UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

DIVISIóN DE CIENCIAS BIOLóGICAS Y DE LA SALUD DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD

TITULO DE LA TESIS

INSERCIóN DEL GEN DE RESISTENCIA A ERITROMICINA EN EL PLÁSMIDO pULVK2 Y

OPTIMIZACIÓN DEL SISTEMA DE TRANSFORMACIóN EN Amycolatopsis mediterranei

TESIS QUE PRESENTA EL ALUMNO

ANGEL EDUARDO ABSALÓN CONSTANTINO

PARA OBTENER EL GRADO DE

LICENCIADO EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

ASESORES

Dr. Francisco José Fernández Perrino

Dr. Javier Barrios González

Dr. Armando Mejía Alvarez

JULIO DEL 2002

1. INTRODUCCI~N

Los actinomicetos son un grupo de microorganismos de gran importancia biotecnológica debido a que son productores de un amplio número de moléculas orgánicas de importancia industrial entre los que se encuentran los antibióticos.

Amycolatopsis mediterranei es un actinomiceto productor de un antibiótico del tipo de las ansamicinas, la rifamicina. Dicho antibiótico ha adquirido importancia por ser activo contra microorganismos causantes de enfermedades como la tuberculosis o la lepra ocasionadas por Micobacterium tuberculosis y Micobacterium Ieprue. . respectivamente, además de haberse reportado actividad inhibitoria en la transcriptasa inversa de alguno virus de RNA. (La1 1994)

Actualmente se aplican di\.ersas técnicas bioquímicas y fisiológicas con el fin de elevar la producción de rifamicina. entre ellos cabe destacar el uso de metaboliros reguladores que incrementan la producción J. más recientemente las técnicas de biología molecular. Sin

embargo, el mejoramiento gendtico de Amycolatopsis mea'iterranei utilizando tkcnicas de biología molecular ha sido muy lento debido principalmente a que las técnicas desarrolladas para microorganismos modelo como Escherichia. coli o Strepromices no son aplicables a este actinomiceto además de no existir vectores de clonación adecuados (La1 y col., 1994).

Los escasos vectores de clonacicin desarrollados para A. mediterranei presentan como principal desventaja la de poseer un tamaño demasiado grande (> a 7.1 Kpb). (La1 y col., 1998). Dicha desventaja los hace deficientes para l a inserción de fragmentos grandes de DNA y para la construcción de genotecas. ?or esta razón, es necesario la construcción de vectores de clonación de bajo peso molecular para este microorganismo con el fin de realizar estudios de mejoramiento genético para incrementar la producción de rifamicina (La1 y col., 1995).

2. OBJETIVOS

Aislar el gen de resistencia a eritromicina a partir del plásmido pIJ4026 e insertarlo en el plásmido pULVK2.

Optimizar un sistema de transformación de Amycolatopsis mediterranei.

Trasformar con el nuevo plásmido obtenido a Amycolatopsis mediterranei.

1.1 Aislamiento de A. nzediterrnrlei y el descubrimiento de la rifamicina.

A. mediterrunei fue aislada por primera vez de muestras de suelo de un bosque de pinos de Francia, en 1957 (Margalith y col.. 1960). Originalmente fue clasificado como Streptomyces nzediterrunei. pero en 1969 Thiemann y colaboradores lo reclasificaron como Nocurdiu nwditerrunei con base en la pared celular. Finalmente en 1986 fue reclasificado como Amycolntopsis mediterranei por Lechevalier y colaboradores.

La rifamicina fue aislada por Sensi y colaboradores en 1959 a partir de un filtrado de una fermentación probándose que poseía actix-idad antibacterial contra otros actinomicetos como los pertenecientes al género Mycobucterium.

La producción a nivel industrial de este antibiótico se inició en 1962 en Italia. y cinco años después, Sensi y Thiemann describieron las condiciones de fermentación óptimas.

Desde entonces, las investigaciones en torno a este microorganismo habían cesado por creerse que se había erradicado la lepra y la tuberculosis. Sin embargo, con el resurgimiento de estas enfermedades los estudios para incrementar la producción de rifamicina han retornado importancia.

