticidad observada , en gados; MW=

masa itioleciilar; M R W = inaja residiial inedio ( ver ORD); c" = concentración

eii granos por inililitro: d = loiigitiid de ruta en ceiitíinetros. Si la concentración

L "

c-

..- r L

c

L

3 1

L..

P

&..

13

c-

P

L

c

r-

L.

L

doiide I = loiigitiid de i-iita e11 dcciiiieti'os; c' = coiiceiiti'acióii eii residuos

iiiolarcs/iiti.o. LX iiiiidadcs para [O I soil grad ciii' din01 - l .

2.- i~iIpiIcI~icid redircitlrr ///olor o / . C . Y ~ L / M ~ , [O7 El índice de refraccioii de

correccióii de Loreiitz ( ver ORD) iio sc aplica tisiialineiite a datos de DC. Siii

embargo, esta coixccióii ocxioiidiiieiite es útil para comparacioiies eii la

Iitera[iira:

3.- Coefiooi/c de er/iiiotju de /I( ' c l ! f iv~~cia/ mob. Eii algunos iiistnitneiitos

l a difereiicia eii absorbancia eiitrc la luz circdaiineiite polarizada taiito a la

izquierda coiiio a la derecha, (.A,- A!<) es iiieclida directaineiitc. Eii diclios

cacos, el coeficieiite de estiiicióii inolai' de diciüijiiio circular (taiiibiéii Ilainado

absorcióii inolar dicroica), E!.- E!< se obtiene de:

doiide d = loiigitiid de paso óptico e11 ceiitiiiietros; c'= coiiceiitracióii eii moles

de residuo por litro:( &[.-El< ) t h e iiiiidiides de litros por iiiol ceiitíinetro.

4.- l < ~ l ~ / < ~ l l ~ ; ? L'/¡//'C' d ! p / ; < : l L / d I' i;t. 5 ¡ 1 I L ~ ! ¡ h l ' I I / L . I ~ L ' t l ' ~ / ~ / l .

La proi>orcioii~lidad. [ O ] =~ 3-300 (::I.- ) !'a Iia sido dada. Otra relacióii Ut i l ,

para l a cciiiparnciiiii de datos ci.iiduj de DC, es: 0,,1,, = 23(AI, -A[(). Aiiiiqie, t i i i a

elipticidad Dbsci-vada. de 0.00 1 gi.ados coi-rtspoiide a tina absorbaiicia dicroicn

difereiicial observada de 3 X I O -' cii iiiiidndes de absorbaiicia.

5.- /.irer_n m m / o t i d . La fiicrza rotacioiial Rk de l a K-ésiiiia baiida de

absorcióii ópticaiiieiite activa SI: defiiie por iiiia iiitegal la cual se puede

eiicoiitrnr coil facilidad. Si la baiida de DC se eiictieiitra cerca de la fonna

Gaussiaiia, eiitoiiccs:

doiide h,,,:,, = loiigitiid de onda de l a k-ésiiiia trniisici.óii; [8,,, , ,]~=[8] a h,,,, ; A = la initad del grosor de l a baiidn.

Reluciories erilre D C y ORD.

DC y l a rotxióii óptica se ciiciiciitrnii relacioiiadas, por la k-ésiina traiisicióii

ópticaiiieiite a c t i u ( s f x t o Cottoii), poi. las relacioiies de Kroiiig-Kraiiiers. Por

inedio de estas ti'aiisfonnacioiies coli iiitegrales, iiiforinacióii coiiteiiida eii uii

espectro completo de ORD piicde ser deducida, eii priiicipio, de iiiia curva de

DC, y \.ice\,ersa. Pi-oyaiiias de coiiipiitadora se eiicueiitraii accesibles para

estos cálciilos. Varios iriitodos para iiiaiiipiilacióii de datos pueden ser

coiiiparados eii esttidios sobi-e el ácido"'-d- 1 O-cainforsulfóiiico. Las

traiisfoniiacioiies piiedeii sc'r iitilizadas para la biisqiieda de traiisiciones

3 6

c

L

r-

L_

ri

L

c

.... c

L.

c

L.

r.

-.

c.

L i 7

b.

,-I óptic:iiiieiite :.cti\.,x iiiáj :ill:i LIcl i-aigo UV q i i t se piiede obsewar. Uria

generalizacioii Uti1 para ciiciilos ciditritivos de i m inagiitud de baiida es, si

una baiida de DC es aprosiiii~id;,,iieiit~ de foniia Gatissiaiia:

....

r-

L"

r-

.... c

L.

...

.3 7

r-

L

L

Los iiiétodos aiiteriores p x n la estiiiiacióii de la estnictiira proteica

utilizaban dispersión óptica rotatoria debido a qiie los instrumentos para -el

estudio coil dicroisiiio circular eii el ultravioleta lejano no eraii accesibles. Las

primeras medidas de dicroisiiio circii!ar de polipéptidos fiieroii realizadas por

Holzwaitli qiiiéii exainiiib los efectos Cottoii asociados con transiciones

electrónicas del péptido e!i a-lielicoidales y eiirollainientos al azar de

polipéptidos sintéticos y eii iiiiogldiiia (la ciial es ainpliameiite helicoidal).

Para poliineros Iielicoidales le asigiiaroii iiiia baiida de DC negativa a 222 nm a

la n+n* traiisicióii ainida, y la baiida negativa 208 iiin y la banda positiva 190

im a la banda polarizada paralela y perpeiidiciilar, respectivaineiite, n+n* transicioiies ainida Tainbiéii Iiicieroii asigiacioiies tentativas de las bandas de

DC de eiirollainieiito al azar, y iiiostraroii (por inedio de la traiisfonnacióii de

Kroiiig-Krainers) que los espectro: de ORD Iielicoidales y de eiirollainieiito al

azar eraii coiisisteiites coii las bniidas de DC.

Después de. este notable adelanto, iiistriiiiieiitos de DC inejorados se

volvieron más accesibles, espectros de DC para poli-L-lisiiia forma p fueron

medidos, y se vokió factible iiiteiyretar datos de DC sobre proteíiias en

ténniiios de coiifoiiiiacióii de polipéptidos, coiiio fiie Iieclio previaiiieiite para

ORD. DC es aliora esteiisaiiiciite utilizado para el estudio de la coiiformacióii

3s

r-

L

P..

-. P

i

P

- r-

L

C.

i

dr poiipcp:id:x J potciiiiis CI! s&i!l.ic,iciii, El Jicioisiiio circtilar tieiie i i i ia vciitaja

sobre I ; I ORD, que coiisijic cii qiic liii? iiiciios !raslape eiitre traiisicioiies

ópticaiiieiitc acti\..aj, y geiiaxiinciitc tiiio pticdc sepnrnr traiisicioiies debido a la

coluiniin veitebral polipeptidia de otros crciiiióforos

El espectro ilc LIC para tres coiifonnacioiies de referencia de l a poli-L-lisiiia

( a-lielice, foniia p y eiiro1l:iinieiito al .?zar) se iiiiiestra eii la figura I ~1

1 I'.

!

~

I- 1 ':, ~ '\ / I

Le - , XI

L ,-,

F i g I r a I

Espcctro dc Dicrosiiiio circular de I;) poli-L-1isiii;i cii 1;i coiiiorri1:icioiics a-liclicoidal a l 100%(cuna I) . p (ciin'a 2) ! ;II w x (ciin;i 3).

(Cabe Iincer notar que la sstriictiirn 13 exhibe solo iiiia baiida de DC iiegativa eii

l a regióii de los 270 iiiii).

Greenfield y. Fasinaii'.''iitiliznroii estas ctiwas para la poli-L-lisiiia para

calcular espectros de DC esperados para varias mezclas de las tres

coiifonnaciories ftiiidaineiitales. Utilizaroii estas ciirvas de DC calculadas para

coiiiparar coil espectros de DC espsriineiitnles para varias proteínas de

coiifonnacióii coiiocida ( a pnitir d~ ejtidios de rayos X). Los resultados de

este aiiiílisis, basados eii datos de 20s a 250 iiin se iniiestraii eii la figura 1

Grwi!f¡cld y Fasii iaii cixoiiti-miii, escciicialiiicnte, ciiaiido uiia protciria está

altaiiieiite oi.,dcii;!da ya sea qiic prcdoiiiiiie u-liélice o esti-uctiira 0, los

resultados ciicticiitraii iiiáj o iiiciiüj a tiii 5% de los datos obtenidos por

iayos X. :\tiiiqtie las estiinacioiies obtenidas para iiiioglobiiia, lisoziina, y Riiasa

sen bastniitc bueiias. Ciiaiido l as proteíiias estudiadas careciaii de gran caiitidad

de regiilnridad, las desviacioiies x a i i iiiuclio iiiayores.

la estructura

Eii este caso la cabida de

estiinada a la coiifonriacibii actual obtenida 110 fiié buena; de cualquier manera

estos resultados si dieroii uiia idea aprosiiiiada de la estructura secundaria de

las proteíiias.

Las difereiicias eiiti'e In> ~ i i i ~ a s Jc DC para proteínas calctiladas y

experimentales piiedeii ser nti ibiiídas cii g a i i p i t e a la naturaleza imperfecta

de los polipéptidos siiitéticos coi110 estiiitiai-es de DC para confonnacioiies

protiicas en cadciia. Piiede iiieiicioiinrse aquí que (1 ) los paráitietros de la

banda de DC pai-a a, p, y eiirollaiiiieiitos de polipéptidos al azar varíaii con las

cadena lateral y el disolveiite (figuras 3,3 y 5), (2) ciirvas de

Figim .: Diiroisnio Ciriiil:ir dc I:) :~-l idi ic cii \x ios pulipcptidos: ;\¿ido poli-L-giuiiniico cn H20 pH 4.4.

- Poli-L-lisiiin C I I H1O pH I 1 . 0 - Poli-[S ' -(l-l i I i l Io~i~tII)-L-~li i i ; i i i i I i~:i] cii nicI:iiioi ::igti:: .X:2. -Poli-L-

al;iiiiii:i ai trilliioiocuiiol k i d 0 irifliioro;icL;ii¿o. 9X 5 : 1.5 .

,,.*, .l""l

Fig1ir;i 4 Figura 5

Figurii : Disroisnio Circiilx dc 1;i foriii:i li dc viirios polipipiidos: -Poli-L-lisiiiii en ngun pH 11.0. Poli-L-

scriix en ngii:i.- Poli-S-c~irl>o\iriiciil-L-Cisiciiia en agua pH 4.3.

Figura : Dicroisnio circuliir dcl ciiro11;iiiiiciiio ;iI ii/.:ir dc 1 iirios poiip6ptidos:- &ido poli-L-glui;iiiiico en

tigun pH 7.5 -Poli-L-lisiiia CII iiguii lit1 F 7 . - Poli- [N ' - (?-liidrosiciil)-L-gluiriniinii] en iiguii.

DC de proteíiias iio ordeiiadas solo soportaii iiiia relacióii cualitativa para

aqiiellas de poli-L-Lisiiia coli eiirollainieiito al azar y del acido poli-L-

glutáinico, (3) otras coiifoi-iiiiicioiies regiilares (cómo la liéli~e-3~o) y

segneiitos muy peqiietios o distorcioiiados de las tres fonnas estandar siii duda

coritribiiyeii al DC de proteíiias eii itiia inaiiera diferente, y (4) gnipos

croinóforos, aroiiiáticos, disiilftiro de cistiiia y g-iipos prosteticos ópticamente

activos bien piiedeii iiifliieiiciar el espectro de DC de la proteína eii el

ultrvioleta lejano (350-1 90 iiin).

