Post on 30-Apr-2020
1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Secretaría de Investigación y posgrado
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Programa de Doctorado en Ciencias Químico-Biológicas
Determinación de la cigocidad del gen RHD T e s i s
Que como parte de los requisitos para obtener el Grado
de Doctor en Ciencias Quimicobiológicas
Presenta
Fany Rosenfeld Mann
Directores de tesis
Dr. Luis A. Jiménez Zamudio
Dra. Elba Reyes Maldonado
México, D.F. Enero 2009
2
EL PRESENTE TRABAJO FUE REALIZADO EN EL SERVICIO DE
HEMATOLOGÍA PERINATAL DEL INSTITUTO NACIONAL DE
PERINATOLOGIA DE LA SECRETARIA DE SALUD, BAJO LA
DIRECCIÓN DE LOS DOCTORES LUIS A. J IMENEZ ZAMUDIO Y
ELBA REYES MALDONADO.
DERIVA DEL PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN CON
REGISTRO 212250-07241 DEL PROPIO INSTITUTO, SIENDO EL
INVESTIGADOR RESPONSABLE EL DR. HÉCTOR A. BAPTISTA
GONZÁLEZ.
3
Mi agradecimiento y consideración para:
Dr. Héctor A. Baptista González y QBP. Rocío Trueba Gómez
Por el gran aprendizaje y las emocionantes discusiones que hemos tenido
a lo largo del tema del Rh
Dra. Elba Reyes Maldonado
Dr. Luis A. Jiménez Zamudio
Dra. Ethel García Latorre
Dra. Margarita Sotelo Ort iz
Dr. Aarón Domínguez López
Dr. Fausto Sánchez
Biol. Georgina Coeto Barona
M en C. Carmen Acuña González
Dr. Arturo Barrón González
M en C Maribel Acosta
QFB. Jazmin I. Cruz Reyes
QFB. Carmen Santamaría Hernández
M en C Higinio Estrada Juárez
M en C Luisa Bermejo Martínez
Lic. Psic. Isaac Cohen Shiver
Al Inst ituto Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud.
Al Servicio de Medicina Transfusional y Banco de Sangre de la Fundación
Medica Sur.
A la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN .
i
ÍNDICE
Índice i
Abreviaturas ii
Índice de figuras iii
Índice de tablas iv
Resumen v
Abstract vii
I. Introducción 1
Antecedentes 4
Planteamiento del problema 25
Justificación 26
Hipótesis 26
Objetivo 26
II. Material y métodos 27
Análisis estadístico 35
III. Resultados 36
IV. Discusión 41
V. Conclusiones 44
VI. Bibliografía 45
ii
INDICE DE ABREVIATURAS
3’-UTR 3’- Región 3`no traducida del inglés 3´untranslated región 5’-UTR 5’-Región 5´no traducida del inglés 5´untranslated región Br-Er Bromuro de etidio Del Deleción Dia /Dib Antígenos Diegoa /b de la proteína Diego EHRN Enfermedad hemolítica del Recién Nacido Fc(γR1) Receptor 1γ de la fracción cristalizable de la los anticuerpos FRET Transferencia de energía de resonancia fluorescente Fya/Fyb Antígenos Duffy a/b de la proteína Duffy GPI Glicosilfosfatidilinositol ISBT Sociedad internacional de transfusión sanguínea del inglés
Internacional Society of Blood Transfusion IV Intravenosa K/k Antígenos Kell/cellano de la proteína Kell Kb Kilobase KDa Kilodaltons Kpa/Kpb Antígenos Penny/Rautenberg de la proteína Kell pb Pares de bases PCR-RFLP Reacción en cadena de la polimerasa con patrón de la longitud de
enzimas de restricción PCR-SSP PCR alelo específica RhAG Proteína RhAG RHAG, RHBG, RHCG Genes de las glicoproteínas asociadas al Rh, RhAG, RhBG y RhCG RHCE Gen RHCE RhCE Antígenos o proteínas C,c,E y e RHD Gen RHD RhD Antígeno o proteína D RHDψ Pseudogen Phi del RHD SMP1 Proteína pequeña de membrana 1, del inglés small membrane
proteína 1 SNP Polimorfismos de un solo nucleótido, del inglés Single nucleotide
polymorphism TAE Amortiguador Tris acetato y etilen diamino tetracetato TBE Amortiguador Tris, borato y etilen diamino tetracetato THE-1B Elemento humano tipo transposón
iii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Reacción de aglutinación en tubo. 3
Figura 2. Orientación opuesta de los genes RhD y RHCE, enfrentados en su posición 3`
9
Figura 3. Evolución de los genes RH 10
Figura 4. Mecanismo de pérdida total del gen RHD 11
Figura 5. Organización cromosómica de las cajas Rhesus 12
Figura 6. Mecanismo del pseudogen RHDψ.
13
Figura 7. Mecanismo de conversión de los genes RH en cis. 14
Figura 8. Estructuras moleculares en europeos con haplotipo D negativo y Del
14
Figura 9. Complejo molecular Rh 16
Figura 10 Estructura molecular de las proteínas RHD y RHCE 16
Figura 11 Cambios en aminoácidos en la proteína Rh condicionan la presencia de RhD débil, D parcial y Del
17
Figura 12 Representación de los genes homocigotos RHD negativo y positivo
19
Figura 13 Representación de los genes homocigoto RHD negativo y
heterocigoto RHD positivo.
20
Figura 14 Representación de los genes RHD negativo en ambos
padres.
20
Figura 15 Guía para el estudio de la embarazada RhD negativo 21
Figura 16 Valoración de la calidad del DNA genómico
29
Figura 17 Observación de la fluorescencia en un sistema computarizado y diagrama de operación del termociclador
31
Figura 18 Picos de fusión de la región 3´UTR Exón 10 RHD.
39
Figura 19 Picos de fusión de la región intron3-exon4 RHD.
40
Figura 20 Curvas de amplificación del exón 7 RHD.
40
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Frecuencia de RhD negativo en diferentes poblaciones 3
Tabla 2 Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT)
6
Tabla 3 Polimorfismos en la secuencia codificante de los genes RHD y RHCE
8
Tabla 4 Nomenclaturas del sistema Rh utilizadas en la literatura 18
Tabla 5 Prevalencia de mujeres Rh negativo e isoinmunización al RhD
22
Tabla 6 Fenotipos RhD positivo con la cigocidad más probable en individuos blancos y negros
23
Tabla 7 Frecuencia de fenotipos Rh
24
Tabla 8 Secuencias de los iniciadores y sondas utilizadas para la amplificación de las regiones del gen RHD y cajas RH
28
Tabla 9 Condiciones de amplificación de las reacciones 33
Tabla 10 Distribución de la población estudiada por grupo Rh 34
Tabla 11 Distribución de la población estudiada por grupos ABO y Rh
36
Tabla 12 Fenotipos Rh de los sujetos de estudio 36
Tabla 13 Fenotipos Rh de los sujetos de estudio 37
v
RESUMEN
El estudio de la cigocidad RHD en las parejas de mujeres RhD negativo tiene importancia clínica para consejo genético pregestacional y gestacional en familias con historia de Enfermedad hemolítica del recién nacido. El objetivo fue identificar la condición de cigocidad del gen RHD en sujetos RhD positivo, por PCR-RFLP tradicional, y PCR en tiempo real en familias residentes en el Valle de México, así como determinar la concordancia de la cigocidad del gen RHD entre el fenotipo del sistema Rh y las pruebas moleculares Material y Métodos. Estudio de casos y controles, transversal y descriptivo. Los casos se integraron por familias donde la madre es RhD negativo y su pareja RhD positivo y al menos un hijo biológico evaluado. Los controles fueron familias con ambos padres RhD positivo y al menos un hijo estudiado. Se determinó al fenotipo del Rh (D,C,c,E,e) y las secuencias específicas del gen RHD (3´ UTR exón 10, exón 7, intron4-exón 4/RHDψ por PCR en tiempo real y cajas RH por PCR-RFLP). Resultados. Se evaluaron 228 individuos, 122 padres y 106 hijos pertenecientes a 61 familias (61 madres y 61 padres). Se constituyeron 28 familias de casos con 44 hijos y 33 familias de controles con 62 hijos. Los fenotipos RhD positivo más frecuentes de la población estudiada fueron CcDee (33.2%), CCDee (24.1%) y CcDEe (23.0%). La concordancia de la cigocidad paterna (61 sujetos) comparando la obtenida por la frecuencia génica de Heiken y el estudio de las cajas Rhesus fue de 0.88 en homocigotos (DD) y de 1.0 en hemicigotos (Dd) con un valor de Phi 0.875. La concordancia entre la cigocidad paterna con base al estudio familiar y de las cajas Rhesus fue de 1.0 con un valor de Phi 1.0. La condición de cigocidad en las parejas tanto de mujeres RhD negativo (casos) y positivo (controles) tuvo una distribución igual, de 0.611 y 0.612 respectivamente. Padres homocigotos del 55.7% y hemicigotos del 44.3%. La condición de cigocidad de los hijos fue estadísticamente significativa entre los grupos de estudio (P<0.05). Una limitante del estudio es que no identifica los otros mecanismos moleculares de la condición RhD negativo, solo el mecanismo de deleción génica, el principal en individuos de origen caucásico, el estudio del pseudogen RHDΨ que no identificó ningún caso en los sujetos de estudio y la amplificación de regiones del gen RHD, que se presentó en todos los 187 casos de RhD positivos y en 5 de los 41 sujetos RhD negativo, lo cual permitió disminuir los falsos positivos en condición homocigota, cuyo mecanismo molecular es por la ausencia de caja híbrida. Conclusiones. Se obtuvo concordancia de 1.0 entre el estudio familiar y el de las cajas Rhesus tanto en homo como hemicigotos. La concordancia entre el estudio basado en la frecuencia génica y el de las cajas Rhesus fue también de 1.0 en hemicigotos y disminuyo a 0.88 en homocigotos.
vi
ABSTRACT
The study of couples in RHD cigocidad of RhD negative women is important for clinical genetic counseling pregestational and gestational in families with a history of hemolytic disease of the newborn. The objective was to identify the status of the gene RHD cigocidad subjects RhD positive, traditional PCR-RFLP and real-time PCR in families residing in the Valley of Mexico, as well as determining the consistency of the RHD gene cigocidad between phenotype Rh system and molecular tests. Material and Methods. Case-control study, transverse and descriptive. The cases were composed of families where the mother is RhD negative and RhD positive and your partner at least one biological child evaluated. Controls were families with both parents RhD positive and at least one child studied. We determined the phenotype of Rh (D, C, c, e, e) and specific sequences of the gene RHD (3 'UTR exon 10, exon 7, exon intron4-4/RHDψ by real-time PCR and PCR boxes RH -RFLP). Results. We evaluated 228 individuals, 122 parents and 106 children belonging to 61 families (61 mothers and 61 fathers). Families were 28 cases with 44 children and 33 families with 62 children of controls. The most frequent positive RhD phenotypes of the population studied were CcDee (33.2%), CCDee (24.1%) and CcDEe (23.0%). The paternal line of cigocidad (61 subjects) obtained by comparing the frequency of gene Heiken and studying Rhesus boxes was 0.88 homozygote (DD) and 1.0 in hemicigotos (DD) with a value of Phi 0875. The correlation between paternal cigocidad based study of family and Rhesus boxes was 1.0 with a value of 1.0 Phi. The status of the couples in cigocidad both RhD negative women (cases) and positive (control) had an equal distribution of 0.611 and 0.612 respectively. Homozygote parents of 55.7% and 44.3% of hemicigotos. Cigocidad status of the children was statistically significant between the study groups (P<0.05). One limitation is that the study does not identify the molecular mechanisms of the condition RhD negative, only the mechanism of gene deletion, the principal individuals of Caucasian origin, the study of pseudogen RHDΨ not identified any cases in the study subjects and amplification of the RHD gene, which was presented in all 187 cases of RhD positive and 5 of the 41 subjects RhD negative, allowing reduce false positives in homozygous condition, whose molecular mechanism is the lack of hybrid box. Conclusions. Correlation was obtained between 1.0 and family study of the boxes in Rhesus as homo hemicigotos. The correlation between the study based on the frequency of the gene and Rhesus boxes was also 1.0 hemicigotos and fell to 0.88 homozygote.