1.2 Estructura y origen bioquímico de la molécula de rifamicina.

La rifamicina B (figura 1) está constituida por un cromoforo de naftoquinona (en azul) procedente de la via del shikimato, el cual está involucrado en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Consta también de una cadena ansa (en verde), característica de todos los antibióticos clasificados como ansamicinas. La cadena ansa se forma por la actividad de enzimas propias de la ruta de biosintesis de rifamicina, particularmente el complejo enzimatico conocido como polikétido sintetasa (PKS) (Ghisalba y col 1984).

La PKS adiciona al cromóforo y al mismo tiempo alarga la cadena mediante reacciones sucesivas de polimerización de malonil Co A y metil malonil Co A

AI cromólbro también se une un derivado del glicerol (en ro.io) que al ser sustituido por otro grupo orginico forma los diferentes derivados semisintéticos.

Existen también dos htomos de oxígeno de origen atmosférico, que se unen a la rifamicina (En naranja).

Figura I. Estructura molecular de la rifamicina.

1.3 Mejoramiento genético

En 1999 August y colaboradores reportaron la secuencia completa del cluster de biosíntesis de rifamicina. El tamaño encontrado fue poco menos de 100 kpb. En el se encontraron más de 20 marcos abiertos de lectura cada uno asociado a una función catabólica o de regulación.

El reporte de la secuencia de genes involucrados en la biosíntesis de rifamicina abre paso a nuevos enfoques y proyectos de investigación. Para tratar de realizar mejoramiento genético serán muy importantes los vectores de clonación, siempre que cumplan características como: la de tener alta capacidad de carga, sitios específicos de inserción de los

fragmentos de ADN, un sistema de transformación eficiente en el huésped y un sistema de selección de transformantes adecuado.

1.4 Estructura de los plásmidos

Los plásmidos son fragmentos de ADN que se encuentran de manera natural en las células bacterianas. Tienen un tamaño que oscila desde las 2 o 3 kilopares de bases (Kpb) a más de 40 Kpb. Dentro de su secuencia los plásmidos contienen genes diversos que ayudan a la célula a adaptarse a un medio en el que usualmente no podrían crecer. Los plásmidos R por ejemplo, contienen genes que confieren al huésped la capacidad de ser resistentes a cierto antibiótico (Weaber 1999)(Lewin 2000)

Mediante técnicas de biología molecular se han logrado desarrollar plásmidos artificiales, que entre otras ventajas, a diferencia de los naturales, son de bajo peso molecular. Estos plásmidos se utilizan actualmente como vectores de clonación, con el fin de insertar y expresar nuevos genes de naturaleza homologa (del mismo microorganismo) o heteróloga (de 'otro microorganismo distinto).

En general los plásmidos artificiales contienen en su secuencia un origen de replicación específico del huésped (Ori), o una secuencia de recombinación homóloga, uno o más marcadores de selección y una región de clonaje múltiple (Weaber 1999)(Lewin 2000)

1.5 Marcadores de selección

Los marcadores de selección son genes que nos permiten diferenciar de alguna manera a las células que contienen el plásmido, de las que no lo tienen.

Existen varios tipos de marcadores de selección (Weaber 1999)(Lewin 2000):

a) genes que confieren la capacidad de crecer en un medio que contenga metales pesados,

genes que confieren la capacidad de crecer en un medio que contenga antibióticos,

genes que confieren la capacidad de crecer y degradar compuestos tóxicos,

genes que codifican para una proteína fluorescente,

genes que complementan una mutación que estaba presente en el huésped,

genes que pueden metabolizar un compuesto incoloro a uno colorido, etc.

1.6 El plásmido pULVK2

El plásmido pULVK2 (Kumar y col., 1994) es un vector reportado para N. lactamdurans, aunque su origen es un plásmido natural de A. mediterranei.

El plásmido pULVK2 de aproximadamente 5.7 Kpb, contiene dos orígenes de replicación; uno para E. coli (pBr- ori) del plásmido pBR322 y uno para A. mediterranei (PA-rep) obtenido a partir del plásmido natural pMEAl00 de este microorganismo; una región de clonaje múltiple para 6 enzimas de restricción (5 de ellas con corte Único) y un gen que confiere resistencia a Kanamicina (Km R).

Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pULVK2

A. mediterranei es un microorganismo que presenta resistencia a una cantidad considerable de antibióticos, entre los que se

encuentra la kanamicina (La1 y col 1994). Esto representa un serio problema al intentar utilizar el gen de resistencia a este antibiótico como marcador de selección en A . mediterranei aunque funcione adecuadamente en E. coli.

Debido a esto, es necesario utilizar otro marcador de selección que confiera resistencia a un antibiótico al que A . mediterranei sea sensible.

Uno de los marcadores de selección que ha demostrado ser efectivo en A. mediterranei es el gen de resistencia a eritromicina utilizado en otros vectores de clonación para actinomicetos (La1 y col., 1998).

3. MATERIAL Y METODO

3.1 Endonucleasas de restricción.

Se utilizaron las enzimas de restricción de las casas comerciales Stratagene y Gibco que a continuación se mensionan: EcoRV, EcoRI, HindIII, BamHI, BclII, y las enzimas de modificación fosfatasa alcalina y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. La amplificación del gen ermE se realizó con la enzima pfu polimerasa.

3.2 Medios de cultivo.

Medios de crecimiento para E. coli.

Medio TB:

Extracto de levadura 24 g Bacto-triptona 12 g Glicerol 4 mL Agua destilada 900 mL

Sol. de KH2P04 170 mM y KzHP04 720 mM* 100 mL

Medio de crecimiento para A . mediterranei.

Medio Bennet Medio Luria-Bertani (LB):

Bacto-triptona 10 g NaCl 10 g Extracto de levadura 5g Agua destilada 1 L

pH= 7.5

Para su uso como medio sólido (Medio LA) se añaden 20 g de agar por litro.

Glucosa 1 og Extracto de malta l g NZ amina A 2g Extracto de levadura l g Agua 1L

Para utilizarlo C O I ~ O medio sólido se agregaron 20 g de agar

3.3 Plásmidos

Los plásmidos que se utilizaron fueron:

a) Plásmido pIJ4026 (Tuteja y col.). Se utilizará para amplificar por PCR el gen E1777E. Sus características son: un gen de resistencia a ampicilina (AmR), el origen de replicacihn de E. coli, dos regiones de clonaje milltiple (policonector) a ambos lados del gen erm E

b) El plásmido pULVK2 (Kumar >’ col., 1994) contiene dos orígenes de replicación. uno para E. coli (pBr-ori) del plásmido pBR322 (Bolívar y col. 1977) y uno para Amycolnroysis mediterrunei (PA-rep), contiene un gen que confiere resistencia a Kanamicina (Km R), >. una región de clonaje múltiple para 6 enzima de restricción (5 de ellas con corte Único). El tamaño del plásmido es de aproximadamente 5.7 kilopares de bases.

3.4 Aislamiento del gen de resistencia a eritromicina a partir del plásmido pIJ4026

El gen se aisló por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Esta técnica se basa en la actividad que tienen las ADN polimerasas de sintetizar ADN a partir de una cadena de ADN molde y un cebador. Mediante este proceso, y usando un cebador específico para cada una de las cadenas de ADN es posible amplificar un fragmento de ADN especifico.

3.4.1 Desarrollo de los cebadores a partir de la secuencia de nucleótidos.

A partir de la secuencia del gen de eritromicina reportada en la base de datos EMBL GenBank número de acceso LO5776 se elaboraron los cebadores, y se anexó un fragmento pequeño que contiene una secuencia

GSll I

.. . ,

de corte para una enzima de restricción que también corta en el plásmido pULVK2.

3.4.2 Condiciones de amplificación.

Los reactivos y las cantidades usados para la amplificación fueron:

H20 77 pL

Cebador 1 2.5 pL

Cebador 2 2.5 pL

Buffer de la enzima (1 OX) 1 O pL

MgC12 50mM 2 PL

ADN molde (-20pM) 5 N- pfu polimerasa 1 PL El volumen final de amplificación fue

de 100 pL.

Se utilizó un termociclador marca Eppendorf modelo ( ).

Las condiciones de temperatura para la amplificación fueron:

Desnaturalización 1 min 95°C

Hibridación 1 min 50°C

Amplificación 1 min 72°C

3.5 Electroforesis en geles de agarosa.

Los fragmentos de ADN se separaron en geles de agarosa y posteriormente fueron teñidos en una solución de bromuro de etidio (0.5 pg/mL) visualizando con radiación ultravioleta.

