TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN RÁPIDA DE ... Productos...2.1) Inhibición del test por sustancias...

TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN RÁPIDADE LEGIONELLA

EN AGUAS

TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN RÁPIDADE LEGIONELLA

EN AGUAS 1 Descripción de Legionella

2 Caracterización de métodos de análisis

Carlos Ferrer, Guillermo Rodríguez

2 Caracterización de métodos de análisis

3 Preparación de las muestras

4 Descripción de métodos selectivos

para Legionella

5 Comparación entre métodos

6 Descripción de la información

complementaria de los test rápidos

7 Utilidad e interpretación de los

resultados de test rápidos

8 Situación en otros países: el caso UK

9. Conclusiones y recomendaciones

NATURAL

ENVIRONMENTS

ARTIFICAL

ENVIRONMENTS

Common state of some microorganism

Different

Changes

1 Descripción de Legionella

Non-growing state growing state

(complex life cycle) (plate)

production of metabolites

stress resistance

sensitivity to disinfectants

or antibiotics

Different

behaviour

Only growth phase

has been studied extensively What about Legionella?

85 %

15 %


Impactoen Salud

%

Legionella pneumophila

(TERMOTOLERANTE

50ºC/algunas horas)

Legionella no pneumophila

2 Caracterización de los métodos de análisis

Estudios en animales

106 UFC

0

107 UFC

10-25

≥108 UFC

Mortalidad(%)

Inóculo

Detectar el nivel

100

Brotes en TR - OMS

106 UFC/l

Uk-1998, USA-1986/1988

107 UFC/l

Australia-1993, USA-1994

105 UFC/l

Uk-1998

Concentración

nivel

Objetivo Estrategia


Aislar

Identificar

Detectar

CRECER

AMPLIFICAR

CAPTURAR Y

CONCENTRAR

semanas

día

hora

Relevante

• Expresada en la forma infecciosa

• Relacionada con la virulencia

• Relacionada con la fisiología

Informaciónbiológica


Útilfisiología

• En contexto con el lifestyle del patógeno

Rápida

• Independiente del crecimiento de la bacteria

• Fácil implementación en el flujo de trabajo

Propiedadmedible

Técnica

Life Death

Transition states Non-culturable statesCell culturable


Cellgrowth

Metabolicactivity

Membranaintegrity

Cell deathResuscitation

Re-growth


Prof. Dr. Ulrich SzewzykConference Chair

PRE-CONCENTRACIÓN Muestra preparada

Cf


Rampa de vacío, laboratorio Rampa de vacío, portable

vacíoBomba de vacío

EmbudoEmbudo

de vidrio

Botella

de vidrio

TuboTubo

Muestra original de agua

preparada

Co

Boulanger, 1995

“ The same concentrate…..”


test test

4 Métodos selectivos para Legionella


1) 7-12 días

2) Fungible y equipos específicos (espacio)

3) “Foto” antigua del riesgo

4) Precauciones( 1UFC = millones o billones de bacterias infecciosas)

Método tradicional: cultivo

4) Precauciones( 1UFC = millones o billones de bacterias infecciosas)

5) Cambios en la cultivabilidad

6) “Falsos negativos” (VBNC, flora interferente)

7) “Falsos positivos”: colonias crecidas (4-8 días) aún no confirmadas

8) Parada de varios días (clausura/acceso restringido) de una

instalación hasta confirmación

Nos permite tener la colonia para estudios epidemiológicos

Precio medio (Europa) 50 euros/ensayo

1) Incluye células muertas: sobreestimación del target microbiano

2) Problemas técnicos sin resolver:

2.1) Inhibición del test por sustancias ambientales

Método génicos: PCR


2.1) Inhibición del test por sustancias ambientales

2.2) Dificultad en medir sólo vivas

3) Resultados 8-24 horas

Nos permite caracterizar la bacteria aislada por el cultivo

PCR: hay una urgente necesidad por añadir información de

viabilidad a los métodos de detección basados en ADN

Precio medio 125 euros (Bélgica, Francia, Holanda)75 euros (Portugal, Italia)140 euros (España)