1
I. INTRODUCCION
Grupos sanguíneos
Los antígenos de los grupos sanguíneos son estructuras químicas (carbohidratos
unidos a lípidos o lipoproteínas y proteínas) polimórficas hereditarias, expuestas en la
superficie de la membrana eritrocitaria, así como en otros tejidos y líquidos del
organismo. Se han identificado alrededor de 300 determinantes antigénicos de grupos
sanguíneos, la gran mayoría pertenecen a alguno de los 29 sistemas reconocidos y los
restantes (aproximadamente 40 antígenos), forman parte de las series y las
colecciones. (Reid, 2004)
Un sistema de grupo sanguíneo consiste en uno o más antígenos que comparten
características en común como su estructura química, la localización en la membrana,
controlados por un gen o genes estrechamente relacionados con escasa o nula
recombinación entre ellos, los cuales han sido clonados y secuenciados y con herencia
independiente (por ejemplos ABO, Rh, Duffy, MNS) . Las colecciones contienen a los
antígenos que tienen alguna relación bioquímica, serológica o genética pero sin cumplir
cabalmente las condiciones de un sistema, entre ellos el antígeno i, Lewis c, Lewis d.
Las series corresponden a antígenos que no reúnen los requisitos anteriores, se
clasifican en series de baja incidencia con <1% (serie 700) por ejempo los grupos Batty,
Christiansen y Biles y de alta incidencia con >99% (serie 900), Langereis, August y
Antón comprendidos en este grupo. (Daniels 2004)
Los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos antieritrocitarios tienen importancia clínica
porque causan reacciones transfusionales, enfermedad hemolítica aloinmune del recién
nacido (EHRN), anemias hemolíticas autoinmunes, defectos de membrana y se han
asociado con diversas enfermedades. (Mohandas, 2005)
En términos generales, se han identificado los diversos eventos moleculares que dan
lugar a la expresión de los diferentes antígenos eritrocitarios, como son: (Reid 2003).
Conversión o recombinación de genes: MNS, Rh, Chido/Rodgers.
2
Duplicación de un exón: Gerbich.
Deleción de un gen, exón o nucleótido: ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock,
Gerbich.
Inserción de uno o más nucleótidos: Rh, Colton.
Substitución de un nucleótido (SNP): La mayoría de los grupos sanguíneos:
RhC/c, RhE/e, Kell/cellano (K/k), Penny/Rautenberg (Kpa/Kpb), Duffya/Duffyb
(Fya/Fyb), Diegoa/Diegob (Dia/Dib)
El primer sistema sanguíneo descrito por Landstainer en 1901, fue el ABO, como
resultado de la mezcla de eritrocitos y sueros de diferentes sujetos sanos, los grupos
sanguíneos restantes se han identificado a partir de entidades clínicas como la EHRN,
las reacciones hemolíticas a la transfusión, así como mediante la inmunización de
animales de experimentación con eritrocitos humanos, el uso de anticuerpos
monoclonales y por las técnicas de biología molecular, que han permitido la
identificación de los polimorfismos, la caracterización de su expresión en tejidos
específicos y la relación entre la estructura y la función. (Denomme, 2004)
Los antígenos de los sistemas Rh y ABO, son de importancia central en el campo de la
inmunohematología clínica. Su identificación es obligada en toda actividad relacionada
con el empleo terapéutico de sangre y sus componentes (NOM .
Los seres humanos se pueden clasificar serológicamente como Rh positivo o Rh
negativo, por medio de la presencia o ausencia de la reacción de aglutinación que se
observa cuando una solución de eritrocitos se enfrenta con anticuerpos anti-D
policlonales, monoclonales o mezcla de ellos (Figura. 1) (Mollison, 1993)
La identificación del antígeno D puede algunas veces ser problemático, porque: 1) El
antígeno D se define por múltiples epítopes conformacionales, algunos cambios en el
gen RHD pueden ocasionar cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína D
que alteren el nivel de expresión o la estructura y epítopes de dicha proteína. 2)
Numerosos métodos (placa, en tubo, fase sólida, columnas en gel) y reactivos (mezcla
de monoclonales, solo IgG, o IgM, policlonales), tratamiento de eritrocitos con enzimas)
3
se han empleado comúnmente con diferentes sensibilidad para la detección de
variantes D. (Westhoff, 2007b)
Figura 1. Reacción de aglutinación en tubo. Derecha. Reacción de aglutinación positiva y negativa respectivamente, por el método tradicional de aglutinación en tubo, nótese el fondo claro y el botón celular íntegro en la reacción positiva y el fondo turbio rojo sin aglutinación en la reacción negativa. Izquierda. Reacción en la técnica moderna en gel, en la reacción positiva se aprecia una banda en la parte superior de la columna y la negativa en el fondo de la columna.
La prevalencia de los individuos RhD negativo varía según el origen étnico y la mezcla
de poblaciones por efecto de la migración, siendo desde casi nula en población
indígena mesoamericana, hasta 25% en el grupo vasco (tabla 1). (Mollison 1993, AABB 2005).
Tabla 1 Frecuencia de RhD negativo en diferentes poblaciones.
Población Frecuencia (%)
Vascos 25
Caucásicos 15
Negros-africanos 8
Asiáticos <1
Mestizo-venezolanos 7
Mestizo-argentinos 10
Indígenas
mesoamericanos
<1
Mestizo-mexicanos
Valle de México
3
INPer 4.9
4
I.1. ANTECEDENTES
Historia y presente del Sistema Rh y Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido
Esta se puede dividir cronológicamente en 4 etapas:
a) Diagnóstico
La primera observación fue realizada en 1609 por una partera francesa Louyse Bour
Geois, quien describió lo que les afligía a unos gemelos, esto actualmente corresponde
a uno con hidrops fetalis y al otro con kernÍcterus; luego en 1932, Diamond, Blackfan y
Baty denominan “Eritroblastosis fetal” al cuadro de eritroblastosis, anemia e ictericia en
recién nacidos pero sin conocer la causa. En 1938 Darrow, propone un mecanismo
inmune como responsable de la hemólisis de los eritrocitos fetales y neonatales. Un año
después Levine y Stetson, demostraron el mecanismo fisiopatológico de la EHRN en
un bebe muerto con hidrops cuya madre presentó una reacción hemolítica después de
haber recibido la sangre de su esposo, proponiendo que tanto la muerte fetal como la
reacción hemolítica, eran consecuencia de la sensibilización materna producida por un
antígeno en los eritrocitos fetales heredado del padre, y ausentes en la madre, el suero
materno aglutinó el 80% de los hematíes probados. En 1940 Landstainer y Wiener,
producen anticuerpos en conejos y cobayos contra eritrocitos del mono Rhesus los que
aglutinaron al 85% de los hematíes de los individuos en Nueva York, al que
denominaron Factor Rh.
Se identificaron los otros 4 antígenos del Rh (C, c, E y e) y se propusieron los
mecanismo hereditarios de este sistema. En 1943 Fisher propuso la existencia de tres
genes y Wiener, Race y Sanger en 1951, la de un solo gen con diversos alelos (Race y
Sanger 1975).
En 1957 Kleihauer y Betke, demostraron la presencia de eritrocitos fetales en la
circulación materna.
5
b) Tratamiento
En 1946, Wallerstein realizó la primera exanguineotransfusión con sangre Rh negativo,
como tratamiento postnatal de la EHRN. En 1956 Bevis, introdujo el estudio
espectrofotométrico de las bilirrubinas en líquido amniótico para valorar la severidad de
la enfermedad hemolítica y, en 1962 Liley, efectuó la primera transfusión intrauterina
como medida de tratamiento prenatal. (Linares, 1986)
c) Prevención
En los años sesentas Finn y Clarke en Liverpool, Gorman, Freda y Pollack en Nueva
York y Bowman en Winnipeg, Canadá, investigaron la aplicación de la gammaglobulina
Anti-D para evitar la isoinmunización al RhD, la fase experimental se realizó con
voluntarios masculinos RhD negativo (prisión de Sing Sing) a los que se les
administraron vía IV 5 mL de sangre RhD positivo, y después se les aplicó suero
hiperinmune Anti-Rh humano. Posteriormente se administró a mujeres RhD negativo
que habían tenido hijos incompatibles RhD positivo, evitando así la enfermedad fetal y
neonatal en embarazos posteriores. (Frigoletto 1982)
d) Diagnóstico molecular
A través de estudios de Southernblot y PCR Colin et al en 1991, demostraron la
existencia de dos genes que participan en la expresión de los antígenos Rh.
En la actualidad varios grupos de investigadores en el mundo, entre los que se
encuentran Wagner y Flegel, en Alemania, han contribuido a aclarar las bases
moleculares de los polimorfismos identificados en diversas variantes alélicas de los
genes Rh, que incluyen al síndrome Rh null, así como la posibilidad de detectar el Rh
fetal en circulación materna, la determinación de la cigocidad de diferentes antígenos
Rh, incluyendo por supuesto, el RHD (Daniels 2004) hasta finalmente poder realizar el
diagnóstico preimplantación. (Seeho, 2005)
En los últimos 10 años, el avance en el estudio molecular de los grupos sanguíneos y
en particular del Rh, avanzó vertiginosamente, permitiendo incorporarlos como
6
herramienta para el estudio clínico. Este conocimiento se ha aplicado en el estudio de
los antígenos débilmente expresados, de la cigocidad al RhD, el rastreo de donadores
antígeno negativo, la solución de las discrepancias ABO y Rh así como en el
quimerismo postransplante. También ha permitido aplicarse en los terrenos de la
identificación, pruebas de paternidad, migración de poblaciones, medicina forense o
estudios antropológicos (Reid 2003).
El sistema sanguíneo Rh (ISBT 004) es el más complejo y polimórfico, a la fecha se han
identificado al menos 49 antígenos, algunos de ellos de muy alta frecuencia hasta otros
con presencia en muy pocos individuos. (Daniels, 2004). Esta variabilidad antigénica no está
representada por la diversidad serológica (Tabla 2)
Tabla 2. Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT) de los
antígenos del sistema Rh, las casillas vacías corresponden a antígenos obsoletos.
Genes RH
Son dos los genes RH estrechamente ligados: el RHD y el RHCE, localizados en el
cromosoma 1, en el brazo corto en la región 34 y la banda 11 (1p34.11).(Logdberg 2005)
Constan de 10 exones y comparten una organización exón/intrón similar, cada uno con
una extensión aproximada de 60 kpb (RHD, 57295 pb y RHCE 57831 pb) y en
orientación opuesta (figura 2), enfrentados en su posición 3’. Tienen muy alta homología
(96%) (Okuda 2000), están separados por el gen SMP1 (small membrane proteína 1) de 7
exónes con 30,000 pb, sin relación funcional. Se han reportado más de 170 formas
7
alélicas de ambos genes. El gen RHD está flanqueado en ambos extremos por unas
secuencias también de alta homología (98.6%), llamadas cajas Rhesus, rió arriba
(ascendente) y rió debajo (descendente) de aproximadamente 9000 pb, con la misma
orientación. Cada una de las cajas Rhesus tiene una región idéntica de 1463 pb, que es
la región de ruptura a través de entrecruzamiento desigual en la deleción del gen RHD,
que forma una secuencia híbrida llamada caja Rhesus híbrida, principal mecanismo de
la población caucásica RhD negativo (Wagne y Flegel 2000).
Todos lo exones son menores a 200 bp, con excepción de los exones terminales 3’ del
RHD y SMP1 (Wagner y Flegel 2000, Flegel 2007).Cada uno de los genes produce un transcrito de
1251 pb que codifica para las proteínas RhD y RhCE de 417 residuos de aminoácidos
cada una y un peso molecular de 30Kd. (Cherif-Zahar 1994)
Homología de RHD y RHCE (Mouro 1993, Simsek 1994, Storry 2004)
El exón 1 de RHD es idéntico al exón 1 de RHCE alelo c.
El exón 2 del RHD es igual al exón 2 del RHCE alelo C.
El alelo C tiene una inserción de 109 pb en el intrón 2 no presente en el alelo c ni en D.
Los exones 1 y 2 del RHCE codifican la expresión C/c. 6 polimorfismos, 2 silentes y 4
con cambio de sentido: E1: C48G (Cys16Trp), E2: A178C (Ile60Leu), E2: G203A
(Ser68Asp), E2: T307C (Ser103Pro).
El exón 5 codifica la expresión E/e.: E5: C676G (Pro226Ala)El intrón 4 del RHCE es 600
pb más grande que el del RHD:
Los exones 4, 5 y 6 del RHD son críticos para los epítopes: D1, D2, D5, D6-7 y D8
(Wagner y Flegel 2000).
