Post on 25-Mar-2020
TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN RÁPIDADE LEGIONELLA
EN AGUAS
TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN RÁPIDADE LEGIONELLA
EN AGUAS 1 Descripción de Legionella
2 Caracterización de métodos de análisis
Carlos Ferrer, Guillermo Rodríguez
2 Caracterización de métodos de análisis
3 Preparación de las muestras
4 Descripción de métodos selectivos
para Legionella
5 Comparación entre métodos
6 Descripción de la información
complementaria de los test rápidos
7 Utilidad e interpretación de los
resultados de test rápidos
8 Situación en otros países: el caso UK
9. Conclusiones y recomendaciones
NATURAL
ENVIRONMENTS
ARTIFICAL
ENVIRONMENTS
Common state of some microorganism
Different
Changes
1 Descripción de Legionella
Non-growing state growing state
(complex life cycle) (plate)
production of metabolites
stress resistance
sensitivity to disinfectants
or antibiotics
Different
behaviour
Only growth phase
has been studied extensively What about Legionella?
1 Descripción de Legionella
85 %
15 %
1 Descripción de Legionella
Impactoen Salud
%
Legionella pneumophila
(TERMOTOLERANTE
50ºC/algunas horas)
Legionella no pneumophila
2 Caracterización de los métodos de análisis
Estudios en animales
106 UFC
0
107 UFC
10-25
≥108 UFC
Mortalidad(%)
Inóculo
Detectar el nivel
100
Brotes en TR - OMS
106 UFC/l
Uk-1998, USA-1986/1988
107 UFC/l
Australia-1993, USA-1994
105 UFC/l
Uk-1998
Concentración
nivel
Objetivo Estrategia
2 Caracterización de los métodos de análisis
Aislar
Identificar
Detectar
CRECER
AMPLIFICAR
CAPTURAR Y
CONCENTRAR
semanas
día
hora
Relevante
• Expresada en la forma infecciosa
• Relacionada con la virulencia
• Relacionada con la fisiología
Informaciónbiológica
2 Caracterización de los métodos de análisis
Útilfisiología
• En contexto con el lifestyle del patógeno
Rápida
• Independiente del crecimiento de la bacteria
• Fácil implementación en el flujo de trabajo
Propiedadmedible
Técnica
Life Death
Transition states Non-culturable statesCell culturable
2 Caracterización de los métodos de análisis
Cellgrowth
Metabolicactivity
Membranaintegrity
Cell deathResuscitation
Re-growth
2 Caracterización de los métodos de análisis
Prof. Dr. Ulrich SzewzykConference Chair
3 Preparación de las muestras
PRE-CONCENTRACIÓN Muestra preparada
Cf
3 Preparación de las muestras
Rampa de vacío, laboratorio Rampa de vacío, portable
vacíoBomba de vacío
EmbudoEmbudo
de vidrio
Botella
de vidrio
TuboTubo
Muestra original de agua
preparada
Co
Boulanger, 1995
“ The same concentrate…..”
3 Preparación de las muestras
test test
4 Métodos selectivos para Legionella
4 Métodos selectivos para Legionella
4 Métodos selectivos para Legionella
1) 7-12 días
2) Fungible y equipos específicos (espacio)
3) “Foto” antigua del riesgo
4) Precauciones( 1UFC = millones o billones de bacterias infecciosas)
Método tradicional: cultivo
4) Precauciones( 1UFC = millones o billones de bacterias infecciosas)
5) Cambios en la cultivabilidad
6) “Falsos negativos” (VBNC, flora interferente)
7) “Falsos positivos”: colonias crecidas (4-8 días) aún no confirmadas
8) Parada de varios días (clausura/acceso restringido) de una
instalación hasta confirmación
Nos permite tener la colonia para estudios epidemiológicos
Precio medio (Europa) 50 euros/ensayo
1) Incluye células muertas: sobreestimación del target microbiano
2) Problemas técnicos sin resolver:
2.1) Inhibición del test por sustancias ambientales
Método génicos: PCR
4 Métodos selectivos para Legionella
2.1) Inhibición del test por sustancias ambientales
2.2) Dificultad en medir sólo vivas
3) Resultados 8-24 horas
Nos permite caracterizar la bacteria aislada por el cultivo
PCR: hay una urgente necesidad por añadir información de
viabilidad a los métodos de detección basados en ADN
Precio medio 125 euros (Bélgica, Francia, Holanda)75 euros (Portugal, Italia)140 euros (España)
SAMPLEPRETREATMENT
Intact cell Damaged cell
4 Métodos selectivos para Legionella
Método génicos: PMA-qPCR
EXTRACTION
AMPLIFICATION
DNA DNA-bound dyes
Membrane impermeantintercalating dyes RADIATION
Unsolvedfalse positives
Resultingsequence
dye
Concentration
Incubation
conditionslight
source length
Choice
Target
gene
critical factors in the experimental design
Cytotoxicity
4 Métodos selectivos para Legionella
Resulting
data
sequence
high number of
dead cells
high levels of suspended
solids or biomass
Salt
concentration
pH
Useful
data
reaction mix
sample
Cytotoxicity
PCR: urgent need for adding viability
information to DNA-based detection methods
4 Métodos selectivos para Legionella
PMA qPCR results variation
target
Matrix
pH
Saltturbidity
“Dead”
cells
PMAlength
Inhibitors
Exclusion of PMA from
“viable” cells is not
clear
underestimation of
live cell numbersfalse-negative
Increasing Ct values (qPCR)
for potentially live cells(membrane compromised cells or
PMA not excluded?)