Varios pzpcles recieiites represeiitaii \,ariacioiies y refiiiainieiitos de los

inetodoc de aiiálisis coli DC preseiitados aiiterioiiiieiite. Straiis et.al"'rcalizaroii

cálculos siinilares del porceiitaje de foniias u, y al azar para varias proteiiias,

iitilizaiido polipeptidos variados ( iio solo la poli-L-lisiiia) coino estaiidares ( o

patroiiesj, y peniiitieiido a los paráiiietros de la baiida de DC variar para los

cálciilos. hlyer'"iitilizó plintos isodicróicos a 198, 204, y 208 iiin para la poli-

L-lisiiia eii su variadas coiiforitiiicioiies para el aiiáiisis del espectro de DC de

inioglobiiia, licoziiiia, Riiasa, y citocroiiio c. Roseiikraiiz y Sclioltaii("titilizaroii

poii-t.-bci-iiia eii ililiis c ~ i i ~ ~ i . l ~ i . ~ i c i ~ ) i i ' ~ s (!e s i l coiii;) su refcreiicia para la foiiiia

iio oi~derixki 1, c;iIciilatoii c i i n x de DC i)ni.a iiiioslobiiia, lisoziiiia, y Riiasa.

Logrriroii qtic eiic:i.jnra iiic-iot ii los kitos espeiiiiiwtales a h = 195$.2OS iim;

pero uii pcix eiiciijc ti b 2 O Y qiit :I que lograroii Greeiifield y Fasinaii.

Saseii:i y \~'etlaiifcr.'''e\.iirii.oii probleinas iiiliereiites eii estáiidares de

polipéptidos; ellos iitilizaroii prutciiias iiativas de coiiformacióii coiiocida para

obteiier ctiiyas de DC de tet'crciicin para coiiforiiiacioiies u, y no ordenadas.

Estos espectros estaiidar, obteiiiiios de datos cristalográficos y de DC pira

mioglobiiia, Riiasa, y lisoziiix [>, coiisider~ibleineiite diferentes de aquellos para

la poli-L-lisiiia (fig. 2) espccinliiieiitc i i i la foiiiia al azar] que después fiieron

utilizados para el cóiiipiito de ciitws de DC para otras proteíiias. Saxeiia and

Wetlaiifer'"obtiivieroii tiii iiiiiy biieii aciicrdo ( inejor que el obtenido por

Greeiifield y Fasiiiaii""pnta carbosipeptidasa, pero fué regular para la a-

quiinotripsiiia. Cada proteiiia probableineiite coiitieiie regiones de estructura

úiiica que no piiedeii ser aiializadas por cualqiiier juego de curvas de refereiicia

para u, p y coiifonnacióii a l azar; además, coiitribucioiies para el DC de

cadenas laterales croiiióforns soli difereiites para cada proteíiia.

Siii eiiibnrgo, este tipo de iiiterptrtacióii de DC basada eii datos de

proteíiias, es iiii paso eii In ditwcióii corttctn. Clieii y Yaiigliicieroii uso de

proteíiias deteniiiiiadns cristalo=i-riticaiiieiite para obtener los"o' paráinetros bo,

[ni]232 y para las foiiiin u-hélice y eiirollainieiito al azar.

Crítica del ; ini lkis : Coluii i i i~i I cr~cI)i~;il tlcl i)olip6ptido.

Polipéptidos siiititicos de cadciia larga soil iiiia eieccióii iinpeifecta coiiio

inodelos para deteiiiiiiiar la esti-tictiira proteica coli DC y ORD. Parainetros de

referencia coiifoiiiiacioiial prii.a fwixis u.. y al azar variaii coli el polipfptido,

y tiria variedad de posibles eo;ti-iictiiras proteicas soil escliiidas eii estos

políiiieros siiiiples. El uso de pulip'ptidos sintéticos coiiio refereiicias para la

coliiiniia proteica, y los efectos di. la loiigitiid de la cadeiia y de la agegacióii

seráii disciitidos.

a- Hélice

Acido poli-L-glutáiiiico de cadeiia larga y poli-L-lisiiia alcaliiia Iiaii sido

utilizados desde lince tieiiipo coiiio inodelos caiioiiicos para la a-lielice en

proteíiias. Aiiiiqiie el espectro qtiiróptico es ciialitativaineiite siinilar para

polipéptidos coi l difereiites cadc.ii;is I;iteralts eii solveiites variados (DC), los

valores iiiixiiiios variaii coiisid~.i~nblciiieiit~. Por ejeiiiplo, los datos de DC para

a-liélice del ácido poli-L-gliitáiiiico, poIi-L-lisiiia, poli-[N'-(2-liidrosietil)-L-

glutainiiia], poli-L- alaiiiiia: ~oIi-.I-itietiI-L-SIiitaii~nto, pli-L-inetioiiii-ra y poli-L-

Iioinoseriiia (eii varios disol\,eiites) estáii lejos de coiiicidir. Este cainbio eii los

paráirietros de la a-liélice iio se deb t tiiiicaiiieiite a los efectos del solveiite.

Cálciilos Iiaii predicho qiie efectos de cadenas laterales iio aroiiiáticas

44

.

. . coiitribiiii-iiii a 1;i f i i i i z n rot:itoi.ia di' 1)aiiil:is prptidicas u-lielicoii!:ilcs, dcbido a

scaiiibios eii la gi'oiiietria de coluiiiiiii i'itebi-al Iielicoidal. Este caiiibio eii la

fuerza rotatorin l i a sido i i iostrxio i ' ~ I ~ i ' ~ i i i i ~ i i t n 1 i i i ~ ~ i i t e coa copoliiiieros de L-

Ieticiiia )' L-lisiiia eii disoi:icióii acuosa, p i - a lo cual [ O ! ~ O S = -34 O00 permaiiece

coiistaiite, pero varia ccii el coiiteiiido de leiicina. Adeinas, el espectro

de DC de la u-lidice coiistrtiida de datos sobre proteínas difiere de aquellos

basados cii polipéptidos siiittticos. Se coiioce que la agegacióii cambia el

ORD de! rícido poli-L-glutáinico Iielicoidal, y se debe de teiier cuidado para

evitar sitiiacióiies parecidas eii protciiias.

Otra caiisn por la qiie los polipeptidos de cadeiia larga piiedeii no ser tin

biieii inodelo es debido a la loiigitiid de la cadeiia. Segineiitos de la a-liélice eii

proteiiias soil coi-tos, variaiido desde 3 hasta 20 uiiidadec peptídicas. Datos de

ORD iiiuestraii qiie los valores de [iii']233 para oligo-L-lisiiias, iiicluso a ii=22,

110 se aprosiina al de la la pol-L-lisiiia debido a la fonnacióii iiicompleta de la

Iiélice. Niiigúii inodelo helicoidal para cadeiias peptídicas cortas es accesible.

Cálciilos teóricos iiidicaii qiie la fuerza rotatoria de la traiisicióii I7 +íI* de la

u-li2lice eii las baiidas di: DC de 705 a 191 iiin debiera ser eii graii parte

dcpeiidieiite sobre !a loiigitiid de la cadeiia, pero varía eii predicciones respecto

a ia t r m c i o i i 11 - n*. ( baiiii;i DC 222 iii11).

Fo i-In as-p

Poli-L-lisiiia a pH elevado, di.sptit5s de caleiitainieiito y reenfriainieiito, es

s wieraliiieiite iitilizado coino tiiia rcfereiicia para la fonna p. Siii embargo, se

Iia iiiostrado qiie l a foiina 0 de la poli-L-lisiiia producida a uii pH iieutro coil

iloiicciI-.;.iiiI:iti> LIC. judiü (SUS! pi'cjL:iitii ii;i cspcctro de DC ligei-ainciite

difci-ciitc qiie ac)iicllos eiicwiti-dos C I I cl ag:in j<>1;1 a p H 1 I . La inagiiitiid de la

baiida de elipticidad de DC a I I Y iwi para esta timiia p tieiie solo l a initad de la

inagiiitiid de la !orina p prodiicid:i iil caleiitx poli-L-lisiiia en agua a pH 1 I ,

coiiio fui eiicoiiirxio por To\viiciid et.al. ""y por Sarkar y Doty.'") Li y

SIiector""estnblecier-oii qiic l;i fi-poli-L-lisiiia eii agua soia piizde fonnar una

hoja plegada iiifiiiita iiiteriiiolcciiI;ir y piiede no ser un buzii inodelo para las

secciones cortas de la estriictiii'a eiicoiitrada en proteínas. Ademas,

depeiidieiido de l a coiicciitracióii y la loiigittid de l a cadeiia, la poli-L-lisina es

capaz de foriiiai. hojas pleated p iiitra o iiitennoieculares ( o, en alginos casos

inezclas).

Difereiites ácidos poli-u-aiiiiiio cii la foriiia p intiectraii diferentes espectros

de DC depeiidieiido de la cadeiia lateral y el disolvente.

Otra dificiiltad es qiie hay tres tipos posibles de estiiicttira p en polipéptidos,

hojas iiiiidris a Iiidrogeiio iiitraiiioleciilaiec paralelas y aiitiparalelas, y

estriictiirn p criizada iiitraiiiolcctilar aiitiparalela. Ha sido iinposible asignar

espec tm de DC ii ORD iiieciiii\.ocriiiniileti;e a alguna de estas fonnas ti otra;

este probleinn lia sido discutido espc;.iiiieiitaliiieiite y teóricaineiite. Una

escepcióii es In ~~oli-[L.-nl~i-I.-~iii-(OEt)-FI,\.]. la cual parecc estar en tina

coiifoiinacióii criizada y coiitieiir: propiedades ópticas de la fonna I-p, caiciiló tina dcpeiidciicia de loiigitud de cadeiia teóricaineiite UIiV' I3 1

estreinadaiiieiite larga pai-a la traiisicioii i i - í l * eii hojas p plegadas

aiitiparalclas. qiie las oli-o-isoleiiciiias, ii= 7 y 8, eii solventes orgánicos

teiiíaii espectros de DC siiiiilnr 3 nqiiellos de polipéptidos p de cadena larga.

11.1 I

.. C”

._.. En rol la n i it ri to ;i I ;iza r.

c

L

c

L

r-

L

r L

c.

c

....

?-

L

El liso de polipeptidos sintéticos, tisiia!ineiite poli-L-lisiiia*HCI

coinpletaiiieiite cargada, poli-L-gliitciiiiato de sodio, coni0 modelos para

segmentos 113 ordciiados di: protziiins (las cuales tienen estructuras asiinétricas

bien defiiiidas nias no regiilariiiciite repetitivas) se encuentra abierto a la crítica.

Primero, el uso de tales polielectrolitos Iia sido cuestionado por Krintm

et,aI,(”’, cliiieii estableció (pie eii agua y a bajas concentraciones de sal el poli-

L-gliitaiiiato de sodio cargado foi-iiia t i n a estriictiira helicoidal extendida debida

a repiilsión de cargas (tal estriictiirri existe en el estado sólido). Debido a esto,

se Iia siigerido.que los polipéptidos (poli-L-gliitainato de sodio, poli-L-prolina o

poli-L-seriiia) en disoluciones salinas iniiy concentradas pueden ser mejores

estindares para cadenas proteicas no ordenadas. Sin embargo, esta sugestión es

disputada por Fasiiiaii et.al.“”’ qiiieiies citaron trabajos mostrando que en altas

concentraciones es posible qiie se colapse PGA en tina estnictiira coinpacta que

no piiede ser detenniiiada como uti eiirollainieiito estadístico verdadero.

Adzinás, se encontró qiie l a sa l piiede iiiteractiiar con los grupos carbonilo del

péptido y a consecuencia piiede caiiibiar los nioineiitos de transición. Hay

evidencia en contra de cualquier foiiiin helicoidal extendida para poli-L-lisina

protoiiada a bajas concentracioiies de sal. Las C L I I V ~ S de DC de eiirollamiento al

azar para poli-[N5-(2-liidi-or~ztil)-L-~Iiitciiiiiiia] no cargada en agia y para

varios ácidos poliainiiio no ioiiizados eii m i o s solventes son cualitativamente

siinilares a aquellas de polipéptidos cargados con una baja fuerza iónica; todas

exhiben bandas negativas de DC a I98 iini y bandas positivas a 218 nm

aFrosiiii3daiiieiitc, i i i i i i q w Ix i i i ay ! tdcs de baiidri son mayores para los

polielectrolitos.Cabe ineiicioiiai- qtie el icido stilfúrico fuerte (algunas veces

utilizado para producir foi.iiias de eiirollaiiiieiito al azar) puede protonar la

columna dcl péptido. El origeii dz la peqiieiia banda de DC a 338 nm es

incierto, y la asigiacióii de oti 'x bandas Iia sido discutido en teoría.