Existen de uno a varios polimorfismos de un solo nucléotido en los 10 exónes de ambos
genes. En la Tabla 3 se muestran los polimorfismos comunes entre los genes RHD y
RHCE, se observan mayores diferencias en los exónes 7 y 10 entre ambos genes
(Dibman 2003). Se han encontrado variantes para ambos genes, dos para RHD y cuatro
para RHCE (www. ExPasy.ch/).
8
Tabla 3. Polimorfismos en la secuencia codificante de los genes RHD y RHCE, se acotan las principales diferencias de nucleótidos en los 10 exónes de ambos genes.
EXÓN 4 5 6
Nucleótido 487-635 636-801 802-939
Cantidad de pb 166 138
Substitución 594 602 667 676 697 712 733 744 787 800 916 932
RHD A C T G G G G C G A G A
RHC T G G C A C T A T A G
RHc T G G C A C T A T A G
RHE T G G C C A C T A T A G
RHe T G G G C A C T A T A G
EXON 7
Nucleótido 940-
1073
pb 134
Substitució
n
941 96
8
97
4
97
9
98
5
98
6
98
9
99
2
102
5
104
8
105
3
105
7
105
9
106
0
106
1
RHD G C G A G G A A T G C G A G C
RHC T A T G C A C T C C T T G A A
RHc T A T G C A C T C C T T G A A
RHE T A T G C A C T C C T T G A A
RHe T A T G C A C T C C T T G A A
EXÓN 1 2 3 4
Nucleótido 1-
148
149 -
335
336-
486
487-
635
pb 148 187 151 149
Substitución 48 150 178 201 203 307 361 380 383 455 505 509 514 544 577
RHD G T A G G T T T A A A T A T G
RHC C T A G G T A C G C C G T A A
RHc G C C A A C A C G C C G T A A
RHE C A A C G C C G T A A
RHe C A A C G C C G T A A
9
Existen tres genes RH relacionados: RHAG, RHBG y RHCG, localizados en el brazo
corto del cromosoma 6, en la región 21 y la banda 1 (6p21.1), el primero con 10
exones, 13 alelos, que genera la proteína RhAG (Rh50) de 407 aminoácidos, cuyo
papel es esencial en la expresión de las proteínas RhD y RhCE, y al parecer es un
canal de gas. Las proteínas RhBG y RhCG no se expresan en los eritrocitos se
localizan principalmente en hígado y en riñón, dos órganos especializados en la génesis
y excreción de amonio. Por comparación genómica y su predicción estructural se ha
podido deducir la posible función de las proteínas RhAG (transporte) y Rh (estructural).
El gen RHAG-LIKE codifica para las proteínas Rhag like, están presente en
Caenorhabditis elegans (nemátodo) y Geodia cydonium (esponja marina), estas
proteínas son similares a las transportadoras de amonio de bacterias y levaduras.(Westhoff
2004)
Figura 2. Orientación opuesta de los genes RhD y RHCE, enfrentados en su posición 3`. El gen RHD está flanqueado a la derecha y a la izquierda por unas secuencias de nucleótidos llamados cajas Rhesus (b).
EXÓN 8 9 10
Nucleótido 1074-1153 1154-1227 1228-1251
Cantidad de pb 80 74 24
Substitución 1193 1358
RHD A C
RHC T -
RHc T -
RHE T -
RHe T -
10
Evolución de los genes RH
La mayoría de los mamíferos poseen solo un gen Rhesus, cuya posición corresponde al
gen RHCE. El gen RHD se originó de la duplicación del gen RH ancestral durante la
evolución de los mamíferos. Una deleción del RHD ocurrió durante la evolución de los
homínidos, como resultado de la recombinación de las cajas Rhesus 5´ y 3´, entonces
se originó el fenotipo Rh negativo en el hombre moderno (Flegel 2007).
La duplicación del gen Rhesus original (ancestral) se piensa que ocurrió durante la
evolución de los primates dando lugar a los genes RHCE y RHD en los humanos. De
acuerdo a la comparación con otras especies (ratón, monos del nuevo y viejo mundo),
el RHD es un gen duplicado, mientras que el RHCE, debido a su proximidad a SMP1
(evolutivamente más conservado), es el gen ancestral y ocupa su lugar.(Flegel 2007)
Probablemente la inversión de la orientación del gen RHD ocurrió en este evento y las
cajas Rhesus fueron los instrumentos para la duplicación (Figura 3).(Wagner y Flegel 2002)
Figura 3. Evolución de los genes RH. Durante la evolución de los mamíferos el gen ancestral RH origino a los genes RHCE y este por duplicación al gen RHD. La deleción del gen RHD dio lugar al fenotipo Rh negativo.
Fuente : Flegel WA. 2007, The Genetics of the Rhesus Blood Groups System. Arztebl;104:651-7.
11
RhD negativo
Cuando menos existen dos mecanismos moleculares para explicar la condición de Rh
negativo. Uno es la deleción total o parcial de gen RHD. La deleción del RHD, es el
mecanismo predominante en sujetos de origen étnico caucásico. Es una condición
homocigota con la ausencia del gen RHD. El punto de ruptura se localiza en la región
de identidad en las cajas del Rh (1463 pb) y se explica por un entrecruzamiento
desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2 repetitivo) Figura 4.
El otro mecanismo es la pérdida de expresión del gen RHD por diferentes mutaciones.
En este segundo grupo, el gen RHD, al menos en parte, está presente, pero su
expresión fenotípica no ocurre. Un caso ejemplar, es el mecanismo mediante el cual los
sujetos de origen étnico negro-africano RhD negativo pierden la expresión del RhD la
que puede ser por al menos tres caminos distintos: la deleción del gen RHD (43 %), la
formación del un pseudogen RHD o gen Rhψ (43 %) y finalmente la formación de un
gen híbrido RHD-CE-D: asociado al haplotipo Cde (15 %) (Singleton 2000, Wagner 2003).
En otro grupo de sujetos fenotípicamente RhD negativo con la formación del gen
híbrido, se tienen diversas opciones como es el gen híbrido RHD-CE-Ds, el haplotipo:
(C)ces o los fenotipos: VS, cm c anormal, e anormal, pero sin D. (
Figura 4. Mecanismo de pérdida total del gen RHD por entrecruzamiento anormal de la caja Rh (b) por su alta homología, dando por resultado la caja híbrida Rh y la eliminación del gen RHD.
12
Fuente: Wagner FF y Flegel WA. 2000 RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood:95
(12):3662-8.
Cajas Rhesus
La Caja RH inicial (5’ RHD) tiene una extensión de 9142 bp y termina
aproximadamente 4900 bp de la región del codón de inicio 5´ del RHD. La caja RH final
(3’ RHD) es de 9145 bp y termina 104 bp después del codón de paro del RHD.
Las cajas RH abrazan exactamente la parte de RHD con homología a RHCE. La
porción central de ambas cajas Rhesus contienen casi completo un elemento humano
tipo transposón (THE-1B). Sin embargo, el marco de lectura abierto usualmente se
encuentra en el elemento THE-1B el cual es eliminado debido a varios cambios de
nucleótidos que ocurren en paralelo en las cajas Rhesus, incluyendo una mutación sin
sentido en el codón 4 (Figura 5).
5´ 3´
Figura 5. Organización cromosómica de las cajas Rhesus. La extensión física de la caja Rhesus inicial (5´RHD) es de 9145pb (barra negra). Cerca del 63% de la secuencia de nucleótidos de las cajas son de ADN repetitivo, los tipos de familias de repetición se indican con el resto de colores. La homología entre las cajas Rhesus inicial y final es del 98.6%, con una región de identidad de 1463 pb (flechas horizontales), hay solo una inserción de 4 pb (al inicio de la región tigger3). Una isla CpG (en L1MC3 MER20) esta localizada en la posición 3´ de la caja Rhesus final (3´RHD) adyacente a la región del promotor del SMP1.
Generación de la caja Rh híbrida
Por la alta homologìa de las cajas Rhesus hay un entrecruzamiento desigual de las
mismas condicionando la deleción del gen RHD. El sitio de ruptura se encuentra
localizado en la región de identidad de 1463 pb, situada entre las posiciones 5701 y
7163 que es casi completamente idéntica. Las diferencias son:
Caja Rh inicial (12T) vs final/híbrida (16T): Diferencia de 4 bp T en una zona
de polyT.
13
Caja RH final vs inicial/híbrida: T/C en la posición 5732, en la región de
identidad.
Entrecruzamiento desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2
repetitivo) (Wagner & Flegel 2000).
La prevalencia de sujetos Rh negativo es ~ 15% en población caucásica, bajo el
mecanismo de deleción RHD es del 99-100 %, variante DELs es 0.30 %, gen RHD no
expresado es de 0.01 % y por alelo híbrido RHD-CE-D 0.05 %. (Wagner y Flegel 2001)
Rh negativo en negro africano
En individuos de origen negro-africano el Rh D negativo puede ocurrir por 3
mecanismos:
Deleción del gen RHD (43-56 %), pseudogen RHDψ (26.2-52.3 %) y gen híbrido
RHDCes: asociado al haplotipo Cde (15.5-17.3 %).
El mecanismo del pseudogen RHDψ es una mutación en la que ocurre una inserción de
37 pb de repetición de los últimos 19 nucleótidos del intrón 3 y los primeros 18
nucleótidos del exón 4 al exón 4, (que es por consiguiente 37 pb mas grande) del gen
RHD, que produce un corrimiento del marco de lectura que da como resultado un codón
de paro en el exón 6 condicionando la no expresión de la proteína D (Figura 6) (Singleton el
al 2000).
14
Figura 6. Mecanismo del pseudogen RHDψ. Consiste en la inserción de 37 pb de una secuencia de repetición entre el intrón3 y el exón 4 en el exón 4 del gen RHD que da como resultado un codón de paro en el exón 6 condicionando la no expresión de la proteína D.
El tercer mecanismo es la conversión de los genes RH en cis (Figura 7).
(A) Los genes RHD y RHCE están orientados en sentido inverso.
(B) La formación de una horquilla en el cromosoma permite la estrecha proximidad de
los segmentos homólogos en la misma orientación de ambos genes, permitiendo la
conversión del gen en evento in cis.
(C) Al eliminarse la horquilla se produce un gen híbrido RHD-CE-D, para este caso se
introduce la secuencia de los exones 4 a 7 del gen RHCE al gen RHD. No
permitiéndose la expresión de la proteína RhD.
Se han identificado un gran número de genes híbridos que condicionan la no expresión
del RhD, con diferentes haplotipos siendo todos con fenotipo RhD negativo o Del (Figura
8) .(Wagner et al 2001)
Figura 7. Mecanismo de conversión de los genes RH en cis. Los genes RHD y RHCE están orientados en sentido opuesto (A), Al formarse la horquilla ambos genes se encuentran muy próximos, facilitando la conversión de segmentos homólogos (B) al eliminarse la horquilla queda un gen hibrido (C).
15
Figura 8. Estructuras moleculares en europeos con haplotipo D negativo y Del. Cada exón está indicado por una caja, los polimorfismos en intrones y promotor investigados se muestran como círculos. Los símbolos color blanco indican la presencia de la secuencia RHD específica. Los símbolos color negro no poseen la secuencia RHD predicha en los resultados por PCR-SSP. Los exónes 1,2 y 8 se muestran en gris, porque los alelos son iguales en el RHD y algunos alelos RHCE. Tanto el panel A como el B demuestran la presencia de genes RH híbridos.
Proteínas Rh
Las proteínas RhD y RhCcEe que portan los antígenos D y C, c, E y e respectivos se
expresan en la membrana de los eritrocitos en asociación con otras proteínas (RhAG,
LW, CD47, Glicoforina B, Duffy y Banda 3). Por la interacción con proteínas del
citoesqueleto, espectrina, proteína 4.2 y anquirina, el complejo Rh contribuye a
mantener las propiedades mecánicas de la membrana. Interactúan dos moléculas de
Rh con dos de RhAG para formar un tetrámero, el cual se une firmemente al
citoesqueleto. Las proteínas RhAG portan los N glicanos de ABH (Sistema ABO y
Sistema H) Figura 9 (Le Van Kim 2006).
Por su homología (20-40%) con las proteínas transportadoras de amonio presentes en
levaduras, bacterias y algunas plantas (alga verde), se piensa que es un canal de
transporte de gas para amonio (Javelle 2007).
16
Figura 9. Complejo molecular Rh. Interacción de las proteínas integrales (Rh, banda 3, CD47, RhAG, GPC) con las proteínas del citoesqueleto (anquirina, espectrina, banda 4.2, 4.1, actina) en la membrana celular del eritrocito.