La concentración de los geles deelectroforesis f i e entre 0.4% y el 2% de agarosa para separar los fragmentos de DNA. La concentración de agarosa en el gel dependerá del tamaño de los fragmentos a separar.

Para identificar el tamaño de los fragmentos de ADN se utilizaron marcadores de peso molecular; el fago h digerido con la enzima de restricción Hind111 y el otro fue el fago h digerido con la enzima Pst I. El primero origina fragmentos (de mayor a menor) de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pares de bases, y el segundo de 1 1509, 5080, 4649, 4505, 2840, 2577, 2454, 2443, 2140,1980,1700,805,516,467,448,339,265, 247 y 2 1 O pares de bases.

3.6 Extracción de ADN a partir de geles de agarosa.

El ADN se extrajo de los geles de agarosa por el método de congelación y centrifugación a través de lana de vidrio (Polman y Larkin, 1989). El método es el siguiente:

A un tubo eppendorf se le practica un orificio en la parte inferior y se le bloquea con lana de vidrio estéril; este tubo se coloca sobre

otro tubo integro. Por otro lado se corta la banda de gel que contenga el fragmento de ADN que se desea extrxr. El gel se congela a - 20°C durante 30 minutos. y posteriormente se centrifuga a 14000 revoluciones durante 5 minutos. El ADN pasari a través de la lana de vidrio, mientras que el gel no lo hará. Posteriormente se agregan 0.1 mL de solución TE' y se centrifuga a las mismas revoluciones durante 1 minuto. La solución obtenida en el tubo inferior se limpia mediante fenolización.

3.7 Aislamiento de ADN plasmídico.

El ADN plasn~idico se aisló por los siguientes métodos:

3.7.1 Obtención de ADN plasmídico a pequeña escala minipreparaciones (miniprep).

Es una modificación del método de Holmes y Quigley (198 1).

Picar una colonia con un palillo e inocular un tubo eppendorf con 1 mL de medio TB estéril (el medio debe contener el antibiótico adecuado para mantener el plásmido dentro de la bacteria). Incubar el tubo a 37°C a 250 rpm durante un mínimo de 6 horas, para que crezcan las bacterias.

Centrifugar a 5000 rpm durante 3 minutos. Resuspender el precipitado en 350 plitros de STET2 y añadir 10 plitros de una solución de lisozima a una concentración de 10 mg/mL en agua.

Mezclar durante 30 segundos y posteriormente her\ir durante 45 segundos. Las proteínas, los restos celulares y el ADN cromosómico se precipita por centrifugación a 14000 rpm durante 1 O minutos y se eliminan

I Solución TE: EDT.4 1 mM pH 8.0 y Tris-HC1 10 mM pH 8.0.

2 Solución STET: EDTA 50 m M pH 8.0, sacarosa al 8% (piv), Tris-HCI I O m34 pH 8.0 y Tritón X-I00 al 0.5% (v/v).

con la ayuda de un palillo estéril. El ADN plasmídico precipita con 40 lnicrolitros de acetato sódico 3M, pH 5.2 y 600 microlitros de ,

isopropanol. Mezclar y mantener a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Centrifugar el ADN plasmídico a 14000 rpm durante 5 minutos y lavar el precipitado con etanol al 70% (v/v). Secar y resuspender en 30 plitros de TE. 2 plitros de esta solución son suficientes para llevar a cabo cada uno de los ensayos de digestión con endonucleasas de restricción necesarios para el análisis de los plásmidos recuperados.

3.7.2 Obtención de ADN plasmídico a gran escala megapreparaciones (megaprep).

Esta técnica se utilizó para obtener gran cantidad de ADN fácilmente digerible.

Inocular 100 mL de medio TB con la colonia que porta el plásmido e incubar 12-16 horas a 37°C y 250 rpm, con el antibiótico adecuado.

Recoger las células por centrifugación a 5000 rpm durante 3 minutos, resuspender el precipitado en 6 mL de STET, repartir la suspensión de bacterias en alícuotas de 350 plitros. A cada tubo, añadir 20 plitros de una solución de lisozima preparada a una concentración de 1 O mg/mL en agua destilada.