Cytotoxicity
Dye concentration
Incubation time
4 Métodos selectivos para Legionella
DNA ‘insoluble’
(loss during
the extraction)
Exclusion of
“dead”
cell signals
Species-specific context,
temperature,
concentration of dye
reduced PMA
uptake
by dead cells
false-positive
Matrix-dependence
(environmental samples)
Further
investigation
is needed
Incubation time
Incubation temp.
Photoactivation
Tube material
Target gene
Length of amplicon
Matrix effects
M. Adela Yáñez, Andreas Nocker, Elena Soria-Soria, Raquel M úrtula, Lorena
Martínez, Vicente Catalán. 2011. “Quantification of viable Legionella
pneumophila cells using propidium monoazide combined with quantitative
PCR”. Journal of Microbiological Methods, vol 85, pp 124-130
4 Métodos selectivos para Legionella
1) To investigate the effect of the optimized PMA treatment conditions on
live L.pneumophila cells, we worked with exponential phase cultures where
the great majority of cells can be expected to be viable.
2) Futher investigation will be needed to reduce the PMA-qPCR signal
of membrane compromised cells by one or two additional logarithms
“El alcance de una técnica de PMA-PCR recientemente presentada en
4 Métodos selectivos para Legionella
“El alcance de una técnica de PMA-PCR recientemente presentada enun congreso de AEAS es para aguas limpias, en particular, aguas deabastecimiento.La técnica no ha resuelto su desempeño en otras matrices, dónde se venecesario estudiar la aplicación de la separación inmunomagnética.”
GRUPO DE QUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA DEL AGUAInvestigador principal: Dr. José Luis Alonso Molina
4 Métodos selectivos para Legionella
ESTERASE
B B
S
REpifluorescence microscopy
?
Membrane filter !Inmunodetection: IDS + cv6
NONFLUORESCENT
ESTER
(CV6)
ESTERASE
GREEN FLUORESCENT
PRODUCT ChemScanRDI
Solid phase cytometer
?
(Ducret et al. 2012) Single-cell analysis of cell viability
after a biocide treatment unveils an absence of positive
correlation between two commonly used viability
markers. MicrobiologyOpen 2013 Feb
4 Métodos selectivos para Legionella
FISH: Fluorescent In Situ Hybridation
4 Métodos selectivos para Legionella
Producto
Moléculas reconocibles (antígeno)en la envoltura celular
(integridad física)
4 Métodos selectivos para Legionella
CEIA: Captura inmunomagnética
Partícula magnética
Substrato
IMÁN
ID + viabilitymarker
Specific instrum.Low trhoughput
4 Métodos selectivos para Legionella
InnoSieveDiagnosticsHolland
Sieve-ID
Low trhoughputNo validationMetabolic basis
ID, Immuno-chromatography
High LOD
High false+ rate
4 Métodos selectivos para Legionella
AlbagaiaLtd
Scotland
Hydrosense
High false+ rate
Strcitly P/A
Only Lp sg1
Culture
High LOD
High time to result
4 Métodos selectivos para Legionella
Phigenics
USA
High time to result
Conflictive results
Not VBNC
PMAqPCR
Specific instrum.False positive
4 Métodos selectivos para Legionella
Phast-BlueSpain
Geniul
False positiveFalse negativeUnsolved issuesFurther develop
NASBA –Microfluidic
(RNA isothermalAmplification) Specific instrum.