Fuente: Le Van Kim C, Colin Y & Cartron JP. 2006, Rh proteins: Key structural and functional components
of the red cell membrane. Blood Reviews; 20:93-110.
Las proteínas Rh están presentes en el 3% de las unidades formadoras de brotes
eritroides (BFU-E) y en el 68% de las unidades formadoras de colonias de la serie
eritrocitaria (CFU-E), así como en todos los eritrocitos maduros. Son detectadas a partir
de la sexta semana de vida intrauterina. (Ref)
Las proteínas de membrana RhD y RhCE son de tipo III, altamente hidrofóbicas y no
glicosiladas ni fosforiladas (Moore 1982 y 1987), por análisis de hidropatía se dedujo que estas
presentan varios cruces por la membrana, y sus grupos amino y carboxilo terminales
son de localización intracitoplásmicos, están formadas por 417 aminoácidos, la proteína
madura pierde el primer aminoácido (Met), 12 segmentos transmembranales, 6 asas
extracelulares y 7 intracelulares Los primeros 47 aminoácidos del lado amino terminal
de ambas proteínas son idénticas. (Avent 1990 y 1992). RhD y RhCcEe difieren por la
expresión de las asas exofaciales 3, 4 y 6. Son diferentes en 34-37 residuos de
aminoácidos dependiendo del alelo presente. La proteína D tiene 5 residuos de cisteína
y la RhCcEe, dos, que dan lugar a 2 y 3 sitios de palmitolación (Cys-Leu-Pro)
respectivamente en el límite del citosol y la bicapa lipídica, que permiten su
estabilización en la membrana celular (Figura 10).(Le Van Kim et al 2005)
La expresión anormal de los antígenos D, C, c, E y e pueden ser causados por
mutaciones sin sentido en los genes RHD o RHCE, pero frecuentemente involucran el
intercambio de material genético entre ambos genes RH. (Daniels 2002)
17
Mutaciones en el gen RHD pueden condicionar la debilidad de expresión de la proteína
D, en forma de D débil, D parcial y Del, los cambios de los aminoácidos en el D débil y
Del no se producen en los epítopes externos, de tal forma que los que poseen estos
fenotipos no producen Anti-D por transfusión ni por embarazo, pero los D parciales sí,
ya que hay modificaciones en los epítopes externos (Figura 11). (Westhoff 2007a)
Figura 10. Estructura molecular de las proteínas RHD y R. Lado izquierdo. Proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos circulados y los sitios de palmitolación, la proteína Rh CcEe tiene una cisteína en la posición 330 en vez de tirosina que da lugar al tercer sitio de palmitolación de la proteína RhCcEe. Lado derecho se señalan los cambios de aminoácidos en la proteína C/c y E/e
Figura 11. Cambios en aminoácidos en la proteína Rh condicionan la presencia de RhD débil, D parcial y Del. Los círculos negros denotan los cambios, los epitopes externos del RhD débil y del Del se mantienen sin cambios.
18
En la tabla 4 se muestran los ocho haplotipos Rh derivados del haplotipo cDe primitivo
que se generaron de una serie de eventos de duplicación, mutaciones puntuales y
recombinaciones.(Carritt 1997, Flegel 2000) Los haplotivos RhD positivo se presentan en color
amarillo y en verde los RhD negativo. La frecuencia de estos haplotipos varía en las
diferentes poblaciones. Las primeras dos nomenclaturas están basadas según el
mecanismo genético propuesto por cada autor, la tercera nomenclatura es numérica (1
a 5) dependiendo de la presencia (+) o ausencia (-) de los antígenos, y la más reciente
y actual, es también numérica, los primeros tres dígitos corresponden al sistema
sanguíneo y los siguientes tres números a los antígenos de dicho sistema, esta
nomenclatura se utiliza para todos los sistemas de grupos sanguíneos.
Tabla 4. Nomenclaturas del sistema Rh utilizadas en la literatura.
Las primeras dos bajo el mecanismo genético propuesto por los autores y las otras dos son nomenclaturas numéricas. Los números negativos indican la ausencia del antígeno.
Cigocidad al RhD
La determinación de la condición del estado de cigocidad del RhD ha planteado
dificultades tanto en el laboratorio, como su aplicación en la clínica.
Debido a que no existe un antígeno antitético del RhD no es posible determinar con
exactitud y precisión la condición de cigocidad por métodos serológicos.
Fisher/Race
1943
Wiener
1951
Rosenfield
1962
ISBT
CDe R1 1,2,-3,-4,5 004--001,002,005
cDE R2 1,-2,3,4,-5 004--001-003,004
CDE Rz 1,2,3,-4,-5 004--001,002,003
,cDe Ro 1,-2,-3,4,5 004--001,004,005
,cde ,r -1,-2,-3,4,5 004--004,005
Cde ,r’ -1,2,-3,-4,5 004--002,005
,cdE ,r” -1,-2,3,4,-5 004--003,004
CdE ,ry -1,2,3,-4,-5 004--002,003
19
Las técnicas de laboratorio utilizadas han sido la hemoaglutinación en tubo del fenotipo
Rh, que es la prueba más difundida y evaluada, seguida por otras técnicas aplicables
solamente a nivel experimental, como son la determinación de la densidad del antígeno
D mediante citometría de flujo o pruebas de electroforesis de proteínas (Westernblot),
entre otras más.
Mediante el empleo de la técnica de hemoaglutinación en tubo para identificar el
fenotipo de los antígenos más comunes del sistema Rh (D, C, c, E y e), nos permite
inferir el genotipo del individuo pero no establecer con certeza su condición de
hemicigoto u homocigoto en el gen RHD, se ha validado en población sajona y permite
con cierto grado de certeza establecer cuál es la probabilidad de cigocidad en el sujeto.
El problema clínico que se presenta comúnmente, es el de aquella mujer Rh negativo,
con pareja sexual Rh positivo, que desea saber cuál es la probabilidad de que tenga un
hijo Rh negativo y así evitar los problemas relacionados con la isoinmunización materna
que ponen en riesgo al feto y el recién nacido, así se puede enfrentar a la posibilidad
de tener hijos RhD negativo, dependiendo de la ausencia o modificación o presencia y
cigocidad del gen RHD paterno (Figuras12, 13 y 14).
Figura 12. Representación de los genes homocigotos RHD negativo y positivo. Uno de los padres RHD negativo y el otro RHD positivo homocigoto, 100% hijos RHD positivo heterocigotos. Los cuadros blancos corresponden a los exónes del gen RhD, los verdes son las cajas Rhesus, los cuadros rosa al gen SMP1 y los azules el gen RHCE.
20
Figura 13. Representación de los genes homocigoto RHD negativo y heterocigoto RHD positivo. Uno de los padres RHD negativo y el otro RHD positivo heterocigoto, 50% hijos RHD positivo heterocigotos y 50% RHD negativo
Figura 14. Representación de los genes RHD negativo en ambos padres. Ambos padres RHD negativo, 100% hijos RHD negativo
La estimación de la probabilidad de la hemicigocidad del alelo D, es útil en la asesoría
de las parejas con riesgo de ser portadores de un hijo con enfermedad hemolítica
isoinmune por Anti-D. Una alta probabilidad de hemicigocidad paterna promueve la
determinación del Rh fetal por métodos de amplificación del ADN. Una alta probabilidad
de homocigocidad requiere de una estrecha monitorización para valorar daño fetal y la
posible intervención terapéutica.
Por otro lado el determinar el RHD fetal permite tomar la decisión de la profilaxis con
gamaglobulina anti D prenatalmente solo si el feto es RhD positivo y evitando su
aplicación innecesaria si es RhD negativo en una madre no isoinmunizada al RhD
(Figura 15)
21
Figura 15. Guía para el estudio de la embarazada RhD negativo.
Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN)
La hiperbilirrubinemia y la EHRN por anticuerpos antieritrocitarios, continúa siendo una
de las primeras 10 o 15 causas de morbilidad neonatal en nuestro medio, aunque su
prevalencia se haya modificado en la última década. Debido por un lado a la reducción
en la tasa de fecundidad para la República Mexicana, que pasó de más de 7 hijos por
mujer a menos de 3, entre 1960 y el año 2000. Otras variables que han influido son una
mejor infraestructura en el estudio inmunohematológico de la gestante, así como de las
acciones normativas que se han implementado en términos de uso terapéutico de la
sangre, la mejoría en las prácticas de atención obstétrica y la prevención con la gama-
globulina anti-D (Baptista 2000, Baptista Radillo, 2006).
La enfermedad hemolítica isoinmune del feto y el recién nacido se debe a una reacción
de citotoxicidad mediada por anticuerpos IgG (Ig1 e Ig3), producidos por la madre contra
los antígenos eritrocitarios fetales de herencia paterna, los cuales cruzan la placenta por
Sistema Rh• Cigocidad del
RHD paterno
• Identificación del
RHD fetal en sangre
materna
No
isoinmunizada
Isoinmunizada
Valorar daño
fetal si es RHD
positivo
Evitar la
aplicación
innecesaria de
la γglobulina
Anti-D
Escenario clínico
Embarazada RhD
negativo isoinmunizada
Anti-D 1:32
Conyuge RhD positivo
D/D D/d
Estrecha monitorización
para valorar daño fetal
y la posible intervención
terapéutica
Determinación del RHD
fetal por métodos de
amplificación del ADNd/d
D/d
22
su unión y transporte con el receptor neonatal Fc (FcRn) pH dependiente hacia la
circulación fetal (Klein y Anstee 2005) y ocasionan hemólisis fetal o neonatal de grado variable
que ocurre principalmente por mecanismos extravasculares, los eritrocitos
sensibilizados con anticuerpos son capturados por las células del sistema fagocítico
mononuclear, a través de la unión del Fc de los anticuerpos con los receptores de
Fc(γR1) de los fagocitos. (Mollison 1993, Oski 1984). Las consecuencias (dependiendo de la
severidad) incluyen anemia por destrucción (bazo e higado), hipoxia, acidosis, aumento
de la eritropoyesis, primero medular y luego extramedular (bazo higado),
hiperbilirrubinemia de predeminio indirecto, hipoalbuminemia, hipoprotrombinemia,
trombocitopenia, hipertensión portal, edema hasta anasarca, insuficiencia placentaria,
insuficiencia cardiaca congestiva, daño neurológico y hasta la muerte si no es tratado
oportunamente. (Baptista 1999)
La hemólisis Los anticuerpos antieritrocitarios se originan por dos mecanismos
principales, la hemorragia feto-placentaria y la transfusión incompatible. (Mollison 1993). Sin
intervención, se isoinmunizarán 1-2 % en la etapa prenatal, 5-15 % al nacimiento y del
3-6 % posterior a un aborto. Cerca del 25 % de sus hijos fallecerán en la etapa
perinatal. La tasa de mortalidad perinatal es del 0.33 %. A pesar del subregistro en los
reportes hospitalarios, la prevalencia de la isoinmunización al RhD disminuyó de entre
9.1-10.3 a 1.4 casos por 1000 nacimientos. (Urbaniak 1998). Se desconoce su prevalencia
en México (Baptista 2001).
La frecuencia de Rh negativo en una población de pacientes del Instituto Nacional de
Perinatologìa de los años 1982 a 1995, osciló entre 4.5 al 5%. En cuanto a su condición
de isoinmunización al RhD, encontramos que varió según el año, del 9.4 al 20.7%,
aunque es claro que tiene un sesgo, pues en aquellos años se reclutaron pacientes con
esta condición, pero al separar por quinquenios ocurrió entre 11.7 y 14.1% (Tabla 5).
(Baptista 2001).
Tabla 5. Prevalencia de mujeres Rh negativo e isoinmunización al RhD entre los años 1982 a 1995.
Años por quinquenios 1982-1985 1986-1990 1991-1995 Total
Pacientes de primera vez 20,898 40,958 38,193 100,049
Pacientes Rh negativo y porcentaje 1065 (5.0) 2052 (5.0) 1740 (4.5) 4857 (4.85)
Pacientes isoinmunizadas y porcentaje 150 (14.1) 276 (13.4) 203 (11.7) 629 (13.0)
23
A partir del fenotipo Rh, se puede inferir la cigocidad más probable del RhD, el origen
étnico es importante dado que modifica sustancialmente la probabilidad de la condición
de cigocidad (Tabla 6). (Walker 1990).