Mezclar durante 30 segundos y hervir durante 45 segundos. Centrifugar a 14 O00 rpm durante 15 minutos, para que precipiten las proteínas, restos celulares y ADN cromosómico, y eliminar con un palillo estéril. El precipitado blando que se obtiene ocupa gran parte del tubo y es muy importante eliminarlo completamente. El ADN plasmídico se precipita con 40 plitros de acetato sódico 3M pH 5.2 y 600 litros de isopropanol. Mezclar y mantener a temperatura ambiente, centrifugar a14000 rpm durante 10 minutos resuspender cada alícuota en 100 plitros de TE.

El ADN obtenido se limpia con fenol y posteriormente se precipita con etanol absoluto frio y acetato de sodio 3 M pH 5.2. Centrifugar el ADN plasmídico a 14000 rpm durante 30

minutos y lavar el precipitado con etanol al 70% (v/v). Secar el ADN, y posteriormente se resuspende en un volumen adecuado de TE.

3.8 Transformación de células de Escllet-ichin coli.

Las células se trasformaron realizando competentes y posteriormente choque térmico. El método es el siguiente:

3.8.1Preparación de células competentes de E. coli por el método del cloruro de rubidio.

Este tipo de células se utilizan en los casos en los que se requiere una eficiencia de transformación elevada. Normalmente se utiliza la cepa de E. coli DH5 a como receptora de mezclas de ligación y proporciona eficiencias de transformación de hasta 5 x 10' transformantes por pgramo de ADK.

Sembrar una placa con medio SOB (sólido) con la cepa de E. coli que vaya a ser utilizada como receptora en la transformación, de manera que se puedan obtener colonias aisladas. Incubar a 37°C durante 12- 14 horas.

Inocular una colonia en un matraz de 500 mL que contenga 100 mL de medio SOB (líquido). Incubar a 37°C y 250 rpm hasta que el cultivo alcance una densidad óptica de entre 0.4 y 0.45 a 600 nm. Mantener posteriormente el matraz a 4°C durante 20 minutos.

Centrifugar el medio para recuperar las células a 3 O00 rpm y 4°C durante 1 O minutos.

Retirar el sobrenadante y resuspender las células en solución RFI 3(un tercio del volumen inicial), con suavidad y cuidando de que la temperatura se mantenga alrededor de

3 Solución RF I : Acetato potásico 30 mM, CaCI?

10 mM, glicerol al 15% (piv), MnClz 50 m\f y RbCl 100 mM. Se ajusta el pH a 5.8 con ácido acirico 0.2M. Se esteriliza a través de un filtro estéril con poro de 0.22 micrómetros de diámetro. Utilizar agua de calidad MilliQ (Millipore).

4°C. Mantener la suspensión durante 20 'I'B (si se pretende la obtención a gran escala de minutos en hielo. ADN plasmídico. En ambos casos, debe

Centrifugar nuevamente a 3 O00 rpm y añadirse al medio de cultivo e1 antibiótico 4°C durante 10 minutos. Retirar la fase líquida utilizado para la seleccibn de los y resuspender las células en solución RF2 transformantes. 4(1/12.5 del volumen inicial). Incubar en hielo durante 20 minutos.

Repartir la suspensión en alícuotas de 200 plitros. Las células competentes obtenidas se pueden utilizar en el momento o se pueden congelar con nitrógeno líquido (o en un baño de hielo seco/etanol) y mantener a -70°C hasta su uso.

3.8.2 Procedimiento de transformación de células de E. coli

Esta técnica fue descrita por Hanahan en 1983 y se utilizó para transformar células competentes de E. coli.

Descongelar las células competentes en un baño de hielo y agua y mezclar con el ADN plasmídico con 100 plitros de la suspensión de bacterias, manteniéndose en hielo durante 20 minutos. El volumen de la solución que contiene el ADN no debe superar el 5% de las células bacterianas utilizadas.

A continuación, someter la mezcla a un choque térmico por inmersión en un baño de agua a 42°C durante 45 segundos. Posteriormente, enfriar rápidamente en hielo durante unos 3 minutos.