SAMPLEPRETREATMENT

Intact cell Damaged cell


Método génicos: PMA-qPCR

EXTRACTION

AMPLIFICATION

DNA DNA-bound dyes

Membrane impermeantintercalating dyes RADIATION

Unsolvedfalse positives

Resultingsequence

dye

Concentration

Incubation

conditionslight

source length

Choice

Target

gene

critical factors in the experimental design

Cytotoxicity


Resulting

data

sequence

high number of

dead cells

high levels of suspended

solids or biomass

Salt

concentration

pH

Useful

data

reaction mix

sample

Cytotoxicity

PCR: urgent need for adding viability

information to DNA-based detection methods


PMA qPCR results variation

target

Matrix

pH

Saltturbidity

“Dead”

cells

PMAlength

Inhibitors

Exclusion of PMA from

“viable” cells is not

clear

underestimation of

live cell numbersfalse-negative

Increasing Ct values (qPCR)

for potentially live cells(membrane compromised cells or

PMA not excluded?)

Cytotoxicity

Dye concentration

Incubation time


DNA ‘insoluble’

(loss during

the extraction)

Exclusion of

“dead”

cell signals

Species-specific context,

temperature,

concentration of dye

reduced PMA

uptake

by dead cells

false-positive

Matrix-dependence

(environmental samples)

Further

investigation

is needed

Incubation time

Incubation temp.

Photoactivation

Tube material

Target gene

Length of amplicon

Matrix effects

M. Adela Yáñez, Andreas Nocker, Elena Soria-Soria, Raquel M úrtula, Lorena

Martínez, Vicente Catalán. 2011. “Quantification of viable Legionella

pneumophila cells using propidium monoazide combined with quantitative

PCR”. Journal of Microbiological Methods, vol 85, pp 124-130


1) To investigate the effect of the optimized PMA treatment conditions on

live L.pneumophila cells, we worked with exponential phase cultures where

the great majority of cells can be expected to be viable.

2) Futher investigation will be needed to reduce the PMA-qPCR signal

of membrane compromised cells by one or two additional logarithms

“El alcance de una técnica de PMA-PCR recientemente presentada en


“El alcance de una técnica de PMA-PCR recientemente presentada enun congreso de AEAS es para aguas limpias, en particular, aguas deabastecimiento.La técnica no ha resuelto su desempeño en otras matrices, dónde se venecesario estudiar la aplicación de la separación inmunomagnética.”

GRUPO DE QUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA DEL AGUAInvestigador principal: Dr. José Luis Alonso Molina


ESTERASE

B B

S

REpifluorescence microscopy

?

Membrane filter !Inmunodetection: IDS + cv6

NONFLUORESCENT

ESTER

(CV6)

ESTERASE

GREEN FLUORESCENT

PRODUCT ChemScanRDI

Solid phase cytometer

?

(Ducret et al. 2012) Single-cell analysis of cell viability

after a biocide treatment unveils an absence of positive

correlation between two commonly used viability

markers. MicrobiologyOpen 2013 Feb

FISH: Fluorescent In Situ Hybridation


Producto

Moléculas reconocibles (antígeno)en la envoltura celular

(integridad física)


CEIA: Captura inmunomagnética

Partícula magnética

Substrato

IMÁN

ID + viabilitymarker

Specific instrum.Low trhoughput


InnoSieveDiagnosticsHolland

Sieve-ID

Low trhoughputNo validationMetabolic basis

ID, Immuno-chromatography

High LOD

High false+ rate


AlbagaiaLtd

Scotland

Hydrosense

High false+ rate

Strcitly P/A

Only Lp sg1

Culture

High LOD

High time to result


Phigenics

USA

High time to result

Conflictive results

Not VBNC

PMAqPCR

Specific instrum.False positive


Phast-BlueSpain

Geniul

False positiveFalse negativeUnsolved issuesFurther develop

NASBA –Microfluidic

(RNA isothermalAmplification) Specific instrum.