Una segiiiida crítica de la utilización de polipéptidos sintéticos como

eiirollamieiitos al azar modelo es de que stis patrones de DC en solución son

bastante diferentes de aquellos de proteínas destnaturalizadas

(presuinibleriieiite 110 ordenadas). Estas proteínas, desnaturalizadas por diversos

métodos, pticdcii

coiifonnacionales;

negativo a 220

aproxiinadameii te.

aiiii tener cadenas polipeptídicas sujetas a problemas

esliibeii espectros de DC caracterizados por un hombro

m i aproxiiiiadaineiite y una banda negativa a 200 nm Este tipo de ctiiva de DC también se muestra por películas

de polipéptidos sintéticos no ordenados en la cual las cadenas peptídicas son

presuinibleineiite restringidas aiiiique no tienen una asimetría repetitiva definida

y rebTilar. Sin eiiibargo, los polipéptidos sintéticos como una solución pueden

ser seriamente cuestionados coiiio tin iiiodelo adecuado para proteínas no

ordenadas.

Otras confortnaciones (le la columna.

La aplicabilidad de los polipéptidos de cadena larga como inodelos para

segmentos de a-liélices, hojas y eiirollainieiito a l azar en proteínas es aun

más notorio si estos segmentos estaii distorcioiiados o son inuy cortos. Además,

estnicturas de la coliiiniia qiie no sean a, p y no ordenadas se sabe que ocurren

eii protciiias y cada L i i i ; i di. c.;t;is c s m x t i i r x piiedr: coii!rilxiir sus propiedades

qiiiriipticas particiiliii'es a los il;it«s de DC. Por ejeiiiplo, cálciilos iiidicaii qiie l a

fiieza rotatoria d:: la lidice-.? ;,, eiisoiitrada eii proteínas, difiere de aqiiclla de la

a-hélice y iiiiiestra sii propia dcpc'iidsiicia dc loiigitiid de cadena.

La sitiiacióii piiede ociii-iir ciiaiido iiiia estriictiira arbitraria de la columna

piiede iiiiitar el DC de tina de las coiiforiiiacioiies de refereiicia (a, p y al azar)

los ciial interfiere seriaineiite.coii la iiiterpretacióii de los datos de DC. Un bueii

ejeinplo de esto es l a graiiiicidiiia S. Esta iiioléciila tieiie I O ainiiioácidos

acoinodados eii tina estriictiii'a tipo p cruzada. Los patroiies de DC obteiiidos

sori de algiiiia foniia siiiiilares a aqiiellos de tina a-hélice. Por lo tanto, la

siiriilaridad del espectro de la graiiiicidiiia al de u-hélice es solo superficial.

L a variedad de espectros de DC obteiiidos para otros compuestos modelo

pequeños coiiteiiieiido iiiio, dos y seis griipos aiiiida ilustra la gran variabilidad

en las propiedades rotatorias qiie se piiedeii concebir para residiios peptídicos

eii coiifoiinacioiies regiilares. Adeinis, existe evidencia qiie algiiios

polipéptidos piiedzii caiiibiar sil coiifoi'iiiacióii debido a agregación coil otros

polipéptidos; este Iiallazgo piiede ser relevaiite para proteínas bajo coiidiciones

de ag-egacioii ya sen iiiter o iiitraiiioleciilai-.

Dispersión (le la'luz

Un factor f inal qiie piiede distorsioiiar los espectros de DC de proteínas es

la dispcrsióii de la liiz. Recieiiteiiieiite se liaii llevado a cabo estiidios qiie

. ".

iiiiicstrai q~ i c Ins b~iiidiis roiacioiiiilcs 1)ucticii SLI. caiiibiadas a rojo y rcdiicidus

eii iiiriyiiiiid p x a siispciisioiics tiirbiiii(por c,jciiiplo, para prot2iiias en

preparacioiies de iiieiiibiaiia). L'ri!. 1, . I i fiieroii los priiiieros eii i i iteiitar

correlacioiiar Ins distoi-cioiics coiiocIdiis eii h i i d a s de DC de a-lidice de

proteiiias de iiiciiibi-aiia coi1 cilciiloj ( I C dispei-sióii diferencial de la Iiiz

esperados y iiii aplniimieiito dc 1:i LibsorciCiii cii sisteiiias con paiticiilas. Dichos

cálculos desde eiitoiiccs liaii sidci refiiiados. Datos de DC Iiaii sido obteiiidos

para siispeiisioiies y peliciilas dispersaiites de aeidos poliainiiio y para

preparacioiies de iiieiiibraiia. La c«iicliisii,ii teiitativa ( b,asada eii ~ a i i parte en

estudios sobre iiiciiibraiias de c i l i i l i i j rojas de la saiige fragneiitadas y no

dispersas y para siispeiisioiies dispersaiites de proteiiias Iielicoidales) es qiie los

efectos por distorcióii por priiticiilns ( piiiicipalineiite aplaiiainieiito de la

absorcióii) y iio coiifoiiiiacioiics cspeciales de proteiiias son las responsables

del espectro de DC característico de iiimbraiias, Debido a esta distorción hay

una coosiderable aiiibigüedid eii la iiiterpretacióii de espectros de DC de

sisteiiias coil paiticulas: pcliciiliis de poli-L-alaiiiiia conocidas coino a-

Iielicoidales a paitir de espectroscopia IR: iniiestraii im espectro de DC tipo j3

ciiaiido la dispersióii se pi'eseiita, 5. el aiiálisis iiiiiestra qiie las proteiiias de la

iiieiiibcma del M!.coplasiiia soil eii graii paiíe de coiifoniiacióii p, aiiiique su

ci i rw ds DC aparece siiiiilar a nqiiclla de tina a-liilice coil distorción por

dispersióii. Por lo. taiito, se deb t teiier iiiiiclio ciiidado eii la iiitrepretacióii de

espectros de DC de sisteiiins tiii.bios, y iiiitodos fisicos iiidepeiidieiites de

deteiiniiiacióii de coiifoiiiincióii debeii de ser iitilizados cuaiido sea posible.

Recieiiteineiite i i i ia celda I i a sido creada, la ciial puede corregir artefactos de

dicpei-sióii y se iiiiiestra proiiieiedoi-a.

( 1 -

Comcnta rios gcricrales

Dos tipos de crornofor'os qiic . iio fon:iaii paite L .i coliiinna, resiL-os de

airiiiioicidos aroiiiáticos y gi-tipos disiilfiiro, piiedeii causar coinplicaciones en

l a iiiterpretacióii de datos de DC. E¡ espectro de absorción de los aromáticos *

(feiiilalaiiiiia, tirosiiia y triptotaiioj y la cistiiia iiicliiyeii baiidas eii la región del

ultraviolela csrcaiio(3.30-300iiiii). Adziiiris, estos ainiiioácidos y la Iiistidiiia

tieiien baiiilas de alwrcióii eii 185-740 iiin eii la región peptidica. Cualqiiiera

de estas bandas piiede ser' ópticaiiieiite activa en iiiia proteiiia, especialineiite si

la cadeiia lateral se iiiaiitieiiz a i iiii aiiibieiite asiiiiitrico. Los efectos Cotton en

el iiltravioleta cercaiio, ciiaiido se asigiaii apr'opiadaineiite a cadenas laterales

específicas, puede ser de iitilidnd eii la deteiiiiinación de las iiiteracciones

coiifoiiiiacioiiales eii las proteiiias, por ejeiiiplo, la estnicttira terciaria de sitios

activos, Por otro lado. las lxiiidns de DC de cadeiias laterales de loiigitiides de

oiida inás bii.jas piiedeii iiiteIl>r¡r c a i la estiinacióii dc las estructiira secundaria

del aiirilisis del efecto Cottoii del pL;ptido. Estiidios de l a absorcióii y de las

propiedades qiiirópticas de coinpiiestos iiiodelo(derivados de ainiiioácidos y

polipéptidos) y de proteíiias Iiaii mostrado qiie en el rango del UV cercano

auiique Ins loiigitiidec de oiida de los t f íc toj Cottoii debidos a tiiia cadeiia

lateral croitiófora dada soil rzlatkaiiieiite constantes, la ainplitiid y hasta el

signo de estas baiidas pwdz variar con l a coiiiposicióii y geoinetría de la

inoliciila. Eii la regióii del UV iejaiio (i.440 i m ) la iiiteracción eiitre la cadeiia

lateral 1, los croiiióforos del piptido piiedeii catisar qiie la posición de las

bandas de DC y ORD seaii uriab1c.s . El pr-opcísito de esta sección es el de

restiiriir los niétodos eii los que se utilizaii los efectos Cotton de las cadenas

laterales para gaiiar iiifoiiiiricióii estructural, as¡ coino mostrar los peligos

idiereiites en tratar de iiitei-pretar los espectros de DC y ORD conteniendo

bandas qiie se traclapeii de piptidos J' cadeiix laterales.

Goodnian zt.al.!i8'esci.ibiei.oii dos artículos itiuy útiles sobre los efectos

Cotton aroiiiáticos eii proteiiias (y coiiipitestos iiiodelo) y en ácidos poliamino,

los cuales cubreii la literatiira iiiiportaiites hasta el año de 1968. El análisis ae

las bandas de DC de aroiiiáticos eii el ultravioleta cercano en proteínas (y

modelos), iisualineiite a 77' doiide estructuras finas caractensticas se vuelven

aparentes. Otro método freciieiiteineiite utilizado para la clasificación de

bandas de cadenas laterales es el caiiibio-rojo debido a la ioiiización (a pH alto)

de la absorción de tirosiiia y los efcctos Cottoii .

Muchos estudios se liaii ocupado con los ácidos aromáticos poli-a-amino

como modelos para estos croiiióforos atrapados eii orientaciones fijas como las

que ptiedeii existir en proteíiias. Dos probleirias son coiniines en estos estudios:

traslape de baiidas peptídicas y aroiiiiticac, y baja soltibilidad de los

polipéptidoc eii agua. Para superar el segiiiido problema, se ha hecho uso

esteiisivo de solveiites no-acuosos, y de copoliirieros (al azar o en bloque) con

residuos solubles en agua y cndeiias laterales iiiodificadas.

La actividad óptica de los residtios de cistiiia ha sido discutida por

Bzycliok." Ejeiiipios de proteiiias que iiiiiestraii bandas de DC en el

ultravioleta cercano a 250-2YOiiiii, atribuidas a los puentes S-S son insulina,

riboiiiicleasa y la~s iieiirofisiiias.

9 ) .

Eii ::iiiei:ii. la piwriiciii de residuos xoiiiiticos puede resultar eii [ilia

estiinacióii iniiy baja eii <I criiiteiiido de u-lidiccs (o foiina p) eii uiia proteíiia.

Est3 coiicliisióii sc basa eii iiiiiclios cstiidios eii el iiltravioleta lejano de DC

para aroiiiaticos siiiteticos c»iiteiiieiido polipéptidos en conformaciones

ordciiadas. (Poco se piicdc pi-ecfccir de derkados de ainiiioácidos aroináticos

iriás peqie~ios coli respecto a la scnnl y iii<igiiitud de los efectos Cotton en

proteínas). Efectos Cottoii positi\,os dt: cadeiias laterales caiicelaii parcialmente

(o cornpletaiiieiite) los efectos Cottoii peptídicos negativos eii el rango 'de

h=200-240 iiiii para poliineros y copoliineros de L-fenilalaiiiiia, L-tirosina , L-

triptofaiio y L-liistidiiia. Esto puede ser verdad bajo ciertas condiciones de una

variedad de solveiitcs,, iiicliiyciido iiiiiclios Joiide los primeros tres polimeros se

pensó que eraii u-lielicoidoles y doiide la poli-L-liistidiiia puede ser estructura

u ó p. Eiitoiices, el traslape de baiidas de DC aromáticas y peptídicas puede

llevar a debilitar apareiiteiiieiite valores iiegativos de elipticidad para la longitud

de onda de la regióii de los péptidos eii proteíiias estnicturadas, y resultar en

una siibestiiiiacióii de la caiitidad de estructura secuiidaria actualmente

preseiite. Por ejeiiiplo, uii estiidio sobre la poli-L-tirosiiia hace iiotar que en

casos iio fa\,orables tiiia cadciia lateral de la tirosiiia puede coinpeiisar la

coiitribucióii de tii ia iiiiióii pcptidica eii tina coiifoi-iiiricióii a-lielicoidal o /3. Uii

caso sobresalieiite de baiidas at-oiiiáticas eii el UV-lejano en proteíiias es aquel

de l a A\,idiiia, ct i~:o espectro de DC coiitieiie iiiia bmda positiva de triptofano

a 32s iii l i .