Añadir 800 plitros del medio LB e incubar a 37°C y.250 rpm durante una hora (con el fin de que las células que hayan incorporado el plásmido expresen la resistencia al antibiótico utilizado como marcador de selección),

Sembrar una alícuota en una caja con medio LA (si no se desea gran cantidad del plásmido) o en un matraz de 500 mL (inoculando la mitad de la cantidad total de células transformadas) con 100 mL de medio

Solución RF2: CaC12 75 mM, glicerol al 15% (p/v), MOPS 10 mM pH 7.0 y RbCl 10 mM. Se ajusta el pH a 6.8 con NaOH y se esteriliza a través de un filtro estéril con poro de 0.22 micrómetros de diámetro.

4

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Desarrollo de cebadores El gen de resistencia a eritromicina

(errnE) presente en el plásmido pIJ4026 deriva del cluster de biosíntesis de eritromicina de Sacharopolyspora erythreae (Kumar y col 1994). En el presente trabajo, a partir de la secuencia de nucleótidos reportada en EMBL GenBank número de acceso LO5776 se desarrollaron dos cebadores diseñados específicamente con secuencias complementarias al inicio y fin del gen de resistencia a eritromicina contenidos en el plásmido.

fueron: 5' - 3' CGCGAATTCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTG

S'-, 3'

TATGAATTCCGTCGCGCGACATCGACCTCC

Las secuencias de nucleótidos obtenidas

Cabe señalar que a las secuencias específicas de nucleótidos le fueron agregadas secuencias de reconocimiento para la endonucleasa EcoRI con el propósito de facilitar la inserción de dicho gen en el plásmido vector.

4.2 Aislamiento y amplificación de ADN de los plásmidos pULVK2 y pIJ4026

Se aisló en ADN de ambos plásmidos por la técnica descrita en el apartado 3.7.2 y se separaron en un gel de agarosa. El plásmido pULVK2, linearizado con una endonucleasa de corte Único, tiene un tamaño aproximado de 5.7 Kpb y el plásmido pIJ4026 linearizado en el mismo sitio tiene un tamaño aproximado de 4.3 Kpb. (figura 5)

9416 kb 6557 kb 4361 kb 5700 kb

4300 kb

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa de los plásmidos pULVK2 (carril 3) y pIJ4026 (carril 4) digeridos con la enzima de restricción EcoRI. En los

carriles 1 y 2 se incluyó el ADN del bacteriofago h digerido con Hind111 y Hindlll-EcoRI, como marcadores de peso molecular.

4.3 Amplificación por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen ermE

Utilizando como ADN molde el plásmido pIJ4026 y los cebadores descritos en el apartado 4.1 se realizó la amplificación del gen ermE mediante PCR. Sin embargo, por tratarse de un plásmido pequeño la polimerasa fue capaz a diferentes condiciones de temperatura y tiempos de amplificación de amplificar el gen, además del plásmido completo (figura 6).

4361 kb

2322 kb 2027 kb 1500 kb

Por esta razón. se decidicj adoptar otra estrategia para aislar el gen e r n ~ E . Esta consistió en la obtención del fragmento a partir de una digestión del plásmido pIJ4026 con la endonucleasa Kpnl. Esta enzima tiene sitios de reconocimiento a ambos lados del gen dentro de los policonectores que se encuentran acotándolo.

Por su parte, el plásmido pUI,\.K2 contiene en su secuencia de nucleótidos un sitio de reconocimiento para la endonucleasa Kpn I.

Debe seíialarse, puesto que uno de los objetivos del presente trabajo es el obtener un plásmido del menor tamaíio posible a los reportados hasta la fecha, que esta estrategia implica un incremento en el tamaño del plásmido final de aproximadamente 200 pb (debido a que el tamafio del gen ermE es de aproximadamente 1400 pb mientras que el fragmento KpnI del plásmido pIJ4026 es de 162 1 pb).

La digestión del plásmido pULVK2 con la endonucleasa de restricción KpnI origina un Único fragmento de ADN, mientras que. la digestión con la misma endonucleasa del plásmido pIJ4026 muestra dos fragmentos, uno de 2691 pb y otro, que contiene al gen erm E de 1621 pb (figura 7)

Figura 6. Gel de agarosa en el que se muestran los productos de amplificación por PCR. En el carril 2 la temperatura de hibridación fue de 57°C y el tiempo de amplificaci6n de 1 .minuto. En el carril 3 el tiempo de amplificación fue tan solo de 30 segundos. Carril 1 h PstI y carril 4, h Hind111 son marcadores de peso molecular.