RNA vs viability


PinvialegEU-Project

RNA vs viabilityANS extractionUnsolved issuesFurther develop

Bacteria-Ag + Ab-MP↔ Bacteria-AgAb-MP


CEIA: Captura magnética y enzimoinmunoensayo

MAGNETIC BEAD

LEGIONELLA CELL

A B C


INTERACTIONFORCE

ALIVE INJURED DEAD

DAMAGEA B C

Cooperative interaction between CD44 and VLA-4 may be involved in T cell recruitment to the central nervous system

The "sandwich" model. A CD44:HA:CD44 mediatedcell:cell interaction. Here CD44 expressed on activatedT cells binds to hyaluronan presented on the surface ofendothelial cells by CD44. The level of hyaluronanexpressed by endothelial cells is increased ininflammatory conditions

The CEIA test detected

i) a signal reduction as a result of the application of biocides and this decrease depends on the biocide,

signal

ii) a signal decrease over time in a suspension of Legionella, and

iii) no signal for a concentrated suspension of dead Legionella

biocidecontrol

signal

time

Peroxidasa

Substrato

Producto ¿L p?

Test látex


Partícula magnética

1 hora 24 horas 15 días

Una estrategia que hace posible:

a) Concentrar una sóla muestra

b) Usar una porción menor para cultivo (tenemos la colonia)

c) Usar otra porción para capturar la Legionella y entonces:

c.1) determinar su presencia y en qué nivel en 1horac.1) determinar su presencia y en qué nivel en 1hora

c.2) reservar la bacteria capturada (bio-pellet) para obtener

otra información a plazo medio-largo:

- aislar la colonia

- analizar el ADN

Purificación(Lavado)

Interferencias

PCR

BIO-PELLET

Study in collaboration with:

Pseudomonas:Pseudomonas:

a) 25%

b) 50%

c) 75%

R = p(D)

(4 Validation of test methods)

Document EA - 4/10.Accreditation in Microbiological Laboratories

Specific guidance on the accreditation of laboratories performing microbiological testing, according to ISO/IEC 17025

http://www.europeanaccreditation.org/

5 Comparación de métodos

(4 Validation of test methods)

4.4 Laboratories shall retain validation data oncommercial test systems (kits) used in the laboratory.These validation data may be obtained throughcollaborative testing and from validation data submitted bythe manufacturers and subjected to third party evaluation(e.g. AOAC). If the validation data are not available or notwholly applicable, the laboratory shall be responsible forcompleting the validation of the method.

Commission Regulation (EC) n°2073/2005

of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs

Alternative validated methods


Alternative validated methods

- Validated against reference methods according protocol set out in the

standard ISO 16140 or internationally accepted similar protocols

- Third party (e.g. AFNOR, Microval, NordVal, AOAC)

Reference method: ISO 11731 Third party: AOAC

• Legipid es el único test internacionalmentecertificado por AOAC Research Institutepara la detección rápida de Legionellapneumophila.

• Solvencia técnica, resultados rápidos,fácil uso, y bajo coste hace de Legipid lamejor técnica para la prevención de brotes


mejor técnica para la prevención de brotesy screening .

Download Certificate:

http://www.aoac.org/testkits/testedmethods.html


Indicador Valor

Sensibilidad,% 98

Especificidad,% 93

Falsos negativos,% 2

Falsos positivos,% 7

Chi-cuadrado 1.8

6 Información de los test rápidos

Evaluación de biocidas


FOTO

control DBNPA

FOTOcontrol Hypochlorite

Mapeo de instalaciones de riesgo


Alto rendimiento en laboratorio: formatos de 40/100 /500 ensayos

Vista superior

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14 15 16

17 18 19 20MP4

CUBETA


1 2 3 4

5 6 7 8

MP2

CUBETA

REACTIVOS

Utilidad del test rápidoUtilidad del test rápidoPLAN DE MANTENIMIENTO

HIGIÉNICO-SANITARIOCULTIVO

ACCION

positivo

Positivo 103104

HACE OPORTUNA LA ACCIÓNDE MANTENIMIENTO

7 Utilidad de los test rápidos

BROTES

EVALUACIÓN

ACCION Positivo

Test rápido

NO ACCIÓN ADICIONAL Negativo

103104

>104

UK

8 Caso UK

CULTIVOCOLONIAS

SOSPECHOSASCOLONIAS

CONFIRMADAS

8 Caso UK

Utilidad del test rápidoUtilidad del test rápido

ACCIÓNAPLICADA

ACCIÓNNO ERA

NECESARIA

NEGATIVO

COSTE

MUESTRA

TEST RÁPIDO

NEGATIVO

POSITIVO

9 Conclusiones y recomendaciones

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