Existe poca iiifoi-inacióii respecto a los croinóforos disulfiiro asimétricos ai

DC de proteiiias o polipeptidos eii la regióii de loiigitud de onda por debajo de

los 240 i i i i i . Siii eiiibai-go, la preseiicia de bandas de DC por debajo de los 240

53

L- .

c

P

L

F

L

c

--

iiiii para la cistiii;i eii SI (cii iiiulls !. cii d i m ~ de KBr), y la esisteiicia de tina

banda de DC positiva a 230 iiiii, para grainicidiiia S, atribuida (por lo menos

parcialiiieiite) a una traiisicióii S-S puede seivir coino iiotas de precuación.

Algunos otros aiiiiiioácidos (cisteíiia, iiietioiiiiia , aspargina, ácido glutámico y

aspartic0 y ainidas) tainbiéii absorbeii luz en la reb"n de los 185-730 nin,

aiiiiqiie no tieiieii la inásiiiia absorcióii eii esta regióii. Su contribución a las

propiedades rotatorias de las proteiiias 110 Iia sido estudiada extensivamente,

pero no se espera que sea larga.

Derivados de miinoficidos y acido poli-L-amino

(I) Fenilaicrnina. Feiiilalaiiiiia puede ser tomada como el cromóforo aromático

típico, atiiique de alguna inanera iiieiios estudios se Iiaii practicado con ella que

con tirosiiia y triprofaiio. Todos los estudios aromáticos tienen en común los

probleinas de l a eleccióii de los coiiipiiestos inodelo y la resolución de las

bandas aroináticas rotatorias de baiidas peptidicas; las inisitias revisiones

piiedcii ser coiisiiltadas prirn todos los coinpiiestos aroinaticos residuales. El

espectro de absorcióii en el iiltrabioleta de feiiilalaiiiiia es el característico de un

aiiillo de beiiceiio inoiio sustituido. La baiida débil, con estructura vibracional

fina, en la regióii de los 260 iiiii da origeii a varios efectos Cotton débiles, no

todas las traiisicioiies soil ópticaineiite activas eii cualquier compuesto dado.

Adeinás, esisteii baiidas de absorcióii electróiiica fiiertes y ópticaineiite activas

inás allá eii el UV.

i?") Coiw 1ii jeii:ildo per I l o i o i \ i t L et. al. I:i estnictiira \ibracionnl fina de

DC varia iaii el coiiipiiestc: c'ii 1;i L-teiiilalaiiiiia por si sola , sólo soli dicroicas

las bandas proiiiiiieiites de absorcióii a 264 y 25s iiiii. (dando Iiigar a efectos

Cotton positivos), pero, por otra parte, en la m i d a y en proteiiias solo las

bandas de dt:bil absorción del croinóforo feiiilalaiiiiia a 268 y 262 nin son

opticaineiite actiws. La resolticitxi de las bandas de DC en el UV-cercano

piiedeii iiicreirieiitxse trabajaiido a 77'; se piiede hacer una asignación de

bandas iitil en l a caracterizacioi: de feiiilalaiiiiia en proteinas puede. Los

solventes orgiiiicos piiedeii afectar eiioniieiiieiite el espectro coinpleto de DC

de l a N-acetil-L-feiiilalaiiiiia aiiiida (así coino las de otros aromáticos).

Estudios sobre el croinóforo feiiilalaiiiiia en polipéptidos son coinplicados

por l a iiisoliibilidad de l a poli-L-feiiilalaiiiiia en agiia (necesitando el uso de

copoliiiieros o de disolventes org;íiiicos) y por el traslape de las bandas de la

cadena lateral y del péptido (esto Iiacieiido l a detenniiiacióii coiifonnacional

muy dificil).

Estudios de DC de políineros iiiostraroii dicroisino positivo ó débilmente

negativo en la región peptidica y se siigirió qiie una estniciira ordenada

(posibleiiieiite a-helicoidal) se foriiia bajo ciertas condiciones del disolvente.

üny'"'eiicoiitró que ia poIi-L-f;.iiii;iIaiiiiia foiina tal estrtictiira en 999ó

diclortiro de etileiio inás l",O de icido trifluoroacético (TFA). El DC forma

bandas finamente estnicti-tiadas de - I O0 deg.cin'/dinol cerca de 260 iim, más

tina banda a los 327 niii ([0]2::=-9000) y iiii Iioinbro positivo a 215 ntn; este

espectro es destruido por TFA adicional. Peggioii et.al.'22'lian concluído, a

partir de dos líneas de evidencia, qiie la estriictiira ordenada piiede ser una a-

hélice hacia l a derecha , aun y ciiaiido siis propiedades de DC son diferentes a

las de ins tipica u-lielicc. l'[~illic[~~.~. L'! eqiccti'o de DC de copoliineros de L-

feiiilalaiiiiia coil ~-cai-botieii~usi-l.-lisiii:i eii tctraliidrofmiio inostraroii una

perturvacióii gmciiial del pat1611 de la u-liilicc coil E-carbobeiisosi-L-lisiiia ai

introdiicir inis feii¡lnlai!iiia. pcia iiiiigúii caiiibio en el sentido Iielicoidal.

Seguido, poli-L-feiiilalaiiiiia pasa iiiia traiisicióii en mezclas agua-ácido

metaiiosiilfóiiico , eii iiiia iii;1ncra míloga a aqiiella de la transición u-hélice a

enrollainieiito de ~~oli-L-cicloliesil~iIniiiiia; bandas en el UV-cercano también

fueroii obseivadas en este estudio. Sin eiiibargo, los patrones de DC de la poli-

L feiiilaliiiiiiia p e d e ser atribiidos 'I iiii traslape de baiidas de cadeiias laterales

croinóforas depeiidieiites de la coiifonnacióii coil bandas iionnales de

eiirollaitiieiito al azar y de péptidos a-lielicoidales. Lo inisrno puede decirse

para l a poli-L-tirosiiia y para poli-L-triptofaiio. Un esriidio reciente de DC

realizado por Peggioii et.al.i'2'sobi.e copolíiiieros de lisiiia y fenilalaiiina en

agiia a varios valores de pIi siigicre qiie la presencia de feiiilalanina en este

sisteina induce a la fonnacióii de l a estructura p.

(ii) i / i m i m El espectro de abs«rció:i de la tirosiiia no ioiiizada (la fonna

presente eii prott'iiias a pH iieiitro) coiitieiie i i i ia banda débil a 275 nin (con un

iioiiibro a los IS2 iiiii) y dos picos iiihs fiiertcs a 723 y 193 iiin. El espectro de

DC de la L-tirosiiia iio ioiiizada iiitittstra bandas positivas con-espoiidieiites a

las transiciones eii 275 y 225 iiiii; la banda de DC iiitervieiie con la

detenniiiacióii coiifoiinacioiid de los polipéptidos de tirosiiia. La sefial de DC

es positiva taiiibiéii a )¿ < 200 11111. Czilciilos teóricos de la actividad óptica de la

tirosiiia iiaii sido elaborados. La estriictiira \.ibracioiial fina se vuelve aparente

en el DC de la tirosiiia (y stis deri\;ados) al eiifriarse. Cuando el g ~ i p o feiiólico

"I

es ioiiizado (a 1111 pI~I sobre I ? ) toda la absorción y bandas de DC son

cainbiadas a loiigitiides de oiiih i i i i j larps. (Este cambio a rojo es útil para

diagiosticar residuos de tirosiiia t'ii proteinas)

t'w :.o n o m i w x

Figura 6 ,-".,...<-,

Dicroisiiio Circultir dc lii poIi-L-~irosiiii~ 1iclicoid;il (- ) . poli-L-Tirosina al awr (--------) (ambas a pH

11.2). y L-tirosiiia a pH 8 ( ......... ) > i i pti I? La roriiiii Iiclicoidnl dcl polimcro fié prcparada por

diliicióii dirccio cn agii;i ;I pH 11.2: I;i ioriii:! dc ciirull;iiiiiciiIo :it :icir priiiicro iuc Ilcvada a pH > 12 y

dcspids a pH 11.2.

Los patrones de DC de l a N-iicetil-L-tirosiiia ainida se muestra en la figura

5 ; l a baiida de los 275 nin para este compuesto en agua es negativo. El ester

stílico de la L-tirosiiia y el ectet etílico de la N-acetil-L-tirosiiia tainbién han

sido esainiiiados a diferentes teiiilier'ntiiras y valores de pH. El espectro de DC

en el UV-cercano de la N-acetil-L-tirosiiia ainida y del etil ester son

estreiiiadaineiite dependientes del solveiite; la baiida de DC del ester a 275 nm

es positiva en diosaiio y iieptiva i'ii inetanol. Honvitz et.al.'2''siigirieron que

de-biera ser posible identificar los residiios de tirosha en proteínas a partir de su

estnictiira de DC vibracioiial eiitte los 275 y los 290 iiin. Las bandas entre los

*.

c

.._ r-

L

250 y 170 iiiii fiicruii iio ta i i iiiilrs cicbitlo al traslnpe de coiitribucioiies rzsiduos

de fenilalaiiiiin y piieiites Ji.iii1fiii.o.

Las propiedades de las dikciol!ipei.ariiias (tlipiptidos cíclicos) eii DC eri el

UV-ccrcaiio coiitciiieiido croiiiótoros aroiiiríticos Iian sido esaininados a

teinperattira aiiibieiite y por debnjo de esta. Los valores de elipticidad para L-

tirosiiia coiiteiiieiido dipéptidos ciclicos soii iiiiiclio inás &Tandes que para los

péptidos lineales análogos, apareiireiiieiite debido a la confonnacióii tígida de

las diketopiperaziiias. Caiiibios a rojo soli causados por la ionización de 'la

tirosiiia y por solveiites orgiiiiicos. L a L-tir-L-tir cíclica iniiestra una pequeña

coiitribiicióii escitoii eii sii DC. Zieglrr y Bush (*%oinpararoii el espectro de

ciclo-(%liciiia)j-L-tirosiiia con aquellos del Iiesapéptido lineal análogo y de la

ciclo-(Gly)-L-leiiciiia. Ellos coiicliiyeroii, con la ayuda de datos de resonancia

inagiitica iiiiclear, qiie el inejoraiiiieiito de las bandas de DC de la ainida x-x*

es el resultado del acoplainieiito entre los croinóforos tirosil y amida.

Coiiio coli los hesapéptidos cíclicos, la preociipacióii principal de los

estudios sobre polipéptidos que coiitieiieii tirosiiia (y otros aroináticos) es el de

resolver peptidos de bandas de DC de cadenas laterales y detenniiiar su

coiifoniiacióii. La estiinacióii de la esti-iictiira secundaria de estos poliineros es

iinpoitaiite si \ a i 1 a ser iit ilizados coi110 iiiodelos para la detenninación

estriictiiral de proteiiias, debido a qiie la coiitribiicióii de croinóforos aroináticos

al espectro de D C e s depeiidieiite de la coiifoi-iiiacióii. El espectro de DC del

políinero iio es la siinple siiiiia de aqiiel de un derivado del ainiiioácido

inoiioinérico (ej. L-tirosiiia) y aqiiel para u n polipéptido de conformación

conocida (ej. u-hélice): los ci-oiiióforos de cadenas laterales iiiteraccionan con

otro y coli croinóforos peptidicos. El probleina, coino lo ilustra con la poli-L-

P

.. -.