En la tabla 7 se muestran las frecuencias fenotípicas, Rh positivo, condición más
probable de cigocidad y Rh negativo así como el tamaño muestral en diferentes
estudios realizados en población mexicana, excepto la primera columna que es en
población sueca, que es la referida por ser un estudio de familias. La frecuencia
fenotípica de la mayoría está en los fenotipos R1R1, R1R2 y R1r, excepto en el estudio
de Lisker, para fenotipo R1r y RhD negativo por ser un estudio realizado en población
Tabla 6. Fenotipos RhD positivo con la cigocidad más probable en individuos blancos y negros
Blancos
(%)
Negros
(%)
Blancos Homocigoto
(%)
Blancos Hemicigoto
(%)
Negros Homocigoto
(%)
Negros Hemicigoto
(%)
CcDee R1r
31.1
8.8
10 90 59 41
R1Ro 3.4 15.0
Ror´ 0.2 1.8
CCDee R1R1
17.6
2.9
91 9 81 19
R1r´ 1.7 0.7
ccDEe R2r
10.4
5.7
10 90 63 37
R2Ro 1.1 9.7
ccDEE R2R2
2.0
1.3
87 13 99 1
R2r” 0.3 <0.1
CcDEe R1R2
11.8
3.7
89 11 90 10
R1r” 0.8 <0.1
R2r´ 0.6 0.4
ccDee Ror
3.0
22.9
6 94 46 54
RoRo 0.2 19.4
24
indígena, con menor mezcla con poblaciones extranjeras. La frecuencia de Rh D
negativa difiere significativamente entre la población caucásica y la mexicana.
La condición de cigocidad varía con respecto a la frecuencia de la población RhD
negativo, se aprecia claramente si se compara el estudio sueco vs cualquiera de los
estudios en mexicanos de la tabla, es más alta la condición de hemicigocidad al RHD
en poblaciones con mayor frecuencia de individuos RhD negativo.
Tabla 7. Frecuencia de fenotipos Rh, condición de RhD positivo y negativo, la cigocidad RhD más probable (alrededor de 90% o más) en diferentes estudios en población mexicana.
Fenotipo Heiken
1966
n 8297
Lisker
1980
n 2616
Quintanar
1999
n
Grunbaum
1980
n 1212
Baptista
1993
n 177
Tiburcio
1978
n 474
Long
1991
n 619
Duval
2007
N 8266
RhD positivo
n (%)
7009 (84.5)
2608
(99.7)
(96.6)
1170
(96.5)
162
(91.5)
431
(91.0%)
570
(92.1)
5707
CCDee (R1R1) 21.3 28.3 26.4 27.7 26.0 25.5 23.9 27.5
CcDEe (R1R2) 17.9 37.2 26.6 27.0 20.3 23.7 22.3 25.9
CcDee (R1r) 40.4 6.8 17.7 18.4 27.1 26.7 27.1 24.4
ccDEe (R2r) 14.8 5.3 7.5 7.8 7.9 12.8 14.4 10.4
Codee (R2R2) 3.6 14.0 6.9 7.2 7.3 6.5 6.5 6.2
CCDEe (R1Rz) 0.06 4.4 3.8 3.9 0.1 2.3 2.3 2.6
ccDee (Ror) 1.8 0.7 1.6 1.6 0.1 2.5 2.8 1.8
CcDEE (R2Rz) 0.06 2.4 3.8 4.0 <0.1 0 0.5 1.1
CCDEE (RzRz) 0 0.8 2.3 2.4 <0.1 0 0.2 0.1
RhD negativo
n (%)
1288
(15.5)
8
(0.3)
(3.4)
42
(3.5)
15
(8.5)
43
(9.0)
49
(7.9)
2559
,ccddee (rr) 96.0 100 84.4 76.1 93.3 93.0 91.8 92.5
Ccdee (rr´) 2.6 0 5.2 4.8 0 4.7 8.2 4.6
,ccddEe (rr´´) 1.4 0 0 4.8 6.7 2.3 0 2.2
CcdEe (r´r´´) 0 0 5.2 0 0 0 0 0.5
CCdee (r´r´) 0 0 5.2 0 0 0 0 <0.1
,ccdEE (r´´r´´) 0 0 0 4.8 0 0 0 <0.1
CCdEE (ryry) 0 0 0 9.5 0 0 0 0.1
Homocigoto 43.0 87.2 72.3 72.2 61.7 58.0 55.7 63.4
Hemicigoto 57.0 12.8 27.7 27.8 38.3 42.0 44.3 36.6
Se compara con el estudio de referencia de Heiken, noten diferencias en la frecuencia de Rh D negativos entre las poblaciones, sueca (segunda columna), indígena (tercera columna) contra el resto de estudios. La heterocigocidad al RHD es mayor en poblaciones con mayor frecuencia de RhD negativo.
25
I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La isoinmunización materno-fetal al Rh es aún un problema clínico que hay que
abordar, a pesar del gran éxito medico que tuvo la prevención con la gammaglobulina
Anti-D, que pudo reducir las tasas de morbimortalidad neonatal pero no erradicar la
enfermedad hemolítica del recién nacido mediada por anticuerpos anti-D.
El conocer el estado de cigocidad RHD que posee el padre: a) Ayuda a predecir junto
con un grupo de pruebas diagnósticas a tomar las acciones necesarias de tratamiento
del feto enfermo, b) Brindar asesoría genética antes de la concepción cuando la madre
esta isoinmunizada y c) Identificar el RHD fetal por métodos no invasivos.
Debido a que existe un alto grado de homología con el gen RHCE, la selección de los
oligonucleótidos para la reacción de amplificación debe ser cuidadosamente diseñada.
• Se han utilizado las diferencias principales entre ambos genes para tal efecto. 1. Una secuencia presente en la región 3´ no traducida del exón 10 del RHD,
que no está presente en el RHCE. 2. Una diferencia de 600 pb en el tamaño del intrón 4 entre RHD (600 pb) y
RHCE (1200pb). 3. Múltiples diferencias entre el exón 7 de ambos genes. 4. La caja Rhesus híbrida está presente solo en Rh D negativo por el
mecanismo de deleción.
• Las cajas Rhesus presentes únicamente a ambos lados del gen RHD.
• Rh D parciales, que poseen ciertos exones reemplazados por los exones
equivalentes del RHCE, por lo que es necesario realizar PCR multiplex de dos o
más regiones.
• Presencia del pseudogen RHD ψ en el 67% de negros africanos RhD negativo,
en el 24% de los afro americanos RhD negativo y en el 17% de surafricanos y
personas mezcladas RhD negativo, que tienen el gen completo pero inactivo con
el inserto de 37 pb entre el intrón 3 y el exón 4, por tal motivo, se busca la
amplificación de la región que contiene el inserto.
• En orientales y algunos caucásicos europeos han encontrado polimorfismos en la
caja Rh híbrida del Rh D negativo.
26
I.3. JUSTIFICACIÓN
La validación de una prueba diagnóstica molecular para definir la condición de
cigocidad en sujetos Rh positivo, permitirá obtener información confiable para
proporcionar consejo pregestacional o prenatal a mujeres RhD negativo isoinmunizadas
y por consiguiente, mejorar la calidad de la atención médica.
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN.
¿Cuál es la eficacia en la determinación del genotipo RHD con el empleo del PCR en
tiempo real y convencional en comparación con el estándar de oro hemaglutinación
(fenotipo), en la identificación de la cigocidad del RHD de los individuos RhD positivo?
I.4. OBJETIVOS E HIPOTESIS
HIPÓTESIS
La concordancia entre la prueba fenotípica y la determinación del genotipo del RHD,
presenta una correlación igual o mayor a 0.95.
OBJETIVO GENERAL
Identificar la condición de cigocidad en el gen RHD en sujetos RhD positivo,
mediante el empleo de PCR en tiempo real y PCR-RFLP tradicional, en familias
residentes en el Valle de México.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar la concordancia de la cigocidad del gen RHD por la determinación del
fenotipo del sistema Rh y las pruebas moleculares del gen RHD.
Validar la determinación del genotipo como prueba diagnóstica en la identificación
del gen RHD en la descendencia de las mujeres Rh negativo con parejas Rh positivo.
27
II. MATERIAL Y MÉTODOS
1. Diseño: Estudio de casos y controles, transversal y descriptivo.
2. Población: Los casos se integraron por familias en donde la madre es RhD negativo
y su pareja RhD positivo y al menos un hijo biológico evaluado. Los controles fueron
familias en donde ambos padres son RhD positivo y al menos un hijo estudiado. La
muestra se obtuvo de dos sitios, un grupo de familias de una escuela en el Distrito
Federal y un grupo de mujeres Rh negativo y sus familias del Instituto Nacional de
Perinatología.
3. Variable de estudio: Pruebas serológicas : Grupo sanguíneo ABO, RhD, fenotipo
Rh. Pruebas moleculares: 3´UTR Exon 10 RHD, secuencia específica del exón 7 RHD,
secuencia del intrón 3-exón 4 RHD y RHDψ, amplificación y corte con Pst1 de las cajas
Rhesus.
Variable independiente: Tabla de frecuencias de cigocidad (Heiken 1966).
Variables dependientes: Grupo sanguíneo RhD, cigocidad basada en el estudio
familiar, genotipo del RHD por PCR-RFLP convencional y en tiempo real.
4. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación:
Criterios de inclusión - Familias residentes de la ciudad de México y área
metropolitana con fenotipo Rh identificado y DNA almacenado.
Criterios de exclusión - Personas con antecedente de transfusión de eritrocitos en los
últimos tres meses. Familias donde el padre es RhD negativo.
Criterios de eliminación - Muestras sanguíneas sin el fenotipo completo o DNA
insuficiente, inadecuado o no identificado apropiadamente.
5. Métodos.
1. Los participantes del estudio bajo consentimiento informado del Protocolo de
Investigación, fueron identificados y obtenidas las muestras sanguíneas (dos tubos
de 2.7 mL con EDTA) de una vena del antebrazo.
2. Se les efectuó el estudio fenotípico de los antígenos Rh (D, C, c, E y e) mediante el
método de aglutinación en tubo y sistema en gel DIANA empleando reactivos
28
hemoclasificadores comerciales para RhD una mezcla de anticuerpos monoclonales
y control del Rh con la misma matriz que los anticuerpos (Immunocor Gamma,
Houston, Texas), a partir de sangre anticoagulada con EDTA. Se utilizaron
anticuerpos monoclonales específicos para el restante de antígenos (Gamma
Biologicals). Se observaron, interpretaron y registraron los resultados.
3. Se dedujo la cigocidad de acuerdo a la frecuencia génica reportada en el trabajo de
Heiken y Rasmuson considerado como estándar de oro (Tabla 8).
Tabla 8. Cigocidad más probable al RHD de acuerdo a la frecuencia génica
4. Se extrajo el DNA de los individuos a partir de los leucocitos de sangre
con EDTA (tres alicuotas) y se almacenaron en el Banco de DNA del Servicio de
Hematología del INPer con un equipo comercial High Pure PCR Template
Preparation Kit (Roche, Mannheim, Alemania), que permite el aislamiento de DNA
genómico de doble cadena a partir de diferentes tipos de muestras biológicas. Este
método de extracción aporta diversas ventajas frente a las técnicas clásicas:
aislamiento de forma rápida, obtención de DNA de buena calidad, libre de
inhibidores de DNA polimerasa, sin emplear laboriosos pasos de extracción con
solventes orgánicos y con menor manipulación de la muestra. Las células son lisadas
mediante una incubación corta con proteinasa K en presencia de un agente
caotrópico (guanidina-HCl 6M), urea 10mM, Tris-HCl 10 mM y triton X100 20%, el
cual inactiva todas las nucleasas. Los ácidos nucleicos se unen selectivamente a un
Fenotipo
Cigocidad más probable en base a la frecuencia génica
D/D ó D/d
CCDee (R1R1) Homocigoto
CcDEe (R1R2) Homocigoto
CcDee (R1r) Hemicigoto
ccDEe (R2r) Hemicigoto
ccDEE(R2R2) Homocigoto
CCDEe (R1Rz) Homocigoto
ccDee (Ror) Heterocigoto
CcDEE (R2Rz) Homocigoto
29
filtro de fibra de vidrio especial. EL DNA unido es purificado por una serie de pasos
de lavado y centrifugación que eliminan componentes celulares contaminantes. Se
ha incluido un amortiguador de remoción de inhibidores de Heparina que permite su
aplicación en muestras con hasta 100 U/mL de Heparina. Finalmente el DNA es
eluído de la columna con 200mL de una solución salina de baja concentración a pH
8.0 (Tris EDTA) obteniendo DNA genómico de alto peso molecular. Todos los pasos
de la extracción se realizan a temperatura ambiente.