RNA vs viability
4 Métodos selectivos para Legionella
PinvialegEU-Project
RNA vs viabilityANS extractionUnsolved issuesFurther develop
Bacteria-Ag + Ab-MP↔ Bacteria-AgAb-MP
4 Métodos selectivos para Legionella
CEIA: Captura magnética y enzimoinmunoensayo
MAGNETIC BEAD
LEGIONELLA CELL
A B C
4 Métodos selectivos para Legionella
INTERACTIONFORCE
ALIVE INJURED DEAD
DAMAGEA B C
Cooperative interaction between CD44 and VLA-4 may be involved in T cell recruitment to the central nervous system
The "sandwich" model. A CD44:HA:CD44 mediatedcell:cell interaction. Here CD44 expressed on activatedT cells binds to hyaluronan presented on the surface ofendothelial cells by CD44. The level of hyaluronanexpressed by endothelial cells is increased ininflammatory conditions
The CEIA test detected
i) a signal reduction as a result of the application of biocides and this decrease depends on the biocide,
signal
ii) a signal decrease over time in a suspension of Legionella, and
iii) no signal for a concentrated suspension of dead Legionella
biocidecontrol
signal
time
Peroxidasa
Substrato
Producto ¿L p?
Test látex
4 Métodos selectivos para Legionella
Partícula magnética
1 hora 24 horas 15 días
Una estrategia que hace posible:
a) Concentrar una sóla muestra
b) Usar una porción menor para cultivo (tenemos la colonia)
c) Usar otra porción para capturar la Legionella y entonces:
c.1) determinar su presencia y en qué nivel en 1horac.1) determinar su presencia y en qué nivel en 1hora
c.2) reservar la bacteria capturada (bio-pellet) para obtener
otra información a plazo medio-largo:
- aislar la colonia
- analizar el ADN
Purificación(Lavado)
Interferencias
PCR
BIO-PELLET
Study in collaboration with:
Pseudomonas:Pseudomonas:
a) 25%
b) 50%
c) 75%
R = p(D)
(4 Validation of test methods)
Document EA - 4/10.Accreditation in Microbiological Laboratories
Specific guidance on the accreditation of laboratories performing microbiological testing, according to ISO/IEC 17025
http://www.europeanaccreditation.org/
5 Comparación de métodos
(4 Validation of test methods)
4.4 Laboratories shall retain validation data oncommercial test systems (kits) used in the laboratory.These validation data may be obtained throughcollaborative testing and from validation data submitted bythe manufacturers and subjected to third party evaluation(e.g. AOAC). If the validation data are not available or notwholly applicable, the laboratory shall be responsible forcompleting the validation of the method.
Commission Regulation (EC) n°2073/2005
of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs
Alternative validated methods
5 Comparación de métodos
Alternative validated methods
- Validated against reference methods according protocol set out in the
standard ISO 16140 or internationally accepted similar protocols
- Third party (e.g. AFNOR, Microval, NordVal, AOAC)
Reference method: ISO 11731 Third party: AOAC
• Legipid es el único test internacionalmentecertificado por AOAC Research Institutepara la detección rápida de Legionellapneumophila.
• Solvencia técnica, resultados rápidos,fácil uso, y bajo coste hace de Legipid lamejor técnica para la prevención de brotes
5 Comparación de métodos
mejor técnica para la prevención de brotesy screening .
Download Certificate:
http://www.aoac.org/testkits/testedmethods.html
5 Comparación de métodos
Indicador Valor
Sensibilidad,% 98
Especificidad,% 93
Falsos negativos,% 2
Falsos positivos,% 7
Chi-cuadrado 1.8
6 Información de los test rápidos
Evaluación de biocidas
6 Información de los test rápidos
FOTO
control DBNPA
FOTOcontrol Hypochlorite
Mapeo de instalaciones de riesgo
6 Información de los test rápidos
Alto rendimiento en laboratorio: formatos de 40/100 /500 ensayos
Vista superior
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
17 18 19 20MP4
CUBETA
5 Información de los test rápidos
1 2 3 4
5 6 7 8
MP2
CUBETA
REACTIVOS
Utilidad del test rápidoUtilidad del test rápidoPLAN DE MANTENIMIENTO
HIGIÉNICO-SANITARIOCULTIVO
ACCION
positivo
Positivo 103104
HACE OPORTUNA LA ACCIÓNDE MANTENIMIENTO
7 Utilidad de los test rápidos
BROTES
EVALUACIÓN
ACCION Positivo
Test rápido
NO ACCIÓN ADICIONAL Negativo
103104
>104
UK
8 Caso UK
CULTIVOCOLONIAS
SOSPECHOSASCOLONIAS
CONFIRMADAS
8 Caso UK
Utilidad del test rápidoUtilidad del test rápido
ACCIÓNAPLICADA
ACCIÓNNO ERA
NECESARIA
NEGATIVO
COSTE
MUESTRA
TEST RÁPIDO
NEGATIVO
POSITIVO
9 Conclusiones y recomendaciones
9 Conclusiones y recomendaciones
9 Conclusiones y recomendaciones
9 Conclusiones y recomendaciones
9 Conclusiones y recomendaciones