L

c

h.

c

i..

c

L_

P.

tirosiiia, es dificil. Las ctiivas dc DC para este políinero (fig. 6) obviamente

reflejan una mezcla de las bandas de péptiao y de tirosiiia. El espectro

resultante no corresponde, ni siquiera ciialitativainente a datos de DC del

polipéptido para las fonna conocidas u$ y al azar. Si pudiera mostrarse q w

un espectro de DC dado para l a poli-L-tirosiiia corresponde al del políinero en

cualquier confoniiación de la coliiiiiiia coiiocida (por ejemplo a-liélice),

entonces el patrón normal de DC para esta conformación puede ser restado.

Las contribución al DC de la cadena lateral piiede ser estimada, y estDs

resultados piiedeii ser aplicados para corregir el DC de proteínas conteniendo

residuos de tirosiiia en segmentos con esta coiifonnacióii. Sin embargo, si la

conformación de la poli-L-tirosiiia 110 se conoce, las contribuciones al DC de la

columna y las cadenas laterales no piiedeii separarse (porque los efectos Cotton

de la tirosina dependen de la coiiforiiiacióii) y los estudios de polímeros son

mucho menos útiles para aplicaciones sobre proteínas.

Después de i i n gran iiíiiiiero de estudios sobre DC y las propiedades fisicas

de la poli-L-tirosiiia y copolíiiieros en varios disolveiites, más cálculos teóricos

de DC, todo lo que se ptiede concliiir es qiie la poli-L-tirosina es

probablemente tina a-liélice hacia la derecha en disolución acuosa bajo ciertas

condiciones. También hay e\.ideiicia de tina Iiélice hacia la izquierda ( I 4 ) y de

formación de hoja p . Sin eiiibargo, tina geiieralizacióii íitil para la interpretación

de DC de proteínas emerge de datos qiiirópticos: todos los espectros de DC y

ORD de la poli-L-tirosiiia (110 iiiiportaiido cita1 es la estnictura correspondiente)

tienen valores de elipticidad en t i n rango entre 210 y 240 nin los cuales son

mucho más positivos que aqtiellos de los poliéptidos normales en

coiifonnaciones ordenadas conocidas, Por lo tanto, residuos de tirosina (y otros

arc!iiiticos) cii prcteíiias piicdeii c;ius;ir una cstiiiiacióii demasiado baja a partir

de datos de DC para cualqiiier coiifonii~icioii ordenada.

El primer s i g o de peciiliaiicirid para la poli-L-tirosiiia f i é su valor de bo

positivo. Beycliok y Fasinaii'"'esriitiiii~iroii sil DC y encontraron qiie el espectro

que se eiiciieiiti'a eii la fígiira 6. Debido a que I:] poli-L-tirosiiia no es soluble en

su forma total iio ioiiizada, el poliiiiero t w o qiie ser esaiiiiiiado a un pH alto.

En la fonna estrtictiirada (helicoidal) hay baiidüs de DC correspondientes a la

bandas de absorción de la tirosiiia no ioiiizada a 275 y 225 nm, más una banaa

a los 248 iiin atribuible a la tirosiiia ioiiizada. Todas estas están superimpuestas

en las baiidas de DC del piptido. Trabajos realizados inás tarde mostró la

presencia de tina baiida de DC positivo a 200 iiin en tninetil fosfato y en

NaCIOJ O. 1 M a pH 10.8; esta baiida, tainbiéii es probablemente una mezcla de

la absorcióii de la tirosiiia a 194 iiin inas la baiida de absorción del péptido 7 ~ -

x*. De alguna iiiaiiera ciirvas de DC difereiites encontradas para la poli-L-

tirosiiia, eii las cuales la baiida iiegativa a 225 iiin no se encuentre, se puede dar

por variaciones de ioiiizacióii.

Algiiiios estudios recientes de copoliiiieros qiie contienen tirosina son de

interés. Sliecliter et. al.'2"eiicoiitraroii qiie para un copolíinero de secuencia L-

tir-L-ala-L-GIu, la baiida de DC n 175 iiiii es negativa en l a conformación

Iislicoidal (,aiiiiqiie la baiida a 215 iiiii reticiie la inisina seiial que en el

hoinopoliinero). Este resiiltado indica l a seiisibilidad del cromoforo de tirosina

a SLI ambiente asiinétrico y iiiiiestra qiie sti habilidad de iiiteraccioiiar con otras

tirosiiia puede caitibiar si1 coiitribiicióii rotatoria. Rainacliaiidran et. al.

""'estiidiaroii el inisino copolíiiiero por iiiedio de ORD. Ellos l o compraron con

u11 copolíinero de seciieiicia al azar (Tir, ala, GIii) en ainbas formaciones a-

60

Iielicoidkil y al a n i . . y di0 c\id;.iicia COI^ d!fi.ncciiiii de rayus S para la fonna

Iielicoidal del copoliiiicro sccumciado. Ellos coiicliiyeroii que en la fonna u-

helicoidal, la coiiti-ibiicioii al ORD de los rccidtios de tirosiiia eii la region de

los 200-350 iiiii ( uii pico a los 33.3 i i i i i J iiiio por debajo de los 200 nrn) casi

caiicela la coiitribiicioii del u-lidice. L a coiitribiicióii de la tirosiiia del

copolíiiiero al azar eii la coiiforiiixióii u-lielicoidal es siinilar en la forma, pero

tieiie solo ciii tercio de la aiiiplittid

Poliinecos de Iiidro~ietil-I,-gliitain¡iia qiie iiicorporaron pequeiias cantidades

de L-tirosiiia iiiiiestr'aii efectos Cotton iiegativos eii l a región del UV cercano en

soliicióii actiosa de inetaiiol al YO04 ( doiide los políineros soli u-lielicoidales)

coiiio se intiestra eii la fíciii'ii 7. Estas baiidas de DC

2 50 2 M 2 ?O z6.a 290 x m .,,.m,

Figiir:i 7

Dicro iwo CirwI: ir en ci ul i rm iolci:i ccrcmo dc sopoliiiicros de N'-(?-liidro~iciil)-L-Cluinriiina con

c:iiiiid:idss u r t x k i s dc L-iirosiiia (iiicorpor;id;i :¡I w r . El so!! ct i i i cs SiIYú iiiclaiiol acuoso . cn cl cual los

copoliiiicros soti u-liclicoid;ilcs. Los \:!iorts cic [!)I soil dados por iiiol dc residuo dc tirositia. Porcicnto molar

dc tirosiii;i cii los coiiipliiiicros. 4 5 - - - - - ; S ~ 17 El cspcciro dc DC de N- acciil- L- lirosiiia ;iiiiidd cn i1ict:itioI . ... . sc 1iiucsir;i p:ir;i coiiipwicion L:is b: i r rx dc crror indican el aciicrdo de

di ipltcir loa c\pcriiticiiios

(calculadas por iiiol de tirosiiia residual) crece desproporcionadaineiite ai

aiiiiieiitar' el coiiteiiido de tirosiiia, otra vez inostraiido iiiteracción especifica.

Adeinás, copolíiiieros eii bloque de L-tirosiiia con DL-glutainato tienen bandas

de DC positi\as a 275 n i i i , siiiiilarts a l a poli-L-tirosiiia. No es posible, eii

ningiiiio de estos casos cnlciilat cl cspeciro de DC del copoliiiiero a cualquier

longitud de onda adicioiiaiido las ciirms de DC de derivados de tirosiiia

modelo, aíiii y ciiniido estos copoliiiietos tieiieii coiifonnacioiies iionnales. Este

resultado iniiestra qiie las coiitribiicioiies nioitiiticas al DC soii dependientes de

la coiifonnacibii, o que las cadenas laterales se iiimovilizaii debido a la

estructura de l a coliiiniia y por lo taiito soii atrapados en una configuración

asimétrico. El exaiiieii de las ciirvas de DC en l a región de la longitud de onda

del péptido para estos copoliiiietos Iiclicoidales iniiestra un descenso aparente

en la inagiiitiid de las bandas de DC del péptido al aiiineiitar el contenido de

tirosiiia; este Iiallazgo es iiiiiy siiiiilar al caso de los copolíineros de triptofaiio.

(Ver figura 8)

c

c

c

L

c.

r-

_- -I

L.

P

L,.

Fi:iir;i X 8:\.

Dicroisiiio Circular cii cI U.V. 1cj;iiio dc c-op-oliiiicros dc N i -(2- liidroxiciil)-L- glutamina con variadas

caiiiidadcs de trip1of;iiio ( incorporado ; I I ;i/. ;ir), Porciciilo 1iioI;ir dc [riptofano cn los copoliincros:

if .......... (poli-liidrosiciil-L-gliii:iiiiiii;i)

2s- X.8 ____---___ 14.8

Los vdiorcs dc [ii] soil d;idos por iiioi dc rcsiduo pcpiidico.

(A) Polipcpiidos u-liclicoid;ilcs CII soliicioii ;iciios;i dc iiiclanol al 80%.

(E) Coiiforiii:icioiics dc c~iroll:~~i~ici~to al :imr CII agua..

(iii) 7i~iptofo~io. Este ainiiioácido absorbe la luz a 227 nin (con estructura

vibracioiial), 2 1 S y 196 11111. El ORD del I=triptofaiio, N-acetil-L-triptofano

ainida y péptidos pequetios, iiiis el espectro de DC del ainiiio ácido, sus ésteres

y N-acetil-L-triptofaiio ainida Iiaii sido esainiiiados. Varias bandas positivas se

encuentran presentes entre los 270 4 300 nin para todos estos compuestos.

Stricklaiid et.al.'26)lian asignado estas bniidas vibracionales a temperatura

ambiente y 77"(doiide son iiie.ioradas) coil la asistencia del espectro se

absorcióii del iiidol. Dos trniisicioiies elcctroiiicas La y Lb, cootribuyen al DC

c

L_

c

L

c

L

c

- c

L

c

c

i

c

de coinpiiestos de triptofaw iiiodc!o en esta regibii. bandas vibracionales de

DC de Lb se eiiciieiitraii localizadas a 290 iiin para la transicón de 0-0 y a 283

iiin para la traiisicióii 0+85ü ciii-'; estas posicioiies iio son cambiados por los

diferentes disolveiites. Varias baiidas de La, localizadas entre los 265 y 297 nin

dependen del disolvente. Varios laboratorios estáii de acuerdo que en la región

de la loiigitud de onda baja el L-triptofaiio a pH neutral tiene bandas de DC a

222 nm (positiva) y a 195 iiin (negativa), lo cual corresponde a sus picos de

absorción. Además, bandas peqwfias a 240 y 200 nin son notadas en a l y n b s

reportes. El espectro de DC del L-triptofaiio es dependiente del pH, y es muy

siinilar a aquel de el N-acetil-L-tiiptofaiio ainida. Estudios de diketopiperazinas

iniiestra que las baiidas de DC eii el UV cercano de Gli-L-trp cíclico y de (L-

trp)z cíclico soli varias veces taii graiides coino aquellas correspondientes,

menos rigidas, a dipéptidos liiieales. Efectos del disolvente en el dipéptidos

fueron demostrados: el diosaiio parece que destruye la iiiteracción entre los

croinóforos iiidol y el aiiillo dipeptidico, pennitieiido una libertad rotacional

más ainplia. Las baiidas de DC del triptofaiio fiieron correlacionadas con

bandas eii P-lactoglobuliiia y aiiliidrasa carbóiiica. Las propiedades quirópticas

de poli-L-tiiptofaiio y siis copoliineroii iiiiiestraii traslape de bandas de péptido

y de cadeiias laterales, siiiiilar al caso de la poli-L-tirosiiia. Gran parte del

trabajo Iia sido resiiinido. Fasiiiaii et.al.""esairiiiiaroii el OF¿D de una película

de poli-L-triptofaiio y eiicoiitraioii a 233 iiin inás efectos Cotton peqiieiios en el

UV cercano. Ello's coiicliiyeroii qiie el poli-L-triptofaiio, aiiii teniendo un valor

de b, positivo, es iiiia a-lvilice Iiacia la derecha ya que una serie de copolimeros

coli y-beiizil-L-gliitaiiiato foiiiiaroii una relación lineal entre bo y el porcentaje

de triptofaiio. Stevens et.al. ""obtiivieroii espectros de DC de películas de poli-

- P - c

L..