5. Las alícuotas de DNA identificadas numéricamente fueron almacenadas
en un apartado para Banco de DNA en los ultracongeladores (-70ºC) del Servicio de
Hematología Perinatal del Instituto Nacional de Perinatología.
6. La calidad del DNA extraído se verificó por electroforesis horizontal
utilizando geles de agarosa al 1.5% con bromuro de etidio (0.5 g/mL) (Sambrook et
al, 1989). El corrimiento electroforético se llevó a cabo en la cámara Horizon 58 (Life
Technologies, Paisley, Escocia) a 65 volts durante 30 minutos con amortiguador TBE
0.5x (500 mM de Tris-HCl, 60 mM de ácido bórico y 83 mM de EDTA). Como control
negativo se usaron todos los reactivos, pero sin DNA, para determinar una posible
fuente de contaminación del material obtenido. Finalmente, los geles fueron
fotografiados con el sistema de captura AlphaImager utilizando el software
AlphaView versión 1.0.1.10 (Alpha Innotech, California, EUA). Figura 16.
7. La pureza (Relación 260/280nm) y concentración del DNA (260nm) se
valoró utilizando un espectrofotómetro ACTGene, EUA. (Sambrook et al, 1989).
Figura 16. Valoración de la calidad del DNA genómico. Se ejemplifica un gel de agarosa al 2%, teñido con
Br-Et (0.5 g/mL). Cada carril corresponde a una muestra proveniente del banco de DNA.
30
8. Se amplificaron secuencias específicas del gen RHD de los sujetos de estudio: a)
Región 3´no traducida del exón 10 del gen RHD por PCR en tiempo real con sondas
de hibridación como formato de detección, b) Región del exón 7 del RHD por sondas
de hidrólisis Taqman, c) Búsqueda del pseudogen RHDΨ con sondas de hibridación
y d) Caja híbrida por método tradicional de PCR y luego se cortó el amplificado (caja
Rhesus río abajo y caja Rhesus híbrida, con este diseño no se puede amplificar la
caja río arriba) con la enzima Pst-I, que cortará en dos sitios en la caja río abajo y en
tres sitios en la híbrida.
Se realizaron las amplificaciones por PCR en tiempo real utilizando el LightCycler II TM
(Roche Molecular Systems, Somerville, NY) Figura 17., es un sistema que consiste en
la integración de un fluorómetro y un termociclador que combina ciclos rápidos de PCR,
con una monitorización de la fluorescencia en tiempo real que va aumentando conforme
aumenta el número de copias de la secuencia de ADN amplificado, valorándose
gráficamente el producto de amplificación.
La reacción se lleva a cabo en capilares de borosilicato, es calentado por aire, y
distribuido por un ventilador, permitiendo una alta velocidad de reacción y con ello, la
especificidad. El gráfico (eje x ciclos y eje y fluorescencia) que se obtiene, es de tipo
sigmoidal. La fluorescencia se detecta en diferentes canales ópticos (530, 560, 610,
640, 670 y 705 nm). Los formatos de detección de los fluorocromos son: a) SyberGreen
1- Este fluorocromo con tres anillos aromáticos se une al surco menor del ADN de
doble cadena, la luz fluorescente verde se detecta a 530 nn en la fase de elongación, b)
Sondas de hibridización (HybProbe)- Contienen dos sondas, la F1 con el fluorocromo
del donador (fluoresceína) que se une por la parte 5¨, y la sonda F2 con el fluorocromo
aceptor (rojo 640 NHS éster ó 705), que se une a la parte 3´ y bajo el principio de
FRET, se detecta en la fase de alineamiento, emitiendo fluorescencia (del fluróforo
receptor) cuando hibridan, c) Sondas de hidrólisis (Taqman). Contiene una sola sonda
con un fluorocromo reportero con un apagador (quencher) se detecta en la fase de
31
elongación y d) sondas sencillas de hibridación que se detectan en fase de
alineamiento.
Figura 17. Observación de la fluorescencia en un sistema computarizado y diagrama de operación del termociclador.
Componentes, condiciones y programación de las reacciones de amplificación
(Tablas 9 y 10).
A. Región 3´ no traducida del exón 10 gen RHD
1. Componentes de la PCR: 6.0 μL H2O grado BM, 0.8 μL MgCl2 3mM, 0.4 μL primer
sentido, 0.4 μL primer antisentido, 0.2 μL sonda ancla Fit-PO4, 0.2 μL sonda
sensora Red LightCycler 640nm, 1.0 μL mezcla de reacción LightCycler FastStart
DNA Master HybProbe (Taq pol, dNTP´s, buffer) y 1.0 μL DNA (20-50 ng).
2. Condiciones de reacción: Fue programado a 45 ciclos de desnaturalización a
95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 61°C por 10 segundos y
posteriormente extensión a 72°C durante 15 segundos.
3. Programa de detección: Se aplicó un ciclo de curvas meeting a 95°C durante 20
segundos, seguidos de 40°C por 20 segundos y 80°C, cero segundos, con una
detección contínua de fluorescencia.
B. RHDψ (intrón3-exón4) ttactgggttttattgcagACAGACTACCACATGAAC
1. Componentes de la PCR: 5.75μL H2O grado BM, 0.8 μL MgCl2 3mM, 0.4 μL primer
sentido, 0.4 μL primer antisentido, 0.2 μL sonda ancla o donadora (FL), 0.2 μL,
sonda sensora o receptora (LC NHS 640), 1.0 μL mezcla de reacción LightCycler
32
FastStart DNA Master HybProbe, 0.25 μL LightCycler Uracil-DNA glicosilasa (2 U/
μL) y 1 μL de DNA.
2. Condiciones de reacción: Fue programado a 45 ciclos de desnaturalización a
95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 64°C por 10 segundos y
posteriormente extensión a 72°C durante 12 segundos.
3. Programa de detección: Se aplicó un ciclo de curvas meeting a 95°C durante 20
segundos, seguidos de 58°C por 20 segundos y 80°C, cero segundos, con una
detección continúa de fluorescencia.
C. Exón 7 RHD
1. Componentes de la PCR: 5.65μL H2O grado BM, 0.5μL primer sentido, 0.5μL
primer antisentido, 0.1 μL sonda de hidrólisis Taqman, 0.25μL UDG y 1.0 μL de
DNA.
2. Condiciones de reacción: Fue programado a 40 ciclos de desnaturalización a
95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 58°C por 30 segundos y
posteriormente extensión a 72°C durante 1 segundo, fase de enfriamiento a 40°C
durante 30 segundos, con una detección sencilla de fluorescencia.
D. Amplificación convencional y corte con Pst1 de las cajas Rhesus
1. Componentes de la PCR: Expand High Fidelity PLUS PCR System, dNTPPack,
Roche®, 50.0 μL Buffer, 2.37 μL MgCl2, 0.5 μL dNTP, 1.0 μL oligonucleotido de
sentido (RHw rez7), 1.0 μL oligonucleotido de antisentido (RHwrnb31), 0.2 μL Taq
pol de alta fidelidad, 0.25 μL Uracil-DNA glicosilasa (UDG) y 15.0 μL H2O + DNA
concentración 50-100 ng para un volumen final de 25 μL de reacción.
2. Condiciones de reacción: 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94ºC por 2 min,
40 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 30 seg, alineación a 65ºC por 30 seg y
extensión a 68ºC por 5 min, luego 1 ciclo a 68ºC por 10 minutos y enfriamiento a 4
ºC
3. Corte con Pst1: 2.5μL buffer, 1.0μL Pst1 1U, 6.5 μLH2O y 15.0 μL producto de la
amplificación para obtener un volumen de reacción de 25.0 μL, el cual es incubado
a 37ºC, luego se toman 15 μL de la digestión los que se mezclan con 1.0 μL de
33
buffer de corrimiento, para ser sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1%
con BrEt, para ser visualizadas y comparadas con el marcador de tamaño molecular
(DNA Molecular Weight Marker XVI (0.25-3.09Kpb, Roche®) con un marcador de
tamaño molecular (DNA Molecular Weigh Marker XII, Roche®) que genera 15
fragmentos desde 50 a 750 bp con una banda final de 2642 pb. y las reacciones
digeridas de los controles DD, Dd y dd como parte del control de calidad.
Tabla 9, Secuencias de los iniciadores y sondas para la amplificación de las secuencias del gen RHD
PCR-RFLP Amplicón y fragmentos Diseño
Caja natural río abajo e híbrida Oligonucleótido Sentido (rez7) 5´CCTGTCCCCATGATTCAGTTACC3´ Oligonucleótido Antisentido (rnb31) 5´CCTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGG3´ Enzima Pst 1
3030 pb 567, 179, 397 y 1887 pb en caja híbrida. 744, 397 y 1887 pb en caja Rhesus natural río abajo.
Wagner FF & Flegel WA. Blood 2000;95(12):3662-8.
PCR Tiempo real Amplicón Diseño
3´UTR Exón10 RHD Oligonucleótido Sentido 5´TCTCACTGTTGCCTGCATT Antisentido 5´TCTAGCCTGGGTGACAGAGTA Sonda 1 5´LC640-GACTTTGCTGTCATGAGCGTTTCTCACGTA--PH Sonda 2 5´CCAGTGCCTGCGAACATTGG—FL
321 pb Lo D et al N Engl J Med1998;339:1734-8, modificado por TIB- MOLBIOL
Intrón 3-Exón 4 RHD ψ Oligonucleótido Sentido 5´ CAGAGGATGCCGACACTCA 3´ Antisentido 5´TCTGCTCAGCCCAAGTAGGA3´ Sonda 1 5´ LC640- Sonda 2 5´
275/238 pb Modificación de Singleton por TIBMOLBIOL
Exón 7 RHD Oligonucleótido Sentido 5´CTCCATCATGGGCTACAA 3´ Antisentido 5´CCGGCTCCGACGGTATC 3´ Sonda 5´ 6FAM-AGCAGCACAATGTAGATGATCTCTCCA—TMR
90 pb Legler et al Tranfusion and Apheresis Science 2002;27:217-23.
PCR-RFLP Amplicón y fragmentos
Diseño
Caja natural rio abajo e híbrida Oligonucleótido Sentido (rez7) 5´CCTGTCCCCATGATTCAGTTACC3´ Antisentido (rnb31) 5´CCTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGG3´ Enzima Pst 1
3030 pb 567, 179, 397 y 1887 pb en caja híbrida. 744, 397 y 1887 pb en caja Rhesus natural río abajo.
Wagner FF & Flegel WA 2000, Blood;95:3662-8
34
Tabla 10. Condiciones de las reacciones de amplificación
El oligonucleótido de sentido (rez7) reconoce la región de identidad de las cajas RH
superior, inferior e híbrida. El oligonucleótido de antisentido (rnb31) reconoce solo la
caja RH inferior y la híbrida. Se pueden identificar las cajas amplificadas por la digestión
enzimática con Pst1, que corta la caja RH híbrida en cuatro bandas (1887,567, 397 y
179 pb) y la caja RH inferior en tres bandas (1887, 746 y 397 pb), cuando se tienen
ambas cajas (hemicigotos) se generan cinco bandas (1887, 746, 567, 397 y 179).
En cada una de las reacciones de amplificación en tiempo real realizadas se incluyeron
muestras control conocidas DD, Dd y dd, así como una muestra blanco de agua, como
parte del control de calidad.
Las muestras de DNA con resultados negativos, fueron estudiadas con una
amplificación de una secuencia específica del gen de albúmina.
La tabla muestra las secuencias de los oligonucleótidos (primers) y sondas, tamaño de
los amplicones y las referencias del diseño molecular y en la tabla se describen las
condiciones de reacción.
Desnaturali-
zación inicial
Desnaturalización Alineamiento Extensión Ciclos Curvas de fusión
(1 ciclo)
3´UTR
Exón 10
95°C 10 min 95°C 10seg 61°C 10seg 72°C 15seg 45 95ºC/10 seg, 40 ºC/20
seg y 85 ºC/0seg
RH ψ 95°C 10 min 95°C 10seg 64°C 10seg 72°C 12seg 45 95ºC/0 seg, 58 ºC/1
min y 80 ºC/0seg
Exón 7 95°C 10 min 95°C 10seg 58°C 30seg 72°C 1seg 40 No
Cajas Rh 94°C 2 min 94°C 30 seg 65°C 30 seg 68°C 5 min 40 No
35
ANALISIS ESTADÍSTICO
Los resultados de los estudios de laboratorio de los sujetos analizados fueron
almacenados en una hoja electrónica tabular, que generó una base de datos. Se
establecieron los estratos de los grupos para cada variable para ser analizados en un
programa estadístico SPSSv12.