Cuando se bajó la temperatura, se obtuvo un barrido de amplificación no detectandose bandas bien definidas, lo que significa una amplificación inespecífica oincompleta. Esto se debe a la alta velocidad de la enzima Pfu polimerasa usada.

9416 kb 6557 kb 4361 kb

5700 kb

2700 kb

1600 kb

4.4 Aislamiento del fragmento Kprz I que contiene al gen erm E a partir del plásmido pIJ4026.

Figura 7. Gel de agarosa que muestra en el carril Z la digestión del plásmido pULVK2 con la endonucleasa Kpn I y en el carril 4 la digestión del plásmido pIJ4026 con la misma enzima.

El fragmento KpnI de 1621 pb se aisló y purificó a partir del gel de agarosa, como se describe en el apartado 3.6. Posteriormente, se procedió a ligarlo al plásmido pULVK2 digerido con la enzima Kpn I

4.5 Ligación del gen ernzE al plásmido

El fragmento KpnI que contiene al gen evmE se mezcló con el plásmido pULVK2 linearizado con la misma enzima en una proporción inserto:vector de 3: 1 (para favorecer la ligación).

La ligación se realizó con la enzima T4 DNA ligasa a una temperatura de 15°C durante 15 horas.

Posteriormente, se transformó la mezcla de ligación como se describe en el apartado 3.8.

Las transformantes obtenidas fueron analizadas por el método descrito en el apartado 3.7.3. Las colonias transformadas deberían incrementar su tamaño desde las 5.7 kpb originales hasta 7.3 kpb.

El nuevo plásmido fue nombrado pUAMAE1 (figura S).

pULVK2.

7.4 kpb 5.7 kpb

Figura 8. Gel de agarosa en el que se muestra en el carril 3 el plásmido pUAMAEl linearizado con la endonucleasa EcoRI de corte Único en este plásmido. En el carril 4 se muestra el plásmido pUAMAEl digerido con la endonucleasa K p I .

El plásn1ido pUAMAEI tiene el mismo tamaño que los más pequeños hasta ahora reportados en la literatura. Sin embargo, en el 2000, Tuteja y colaboradores reportaron que el origen de replicación PA-rep contenido en los plásmidos pULVK2 y pUAMAEl posee secuencias que no son necesarias para la replicación autónoma en Amycolu/opsis, por lo que la disminución del origen dc replicación disminuiría, como consecuencia, el tamaiio del plásmido pUAMAE1. El origen de replicación PA-rep del plásmido pUAMAE1. tiene un tamaño aproximado mayor a las 2500 pb. La1 y colaboradores, reportan sin embargo, una secuencia de origen de replicación de 981 pb en el plásmido.pRL53.

Esto significa una disminución en el tamaño de PA-rep de más de 1500 pb. De manera que es posible disminuir el tamaño de pUAMAE1 en el mismo número de pares de bases.

Cabe mencionar que la disminución del tamaño de PA-rep conseguida por Tuteja y colaboradores se consiguió mediante digestiones con endonucleasas de restricción. Esto significa, como los mismos autores mencionan, que es posible que utilizando herramientas de biología molecular de mayor precisión, como disminuir base a base el origen PA-rep, pueda acortarse aún más dicho fragmento.

El plásmido .pRL53 reportado por Tuteja y col en el 2000 con el origen de replicación disminuido a 981 pb es el más pequeño reportado hasta ahora para A . mediterranei, con un tamaño de 7.25 kpb. Si el origen de replicación del plásmido pUAMAE1 es recortado hasta obtener el mínimo tamaño, se convertiría en el más pequeño de los reportados hasta el momento.

- Este nuevo plásmido sería de gran utilidad como vehículo de clonación para fragmentos de DNA de alto peso molecular, e incluso para el desarrollo de genotecas. pues su capacidad de carga sería superior a las 7 Kpb.

5 . CONCLUSIONES

Se logró la inserción del un fragmento de 162 1 pares de bases que contiene al gen de resistencia a eritromicina en el plásmido pULVK2.

Dicha inserción dio origen a una nuevo plásmido llamado pUAMAE1.

4. REFERENCIAS

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