(2'1, L-trp. Cos:iiii et :iI. cstti~li~w~i! los qiec t ros de DC de un copolíiiiero de

bloqit. de triptotiiiio coil .~-etil-DL-~liitaiiiato eii trifluoroetaiiol, solveiite eii el

cual el políiiiero apai-cce estriictiii.iido. Biiiidas de DC fueron encontradas a 290

iini (AF -0.63), 256 y ZSO(l1oiiitros positivos), 272 (A~=2.65) , 226

(,As=42.27), 310 (SE= -3ó.4), y 190 (Ac = 14.3). Las dos bandas dicroicas a

210 y I90 iiin soli de la iiiisiiia sciial y posicióii que de aquellas observadas

para polipéptidos en iiiia coiifonnacióii u-helicoidal hacia la derecha. De

cualqiiier iiiaiiera, l a baiida a 226 iiin iniiestra que transiciones iiidol

ópticaiiieiite xtivas se traslapoii a traiisicioiies peptídicac en este políinero, y la

asignación coiiforiiiacioiial requiere ser coiifiniiada.

(iv) Hislitlitia. El grtipo iiiiidazol de la Iiistidiiia tieiie iiii pico de absorción a los

210 iiin que podria iiitci-ferir coil las inedicioiies de DC en proteínas. El

espectro de DC del L-aiiiiiioácido iniiestra una banda positiva a los 213 nin (lo

ciial cainbia ligeraiiieiite a i-ojo eii ácido) y uiia baiida negativa a los 193 iiin. Se

mostró que iiiia baiida iiegatim a 2 17 iiin eii ciclo-Gliz-L-Tir-Gliz-L-His tiene

coiitr-ibircioiies de traiisicioiies m i d a i1-x- y traiisicioiies electrónicas iinidazol.

Poli-L-liistidiira Iia sido esttidiada por iiiedio de ORD, DC y espectroscopía

iiifraimjo. En general se está de actiei-do que a 1111 pH ineiior de 4, donde la

moiety del iiriidazol lleva uiia carga positiva y donde el espectro de DC se

caracteriza por tiiin baiida positiva a los 222 iiin, el políinero es tin

. eiirollaiiiieiito al azar (o tal vez illla cadeiia extendida). Sin embargo, en

65

.

süliicioiics aciios;!~ que s,: wciiei~iriiii p o r m i b a dcl pK de In traiisicióii del

iniiodazol (pH 5-6) hay iiiia coiiti.owIs¡a sobre la foiiiia ordeiiada (o fonnas) de

la poli-L-liistidiiia. A pi1 - 6 el DC coiitieiie bniidas a 221 iiin ([í3]--5000) y a

203 iiin ([O]- 16000j; caiiibios de DC intiy coirip!icados ( iiivolucrando más de

dos especies) fiieroii iiotados al \ aiiar el pH de 4 a 6. No qiieda claro si la poli-

L-histidiiia a pH neutral es i i i i ~ i IiZlice Iincia la izquierda, iina lidice hacia la

deieclia (con coiitribucioiies de cadeiias laterales que confunden las

propiedades qiiirópticas), iiiin hoja f3 o talvez algiina otra conformación o ina

mezcla. Eii ciialqiiier caso (coiiio parece ser l a regia para residuos aromáticos),

¡a preseiicia de Iiistidiiia resiiitn eii 1111 espectro de DC iniiclio menos negativo

en la región de 195-340 11111 qiie iiin c i i i w i ioi i i ial a o p. Peggioii et.al.'~'"'exainiiinroii espectros de DC de iina serie de copolíineros al

azar de L-liistidiiia coil L-lisiiia, y coiicluyeiw que la estructura ordenada

asiiinida por la poli-L-liistidiiia no protonada en apia no puede ser una a-

Iiélice. Uii copoliiiiero de seciieiicia L-(His-Ala-Glu),,, el cual es soluble en

agua y 1111 buen iiiodclo para Ii¡.itidiiia eii proteiiias, tieiie tin espectro de DC en

agua el cual iiidica eseiicialiiieiite iiiia coiifoiinacióii de eiirollainiento al azar a

todos los valores de pH, coil poca seiial de iiiterfereiicia de la actividad óptica

de cadeiias laterales.

fLy Resitlrios q r r c c0/7//~/1~~1 .\r///i/ro. Adtitiis de los residuos aromáticos, la

coiitribiicióii de los resicliios coiiteiiieiido sulfiiro, principalineiite cistiiia (S-S),

deben toiiiarse eii ciieiita. Cisteiiin (SH), iiietioiiiiia (SCH3) y cistina tienen

colas de absorción largas eii la regioii de los 195-230 nin; cistina tiene una

66

banda ;idicic)ii:I.l ;I los 250 iiiii I : I ~ ~ c ~ i i i u i i ) i - o jiiI1.iii.ü por si iriisino no parccc ser

ima fiiciitc iiiipoitaiits dt x í i \ , i c ! a i i i ipt ica.

Por otro lado, el craiiióibro cijtiiia disiilfitro presenta tina fiieiite iniiy

sigiificati\.a de actividad óptica. Uii agriipainieiito disiilfuro se fija rigidamente;

la barrera de roi;icióii de la i i i i i h i S-S es alta, y el disulfiiro piiede existir eii

ciialqucira de dos rotóiiicros tciiit'iiilo iiii seiitido de rotación ya sea hacia la

derecha o hacia l a izquierda. Aiiiique uii inievo centro de asimetría es creado en

la cadena peptídica, caiisaiido efectLx Cottoii eii las regiones de el ü V lejano y

cercaiio. El ,iiigiilo dihedral ( detiiiido por Cl-S-S y S-S-Cz) a t á cerca de los

!IO", eii la cistiiia iiiisiiia, pero piieclt' variar eii proteíiias. La banda de absorción

cambia a rojo si~iiificativaiiieiite al disiiiiiiiiir el áiigiilo dihedral de tal inaiiera

que las baiidas de DC de S-S CII el UV cercaiio piiedeii aparecer eii cualqiiier

parte eiitre los 250 y 270 iiiii aprosiinndaineiite. Además, estas bandas no

tieiien iiiia estriictiira vibiacioiial tii ia; este factor piiede ser una ayuda para el

diagiióstico de proteiiias.

Beycliok '.'''y Coleinaii y Bloiit '")eiicoiitraroii que la L-cistitia tiene una

aiiiplia baiidu de DC iiegativn dcpeiitlieiite del pH a 235 nin ([el- -2500), la

ciial ss coiiipaitida por dsii\riiios de N-acetil y por

iiieqiiiL.ocadaiiieiite asociada coii la traiisicióii

depeiidieiite del pH (positiva, cerca de los 230 iiiii),

estos coiiipuestos.

Iioinocistiiia y la cual es

disulfiiro. Otra banda

tainbiéii está presente en

Contribuciones no peptidic;is cii 1)rotcíii;is.

La re\ isióii de las propiedades qiiirópticas eii S I UV cercaiio (priiicipalinente

Dicroisiiio Circidar) de protciiias se Iia viielto en uiia técnica coinún

c-

*

C"

F

L.

P-

." c

L

c

L

c

L

r-

rL c i ;'I 1tc111 CI: ic piicdi: gi.:i~.i.:ii. I ii I;,i~iii:ici 011 (11 I I sobre rcsiciiios aroiiiá t ¡cos y

cistiiiicos e;peciticos y del i x J i o c p c ' 10s roclcii. por ejeiiiplo en el sitio nctko

de i i i ia ciiziiiia. Por otro lado, iiiii! poco sabe sobre ias coiitribucioiies de las

cadenas laterales al espectro de DC de protciiias en la región peptidica en el

UV- lejano, o solii-e iii&oclos gciiernles de iiiterpretacióii coiifonnacioiial en

presencia de bandas de DC cir crideiias laterales. Goodinaii y Toiiiolo'33'liaii

revisado el trabajo Iieclio a travr's de 196s sobre la actividad óptica aroinática

en proteínas. Beycliok "'h realizado estudios que coiitribiiyen con

iiiforiiiacióii dc DC eii disiilfiiros eii proteíiias. Uii estudio reciente sobre

iiisiiliiia ilustra ci probleiiia del trasiapes (!e las baiidas de péptidos y cadenas

laterales.

No Iiaii Iiabido cstiidios esp-ciíicaiiieiite sobre Iiistidiiia. Pocos estiidios se

tiaii centrado, en el papel de la ft.iiilalaiiiiia en proteiiias debido a la debilidad de

stis baiidas de DC; algunas excepciones soli investigaciones sobre peroxidasa,

y carboxipeptidasa. Estudios sobre tirosina iiicliiyeii a la riboiiucleasa, niicleasa

estafilococal, citocroiiio c. lijoziiiia, iiisiiliiia, coiicaiiavaliiia y

carbosiptptidasa. EL DC del triptot'aiio I ia sido exaiiiiiiado eii citocroino c,

lisoziiiia, nvidiiia, Iieiiiuglobiiia, psrosidasa, qiiiinotripsiiiógeiio y

carbosiprlptidasa. Piieiitrs de c i j t i i i a i 'ii riboiiiicleasa, lisoziina, iiisulina, las

iieiirofisiiias, y oti-as proteiiias Iiaii sido in\. sstigadas.

Ha sido posible difereiicini- bniiilas d? DC de varios residuos de cadenas

laterales por iiicdlo de estiwtiiix \ ibi,oiiic;i fiiia. Gim parte del trabajo se llevó

a cabo a baja tei1iperatiii.i. doiidc ILi rtjoliicióii de la banda era inejor. Uii

ejeinplo (raíz fiierte peroridasa AI iiiiiestia en la figlira 9 . Las bandas de

DC debidas a 1111

Figura 9A L.Cii<iIiiLl 11. 0iid:i (iiiii)

vi judimioi i . L:; p:ro\jd.;s;i ( 1 9 iill!

de sxi i2 (?!I 7 )

NOTA5. (A : ;ibsorci&i ) : Absorsioii .ipro\iiii.iil:i dc 1;i Iiciiic iiioic:! :I ? 9 I w sc iiiiicsir:i por I:i li~ic;~ piinicnda.

Asign;>-ioiics vibroiiicx soii d:id:is p~:i b ~ : i ~ i I . i ~ i i T7'

8. Diiroisiiio Circiilx € 1 Dicroisiiio s.- icgisir;i coi110 o\~-,-IL:) Loiijiiud dc ir:iycciori;i dc ccldii dc O. 12

mm. No sc ixi!csir:iii ~ J ~ O S n ;.< 270 iiiii ixiqiic i'$i ¡ii!csl¡g:ict6ii sc ocupo priiicip:iliiicriic coil Dicroisiiio

Circular dc iripiofxiii.

L I I > I : C ¡ I . I i'ii : ig:wg! i<mi ( I . 1 vlv) coiiiciiiciido 511 r i i M dc fosf;iio

tipo de cadena lateral dads piiedcii. c'ii casos favorables, ser correlacioiiadas

con residuos específicos y gciic'i'ar iiiforiiiacioii respecto al inedio que los

rodea.

Propiedades qiiirópticas de giipos prostiticos son estudiados en algunas

ocasiones, por ejeiiiplo, l a Iieiiioglobiiia. Estas bandas pueden ser resueltas a

partir de bandas de proteinas: esto se Iia llevado a cabo para los gupos Iieino

de la perosidasa, hemoglobina y citocromo c. Iiiformacioii respecto a la

estequioinetría y iiiaiiera dc coeiiziiiins y de l a unión iónica de metales a

enzimas puede ser obtenida inoiiitoreaiido los efectos Cotton extrínsecos (en la

región sobre los 300 i i in) sobre la t'oiinacióii de complejos enzima-cofactor en

la ausencia o en la preseiicia de siistrato. El ORD de varios sistemas ha sido

revisado. Un ejeiiiplo de tiun iiivestigncióii de DC siinilar (de glutainato

desliidrogeiiasa de Iiigado de rcs y NADH) p e d e ser visto en Koberstein y

Siiiid.

bluclias iiivestigacioiits t i t i l imr cniiibios de pH para distinguir entre bandas

de cadenas laterales: residiios de tirosina iiiiiestraii paiticulanneiite 1111 gran

cainbio a rojo al ioiiizai-se (ver íiyiia 6). Desiiattiralización de proteinas [por

calor, pH estreiiios, o adición de iiii desiiattiralizaiite (e.g. hidrocloruro de

piaiiidiiia)] es otra Iisi~aiiiieiita coiiiíiii; de esta inaiiera el ambiente de una

proteina de residiios dados piiede ser variado, al igual que el efecto sobre

70

estudios dc DC . La iiiayoiia tic l o s papeles catalogados aiiterioniieiite iiiideii

uiiicaineiite DC eii el UV cercmo (>.>?-lo iiiii); algiiiios tienen que vcr con

regiones de ineiior loiigitiid de o i i c i a .