Se obtuvo la estadística descriptiva de la población total y por grupo de estudio. Se
estableció la concordancia entre la cigocidad establecida por la frecuencia génica y la
obtenida por el estudio familiar mediante la prueba de Phi. De igual manera se evalúo la
concordancia entre la cigocidad basada en frecuencia genotípica y la obtenida por el
estudio familiar con la cigocidad basada en los estudios moleculares.
Se evaluó mediante la metodología de pruebas diagnosticas la capacidad de
identificación de cigocidad en la descendencia.
Se aplicaron los criterios para determinar el genotipo más probable a partir del fenotipo
identificado (1.- sin conocer los fenotipos paternos, a través de la tabla de frecuencias
del Rh de Heiken y Rasmuson y 2.- conociendo los fenotipos de padres e hijos). Se
correlacionaron el fenotipo y los genotipos para valorar el grado de concordancia entre
ambos métodos por el análisis de Phi y, para valorar la frecuencia esperada contra la
observada en los grupos de estudio, se aplicó la prueba X2.
36
III.- RESULTADOS
Serológicos
Se evaluaron 228 individuos, 122 padres y 106 hijos pertenecientes a 61 familias (61
madres y 61 padres). Se constituyeron 28 familias de casos y 33 familias de controles.
En la Tabla 11 se muestra la distribución de la población RhD positivo y negativo, 187
(82.0%) sujetos fueron RhD positivo (33 madres, 61 padres y 93 hijos) y 41 (18.0%)
fueron RhD negativo (28 madres y 13 hijos).
De los 106 hijos evaluados, 44 correspondieron al grupo de casos, de estos 33 fueron
RhD positivo y 11 RhD negativo. El grupo control estuvo conformado por 62 hijos, de los
cuales 60 fueron RhD positivo y 2 RhD negativo.
Tabla 11. Distribución de la población estudiada por RhD
Familia (228)
Positivo n/% (187/82.0)
Negativo n/% (41/18.0)
Hijo (106)
93 (87.7)
13 (12.3)
Madre (61)
33 (54.1)
28 (45.9)
Padre (61)
61 (100.0)
En el estudio del grupo sanguineo ABO, la distribución obtenida fue con predominio del
grupo O (64.9%), seguido del grupo A (24.1 %), grupo B (9.6%) y finalmente AB (1.8
%). Al comparar su distribución de acuerdo con la condición del Rh, no hubo diferencias
(Tabla 12).
Tabla 12 Distribución de la población estudiada por grupo ABO y Rh
Grupo ABO (228)
Positivo (187/82.0)
Negativo (41/18.0)
O (147/64.5)
121 (64.1)
26 (57.8)
A (55/24.1)
44 (24.5)
11(28.
B (22/9.6)
19 (9.9)
3 (11.1)
AB (4/1.8)
3 (1.5)
1 (2.2)
37
Se realizó la identificación de los fenotipos del sistema Rh, los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 13, donde se observa que los fenotipos más frecuentes fueron
CcDee con 62 casos, CCDee 45 casos, CcDEe 43 casos y ccddee 36 casos, los demás
fenotipos se encontraron con menor frecuencia. Los fenotipos hemicigotos (D/d) se
muestran en casillas amarillas, de acuerdo a la tabla de frecuencias génicas de
Heiken.y Rasmuson.
Tabla 13. Fenotipos Rh de los sujetos de estudio
Con los resultados obtenidos del estudio de fenotipificación del sistema Rh y tomando
en consideración la tabla de frecuencias génicas de Heiken y Rasmuson (Tabla 8), se
estableció la probabilidad de la cigocidad paterna (28 casos y 33 controles) y a través
del estudio por familia.
Fenotipo
Madre
n61
n (%)
Padre
n61
n (%)
Hijos
n106
n (%)
Total
n228
n (%)
RhD positivo 33 61 93 187
CCDee (R1R1) 15 (45.4) 14 (23.0) 16(17.2) 45(24.1)
CcDEe (R1R2) 7 (21.2) 19 (31.1) 17(18.3) 43 (23.0)
CcDee (R1r) 6 (18.1) 15 (24.6) 41 (44.0) 62(33.2)
ccDEe (R2r) 2 (6.1) 6 (9.9) 8 (8.6) 16 (8.6)
ccDEE(R2R2) 2 (6.1) 3(4.9) 5(5.4) 10 (5.3)
CCDEe (R1Rz) 1 (3.1) 1 (1.6) 1(1.1) 3(1.6)
ccDee (Ror) 0 3 (4.9) 4(4.3) 7(3.7)
CcDEE (R2Rz) 0 0 1(1.1) 1(0.5)
Homocigoto 25(75.8) 37(60.7) 40(43.0) 102(54.5)
Hemicigoto 8(24.2) 24(39.3) 53(57.0) 85(45.5)
RhD negativo 28 0 13 41
,ccddee (rr) 26 (92.9) 0 10 (77.0) 36(87.8)
Ccdee (rr´) 0 0 1(7.7) 1( 2.4)
CcdEe (r´r´´) 2 (7.1) 0 2 (15.3) 4 (9.8)
38
La cigocidad paterna por grupo de estudio y de acuerdo con la frecuencia génica para
el grupo de estudio, fue de 10 (35.7%) hemicigotos y 18 (64.3%) homocigotos, mientras
que para el grupo de los controles se obtuvieron 14 hemicigotos (42.4%) y 19 (57.6%)
homocigotos, sin diferencia estadísticamente significativa (t exacta de Fisher 0.611).
Para la cigocidad paterna por grupo de estudio y en relación con el estudio familiar,
para el grupo de casos se obtuvieron 14 (50.0%) hemicigotos y 14 (50.0%)
homocigotos; mientras que para el grupo de los controles fueron 14 (42.4%)
hemicigotos y 19 (57.6%) homocigotos, también mostró la misma distribución de la
cigocidad, en el cual tampoco se obtuvo diferencia significativa (t exacta de Fisher
0.612). La razón de momios de la cigocidad de los padres por frecuencia génica fue de
OR 1.3 (0.47-3.73) y de OR 0.75 (0.26-2.1) por estudio familiar.
Para el caso de las frecuencias del RhD de los hijos de los casos estudiados (33
positivos y 11 negativos) y de los controles (60 positivos y 2 negativos) se obtuvo una
frecuencia diferente de RhD negativo y significativamente mayor (p 0.0015) para el
grupo de casos, explicable por ser hijos de madres RhD negativo; mientras que para los
controles se obtuvo la frecuencia esperada (alrededor del 3%).
Moleculares
En todos los 187 sujetos RhD positivo se obtuvo amplificación de las cuatro secuencias
del gen RHD estudiadas (3´UTR exón 10, exón 7 e intron3-exón4/RHDΨ, Cajas
Rhesus). Mientras que en 32 de los 41 casos (0.78) RhD negativo solo amplificaron las
cajas Rh híbridas de forma homocigota (mecanismo de deleción en sujetos RhD
negativo). En 5 individuos (8.2%) amplificaron una o más de las secuencias estudiadas,
en los 5 casos se identificó una caja Rh natural descendente y una caja híbrida
(mecanismo mixto en sujetos Rh negativo). En ningún caso se identificó la presencia del
pseudogen RHDΨ (segundo mecanismo y de alta prevalencia en negroafricanos de
RhD negativo).
39
Se identificaron 3 casos en donde la cigocidad no concordó con la tabla de frecuencias
génicas, pero si con el estudio familiar y en concordancia completa con el estudio de
las cajas Rh.
La concordancia obtenida entre la cigocidad paterna con base en la frecuencia génica y
el estudio de las cajas Rhesus, fue del 0.88 en homocigotos y de 1.0 en hemicigotos
con un valor de Phi de 0.875.
Asimismo, la concordancia obtenida entre la cigocidad paterna con base al estudio
familiar y de las cajas Rhesus fue de 1.0, tanto para los fenotipos homocigotos como
hemicigotos, con un valor de Phi de 1.0.
En otras palabras cuando una mujer RhD negativo y conyuge RhD positivo acuden a un
consejo genético, al conocer el fenotipo de ambos, esto nos ayudará a conocer la
probabilidad de tener un hijo RhD negativo, ya que si por fenotipo es homocigoto, y no
se cuenta con el estudio familiar, podremos tener un 12% de falla en la estimación de la
cigocidad, es decir que siendo el padre hemicigoto con la posibilidad de tener 50% de
hijos RhD negativo lo determinamos como homocigoto, sin la posibilidad de tener hijos
RhD negativo (falso positivo).
Las figuras muestran algunos ejemplos de las curvas de amplificación y los picos de
fusión de los ensayos efectuados en los sujetos de estudio.
Figura No. 18 Picos de fusión de la región 3´UTR Exón 10 RHD. Se aprecia el producto de amplificación
específico para cada muestra evaluada con una Tm de 71°C.
40
Figura No. 19 Picos de fusión de la región intron3-exon4 RHD. Se aprecia solo un producto de
amplificación (el tipo silvestre) por cada sujeto estudiado a una Tm de 68.2°C.
Figura No. 20 Curvas de amplificación del exón 7 RHD. Se observa la curva de amplificación de cada
DNA estudiado comenzando a partir del ciclo 24-25.
41
IV.- DISCUSION
Los ensayos basados en PCR han sido utilizados por diversos autores para determinar
la cigocidad del RHD. La prueba es de gran valor al estudiar una pareja de mujer RhD
negativa isoinmunizada con Anti-D y cónyuge RhD positivo. El riesgo de afección de un
feto es del 100% si el padre es homocigoto (D/D) y del 50% si es hemicigoto (D/d).
Inicialmente los métodos se basaron en la amplificación de sitios polimórficos que están
genéticamente ligados a la ausencia del gen RHD. Se mostró que unidades repetidas
pequeñas (STR) de las formas (AC)n (GCAC)n en el intrón 2 pueden ser usadas para
definir si el padre con fenotipo ccDee tiene el genotipo cDe/cde o cDe/cDe. (Kemp 1999).
Los fragmentos SphI que abarcan los exones 4 a 7 del gen RH se presentan en 4 tipos
de bandas diferentes que corresponden a la distribución y segregación de los
haplotipos Rh comunes (Huang 1996).
Anteriormente, la determinación de la cigocidad se realizaba a través de la utilización
de la prueba de desequilibrio de enlace, la cual permitía determinar la correlación
fenotipo-genotipo de manera directa con base en un análisis estadístico. Adicional a lo
anterior, posteriormente, se identificaron polimorfismos en secuencias de repetición en
el intrón 8 de los genes RHD y RHCE; ambos conteniendo 5 unidades de repetición de
5 pb (AAAAT)n. Las 5 repeticiones en ambos genes, fueron identificados
exclusivamente en donadores japoneses sin el gen RHD (Fujiwara 1999).
Todas estas pruebas utilizadas con anterioridad dependían del cálculo del desequilibrio
de enlace y por consiguiente, son abordajes indirectos.
También es posible dosificar directamente el gen RHD por PCR convencional (de punto
final), comparando la intensidad del producto amplificado contra un gen de
referencia(Chan 2001). Este fundamento se aplicó en la técnica de electroforesis capilar,
que ya ha sido utilizada para evaluar el gen RH (Cossu 1996). Finalmente se describió un
método por PCR en tiempo real en el cual las secuencias específicas amplificadas del
RHD se pueden cuantificar en relación con un gen de referencia. (Chiu 2001). Estos
métodos no permiten identificar otros mecanismos implicados en la condición de RHD
negativo, como el pseudogen RHDψ y otros alelos aberrantes.
42
Desde que se definió la organización genómica del locus RHD y se identificó el sitio
preciso de la deleción del gen (Wagner 2000), se pudieron desarrollar métodos basados en
PCR-RFLP y PCR tiempo real. La cigocidad por el método de PCR-RFLP descrita por
Wagner y Flegel 2000, también puede ser afectada por la presencia del pseudogen ψ o
por mecanismo híbrido. Correlaciona en todos los casos cuando los hemicigotos (la
parte RhD negativa heredada) derivan del mecanismo por deleción. Se tiene un reporte
del análisis de cigocidad por PCR en tiempo real (Araujo), pero nuestro grupo no lo pudo
reproducir. Una perspectiva es identificar la cigocidad por esta metodología para hacer
esta prueba accesible a la clínica, por ser un método rápido, sensible, confiable, sin
manipulación del DNA y menor riesgo de contaminación, hacen que esta técnica se
perfile como una herramienta necesaria en el área del diagnostico clínico y la
investigación.
No se puede definir la cigocidad RHD por las amplificaciones de los segmentos del gen
estudiados por PCR en tiempo real porque no fueron cuantificados los DNA obtenidos
de los sujetos de estudio, ni comparados con un gen constitutivo de una o dos copias,
pensamos que podríamos diferenciarlos en la fase donde comienzan las
amplificaciones pero esto no fue posible.
Por los estudios referidos en la literatura, se concluye que pueden usarse
indistintamente las pruebas que identifican la cigocidad RHD a través de PCR
cuantitativo de los métodos que determinan la caja híbrida (PCR-RFLP, PCR alelo
específica ), dando los mismos resultados, (van der Shoot considerando que ambos
tienen la limitante de no identificar otros mecanismos de generación de fenotipo RhD
negativo, de ahí que sea importante considerar la etnicidad de los individuos a estudiar,
pero se pueden tener valores predictivos positivos y negativos muy altos cuando la
población estudiada es de origen blanco europeo.(Waner 2002).
43
Concordancia entre los diferentes métodos de estimación de la cigocidad RHD.
Autor Frecuencia
génica
Estudio
familiar
Estudio
Molecular
Danes 72 ND 95.8
Fany 61 100 100
Chiu 46 ND 100
44
V. CONCLUSIONES.
1. La condición de cigocidad al RHD se distribuye de manera simétrica en las
parejas de mujeres RhD negativo y positivo.
2. La identificación de la cigocidad de la pareja RhD positivo se debe efectuar
mediante la combinación de estrategias de acuerdo a la situación clínica.
La determinación simultánea del fenotipo Rh y la identificación molecular
de la cigocidad son herramientas útiles en el asesoramiento genético
perinatal, sobre todo en las formas homocigotos del RHD, para valorar
casos en que aparentemente tienen la condición homocigota y por
consiguiente el 100% de los hijos serán RhD positivo que son hemicigotos
que tienen la posibilidad del 50% de engendrar hijos RhD negativos que no
serán afectados por ese silencioso proceso llamado isoinmunización
materna.
3. Si una pareja con mujer RhD negativo y pareja RhD positivo que por
fenotipo es más probable que sea homocigoto tiene un error en la
identificación de la cigocidad del 12%, a diferencia de la condición
hemicigota en la que tiene una probabilidad del 100% de tal condición.
4. El estudio molecular permite conocer con más precisión esta condición,
sobre todo en las formas homocigotos del RHD, para valorar casos en que
aparentemente tienen la condición homocigota y por consiguiente el 100%
de los hijos serán RhD positivo que son hemicigotos que tienen la
posibilidad del 50% de engendrar hijos RhD negativos que no serán
afectados por ese silencioso proceso llamado isoinmunización materna.
45
VI. Bibliografía
http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.php
Avent ND, Ridgwell K, Tanner MJA, Anstee DJ. 1990. cDNA cloning of a 30 kDa
erythrocyte membrane protein associated with Rh (Rhesus)-blood-group-antigen
expression. Biochem J 271: 821-5.
Avent ND, Butcher SK, Liu W, Mawby WJ, Mallinson G, Parsons SF, Anstee DJ,
Tanner MJA. 1992. Localisation of the C-termini of the Rh polypeptides to the
cytoplasmic face of the human erythrocyte membrane. J Biol Chem 267: 15134-
15139.
Baptista GHA, Rosenfeld MF y Ruiz MLO en Medicina transfusional Capítulo 19
pp473-502 Ed. Prado1999 Radillo GA y Escamilla GG editores.
Baptista GHA, Rosenfeld MF, Pérez PJD, López MA & Leiss MT 1993. Frecuencia de
los antígenos eritrocitarios del Sistema Rh en los cónyuges de mujeres Rh negativo.
Perinatol Reprod Hum 1993; 7: 44-8.
Baptista GHA, Rosenfeld MA & Leiss MT 2001. Prevención de la isoinmunización
maternal al RhD, con gamaglobulina anti-D. Salud Pública de México; 43: 52-8.
Carritt B, Kemp TJ, Poulter M 1997. Evolution of the human RH (rhesus) blood group
genes: a 50 year old prediction (partially) fulfilled. Hum Mol Genet 6: 843-50.
Cerda-Flores RM & Garza-Chapa R. 1989. Variation in the Gene Frecuencies of
Three Generations of Humans from Monterrey, Nuevo León, México, Human Biology;
61: 249-61.
Cerda-Flores RM, Kshatriya G.K, Bertin T.K., Hewett-Emmett D., Hanis C.L,
Chakraborty R. 1992. Gene Diversity and estimation of genetic admixture among
Mexican-Americans of Starr County, Texas, Annals of Human Biology. 19: 347-360.
Cherif-Zahar B, Le Van Kim C, Rouillac C, Raynal V, Cartron JP, Colin Y. 1994.
Organization of the gene (RHCE) encoding the human blood group RhCcEe antigens
and characterization of the promoter region. Blood Cells Mol Dis 19: 68-74.
Daniels G. 2001. Wien Klin Wochenschr 113/20-21:781-6.
46
Daniels G. 2002, Human blood groups. 2nd Edition Blackwell Science, Oxford pp195-
9.
Daniels GL, Fletcher A, Garratty G, Henry S, Jorgensen J, Judd WJ. ISBT. 2004.
Blood group terminology 2004: from the International Society of Blood Transfusion
Committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang. 87: 304-16.
Denomme GA. 2004. The structure and function of the molecules that carry human
red blood cell and platelets antigens.Transf Med Rev; 18: 203-31.
Dibmann PM Tesis doctoral 2003. Nicht-invasive Bestimmung des fotalenRhesus-D-
Genotyps in der Schwangerschaft von Antigen-D- negativen Frauen. Facultad de
Biología de la Universidad de Bielefeld.
Duval-García IA. 2007. Tesis grado de maestría en CQB. Identificación de fenotipos
poco frecuentes del Sistema Rh y creación de un Banco de ADN de una muestra de
sujetos del Valle de México. IPN-ENCB.
Flegel WA & Wagner FF: Molecular genetics of RH. Vox Sang 78 Suppl 2: 109- 115(2000).
Flegel WA. 2007. The Genetics of the Rhesus Blood Group System. Dtsch
Arztebl;104(10):651-7.
Frigoletto FD, Jewett JF & K0nugres AA. 1982. Rh Hemolytic Disease. New Strategy
for Eradication. GK Hall Medical Publishers Boston Massachusetts.
Grunbaum BW, Selvin S, Myhre B.A.& Pace N, 1980. Distribution of Gene
Frecuencies and Discrimination Probabilities for 22 Human Blood Genetic Systems in
four racial Groups. J of forensic sciences;25 (2):428-44.
Javelle A, Lupo D, Li XD, Merrick M, Chami M, Ripoche P & Winkler FK. 2007,
Structural and mechanistic aspects of Amt/Rh proteins. J of Struct Biol 158:472-81.
Le Van Kim C, Colin Y & Cartron JP. 2006, Rh proteins: Key structural and functional
components of the red cell membrane. Blood Reviews; 20:93-110.
Klein HG & Anstee DJ. 2005, Mollison´s Blood Transfusion in Clinical Medicine, A
revision of the 10th edition. Pp 496-545.11th Blackwell Publishing.
Linares GJ. 1986 Inmunohematología y Transfusión. Principios y Procedimientos.
Primera impresión, Caracas, Venezuela. 61-6.
47
Long CJ, Williams RC, McAuley JF, et al, 1991 Genetic Variation in Arizona Mexican-
Americans: Estimation and Interpretation of Admixture Proportions. American Journal
of Physical Anthropology; 84:141-57.
Lisker R. 1981 Estructura genética de la población mexicana. Aspectos médicos y
antropológicos. Ed. Salvat. pp. 61-6.
Lögdberg L, Reid ME, Lamont RE, Zelinski T. 2005 Human blood group genes 2004:
chromosomal locations and cloning strategies. Transf Med Rev 19:45-57.
Mohandas N & Narla A 2005. Blood Group antigens in Elath and disease. Curr Op in
Hematol, 12:135-40.
Mollison Pl, Ergelfriet CP & Contreras M. 1993. Blood Transfusion in Clinical
Medicine, 9th Ed. Blackwell Scientific Publications. London. Cap 5 The Rh Blood
Group System (and LW) pp205-45.
Moore S, Woodrow CF, McClelland DB 1982. Isolation of membrane components
associated with human red cell antigens Rh(D), (c), (E) and Fy. Nature 295: 529-31.
Moore S, Green C 1987. The identification of specific Rhesus-polypeptide-blood-
group ABH-active-glycoprotein complexes in the human red-cell membrane. Biochem
J 244:735-41.
Mouro I, Colin Y, Cherif-Zahar B, Cartron JP, Le Van Kim C. 1993. Molecular genetic
basis of the human Rhesus blood group system. Nat Genet 5: 62-5.
Oski FA & Naimann LJ. 1984, Problemas hematológicos en el recién nacido. 3era Ed.
Editorial Médica Panamericana, pp
Pereira C, Sobrinho-Simoes M & Araujo F. 2003 Genotyping RHD zygosity using
real-time polymerase chain reaction. Vox sang;84:243.
Okuda H, Suganuma H, Kamesaki T, Kumada M, Tsudo N, Omi T, Iwamoto S, Kajii
E. 2000.The analysis of nucleotide substitutions, gaps, and recombination events
betweenRHD and RHCE genes through complete sequencing. Biochem Biophys Res
Commun 274: 670-83.
Race RR y Sanger R. 1975. Los Grupos sanguíneos humanos. Ed. La Prensa
Médica Mexicana 2ª. Edición pp. 161-171.
48
Heiken A & Rasmuson M 1966, Genetical Studies on the Rh blood Group system.
Hereditas Lund 55:192-212.
Reid ME. 2003. Applications of DNA-based assays in blood group antigen and
antibody identification. Transfusion;43:1748-57.
Reid ME y Mohadas N. 2004. Red Blood Cell Blood Group Antigens : Structure and
Function. Seminars in Hematology;41(2):93-117.
Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T.1989 Quantitation of DNA and RNA. En :
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, EUA, ppE5-7.
Seeho SKM, Burton G, Leigh D, Marshall JT, Persson JW & Morris JM. 2005. The
role of preimplantation genetic diagnosis in the Management of severe rhesus
alloimmunization: first unaffected pregnancy: Case report. Human Rep 20 (3):697-
701.
Simsek S, de Jong CA, Cuijpers HT, Bleeker PM, Westers TM, Overbeeke MA,
Goldschmeding R, van der Schoot CE, von dem Borne AE. 1994. Sequence analysis
of cDNA derived from reticulocyte mRNAs coding for Rh polypeptides and
demonstration of E/e and C/c polymorphisms. Vox Sang 67: 203-9.
Singleton B, Green CA, Avent ND, Martin PG, Smart E, Daka A et al. 2000 The
presence of an RHD psudogene containing a 37 base pair duplication and a
nonsense mutation Africans with the RhD-negative blood group phenotype. Blood;
95:12-8.
Storry JR.Olsson ML. 2004 Genetics basis of blood group diversity. BJH.126:759-71.
Technical Manual of American Association of Blood Banks. 2005 15 Ed. Washington
DC, Capítulo
Tiburcio V, Romero A & De Garay AL. 1978 Gene frecuencies and racial
intermixture in a Mestizo population from Mexico City. Annals of Human Biology; 5
(2):131- 8.
Urbaniak SJ. 1998. The Scientific basis of antenatal prophylaxis. Br J Obstet
Gynaecol ;105 Suppln18:11-8.
49
Wagner FF y Flegel WA. 2000 RHD gene deletion occurred in the Rhesus box.
Blood:95 (12):3662-8.
Wagner FF, Frohmajer A y Flegel WA. 2001 RHD positive haplotypes in D negative
Europeans. BMC Genet; 2: 10
Wagner FF y Flegel WA. 2002. RHCE represents the ancestral RH position, while
RHD is the duplicated gene. Transfusion;99 (26):2272-3.
Wagner et al BMC 2003. Genet; 4: 14).
Westhoff CM. 2004. The Rh blood group system in review: A new face for next
decade Transfusion 44:1663-73.
Westhoff CM. 2007a. The Structure and Function of the Rh antigen Complex. Semin
Hematol 44(1):42-50.
Westhoff CM. 2007b. Rh complexities: serology and DNA genotyping. Transfusion
47; 15s-22s.
50