La iiiodificacih qiiíiiiica de residtios específicos intiestra ser prometedor y

convertirse eii tiiia iiiiportaiite tfciiica de DC; tirosiiia en iiisiiliiia y en lisoziina,

y triptofaiio eii lisoziina, Iiaii sido estiicliados de esta manera. Los efectos de la

iiiiióii de iiii iiiliibidior o el sustrato sobre baiidas de DC de cadenas laterales

lian sido medidas para carboxipeptidasa, iiucleasa estafilococal, hs iieurofisiiias, coiicaiiavaliiia, lisoziina y riboiiiicleasa.

Ejeniplo especiycos. (r)l~ihoili,L.lecr.va~oiiii~l~~i.su I'cimmitica. Diversos tipos de

información pueden obteiierse a paitir de estudios ciiidadosos de DC y ORD de

una proteína. La riboiiiicleasa paiicreática Iia sido la eiiziina favorita para el

estudio porqiie la inoléciila no contiene residtios de triptofano o inucha a-

Iiélice; adeinás la asignación de los efectos Cotton que surgen de la tirosina y la

cistiiia son mas certeros qiie eii la inayoría de las proteinas. Algunas

investigaciones sobre la Riiasa Iiaii sido resiiinidas. En 1965, Glazer y

Siiiiinoiis""esttidiaroii priiiieio los espectros de ORD de la riboniicleasa. Una

baiida fiié encontrada cerca de los 775 iiiii a pH 6.2 la cual cambió a 292 nin a

pH 1 1 , inostraiido qiie la baiida estaba asociada con residuos de tirosina

expuestos a solvente y por lo taiito siisceptibles a ioiiizarse. Dodecil-siilfato de

sodio reiiiovió estas baiidas; adeinás In asimetría surgió de iiiteraccióiies

específicas de residuos de tirosiiia eii su ainbieiite nativo. Siinpsoii y Vallee

encontraron qiie estas baiidas estenias de tirosiiia podiaii ser inodificadas siii

afectar el resto del espectro de ORD. Siininoiis y Glazer07)~oiitiiiiiaron siis

.-

i36)

71

espci-iimiitos iitilizniiilo ílC 1 c~icoiiti-ai'oii iiiia banda de DC iiegativa a 273 11111

a p ~ i iieiitro tn c ~ i t cniiibio a 2x5 iiiii a pFi I I . Iiasiiiziiine et.ai. "X'coiiipararon

el DC de la i - i bü i i t i~ l~ . a~a A coli nqiiel de In poli-¿-tirosiiia y eiicoiitraroii que la

elipticidad de los rejidiios de tirosiiia eii la proteiiia era inticlio inás alta de lo

que se esperaba de la elipticictxl de l a poli-L-tirosina. Establecieron, por lo

tanto, que los residuos qiie ciiterrabaii a la proteína tenían tina inayor

coritribiicióii al DC que los residuos esteiiios. Al caleiitar l a Rnasa la

elipticidad disiniiiiiia a los 275 iini en dos pasos, sugiriendo que los residuos de

tirosiiia eiiteindos (los cuales cstabilizaii la estructiira terciaria de la proteína)

no se desdoblaron siiiiiiltaiieaiiieiite coil los espiiestos.. Siinons et.a1.'39'y

Bello(J'l'tainbiéii siguieron la desiiatiii.nlizacióii ténnica de la ribonucleasa y

llegaron a una coiicliisióii siiiiilar.

Hoiwitz et.al.'""esaiiiiiiriroii el espectro de DC en el UV cercano de la

riboiiiicleasa a 77". Siis resultados se iiiuestraii eii la figura 10.

270 Mo . 230 500

L O i i ~ i ! i i t l dc 0iid;i (iiiii)

Figura Iii.

Espcciro dc Dicroisiiio Circular cn el i i l l m iolci:i ccrc:!IIo dc I:¡ riboiiuclcns3 A a 17". Conccnirncion dc

protck i 5.6 iii%l. loiisiiiid d e 1;i ir;i!cc!ori:i 0 Z i i i t i i : soi\ciiti- :ip;i-gliccroi (I:]. v/v) con 25 InLí dc fosfaro

dc sodio. BL es I J iiiicii 1x1s:. El cqxclro ki sido rcjucllo c i i coiiipoiiciiics corrcspondicnics a coniribucioncs

Corrclacioiiiiiido el DC coli k i cstiictriia vibracioiial fina qiie iniiestra la proteiiia

y por coiiipiiestos iiiodelo eii el sspwtro de absorcióii, fiieroii capaces de

difereiiciar las coiitiibiicioiics :iI DC de los residiios de tirosiiia eiiterrados y

espiiestos y de los piieiites S-S. El iiiisino bwpo estudió la RNasa-S. y

eiicoiitrai'oii que el iiiedio de uiia solo residiio de tirosiiia cambiaba.

Pfliiiniii y Beycliok""estiidini.oii la rediiccióii y la reoxidación de la

riboiiiicleasa paiicrelitica y ciicoiitrnroii qiie la baiida de DC de la tirosiiia a 240

iiin parecía estar asociada coli la foiiiiacibii de los piieiites S-S correctos de la

eiiziiiia iiitacta. Siitioiis""esniiiiii~ el efecto de el eiilace de uii iiiliibidor,

3'CMP, sobre la batida de tii.osiiia a 230 iiin seiisible al medio que la rodea.

Eiicoiitró qiie titia cadena lateral de la tii'osiiia, reinovida lejanameiite del sitio

activo de l a Riiasa y previaiiieiite eiitenada, se volvió expiiesta al solveiite al

fonnarse el coinplejo eiiziiiia-iiiliil>idor.

El espectro de DC. eii el U V Iejaiio de la Rima iniiestra poca evidencia de

la baiidn de l a u-lii-lice cnracttristicn a 222 iiin. Debido a que la detenninación

coiifoniiricióiial poi' DC se eiiciic'iitrn eii hieii aciierdo coli los datos de rayos X,

la Riiaca iio es probableineiite 1\11 caso (coino el de la avidiiia) eii el ciial las

batidas de DC eii el tiltra\.ioleta kjaiio obsctireceii seriamente los efectos

Cottoii del péptido.

(/u /,/w://m/. El espectro de DC eii el U V cercano fue resuelto eii tres baiidas

positkas eiitre los 280 y los 300 iiiii m a bniida negativa a los 267 iiin; la

priiiicra l);iiidn 1i:i sido n ~ i ~ ~ l ~ ~ i i ~ l ~ i ; I / d~siiliiiro 1 3 la presciicia de iiii iiiliibidor

coiiipctitivo, ic'-ncetii-D-gliic«~~liiiiii~i, las h i idas aromáticas de DC se

iiiteiisificaii, lo ciinl iiidica qtic los rcsidiios aroiiiáticos expuestos eii el sitio

doiidc sc: liga el siib-hto soil ópticaiiiciiíc: iiciivos. Estudiando los efectos del

pH, I k d i ~t.al.','i'i.iicoiiti.ai.oii qiir algiiiios de los residuos de tirosiiia

ópticniiwitc activos soil espiicstüs ;i i i i i solveiite, piiedeii ser ioiiizados a pH

alcaliiio, pcro se viielveii ópticaiiieiitc iiiactivos cuaiido la lisozima se

desnaturaliza por esposicióii a iiii pH>I 2.

Mis i'ecieiiteiiieiite, I-lalper et.nl.'."'distiiiLiiieron eiitre las baiidas de

tirosiiin, triptofriiio y disiilfiiro poi. iiiedio de la dependencia al pH. Ellos

coiiipararoii la lisoziiiiri Iiiiiiiaiia con la de la clara de huevo de la galliiia y

eiicoiitraroii difereiicias eii la regióii del DC eii el UV cercano, .aíiii y cuaiido las

eiiziiiias mostraban 1111 espectro siiiiilar de DC eii el UV lejano, iiidicando

estructura secuiidaria aiialoga. Dos aitíciilos recientes tratan con las

inodificacioiies qiiíiiiicas de la lisoziiiia de galliiia: Teicliberg et.al. '46'oxidaron

el triptofano-108 selectivaiiieiite, y deteiiiiiiiaroti su coiitribiicióii al DC por

iiiedio de diferencia de espectros de DC. Eiicoiitraroii que este residuo es

rrspoiisable de In iiiayoria de In regióii aroiiiAtica de DC de la lisoziina, esto es

qiis la oxidacióii no nfkcta si=iiilicati\.,aiiiciite las baiidas de elipticidad

depeiidieiites de In coiifoi-iiincióii a 709 J' 192 iiiii, y que si hay un cambió de la

orieiitacióii de l a TRO- I OS cuniido iiiliibidores oligosacáridos se ligaii al sitio

activo. Atassi et.al. hizo dtrivados de dos tirosiiias y seis triptofaiios de

lisoziiiia; a l esaiiiiiiar 10s datos JI: DC y ORD estos mostrabati varias

caiitidadcs de desdoblniiiieiito.

PARTE F,SPEI<I\I EXT.\ I .

I N T R O D U C C I ~ Y :

La pepsiiia lia sido i i i ia de la pi.oteiiias iiiás esteiisameiite estudiadas, ya que

fiié reconocida desde hace l a r p ticiiipo coiiio el pi-iiicipal agente catalitico de

la disestióii gistiica en aiiiiiialcs: por eslo el gi'aii interés en la naturaleza de su

acción eiiziiiiática w7) . Se ha observado también iin material iiiactibo

catalíticaineiite (pepsiiiógeiio) el cual se Iia convertido a pepsina ciiando se

acidifica.(4s)

Hay varios tipos de pepsiiia qiie I iai i sido clasificadoscoino A, B, C y D; de

estos el predoiiiiiiaiite es el A, al cual se le lia Ilaiiiado siinpleineiite pepsiiia, los

deinás apareceii eii iiiia ineiior caiitidad.'J'9'

De los estudios que se hail realizado con la pepsina se ha visto

priiicipalineiite l a variacióii de si1 act¡\ idad en fiiiicióii del pH, ya que ésta tiene

uti papel iiiipoitaiite desdc SII piiriticncióii , pi-iiicipalineiite por inedio de

croiiiatogatia tradicioiiai."'"

Se ptirificó l a irpsiiia dz cciJo por iiiedio de croinatogafia líquida de alta

presióii (HPLC), iitilizaiido filtraciciii eii gc'l e iiitercainbio ióiiico. Adeinás se

estiiiió el coiiteiiido de estriictiii'a swiiiidaiia de la eiiziina, por Dicroisino

Circiilar.

D ic ro ís ni o Ci I'C ii I :I r

Los espectros de DicLoisino Circular se obtuvieron a 25°C en un

espectrofotopolaríit~~t~o Jasco J 500-A, calibrado con ácido (+)-io-

caiiforsiilfóiiico. Los espectros obteiiidos corresponden a la región del

ultravioleta le.jaiio 190-250 iiiii.

Resiiltados.

Las figuras I I a,b,c y d sc iiiiiestran los espectros de dicroísino circular de

la . . pepsiiia (coiiceiitracióii 0.250 iiigjiiil) a diferentes valores de pH, en la región

del ultravioleta lejano (I90 a 350 iiin). A pH = 5.7 se observan dos bandas, una

positiva centrada eii 190 iiin y otra negativa eii 214 iiin ( f i p r a 1 la); a pH=3.O

(figura I I b), se observa m a disiiiiiiiicióii a la initad, en l a intensidad de ambas

bandas. A pH=2.O (tigui.a I I C ) se obcena iiiia pérdida total de la banda

positiva. La eiiziina pierde totaliiieiite la estructura secuirdaria cuando el

pH=l.6 (figura d) y se desiiatiiraliza iireversibleineiite.

76

r-.

P

L.

c

L

c

Lie

P

...

P="

L_

rl-.

L.. Loopifiid de onda imm)

F-

Figura I I:i Dicroisiiio Circiil;ir dc 1;) pcpsiii;~ pH 5.7 6.

77

P

..-

P

.-. .

Longitud de onda (nrn) _. c

P

Figura 1 Ib: Dicroisnio Circuhr dc pcpsiri:~ pH 3 0 L_

r-

L__

P

L

i

I

! i ! ! .- _i

ri.. ..;

c

L_

75 ._ P

Elip/lOCO (vrad.cnZ/dmol) ... . , "" I

I I ' 1

Figura I I C Dicroisi~io Circiilx dc pepsiii:i pH 2 o

c

L...

c

*i

I I -8 CYLL".:."l.!.'.l.~Y.U"-..il( :.'+'..u.LLl.t ,../. i .J.,. ;.u ma 200 210 220 230

Lowltud de Onda (nm)

Figiira I Id: Dicroisiiio Circlihr dc pcpsiiiii pH I o,

Se calciiló el porcentaje de estriictiii'a secundaria por el inétodo LINCOMB,

de Perczel et.al.'"' .En 1;i t;ibln se prcseiitnii coiitribiicioiies de estnictiira

secuiidaria a cada iiiio de los \nlui-es de pH estiidindos.

L...

c

b.. cr-hclicc

c

i_

r-

c

c

L.

c

c

c.

Giros -[l+p-ixir:iiciii 45.SG

Cronioforos no 19.51

pcpiidiios (disulftiro.

aroniiiicos)

Z.Oí>

-36.77

15 44 3(i 78 34 78

22 65 2G.04

Estnicrtira irrcguhr

Hoja -p-nniip;inlcl;i 13 99

--11-...."...... I LI... " _LII "_- Se observa iina pérdida total de la coiitribiicióii debida a hoja P-paralela al

disiniiiuir el pH de 5.7 a 2.0, iiiieiitras que hay tin auineiito casi del 100% de

estriictiira irre@ilar y coiitribticióii no peptídica ( aroináticos y disulfuro) al

disminuir el pH.

c.

c

COIYCL USIóiV: El Dicroisiiio Circular piicdc. gciicrar estiiiiacioiies útiles de la estructura

secundaria de iiiia proteiiia. 5ii algiiiios casos, de acuerdo coil los resultados

por difracción de rayos X resiiita excelente.

Asiinisnio se piiede utilizar para el estudio de la estabilidad , ya sea en

fiiiición del pH o la teinpcratiira. Eii este trabajo, en la desnaturalización de la

pepsina frente al pH se obseilió iiiia pérdida total de la contribución debida a

hoja @-paralela al disiniiiiiir el pH de 5.7 a 2, mientras que hay un aumento de

estructura regular y contribución no pzptídica, aromáticos y puentes disulfuro al

disminuir el pH.

82

L

L"

P

- r\

i-

r.

c-

c-

L..

c

c.

c

..- P

CIT.4S GILJLIOCR .:i~~IF-IC-I.r:

1 . - C.C.F. Blake, D.F. Koeiiig, G A. Mair, A.C.T. North, D.C. Pliillips, and

V.R. Saiinn, :Vdiwc (Loiidoii) 206, 7 Y ( 1965); D.C. Pliillips, Sci.At?icr. 215,78

(1966); P/.oc. Nol. .4cotf. Sci. W.S. 57, 484 (1967).

2.- D.M. Blow aiid T.A. Steitz, Aim. Rei.. Riochoti.39, 63 (1970).

3.- N.J. Greeiifíeld and G.D. Fasiiiaii. Biochemistry 8,4108 (1969).

4.- J.H. Straus, A.S. Gordon y D.F.H. Wallacli, E1ir.J. Biocliem. I I , 201

(1 969).

5.- Y.P. Myer, Res. Coiniiiiiii. Cliein. Patiiol. P a m . 1,607 (1970).

6.- H.Roseiikraiiz y W. Sclioltaii. Hoppe-Seylers 2. 352,896 (1971).

7.- V.P. Saxeiia y D.B. wetlaifer, Proc. Nat.Acad.Sci.U.S: 68,969 (1971).

8.- V.P. Saseiia y D.B. wetlaiifer, Proc. Nat.Acad.Sci.U.S. 68,969 (I97 I) .

9.- N.J. Greeiifíeld y G.D. Fasiiiaii, Bioclieiiiistry 8, 4108 (1969).

10.- V.H. Clieii y J.T. Yaiig, Biocliein. Biopliys. Res. Cornrnun 44,1285 (1971).

1 1 .- R. Towiieiid, T.F. Kiiinosiiiski, S.N. Tiinaslieff, G.D. Fasman y B.

Davidson Biocliein. Biopliys. Res. Coininiiii. 23, 163( 1966).

12.- L.K. Li y A. Spectpr, J . Aiiier. Cliein. Soc. 9 1,220 (1 969).

13.- D.W. Urrv, Proc. Nat. Acnd. Sci.U.S. 60,l 14 (1968).

14.- Goodinaii et.al.(M. Goodiiiaii, F. Naider y C. Toiiiolo, Biopolyiners

10,1719 (1971).

15.- M.L. Tiffany aiid S. Kriinin, Biopolyiners 6, 1379 (1968); 8, 347 (1969);

S. Kriinin, J.E. Mark aiid M.L. Tiffaiiy, Biopolyiners 8,695 (1969); S. Kriinin

and J.E. Mark, Proc. Nat. Acad.. Sci. US. 60, 1122 (1968).

16.- G.D. Fasinaii, H.Hoviiig y S.N. Tiinaslieff Biocliemistry 9, 3316 (1970).

17.- D.W. Ui-ry y T.H. Ji, Arch. Biocliein. Biopliys. 128, 802 (1968).

L _

r-

." r-

IS.- , M. Goodiiiaii y C. Tniiiolo, Biopolymers 6, 1673 (1968); M. Goodman,

G.W. Davis y E. Beiiedetti, Accoiiiits Clicin. Res. 1, 275 (1968).

19.- S. Beycliok, Science. 154, 1788 (1 966); S. Be).cliok p. 293.

20.- J. Honvitz, E.H. Stricklaiid y C. Billups, J. Ainer. Chein. Soc. 91, 184

(1969).

21 .- D. W. Urry, Aiiiiu. Rev. PIiys. Clieiii. 19, 477 (1 968).

22.- E. Peggioii, A.S. verdini; A. cosaiii y E. Scoffone, Macromolecules 2 ,170

( 1969 ); E. Peggion, L. Strasorier y A. Cosani, J. Amer. Chem. Soc. 92,381 *

(1 970).

22.- E. Peggioii, AS. Verdiiii, A. Cosaiii y E. Scoffoiie, Macromolecules 3,

194 (1970).

23.- J. Honvitz , E.H. Stricklaiid y C. Billiips, J. Amer. Chem. Soc. 92, 21 19

(1 970).

23.- S.M. Ziegler y C.A. Bush, Biochemistry IO, 1330 (1971).

25.- S. Beycliok y G.D. Fasinaii, Biochemistry 3, 1675 (1964).

26.- B.Sliechter, I . Sliecliter, J. Rainacliaiidraii, ACoiiway-Jacobs y M. Sela,

Eur. J. Biocliein. 20, 301 ( I 97 I ) .

27.- J. Rainacliaiidraii, A. Berger y E. Katchalski, Biopolymers IO, 1829

(1971).

26.- E.H. Sti-icklaiid, J. Hoi-witz y C. Billiips, Biochemistry 8, 3205 (1969);

E.H. Stricklaiid, J. Honvitz, E. Kay, L.M. Shannon, M. Wilcliek y C. Billups,

Biochemistry 1 O, 263 (1 97 1 ).

27.- G.D. Fasinaii, M. Laiidsberg y M. Bucliwald, Can. J. Chem. 43, 1588

(1 965).

2s.- L. SteveiiY, R. Towiieiid, S.N. Tiinaslieff, G.D. Fasman and J. Potler,

Bioclieiiiistry 7,371 7 (196s).

29.- A. Cosaiii, E. Pcggioii, A.S. VcrJiiii J ’ bl. Tri-bojevich, Biopolyiners 6,

963 (1 968).

30.- E. Peggioii, A. Cosaiii, M.Tc.i-bojevicli y E. Scoffoiie, Maci-oinolecules 4,

725 (1971).

3 I _- S. Beycliok p. 293.

32.- D.L. Coleinaii y E.R. Bloiit, eii “Coiifonnatioii Biopolyiners”

33.- M. Goodinaii y C. Toiiiolo, Biopolyiiiers 6, 1973 ( I 968).

34.- S. Beycliok, Proc. nat. Acad. Sci. U.S. 53, 999 (1965).

35.- A.N. Glazer y N.S. Siiiiiiioiis, J . Aiiier. Clieiii. Soc. 87, 3991 (1965).

36.- R.T. Siiiipsoii y B. Vallee, Bioclieinistry 5, 253 1 ( I 966).

37.- N.S. Siininoiis y A.N. Glazer, J. Ainer. Cliein. Soc. 89, 5040 (1967).

38.- H. Hasliiziiine, M. Sliiraki y K. Iiiialiori, J. Biocliein [Tokyo) 62, 543

(1 967).

39.- E.R. Siininoiis, E.G. Scliiieider y E.R. Bloiit, J. Biol. Cliem. 244, 4023

(1 969).

40.- J. Bello, Bioclieiiiistry 8, 4535 (1 969).

31 .- J. Honvitz, E.H. Stricklaiid y C. Billups, J.Ainer. Cliein. Soc. 92,2119

(1 970).

42.- M.N. Pfliiiiiin y S. Beycliok, .1. Biol. C h i . 2-43, 3982 (1969).

43.- E.R. Siininoiis, Biocliiiii.Biopli?.s. Acta 25 1, 1 26 ( I 97 I ) .

4-4.- K. Ikeda, K. Hainagticlii, M. Iiiiaiiislii y T. Ainaiio, Biocliein. (Tokyo) 62,

315 (1967).

45.- J.P. Halper, N. Latovitzki, H. Benisteiii y S. Beycliok, Proc. Nat. Acad.

Sci. U.S. 68, 517 (1971).

46.- V.I. Teicliberg, C.M. Kay y N . Sliaroii, Etir. J. Biocliein. 16, 55 (1970).

-‘.

47.- J.R. Green, -‘ The soluble fci-tiiciits aiid Fsiiiieiitatioii”. Cambridge Uiiiv.

Press, Cambridge, 1898; E.H. Statding, ‘‘ Recent Advaiices iii the Pliisiology of

Digestion”. Keener, Chicago, Illiiiois, 1906; T. Scliwaiin, Arch, Aiiat. Physiol.

p. 90 , (1 836).

48.- J.N. Langley, J.Plisiop. (Loiidoii) 3, 246 (1882); J.N. Langley and B. Edkins, ¡bid 7, 371 (1886); R.M. Heniott,J. Geii. Pliysiol. 21, 501 (1938).

49.- J. Steiiiliardt, JBC 129, I35 (1939); A.P. Ryle and R.R. Porter, BJ 73, 75

(1 959); D. Lee aiid A.P. Ryle, BJ 104, 735 and 742 (1 967).

50.- E. Zeffreii aiid E.T. Kaiser, JACS 89, 4204 (1967); W.T. Jackson, M.

Sclilainowitz aiid Sliaw, ABB I3 I , 374 ( I 969); J. Tang, S. Wolf, R. Capiitto

and R.E. Ti-iicco, J Biol. Clieiii. 234, 1174 (1959); C.H.W. Hirs, S. Moore and

W.H. Stein, J: Biol. Clieiii. 200, 493 (1953); A.P. Ryle, Biochem. J. 96, 6

(1 965); D.Lee aiid A.P. Ryle, Bioclieii1.J. 104, 735 (1967).

51.- A. Perczel., M. Hollosi., G . Tiisnady and G.D. Fasmaii., Protein

Engineering 4, 669-679 ( 199 I ).

ab¡& UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Documents

Transcript of ab¡& UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA